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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

Summary

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Abstract

Se presenta un dispositivo de microfluidos que permite la determinación cuantitativa de biomoléculas intracelulares en múltiples células individuales en paralelo. Para este propósito, las células están atrapados pasivamente en el medio de una microcámara. Tras la activación de la capa de control, la célula se aísla del volumen que rodea en una pequeña cámara. El volumen que rodea a continuación, puede ser intercambiado sin afectar a la célula aislada. Sin embargo, al abrirse corta y cierre de la cámara, la solución en la cámara puede ser sustituido dentro de unos pocos cientos de milisegundos. Debido a la reversibilidad de las cámaras, las células pueden ser expuestos a diferentes soluciones secuencialmente de una manera altamente controlable, por ejemplo, para la incubación, el lavado, y finalmente, la lisis celular. Las microcámaras bien cerrados permiten la retención del lisado, minimizar y controlar la dilución después de la lisis celular. Desde la lisis y el análisis se producen en el mismo lugar, se retiene una alta sensibilidad porque no más lejos dilution o pérdida de los analitos se produce durante el transporte. Por tanto, el diseño microcámara permite el análisis fiable y reproducible de un número muy reducido de copias de moléculas intracelulares (attomoles, zeptomoles) liberadas por las células individuales. Además, muchos microcámaras pueden estar dispuestos en un formato de matriz, permitiendo el análisis de muchas células a la vez, dado que los instrumentos ópticos adecuados se utilizan para el seguimiento. Ya hemos utilizado la plataforma para los estudios de prueba de concepto para analizar las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores y segundos mensajeros en forma cuantificable, ya sea relativa o absoluta.

Introduction

Muchos estudios en el pasado han revelado diferencias entre células dentro de una población de células grandes 1-3, en particular, la señalización de los procesos 4, o las cantidades de biomoléculas intracelulares tales como proteínas, metabolitos, 5,6 y 7,8 cofactores. Estas heterogeneidades se considera que son de importancia fundamental para la adaptación celular y la evolución 9, sino que también juegan un papel clave en la aparición y el tratamiento de enfermedades como el cáncer 10-13. Por lo tanto, los estudios sobre el nivel de una sola célula son de gran interés en la investigación biológica y farmacológica, en particular si estos estudios revelan las diferentes respuestas de las células después del tratamiento con sustancias químicas bioactivas.

En los últimos años, muchas plataformas analíticas se han desarrollado que facilitan el análisis de células vivas individuales o la composición química del contenido de la celda. Mientras que células activadas por fluorescencia (FACS) es el oro StAndard para el análisis de muy alto rendimiento de células vivas individuales, el método no puede ser empleado para la cuantificación de compuestos intracelulares o secretadas. La aparición de plataformas de microfluidos ha prometido estrategias analíticas novedosas para el posicionamiento, el tratamiento y la observación de las células individuales. Un hito en la microfluídica se alcanzó con la integración de las válvulas de PDMS flexibles realizadas por Quake y compañeros de trabajo 14,15. Estas válvulas son útiles ya que pueden aislar a las regiones en el chip, por ejemplo, separar dos culturas 16. Además, son especialmente aplicable para el análisis de células individuales y, por tanto, ayudan a reducir los problemas de dilución del analito. La potencia de este enfoque para el análisis de una sola célula se ha demostrado recientemente por Hansen y compañeros de trabajo, que analizaron la expresión de genes de cientos de células individuales en paralelo 17.

Cuando el objetivo proteínas y metabolitos, el análisis es muy difícil debido a la falta de un adecuadométodos mplification, el gran número de diferentes compuestos presentes, y sus variaciones en la naturaleza química. Además, se espera que la mayoría de biomoléculas intracelulares a estar presentes en bajo número de copias en el orden de unos pocos diez miles 18, por lo tanto, el método analítico utilizado debe tener una alta sensibilidad. Ensayos más potentes, como los inmunoensayos y los inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA) son difíciles de integrar en los dispositivos de microfluidos, ya que requieren varios pasos de lavado y de incubación, así como la inmovilización de superficie.

Debido a estos desafíos, no es sorprendente que sólo unos pocos ejemplos han sido reportados donde las proteínas o metabolitos se cuantificaron en el nivel de una sola célula. Por ejemplo, los estudios sobre la secreción de compuestos fluorescentes han sido reportados 19,20. Recientemente, la aplicación con ELISA se presentó para el análisis de secretadas (no fluorescentes) proteínas a partir de un cultivo de células (THP-1 células) 21 y solo (immune) células 10. Orientación de las proteínas intracelulares, Shi et al. Desarrolló un dispositivo de microfluidos que facilitó la identificación de proteínas intracelulares para el análisis de las vías de señalización en las células tumorales por medio de un inmunoensayo 11. Sin embargo, se determinaron sólo cantidades relativas de las proteínas y no hay amplificación enzimática se utilizan para aumentar la señal para las proteínas de baja abundancia.

Recientemente, hemos sido capaces de combinar un microdispositivo captura de una sola célula con ensayos de fluorescencia 8 e inmunoensayos 22 (Figura 1). Las células están atrapados pasivamente en las estructuras de vallas micronizada, que permiten el suministro y el intercambio (rápida) de medio y otros agentes químicos sin ningún movimiento de las células. Una válvula en forma de anillo alrededor de cada trampa permite el aislamiento de la célula en un volumen muy pequeño ("la microcámara"). Esta válvula se acciona inmediatamente después de la introducción de un tampón de lisis celular (hipoosmolar), sena vez que la prevención de moléculas intracelulares o moléculas secretadas a difundir lejos. Lo más importante, debido al pequeño tamaño del volumen (625 PL) se evita gran dilución de las moléculas. Además, puesto que la lisis y análisis se llevan a cabo en en la misma posición en el chip, no hay pérdida de analitos debido al transporte. El diseño de chips descrito aquí tiene 8 filas alternas de 7 ó 8 microcámaras, por un total de 60 microcámaras. Las cámaras son accionados en filas, de manera que se impide la contaminación cruzada a lo largo de una línea.

La plataforma se puede utilizar en combinación con ensayos de fluorescencia, así como ensayos inmunológicos (Figura 1D). Para este último, hemos establecido protocolos para la inmovilización de los anticuerpos, que son compatibles con la producción de chips y proceso de montaje. De ahí que la plataforma se abre el camino para ensayos sensibles, fiables y cuantificables a nivel de células individuales. Hasta ahora, se ha utilizado el dispositivo para el análisis de la ienzimas ntracellular y secretadas (cuantificación relativa mediante ensayos enzimáticos), cofactores intracelulares, proteínas y pequeñas moléculas (cuantificación absoluta por ensayos de punto final o ELISA). En lo que sigue, se describe el proceso de fabricación de chips por medio de litografía blanda de múltiples capas y los protocolos para los patrones de los anticuerpos por medio de la impresión por microcontacto y química de superficie. Además, se dan algunos ejemplos de uso de chips y las operaciones.

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Protocol

1. SU-8 de fabricación Maestro

Preparar dos moldes maestros para los canales (de fluidos y control, para esquemas y dimensiones ver Figura 2) con el siguiente protocolo pero con diferentes patrones de máscara. El proceso se muestra en la Figura 3a.

  1. Comience por calentamiento de una oblea de silicio de 4 pulgadas por 10 min a 180 ° C. Cargue la oblea deshidratado en un spin-revestidor y utilizar el siguiente protocolo para spin-coating SU-8 2015:
    1. Haga girar la oblea a 100 rpm durante 20 segundos (tapa abierta de spin-revestidor, dispense SU-8 durante este paso, cierre la tapa después de la dispensación).
    2. Girar la oblea a 500 rpm durante 10 seg (extendería el resistir sobre toda la oblea).
    3. Girar la oblea a 1750 rpm durante 30 seg (define la altura de la resistirse a 20 micras).
  2. Eliminar resistir desde el borde de la oblea con acetona (utilizar un hisopo), ya que esto lo contrario se adhieren a la zona de cocción en el siguiente paso. Transfiera la oblea para ahotplate a 95 ° C y el calor durante 4 min. Después de la softbake, exponer el resistirse a través de una fotomáscara pegado a sodalime vidrio en un alineador de la máscara con la luz UV (150 mJ / cm 2, medida a 365 nm).
  3. Después de la exposición, calentar la oblea de nuevo a 95 ° C durante 5 minutos sobre una placa caliente. Enfriar la oblea a RT y luego sumergirlo en un baño de SU-8 desarrollador durante 4 min. Agitar suavemente para quitar sin impresionar SU-8. Lave la oblea con isopropanol grado de sala limpia y secar con nitrógeno. Revise debajo de un microscopio si el desarrollo se ha realizado correctamente (especialmente las trampas de células). Si las trampas de células están completamente desarrollados, el reflejo de la oblea de silicio debe ser visible. Si es necesario, el desarrollo de la oblea de nuevo durante unos minutos.
  4. Hornear la oblea en un horno durante 2 horas a 180 ° C para eliminar todo disolvente residual. Compruebe la altura de los canales con un perfilador paso. Si la altura es diferente de la altura deseada, repita este protocolo de comenzar en el paso 1.1 con una nueva oblea ycambiar la velocidad de centrifugado (paso 1.1.3). Finalizar la fabricación del molde maestro por silanizar la oblea con 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodecilo-dimethylchloro-silano en un desecador durante toda la noche.

2. Fabricación Maestro para la impresión por microcontacto

  1. Con el fin de preparar los moldes maestros para la impresión por microcontacto, deshidratar una oblea de silicio durante 10 minutos a 180 ° C. Spin-capa de 1 ml HDMS en esta oblea a 7500 rpm durante 30 segundos (el resistir adhiere mejor a una superficie silanizada). Spin-capa 2 ml de AZ1518 positivo resisten con este protocolo:
    1. Dispensación estático de la oponga resistencia a la oblea.
    2. Haga girar la oblea durante 5 segundos a 500 rpm.
    3. Haga girar la oblea durante 60 segundos a 4000 rpm.
  2. Después de un segundo softbake 50 a 100 ° C sobre una placa caliente, exponer al resistir a la luz ultravioleta (21 mJ / cm 2 a 365 nm) a través de una fotomáscara y en un alineador de la máscara. Desarrollar el resistir en un baño de AZ 726 de 75 seg. Enjuague la oblea desarrollado con DI-agua y golpe dry con nitrógeno. Eliminar el disolvente residual mediante el calentamiento de la oblea a 115 ° C durante 50 seg. Silaniza la oblea al vacío durante la noche.

3. La fabricación del chip de microfluidos

Un diseño de dispositivo de dos capas se utiliza para estos experimentos. Las dos capas se preparan por separado y se unen entre sí, antes de que el chip se une finalmente en un portaobjetos de vidrio (Figura 3b). Este paso se describe la producción de las capas de PDMS y el sello de PDMS para la impresión por microcontacto.

  1. Preparar una mezcla 10:01 de PDMS y agente de curado. Prepare unos 80 g de PDMS en total (usando nuestros diseños, esto se traducirá en 10 fichas). Mezclar ambas partes vigorosamente y desgasificar la PDMS hasta que la mezcla esté libre de burbujas (~ 30 min).
  2. Coloque las tabletas con la capa de control dentro de una caja de Petri con cinta adhesiva en la parte inferior. A continuación, vierta ~ 50 g de PDMS en la parte superior y colocar la oblea durante al menos 2 horas en un horno a 80 º C para asegurar la completacurado de los PDMS. Repita el mismo procedimiento para la oblea de la impresión por microcontacto, para esto se necesita ~ 20 g de PDMS.
  3. Spin-capa de PDMS en la oblea con la capa de fluido a una velocidad de rotación de 2000 rpm para formar una capa de alta PDMS aproximadamente 40 micras. Curar el PDMS en un horno durante al menos 1 hora a 80 ° C.
  4. Cuando ambas partes se curan, retire la capa de control de la oblea y cortar en pedazos con una cuchilla de afeitar. Hacer agujeros de conexión de presión mediante el uso de un golpeador biopsia 1 mm. Para el almacenamiento, es conveniente poner un pedazo de cinta adhesiva sobre los canales.
  5. Para unir las dos capas, tome la oblea spin-revestido y la parte superior y colocarlos en un limpiador de plasma 23. Después del tratamiento de plasma, alinear rápidamente dos partes con un microscopio con una gran distancia de trabajo. Agregue un poco de PDMS piezas de alrededor de las partes superiores colocados. Este paso no es obligatorio, sin embargo, facilita la eliminación de los PDMS de la oblea. Coloque la oblea en un horno a 80 ° C durante al menos 1 hr.
  6. Utilice un bisturí para retirar con cuidado el PDMS de la oblea y reducir los microchips. Hacer agujeros de acceso para las conexiones de fluidos con un golpeador biopsia 1,5 mm.
  7. El chip de PDMS está terminado y se puede almacenar durante meses. Opcional: Si el chip se utiliza con un depósito, cortar la parte superior de una punta de pipeta de 200 l y utilizar algunos de repuesto, PDMS semicurados para pegar en la parte superior. Ponga el chip en el horno de nuevo a 80 ° C durante al menos 1 h.

4. Vinculación a la diapositiva de cristal

Para utilizar el dispositivo para ensayos enzimáticos directos, el único paso necesario después de la unión es el bloqueo de las superficies. Para este protocolo, proceda a A. Sin embargo, para utilizar el chip de microfluidos para inmunoensayos o ELISA, por favor consulte el protocolo B para restringir los sitios de unión sólo en la placa de vidrio (es decir, para la microscopía TIRF o SPR). Si esta restricción no es importante, consulte a A, pero el uso de conjugados con biotina en el paso 4.3 y continúe con el paso 4.8en el protocolo B para crear una superficie completamente funcional.

Antes de realizar el protocolo A y B: Se recomienda para filtrar todas las soluciones de proteínas usadas antes de introducirlos en el chip. Escombros y de proteína agregados pueden de otro modo bloquear trampas de células, reduciendo así el número de cámaras que se pueden utilizar para el análisis. Para este fin, utilizar una unidad de filtro de adsorción no proteico para filtrar todas las soluciones antes de su introducción en los canales.

Protocolo A (ensayos enzimáticos)

  1. Para finalizar el dispositivo de microfluidos, unir las partes de PDMS en un portaobjetos de vidrio. Para ello, primero limpiar un portaobjetos de vidrio con jabón, agua destilada y etanol. Secar el portaobjetos con una corriente de nitrógeno. Limpie la parte PDMS con cinta scotch.
  2. Ponga la parte PDMS y el portaobjetos de vidrio limpio en el filtro de plasma de 45 segundos a 18 W. Para asegurar una unión fuerte, poner el chip en un plato caliente (100 ° C) durante 5 min.
  3. Después de la unión, llene el chip con fLUID. Una manera fácil de conseguir esto es utilizar la fuerza centrífuga. Corte la parte inferior de la punta 200 l pipeta. Para los canales fluídicos, llenarlos con la solución de bloqueo (albúmina de suero bovino (4% w / v) o poli-L-lisina) glicol de polietileno injertado (0,05% w / v) y colocar las puntas en las entradas. Rellene las entradas de la capa de control, ya sea con agua o con una solución isosmótico, por ejemplo, PBS. Coloque el chip en la centrífuga (800 xg) durante 5 min. Los canales deben ser ahora llenos de líquido completamente. Si no, repita este paso.
  4. Incubar la solución de bloqueo durante al menos 30 min a temperatura ambiente. Lavar la solución de la capa de fluido con PBS a un caudal de 10 l / min utilizando una bomba de jeringa. El dispositivo está ahora listo para experimentos de células.

Protocolo B (inmunoensayos)

Para obtener una visión completa de la modificación de la superficie del paso 4.7 en adelante, por favor consulte la Tabla 1.

  1. EnPDMS Cubate sellos para impresión por microcontacto con una solución BBSA / BSA (por ejemplo, 1-100). Después de 30 min, limpiar los sellos a fondo con agua destilada y secar el sello bajo una corriente de nitrógeno. Colocar rápidamente los sellos en un portaobjetos de vidrio limpio (Figura 4).
  2. Exponer el portaobjetos de vidrio con el sello junto con la parte superior del chip microfluídico a plasma de oxígeno durante 45 segundos a la máxima potencia (18 W) en un limpiador de plasma. Después del tratamiento de plasma, quitar el sello y alinear la superficie impresa debajo de las microcámaras del dispositivo. Coloque el chip durante 30 min sobre una placa caliente a 50 ° C.
  3. Para bloquear la superficie restante, introducir solución esterilizada por filtración de BSA (4% (w / v) en PBS) en el chip con una centrífuga (véase el paso 4.2). Incubar durante 1 hora y lavar la solución de la capa de fluido con PBS (véase el paso 4.3). El chip se puede usar entonces directamente o almacenarse durante hasta 2 semanas a 4 ° C en una caja húmeda.
  4. Para un surfac de unión completamente funcionalE, introducir avidina (0,025% (w / v) en PBS) en el depósito. Utilice una velocidad de flujo de 5 l / min durante 30 min para retirar la solución de avidina a través de los canales de fluido. Después, enjuague PBS durante 10 min. Enjuagar el depósito a fondo.
  5. Después, añadir la proteína G (0,0025% (w / v) en PBS) y lavando durante otros 30 min. Lavar con PBS durante otros 10 min después. A continuación, añadir el anticuerpo de interés (0,0001% (w / v) en PBS) durante 10 min. Después de 10 min, detener el flujo durante 15 min para permitir la unión. A continuación, lavar con PBS durante 10 min.

5. Experimentos de células

El protocolo está escrito en términos generales debido a la variedad de posibles ensayos. A modo de ejemplo se indican los reactivos necesarios para el ensayo de toxicidad G6PDH. La eficiencia de las células atrapando inicial del dispositivo es de alrededor de 2,5%, es decir, 5 de cada 200 células quedarán atrapados. La ocupación final de las trampas de células depende fuertemente de la línea celular utilizada, el protocolo de suspenderla línea celular y el tiempo, las células se lavan a través del canal. Para células que crecen naturalmente en suspensión (tales como U937), células individuales se pueden encontrar en aproximadamente el 75% de las cámaras después de unos pocos minutos. Las otras cámaras, o bien no están llenos, o ocupadas por dos o más células. En general, la ocupación de una sola célula es más pequeño para líneas de células adherentes. Cuando se utiliza el protocolo de suspensión más bien leve que aquí se presenta, el porcentaje disminuye a aproximadamente 30% (HEK, células MLT). La ocupación de una sola célula puede ser mejorada por tratamiento con tripsina de las células, pero esto también puede alterar los resultados de los experimentos.

Dependiendo de la molécula diana, adsorción o absorción de PDMS pueden influir en los resultados. La adsorción se puede reducir mediante el bloqueo de las superficies con BSA o PLL-g-PEG. La absorción es poco probable para la mayoría de las biomoléculas hidrófilas, pero debe ser revisado para (pequeñas) componentes celulares lipofílicas.

  1. Preparar las células de acuerdo con el protocolo específico (por ejemplo,
  2. Cargar las células en el chip utilizando una bomba de jeringa y el flujo hacia delante, en lugar de retirar la suspensión de células. Utilice una velocidad de flujo de 5 l / min para las líneas celulares en suspensión y mayores tasas de flujo de 10-20 l / min para células adhesivas ya para reducir de fijación no específica de las células sobre las paredes del canal.
  3. Cuando se llenan las trampas, cerrar las cámaras. Si muchas células se adhieren de forma no específica a la superficie, tratar de lavarlos con tampón de disociación celular a una velocidad de flujo de 10-30 l / min.

Protocolo A (ensayos enzimáticos)

  1. Retirar tampón de lisis a través del chip. Para este ejemplo, este tampón es un tampón de hipoosmolar con adición de Tween 20 (Tris-HCl 10, 10mM de KCl, 1,5 mM de MgCl 2, 1% (v / v) de Tween 20). Para la lisis, las cámaras de abrir y cerrar rápidamente (es decir, 500 ms para caudales de 10 a 50 l / min 7,21). Para el ensayo de G6PDH, añadir 2 mM de glucosa-6-fosfato, NADP 0,5 mM, 0,5 U / ml de diaforasa y 0,3 mM de resazurina al tampón de lisis. Iniciar el seguimiento de la cinética de reacción inmediatamente después de la lisis.

Nota: Elija cualquier tampón que es adecuado para el ensayo, sin embargo, ten en mente que los detergentes fuertes (como Triton, SDS) las células lisan inmediatamente y dará lugar a una pérdida del analito durante la apertura de la cámara.

Protocolo B (inmunoensayos)

Para una breve descripción de los experimentos de ELISA de células (tasas de flujo, el estado de la cámara, etc), por favor consulte la Tabla 1.

  1. Para ELISA, añadir el reactivo de detección requerido (por ejemplo, anticuerpo secundario, antígeno marcado) directamente al tampón de lisis. La invención añadidas Tween 20 reduce la adsorción no específica. Lisar las células según la etapa 5.4. Incubar la mezcla durante 10-15 minutos para permitir la unión (tiempo de incubación dependiendo del antígeno utilizado y el anticuerpo).
  2. Conjugados de enzima-anticuerpo que adsorbidos no específicamente a las paredes de los canales pueden conducir a una conversión del reactivo de detección ya en el interior del depósito y los canales. Para reducir los problemas de esta adsorción, lave un inhibidor de la permanente de la enzima de detección utilizado a través del chip durante el tiempo de incubación (cámaras cerradas, antes de añadir el reactivo de detección). Para HRP, utilice HCl 20 mM en agua para inactivar permanentemente las enzimas no específicamente adsorbidos.
  3. Después del tiempo de incubación, introducir el reactivo de detección (por ejemplo, Amplex Red y peróxido de hidrógeno para HRP) al chip. Abra las cámaras de nuevo en breve para lavar el anticuerpo secundario no unido de distancia y añadir el reactivo de detección. Iniciar el seguimiento de la cinética de reacción inmediatamente.
  4. Calibración: Inmovilizarel anticuerpo contra la diana de interés. Cerrar cámaras. Preparar diferentes concentraciones de analito en tampón o en lisado de células fuera del chip. Aplicar una concentración en el chip y rápidamente cambiar el volumen interior de las cámaras (500 ms de tiempo de apertura). Este tiempo de apertura es suficientemente corto para garantizar que no se produce la acumulación adicional de lavado analito, y sólo un número específico de moléculas desde el volumen de la micro-cámara se detecta. A partir de la concentración conocida de antígeno dentro de la solución y el volumen de la cámara (625 PL), calcular la cantidad dentro de la cámara. Después, continúe con el paso 5.5 e introducir el resto de detección.

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Representative Results

Nuestra plataforma es capaz de analizar una variedad de intracelular, así como moléculas secretadas presentes en o producidos por células individuales. Aquí, nos gustaría presentar diferentes estudios ejemplo para subrayar la variedad de posibles ensayos. Daremos un ejemplo para una enzima secretada (Figura 5a), así como una enzima intracelular (Figura 5b) y proteína (Figuras 5C y D). Para más ejemplos, como cofactores o pequeñas moléculas, consulte Eyer et al. (2012) y Eyer et al. (2013).

En primer lugar, presentamos un ensayo para una enzima secretada (Figura 5a). Tras la activación con forbol miristato acetato (PMA), monocitos humanos inducen la secreción de lisozima, una enzima que induce la lisis de la célula bacteriana. Para este ensayo, el tampón de celda contiene 4-metilumbeliferil β-DN, N '-diacetylchitobioside, un sustrato débilmente fluorescente para lysozyme. Tras la escisión de los residuos de azúcar por la enzima, el fluoróforo se libera y puede ser detectado dentro de la cámara. Aquí, la ventaja de la micro-cámara es la dilución minimizada de la enzima secretada, permitiendo la detección de bajas concentraciones de enzimas dentro de un corto período de tiempo. En la figura 5a, varios ejemplos de curvas se muestran en representación de la cifra de negocios enzimática de la lisozima secretada a partir de células U937 estimuladas individuales. La línea de células U937 se deriva de un paciente con linfoma histiocítico, y se puede inducir a la diferenciación monocítica terminal. La línea celular produce TNFa, lisozima y β2-microglobulina después de la estimulación con PMA. Sin rotación es detectable en cámaras abiertas o cámaras libres de células (línea discontinua).

La figura 5b muestra la cuantificación relativa de una enzima intracelular, aquí la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH). G6PDH es una proteína de la limpieza y las células del mismo tejido de origen no debería variar en gran medida en su concentración G6PDH 24. Aquí, las células U937 fueron atrapados en la cámara, y que suministran un ensayo de fluorescencia para la detección de la G6PDH junto con el tampón de lisis. Se compone de glucosa-6-fosfato, NADPH, la enzima diaforasa y la resazurina sustrato, que se convierte en resorufina fluorescente cuando G6PDH está presente. La tasa de aumento de la fluorescencia con el tiempo se corresponde con la cantidad de G6PDH. El microchip facilita aún más estudios sobre el efecto de compuestos tóxicos, por ejemplo, mediante la incubación de las células con una toxina (aquí camptotecina) durante un tiempo definido (60 min). Después de este tratamiento, la enzima liberada fue arrastrada y las células se lisaron, y se midió el nivel de G6PDH. De hecho, una pérdida significativa de contenido de enzima intracelular era visible debido a un aumento más lento de la fluorescencia (líneas rojas y columnas en la Figura 5b). Los detalles de este estudio se pueden encontrar en Eyer et al. 8

e_content "> Además, se muestran los resultados de un inmunoensayo para el análisis de cantidades GFP intracelulares. Para la expresión inducida, las células HEK293 transfectadas con donde el sistema de expresión T-Rex. En este sistema, la expresión de GFP se pueden inducir mediante la adición de tetraciclina . Después de 8 horas de incubación, las células se suspendieron, vacían en el chip, atrapados, y posteriormente se lisaron. captura de anticuerpos anti-GFP se inmovilizaron sobre la superficie del vidrio siguiendo el protocolo presentado aquí para obligar a la GFP liberado de la célula. Figura 5c muestra la cinética de unión de GFP para el anticuerpo. En este ejemplo, la GFP podría medirse directamente mediante microscopía de fluorescencia total interna debido a la fluorescencia de la proteína. Queremos hacer hincapié en que las proteínas no fluorescentes se pueden detectar también mediante el uso de un ELISA de tipo sándwich o similar formatos. Para ello, los componentes del ensayo necesarios pueden ser introducidos después de las etapas de lavado. La ventaja de ELISA es la amplificación de la señal debidoa la enzima, dando un producto fluorescente que se acumula dentro de la microcámara.

Por último, nos gustaría presentar un ELISA sándwich de una sola célula con GAPDH como la proteína diana. Se determinó GAPDH en células U937 de suspensión, así como células HEK293 adherentes (Figura 5d). Para ello, tenemos inmovilizados anticuerpo anti-GAPDH (anticuerpo de captura). Después de la lisis celular, se introdujo el segundo anticuerpo marcado con enzima (anticuerpo de detección). Las cámaras se abrieron y debido al flujo, detección de anticuerpos no unidos fueron arrasadas y Amplex Roja fue introducida a la cámara. La conversión de Amplex Red a fluorescente resorufina por el HRP (anticuerpo de detección) se controló con el tiempo en todos los 60 microcámaras al mismo tiempo. La pendiente de la parte lineal de la reacción se determinó. Esta pendiente se correlaciona directamente con la concentración de la enzima y por lo tanto, a la concentración de analito. Los resultados a partir de células U937 individuales mostraron un promedio de GAPDHcantidad de 2,6 attomol, con valores mínimos y máximos de 2,0 y 3,2 attomol, respectivamente. El análisis de los datos de 46 células HEK reveló que las células contenidas en promedio GAPDH 2,5 attomol (mínimo 0,9 attomol; máxima 4,1 attomol).

Figura 1
Figura 1. El microdispositivo y esquemas de los diferentes ensayos presentan. A) El microdispositivo montado. Aquí, las cámaras se llenan con fluoresceína para la visualización (fluorescencia verde). También es visible el depósito, las conexiones de la capa de control (presión, conectores 2x4 en la parte trasera izquierda y delantera derecha) y la conexión con la bomba de jeringa (delantero). B) Acercar en la zona microcámara. Muchas de estas cámaras pueden estar dispuestos en una matriz. Para la visualización, colorante alimenticio naranja se aisló dentro de las cámaras, mientras que colorante alimenticio verde se vacía a través de los canales. La capa de control de presión se llena de agua. C) Zoom en una sola microcámara. D) Representación esquemática de la operación del dispositivo. Dentro de una microcámara (vista lateral), una sola célula es atrapado y aislado. La célula puede ser estimulada, se incuba, se lava y finalmente lisadas dentro del chip. El contenido celular se puede analizar directamente con ensayos para enzimas o coenzimas que se genera un resto fluorescente tras la reacción (a la izquierda). Para otras proteínas, la superficie se puede modificar con anticuerpos que se unen específicamente a la proteína diana (a la derecha). Dado que el antígeno se une a la superficie, el lisado se puede lavar y moléculas de detección, tales como anticuerpos secundarios se puede agregar a cuantificar la proteína diana. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 2. Esquema de los sistemas y las dimensiones de la microcámara de canal. A) diseño de la máscara de la capa de fluido. La capa de fluido está formado por (de izquierda a derecha) una salida, la zona de la cámara, un filtro para retener partículas y agregados celulares y una entrada. A 4 en forma de disco puede albergar las estructuras para la producción de 10 fichas. B) El diseño de la máscara de la capa de control correspondiente. Debido al espacio necesario para la alineación, a 4 en forma de disco contiene las estructuras de producción de las 5 fichas. C) Esquema de capas alineadas (izquierda) y de la ampliación que muestra una trampa de células (derecha), ambos con escalas de longitud. Haga clic aquí para ver la Ampliar imagen .

Figura 3 Figura 3. Esquema de de SU-8 de procesamiento y la producción de PDMS. A) Esquema del protocolo de procesamiento de SU-8. Una oblea de silicio es recubrió por rotación con SU-8 y-horneado suave a 95 ° C durante 4 min. El diseño del canal de microfluidos deseado es transferido sobre el SU-8 utilizando una fotomáscara y la exposición a la luz ultravioleta. Después de un secado posterior a la exposición (95 ° C, 5 min), SU-8 es desarrollado y-al horno duro a 180 ° C durante 2 h. B) Esquema de la fabricación de chips de microfluidos. Una mezcla de PDMS oligómero y el agente de curado es spin-revestido sobre la forma principal para los canales de fluidos, y se vierte sobre la forma principal de la capa de control. Los negativos de los canales se representan en color rosa. Ambas capas se curan en un horno. La parte chip de capa de control de que se desmonte de la oblea (canal de control en azul) y los agujeros para las conexiones de presión se perforan (blanco). Tanto el control de partes ycapa de fluido se coloca en el plasma de oxígeno, y después, que están alineados y entre sí. Todo el chip está a continuación desmontado de la forma principal de fluido (canal de fluido en rojo) y los orificios de acceso de fluido se perforan (blanco). Por último, el chip y un portaobjetos de vidrio se unen después de la activación de superficie en el plasma de oxígeno. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 4
Figura 4. Esquema de la impresión por microcontacto. A) fabricación de Maestro para la litografía blanda. (1) A PDMS sello se incubó con proteína (SCQ) solución. (2) Se retira la solución, el sello se lava y una monocapa de la proteína permanece en el sello. (3) El sello se coloca en un portaobjetos de vidrio, con lo que las proteínas se transfieren a la superficie de cristal cara. Durante este tiempo, el microchip junto con el sello en el cristal está expuesto a un plasma de oxígeno. (4) El sello se retira y el microchip está unido al portaobjetos de vidrio. Para la visualización, dos estructuras de ejemplo se muestran, impresos con fluorescente conjugado BSA fluoresceína. B) Área de Microcontacto impreso por cámara. Desde la impresión y las cámaras no están alineadas, se evaluaron las variaciones en los puntos de unión (área impresa) en tres fichas diferentes (números 1-3), y los 60 microcámaras. Como resultado, la variabilidad de la cámara para la cámara es relativamente pequeño (<2,5%) y la variabilidad-chip a chip fue insignificante (<1%), lo que demuestra que en realidad no hay necesidad de alinear las estructuras impresas a las cámaras. clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 5. Los resultados de la G6PDH, la lisozima, GFP y ensayos de GAPDH. Los resultados representativos. A) la secreción de enzima a partir de células individuales. Izquierda: esquemática del ensayo para una enzima secretada, aquí lisozima. La lisozima es secretada por las células U937, activadas con PMA individuales y se acumula dentro de las microcámaras cerrados, donde se cataliza la producción de 4-metilumbeliferona fluorescente. Derecha: Los datos obtenidos de un experimento de la secreción. Las curvas verdes muestran la intensidad de fluorescencia con el tiempo para las cámaras ocupadas por una célula, se muestra también es una cámara sin células (negro, línea de puntos) para la comparación. B) Detección de enzimas intracelulares en células individuales. Izquierda: Esquema del ensayo para la enzima G6PDH intracelular. Tras la lisis celular, la G6PDH intracelular se libera dentro de la cámara, donde los otros componentes para una reacción en cascada enzimática están presentes. Derecha: Ejemplo de curvas y datos representativos. Soltero U937las células se analizaron para su contenido de enzima (negro). Tras la influencia tóxica de la camptotecina, que permeabiliza la membrana, dos tercios de la enzima se perdió (naranja). C) Inmunoensayo de proteínas intracelulares de células individuales. Izquierda: Esquema de un inmunoensayo, aquí para la GFP proteína intracelular. Los anticuerpos anti-GFP se inmovilizaron sobre el protocolo de acuerdo de superficie descrito en este documento. Las células se lisaron entonces en el chip y los puntos de unión se monitorizaron con el tiempo utilizando microscopía TIRF. Derecha: Gráfico de tal experimento muestra la cinética de unión de GFP a los anticuerpos inmovilizados. Punto de Tiempo 1 marca la introducción de tampón de lisis. En el punto 2 de tiempo, GFP está empezando a acumularse en la superficie, lo que significa que se ha producido la lisis celular. La unión de GFP a los anticuerpos se termina en el punto de tiempo 3. D) Sandwich ELISA de las proteínas intracelulares de las células individuales. Izquierda: Esquema de un ELISA sandwich, aquí por el GADPH proteína intracelular. Lucha contraanticuerpos-GAPDH se inmovilizaron sobre el protocolo de acuerdo de superficie descrito en este documento. Las células se lisaron entonces en el chip y se incubaron. GPADH liberada unido al anticuerpo, la cámara se lavó y se introdujo anticuerpo de detección (junto con HRP). En un último paso, anticuerpo de detección no unido se elimina por lavado, el reactivo de detección se introdujo y la reacción se controló con el tiempo. Derecha:. Cuantificación de GAPDH dentro de las células U937 y HEK293 Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Protocolo de modificación de la superficie de ELISA

Paso Tiempo Concentración Caudal Tiempo de incubación libre-Flow Cámara abierta / cerrada
[Min] (W / v)% [L / min] [Min] </ Td>
BSA 30 4 - Abierto
PBS 10 5 Abierto
Avidin 30 0.025 5 Abierto
PBS 10 5 Abierto
Proteína G, biotina 30 0.0025 5 Abierto
PBS 10 5 Abierto
Anticuerpo 20 0.0001 5 15 Abierto
PBS 10 5 Abierto
Células
(300.000 células / ml) 		~ 5 30 Cierre cuando están ocupados trampas.
El tampón de lisis 5 30 Abrir en breve
Inhibidor (por ejemplo, HCl 20 mM) 15 10 Cerrado
PBS 2 30 Cerrado
Reactivo de detección 5 30 Abrir en breve
Comience a controlar la reacción

Tabla 1. Modificatio SuperficieN protocolo para ELISA. Para una explicación, véase el texto.

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Discussion

Tecnología microfluídica ha abierto nuevas y fascinantes posibilidades para el análisis de una sola célula. En particular, la posibilidad de atrapar e inmovilizar las células individualmente por herramientas microfluídicos ha permitido estudios sistemáticos a corto y largo plazo sobre las propiedades de una sola célula y la respuesta. Además, la encapsulación de células en microgotas de alta frecuencia, generados en un microchip, ha permitido estudios de secreción de células individuales, que no se pueden realizar con los dispositivos convencionales de citometría. El enfoque de microgotas, sin embargo, tiene algunas limitaciones cuando se requieren las etapas de incubación y lavado para el protocolo de análisis. Nuestro enfoque combina ambos conceptos de captura y el aislamiento de células y por lo tanto, facilita la realización de ensayos más complejos, incluyendo inmunoensayos basados ​​en anticuerpos inmovilizados en la superficie. Además, el método es muy flexible con respecto a la aplicación y de destino analitos.

El diseño del microchip permite (i) eficienciaatrapamiento de células ciente, (ii) suministro de diversos tampones y reactivos, y (iii) el aislamiento fiable en un volumen muy pequeño cuando se requiera. De esta manera se evita la dilución de las moléculas diana. Sesenta (cientos) de microcámaras se colocan en un solo dispositivo que permite muchos experimentos en paralelo. Las válvulas en forma de redondos de cierre las microcámaras pueden ser abordados conjuntamente o por separado por filas o columnas, que es importante cuando se debe impedir la contaminación cruzada de cámaras adyacentes. Con las microcámaras cerrados, los canales pueden ser tratados con soluciones nocivos tales como el ácido clorhídrico para los propósitos de limpieza sin afectar a las células atrapadas. Por otro lado, el intercambio rápido del volumen interior de la microcámara es posible. Actualmente se necesita un tiempo mínimo de 200 mseg para abrir completamente la cámara y para introducir nuevos reactivos (para el intercambio completo de la microcámara de volumen, la velocidad de flujo tiene que ser considerado).

Mientras que nuestro método es muy reliable y reproducible, se debe tener en cuenta que hay dos principales puntos críticos en el protocolo de fabricación de chips y funcionamiento. En primer lugar, la unión de las dos capas de chips después de la activación de plasma tiene que hacerse rápidamente. La alineación es crítica, de lo contrario algunas cámaras o incluso todo el chip no es utilizable, ya que la unión es irreversible. Este paso podría ser difícil para los usuarios sin experiencia, sin embargo, después de algún entrenamiento incluso menos experiencia personal de laboratorio obtienen por lo general buenos resultados. El segundo punto crítico es la limpieza durante el montaje y el uso del microchip. Si las partículas de polvo están presentes en la superficie del chip, que pueden comprometer canales de control y las válvulas o incluso conducir a una rotura de la PDMS-PDMS o enlace de PDMS-vidrio. Por lo tanto, pasamos un montón de atención a los procedimientos de limpieza. Cabe señalar que, además de la forma de fabricación de master (realizada en una sala limpia), que producimos y utilizamos los microchips en un entorno de laboratorio normal, donde el polvo de unnd partículas están presentes.

A pesar de todos los cuidados, si las cámaras no están cerrando correctamente, podría ser que, o bien las líneas de presión se bloquean o el proceso de recubrimiento por rotación no proporcionaron el espesor de la membrana derecha. Además, de vez en cuando se observó unión insuficiente, lo que resulta en la rotura de la unión entre las dos capas de PDMS. Si la cantidad de fichas del mismo lote están mostrando este problema, es posible que el tiempo entre la activación de plasma y la alineación es demasiado largo. A veces, experimentamos PDMS adhesivas en las obleas que no pueden ser destituidos correctamente y fue el resultado de la silanización insuficiente de la oblea.

Una vez establecido el método de producción, la plataforma de microfluidos se puede utilizar para muchos estudios diferentes en el nivel de células individuales. Aquí, demostramos la detección de agentes intracelulares y secretadas con diferentes ensayos, pero muchos otros ensayos son posible en el chip. La mayoría de las proteínas no son fluorescentes y su deprotección a través de inmunoensayos no es sencilla. Implementación de ELISA en el chip traerá muchos beneficios. En primer lugar, el ensayo puede ser diseñado muy específicamente para la proteína deseada (cuando los anticuerpos adecuados están presentes). En segundo lugar, la información de ELISA puede ser cuantificada incluso en límites bajos de concentración, dando el número de proteínas o moléculas copias presentes en la célula.

Nuestro chip de corriente está diseñado para el análisis de células de mamífero individuales. Sin embargo, la modificación de la viruta para otras células tales como bacterias, algas y levaduras, debería ser posible. Hasta ahora, la única limitación para los experimentos es la necesidad de un ensayo basado en la fluorescencia. Sin embargo, actualmente estamos estudiando la aplicación de la espectrometría de masas como técnica de detección. Una vez establecida, la gama de problemas analíticos que pueden investigarse con la plataforma será aún más amplio. Además, puesto que no todos los análisis es posible en presencia de tampones de lisis celular, seestán actualmente también la evaluación de varias otras técnicas de lisis en la plataforma. Estamos seguros de que la plataforma de microfluidos versátil presenta en este documento sirve de base para nuevos estudios de una sola célula en el proteoma, metabolome y secretoma nivel.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores agradecen Tom Robinson para la prueba de lectura del manuscrito, C. Bärtschi y H. Benz para la construcción del sistema de control de presión a medida. También nos gustaría reconocer el uso de las instalaciones de sala limpia primero y el Centro de Microscopía de luz (LMC), tanto en la ETH Zürich. El trabajo fue financiado por Merck Serono y el Consejo Europeo de Investigación (CEI) a través del Programa Marco de séptima (ERC Starting Grant, el proyecto no. 203428, nμLIPIDs).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS:
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
SU-8 2015 MicroChem Corp. (Netwon, MA) n.a.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane ABCR (Karlsruhe, Germany) AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate Sigma Aldrich M9763
Acetone Merck VWR (Darmstadt, Germany) 100014
Avidin AppliChem (Axon Lab AG) A-2568
AZ 1518 AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
AZ 726 developer AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) n.a.
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A-4503
Bovine serum albumin, biotin Sigma Aldrich A-8549
Cell dissociation buffer Invitrogen 13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS) Sigma Aldrich 40215
Hydrochloric acid Fluka 84422
Isopropanol Merck VWR (Darmstadt, Germany) 109634
Magnesium chloride hexahydrate Fluka 63068
MR developer 600 Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) n.a.
PBS Invitrogen 10010-031
PLL-g-PEG grafted SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
PLL-g-PEG grafted biotin SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) n.a.
Potassium chloride Fluka 60132
Protein G, biotin Sigma Fine Chemicals 41624
Silicon wafer Si-Mat (Kaufering, Germany) n.a.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow Corning 39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Biorad 1610716
Tween 20 Biorad 1706531
EQUIPMENT:
Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
0.22 µm PES syringe filter TRP 99722
1/1.5 mm biopsy puncher Miltex, York PA 33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm Partec 04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K Kuehner n.a.
Hotplate HP 160 III BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
MA-6 mask aligner Karl Suess n.a.
Multizoom AZ100M microscope Nikon Corporation n.a.
Photomask Microlitho, Essex, U.K. n.a
Plasma Cleaner PDC-32G Harrick n.a.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE Laurell n.a.
Spin Modules SM 180 BM Sawatec, Sax, Switzerland n.a.
Step profiler Dektak XT Advanced Bruker n.a.
Syringe pump neMESYS Cetoni n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells. J. Vis. Exp. (80), e50618, doi:10.3791/50618 (2013).

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