Ett mikroflödes Chip för Mångsidig kemisk analys av enskilda celler

Summary

I den här artikeln presenterar vi en mikroflödessystem chip för enskild cell analys. Den tillåter kvantifiering av intracellulära proteiner, enzymer, kofaktorer och andra budbärare med hjälp av fluorescerande analyser eller immunoanalyser.

Abstract

Vi presenterar en mikrofluidanordning som möjliggör kvantitativ bestämning av intracellulära biomolekyler i flera enskilda celler parallellt. För detta ändamål är de celler passivt fångade i mitten av en mikrokammare. Vid aktivering av reglerskiktet, är cell isolerad från den omgivande volymen i en liten kammare. Det omgivande volymen kan sedan utbytas utan att påverka den isolerade cellen. Men på kort öppning och stängning av kammaren, lösningen i kammaren kan bytas ut inom ett par hundra millisekunder. På grund av reversibiliteten av kamrarna, kan cellerna utsättas för olika lösningar i tur och ordning på ett mycket kontrollerbart sätt, t.ex. för inkubation, tvättning och slutligen cellys. De täta micro möjliggör bibehållandet av lysat, minimera och reglera utspädnings efter cellys. Eftersom lysering och analys sker vid samma plats, är hög känslighet behålls eftersom ingen ytterligare dilution eller förlust av analyterna förekommer under transport. Den mikrokammare designen gör därför tillförlitliga och reproducerbara analyser av mycket små kopieantal av intracellulära molekyler (attomol, zeptomol) frigörs från enskilda celler. Vidare kan många microchambers vara arrangerade i en array-format, vilket gör analysen av många celler på en gång, med hänsyn till att lämpliga optiska instrument används för övervakning. Vi har redan använt den plattform för proof-of-concept studier för att analysera intracellulära proteiner, enzymer, kofaktorer och andra budbärare i antingen relativ eller absolut kvantifierbart sätt.

Introduction

Många studier i det förflutna har avslöjat cell-till-cell skillnader inom en stor cellpopulation ^1-3, särskilt signalering processer ^4, eller de mängder av intracellulära biomolekyler som proteiner ^5,6, metaboliter och kofaktorer ^7,8. Dessa heterogeniteter anses vara av grundläggande betydelse för cell anpassning och evolution ^9, men också spela en viktig roll i uppkomsten och behandlingen av sjukdomar som cancer ^10-13. Därför studier av encelliga nivå är av stort intresse inom biologisk och farmakologisk forskning, i synnerhet om dessa studier visar de olika cellsvar efter behandling med bioaktiva kemiska ämnen.

Under senare år har många analytiska plattformar utvecklats som underlättar analysen av enskilda levande celler eller den kemiska sammansättningen hos cellinnehållet. Medan fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) är den gyllene stAndard för mycket hög genomströmning analys av enskilda levande celler, vilken metod kan inte användas för kvantifiering av intracellulära eller utsöndrade föreningar. Framväxten av mikroflödes plattformar har lovat nya analytiska strategier för positionering, behandling och observation av enskilda celler. En milstolpe i mikrofluidik nåddes med integrationen av flexibla PDMS ventiler realiseras av Quake och medarbetare ^14,15. Dessa ventiler är användbara eftersom de kan isolera regioner på chip, till exempel separera två kulturer ^16. Dessutom är de särskilt gäller för enskild cell analys och därmed bidra till att minska analytspädningsproblem. Styrkan i denna metod för encelliga analys har nyligen visats av Hansen och medarbetare, som analyserade genuttryck från hundratals enskilda celler parallellt ^17.

När du riktar proteiner och metaboliter, är mycket svårt att analysera på grund av brist på lämplig amplification metoder, det stora antalet olika föreningar närvarande och deras variationer i kemisk natur. Dessutom är de flesta intracellulära biomolekyler förväntas finnas i lågt antal kopior i storleksordningen några tio tusen ^18, därav den analysmetod som används måste ha en hög känslighet. Mer kraftfulla analyser såsom immunanalyser och enzymbundna immunanalyser (ELISA) är svåra att integrera i mikrofluidanordningar eftersom de kräver flera tvättnings-och inkubationssteg liksom ytan immobilisering.

På grund av dessa utmaningar, är det inte förvånande att bara ett fåtal exempel har rapporterats där proteiner eller metaboliter kvantifierades på encelliga nivå. Till exempel har studier på utsöndringen av fluorescerande föreningar rapporterats ^19,20. Nyligen var genomförandet med ELISA presenteras för analys av utsöndrade (icke-fluorescerande) proteiner från en cellkultur (THP-1-celler) ²¹ och singel (immune) celler ^10. Targeting intracellulära proteiner, Shi et al. Utvecklade en mikrofluidanordning som underlättade identifieringen av intracellulära proteiner för analys av signalvägar i tumörceller med hjälp av en immunanalys ^11. Emellertid var endast relativa mängder av proteiner bestämdes och ingen enzymatisk amplifiering användes för att öka signalen för låg abundans proteiner.

Nyligen kunde vi kombinera en encelliga fångstmetoder mikroanordning med fluorescensanalyser ⁸ och immun ²² (Figur 1). Celler passivt fångade i mikrostorlek hindret strukturer, som möjliggör leverans och (snabb) utbyte av medium och andra kemiska medel utan någon rörelse av cellerna. Ett ringformat ventil runt varje fälla möjliggör isolering av cellen i en mycket liten volym ("mikrokammaren"). Denna ventil aktiveras omedelbart efter införandet av en cell-lyse (hypoosmolar) buffert, haniou förhindra intracellulära molekyler eller utsöndrade molekyler diffundera bort. Viktigast av allt, på grund av den ringa storleken av den volym (625 pl) stor utspädning av molekylerna undviks. Vidare, eftersom lysering och analys utförs i vid samma position i chippet, finns det ingen förlust av analyter på grund av transport. Den chip design beskrivs här omfattar 8 alternerande rader av antingen 7 eller 8 micro, totalt 60 micro. Kamrarna är påverkad i rader, så att korskontaminering längs en linje som är utesluten.

Plattformen kan användas i kombination med fluorescensanalyser såväl som immunologiska analyser (fig 1d). För det senare har vi etablerat protokoll för immobilisering av antikroppar, som är förenliga med produktion chip och monteringsprocessen. Därav plattformen öppnar för känsliga, tillförlitliga och kvantifierbara analyser på enskild cellnivå. Hittills har vi använt anordningen för analys av intracellular och utsöndrade enzymer (relativ kvantifiering av enzymatiska analyser), intracellulära kofaktorer, proteiner och små molekyler (absolut kvantifiering av endpoint analyser eller ELISA). I det följande beskriver vi processen för chiptillverkning med hjälp av flerskiktsmjuk litografi och protokollen för mönstring av antikropparna med hjälp av mikrokontakttryckning och ytkemi. Dessutom är några exempel på chips användning och drift saknas.

Protocol

1. SU-8 master Fabrication

Förbered både master formar för kanalerna (fluidic och kontroll, för scheman och mått se figur 2) med följande protokoll men med olika maskmönster. Processen visas i fig 3a.

1. Starta genom upphettning av en 4 tums kiselskiva i 10 min vid 180 ° C. Ladda uttorkad rånet på en spin-bestrykare och använd följande protokoll för spin-beläggning SU-8 2015:
   1. Spin rån vid 100 rpm i 20 sek (öppna locket på spinn-bestrykare, dosera SU-8 under detta steg, stäng locket efter dosering).
   2. Spin rån vid 500 rpm i 10 sek (detta kommer att sprida motstånd över hela skivan).
   3. Spin wafer vid 1750 rpm under 30 sek (definierar höjden hos resisten till 20 mikrometer).
2. Ta emot från kanten av skivan med aceton (använd en kompress) eftersom det annars kommer att hålla sig till plattan i nästa steg. Överför rånet att ahotplate vid 95 ° C och värme i 4 min. Efter softbake, utsätta motstå genom en fotomask tejpad sodaglas i en mask Aligner med UV-ljus (150 mJ / cm ^2, uppmätt vid 365 nm).
3. Efter exponeringen, upphetta rånet igen vid 95 ° C under 5 min på en värmeplatta. Kyl ner wafer till RT och sedan doppa den i ett bad av SU-8 utvecklare för 4 min. Skaka försiktigt för att avlägsna oexponerade SU-8. Tvätta skivan med renrumskvalitet isopropanol och blås torrt med kvävgas. Kontrollera i mikroskop om utvecklingen var lyckad (särskilt cell fällor). Om cellen fällorna är helt utvecklad, bör reflektionen av kiselskivan vara synlig. Om det är nödvändigt att utveckla wafern igen under några minuter.
4. Baka skivan i en ugn under 2 h vid 180 ° C för att avlägsna allt kvarvarande lösningsmedel. Kontrollera höjden av kanalerna med ett steg profiler. Om höjden avviker från önskad höjd, upprepa detta protokoll börjar på steg 1.1 med ett nytt rån ochändra centrifugerings hastighet (steg 1.1.3). Färdig tillverkning av master formen genom silanisering wafern med 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silan i en exsickator över natten.

2. Mästare Fabrication för Microcontact utskrift

1. För att framställa huvudformar för mikrokontakttryckning, dehydratisera en kiselskiva i 10 min vid 180 ° C. Spin-kappa 1 ml HDMS på detta rån vid 7.500 rpm i 30 sek (det motstå fäster bättre på en silaniserad yta). Spin-coat 2 ml AZ1518 positiv resist med detta protokoll:
   1. Statisk dispense av resisten på wafern.
   2. Spin wafer för 5 sekunder vid 500 rpm.
   3. Spin wafer för 60 sekunder vid 4000 varv per minut.
2. Efter en 50 sek softbake vid 100 ° C på en värmeplatta, exponera resisten för UV-ljus (21 mJ / cm ² vid 365 nm) genom en fotomask och på en mask aligner. Utveckla resisten i ett bad med AZ 726 för 75 sek. Skölj utvecklade rånet med DI-vatten och blås dry med kväve. Avlägsna återstående lösningsmedel genom upphettning av rånet vid 115 ° C under 50 sek. Silaniseras wafern under vakuum över natten.

3. Tillverkning av mikroflödessystem chip

En två-skiktsanordning design används för dessa experiment. De två skikten är framställd separat och är förbundna med varandra, innan chipet är slutligen bundet på en glasskiva (Figur 3b). Detta steg beskriver framställning av PDMS-skikt och PDMS stämpeln för mikrokontakttryckning.

1. Förbered en 10:01 blandning av PDMS och härdare. Förbered ca 80 g PDMS totalt (med hjälp av vår design, kommer detta att resultera i 10 marker). Blanda båda delarna om kraftigt och degas PDMS tills blandningen är fri från bubblor (~ 30 min).
2. Placera skivan med styrskiktet inuti en petriskål och tejpa fast på bottnen. Därefter häller ~ 50 g av PDMS på topp och sätta skivan i minst 2 h i en ugn vid 80 ° C för att säkerställa fullständighärdning av PDMS. Upprepa samma procedur för microcontact utskrift rånet, för ~ 20 g PDMS behövs.
3. Spin-coat PDMS på skivan med fluidic skiktet vid en rotationshastighet av 2000 rpm för bildning av en approximativt 40 ^ m hög PDMS-skiktet. Bota PDMS i en ugn under åtminstone en timme vid 80 ° C.
4. När båda delarna är härdade, ta bort reglerskiktet från skivan och skars i stycken med ett rakblad. Punch tryckanslutningshålen med hjälp av en 1 mm biopsi hålslag. För lagring, är det lämpligt att sätta en bit tejp över kanalerna.
5. För att förbinda de två skikten, ta den spinnbelades wafern och den övre delen och placera dem i en plasma renare ^23. Efter plasmabehandling, snabbt justera båda delarna under ett mikroskop med stort arbetsavstånd. Lägg till några extra PDMS runt de placerade bästa delarna. Detta steg är inte obligatoriskt, men det underlättar avlägsnandet av PDMS från skivan. Placera skivan i en ugn vid 80 ° C under minst en timme.
6. Använd en skalpell för att försiktigt ta bort PDMS från skivan och att klippa mikrochips. Punch åtkomsthålen för fluidic anslutningar med en 1,5 mm biopsi hålslag.
7. PDMS-chip är nu färdig och kan lagras i månader. Valfritt: Om chipet används med en reservoar, skär den övre delen av en 200 l pipett spets och använda några extra, delvis härdade PDMS att limma den på toppen. Sätt chipet i ugnen igen vid 80 ° C under minst en timme.

4. Limning till Glass Slide

För att använda enheten för direkta enzymatiska analyser, är det enda steget krävs efter limning blockering av ytor. För detta protokoll, fortsätt till A. Men för att använda mikroflödessystem chip för immunanalyser eller ELISA, se protokoll B för att begränsa de bindningsställen endast i den glasskiva (dvs. för TIRF mikroskopi eller SPR). Om denna begränsning inte är viktigt, se A, men använda biotinylerade konjugat i steg 4,3 och fortsätt med steg 4.8i protokoll B för att skapa en fullt fungerande yta.

Innan du utför protokoll A och B: Det är lämpligt att filtrera alla de använda proteinlösningar innan de förs in i chipet. Skräp och proteinaggregat kan annars blockera cell fällor och därmed minska antalet kammare som kan användas för analys. För detta ändamål använder en icke-protein adsorberande filterenhet för att filtrera alla lösningar innan de förs in i kanalerna.

Protokoll A (enzymatiska analyser)

1. För att slutföra den mikroflödessystem enhet, binda PDMS delar på en glasskiva. För att göra detta, först rengöra en glasskiva med tvål, destillerat vatten och etanol. Torka objektglaset med hjälp av en kvävgasström. Rengör PDMS del med tejp.
2. Sätt PDMS delen och den rengjorda glasskivan in i plasma renare för 45 sek vid 18 W. För att säkerställa en tät förbindning, sätta chipset på en värmeplatta (100 ° C) under 5 min.
3. Efter förbindning fylla chipet med Fluids. Ett enkelt sätt att uppnå detta är att använda centrifugalkraft. Skär den nedre delen av 200 mikroliter pipettspets. För fluidic kanaler, fylla dem med blockeringslösning (bovint serumalbumin (4% vikt / volym) eller poly-L-lysin) ympat poly-etylenglykol (0,05% vikt / volym) och placera spetsarna in i inloppen. Fyll styrlagret vikar med antingen vatten eller med en isosmotisk lösning, t.ex. PBS. Placera chip till centrifugen (800 xg) i 5 min. Kanalerna ska nu fyllas med vätska helt. Om inte, upprepa detta steg.
4. Inkubera den blockerande lösningen under minst 30 minuter vid rumstemperatur. Tvätta lösningen ut ur fluidskiktet med PBS vid en flödeshastighet av 10 ul / min med användning av en sprutpump. Anordningen är nu klar för cellförsök.

Protokoll B (immun)

För en fullständig översikt av ytan ändring från steg 4.7 och framåt, se tabell 1.

5. Icubate PDMS frimärken för microcontact utskrift med en bBSA / BSA-lösning (t ex 1-100). Efter 30 min, rengör stämplarna noggrant med destillerat vatten och torka stämpeln under en ström av kväve. Snabbt placera stämplar på en rengjord glasplatta (Figur 4).
6. Exponera glasskiva med stämpeln tillsammans med den övre delen av microfluidic chip till syreplasma under 45 sekunder vid maximal effekt (18 W) i en plasma renare. Efter plasmabehandling, ta bort stämpeln och rikta den tryckta ytan nedanför micro på enheten. Placera chip för 30 min på en värmeplatta vid 50 ° C.
7. För att blockera de återstående yta, introducera sterilfiltrerad BSA-lösning (4% (vikt / volym) i PBS) i chipet med centrifug (se steg 4.2). Inkubera i en timme och tvätta lösningen ut ur fluidskiktet med PBS (se steg 4.3). Chipet kan sedan användas direkt eller lagras i upp till 2 veckor vid 4 ° C i en fuktig låda.
8. För en fullt funktionell bindande surface, introducera avidin (0,025% (vikt / volym) i PBS) i behållaren. Använd en flödeshastighet av 5 jil / min under 30 min för att dra tillbaka den avidin lösning genom fluidkanalerna. Efteråt spolas PBS under 10 min. Skölj behållaren noggrant.
9. Efteråt, till Protein G (0,0025% (vikt / volym) i PBS) och spolning under ytterligare 30 min. Tvätta med PBS under ytterligare 10 min efteråt. Därefter tillsättes antikroppen av intresse (0,0001% (vikt / volym) i PBS) under 10 min. Efter 10 min, stoppa flödet under 15 min för att medge bindning. Nästa, tvätta med PBS under 10 min.

5. Cell Experiment

Det protokoll som är skriven i allmänna termer på grund av olika möjliga analyser. Som ett exempel de reagens som behövs för analys av G6PDH toxicitet ges. Den initiala cellinfångningskapaciteten hos anordningen är ca 2,5%, dvs 5 av 200 celler kommer att fastna. Den sista inflyttning av cell fällor är starkt beroende av använt cellinje, protokollet att avbrytacellinjen och den tid cellerna spolas genom kanalen. För celler som naturligt växer i suspension (t.ex. U937), kan enskilda celler finns i ca 75% av kamrarna efter några minuter. De andra kamrarna är antingen inte fyllda eller upptagen av två eller flera celler. I allmänhet är den encelliga beläggning mindre för adherenta cellinjer. När du använder den ganska milda suspensions protokoll presenteras här, minskar den andel till ca 30% (HEK, MLT celler). Den encelliga beläggning kan förbättras genom trypsinbehandling av cellerna, men detta kan också förändra resultaten av experimenten.

Beroende på målmolekylen, kan adsorption eller absorption till PDMS påverka resultaten. Adsorption kan reduceras genom att blockera de ytor med BSA eller PLL-g-PEG. Absorption är osannolikt för de flesta hydrofila biomolekyler, men det bör kontrolleras för (små) lipofila cellkomponenter.

1. Bered celler enligt det specifika protokollet (t.ex.
2. Fyll på celler på chipet med användning av en sprutpump och framåtflödet, istället för att dra tillbaka den cellsuspension. Använd en flödeshastighet av 5 | il / min för suspensionscellinjer och högre flödeshastigheter av 10 till 20 | il / min för adhesiva celler sedan för att minska icke-specifik vidhäftning av cellerna på kanalväggarna.
3. När fällorna är fyllda, stäng kamrarna. Om många celler vidhäftar icke-specifikt till ytan, försök att tvätta bort dem med cell dissociation buffert vid en flödeshastighet av 10 till 30 | il / min.

Protokoll A (enzymatiska analyser)

4. Uttag lysbuffert genom chipet. I detta exempel, är denna buffert en hypoosmolar buffert med tillsatt Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM KCl, 1,5 mM _MgCl2, 1% (volym / volym) Tween 20). För lysering, snabbt öppna och stänga kamrarna (dvs. 500 msek för flödeshastigheter av 10 till 50 ul / min ^7,21). För G6PDH assay, till 2 mM glukos-6-fosfat, 0,5 mM NADP, 0,5 U / ml diaforas och 0,3 mM resazurin till lysbuffert. Börja övervaka kinetiska reaktionen direkt efter lys.

OBS: Välj någon buffert som är lämplig för analysen, men kom ihåg att starka rengöringsmedel (som Triton, SDS) lyserar celler omedelbart och kommer att leda till en förlust av analyt under kammaröppningen.

Protokoll B (immun)

För en kort beskrivning av ELISA cellförsök (flödeshastigheter, kammar status, etc.), se tabell 1.

5. För ELISA, tillsätt den erfordrade detektionsreagens (t.ex. sekundär antikropp, märkt antigen) direkt till den lyseringsbuffert. Den häri sattes Tween 20 reducerar ospecifik adsorption. Lysera cellerna enligt steg 5,4. Inkubera blandningen i 10 till 15 minuter för att tillåta bindning (inkubationstid beroende på den använda antigenen och antikropp).
6. Antikropps enzymkonjugat som adsorberas ospecifikt till kanalväggarna kan leda till en omvandling av detekteringsreagens redan inne i behållaren och kanaler. För att minska problem från denna adsorption, spola en permanent hämmare av den använda detektions enzymet genom chipet under inkubationstiden (kammare stängd, innan du lägger den detektionsreagens). För HRP, använder 20 mM HCl i vatten för att permanent inaktivera ospecifikt adsorberade enzymer.
7. Efter inkubationstid införa detektionsreagenset (t.ex. Amplex Red och väteperoxid för HRP) till chipet. Öppna kamrarna inom kort igen för att tvätta nonbound sekundära antikroppen bort och lägga till detektionsreagens. Börja övervaka kinetiska reaktionen omedelbart.
8. Kalibrering: Immobiliseraantikroppen mot målet av intresse. Stäng kammare. Förbered olika koncentrationer av analyten i buffert eller i cellysat utanför chipset. Applicera en koncentration till chipet och snabbt byta volymen i kamrarna (500 msek öppningstiden). Denna öppningstiden är tillräckligt kort för att se till att ingen ytterligare ackumulering sker från analyt rodnad, och bara ett visst antal molekyler från volymen av mikrokammar upptäcks. Från den kända koncentrationen av antigenet inne i lösningen och volymen av kammaren (625 pl), beräkna mängden inuti kammaren. Därefter fortsätter du med steg 5.5 och införa detekteringsdelen.

Representative Results

Vår plattform är kunna analysera en mängd olika intracellulära samt utsöndrade molekyler i eller bildas av enstaka celler. Här vill vi presentera olika exempel studier för att understryka olika möjliga analyser. Vi ger ett exempel för ett utsöndrat enzym (figur 5a) samt ett intracellulärt enzym (figur 5b) och proteinet (fig. 5c och d). För fler exempel, som kofaktorer eller små molekyler, se Eyer et al. (2012) och Eyer et al. (2013).

Först presenterar vi en analys för ett utsöndrat enzym (figur 5a). Vid aktivering med forbolmyristatacetat (PMA), humana monocyter inducerar utsöndring av lysozym, ett enzym som inducerar bakteriell cellys. För denna analys cellbufferten innehåller 4-metylumbelliferyl β-DN, N'-diacetylchitobioside, ett svagt fluorescerande substrat för lysozYME. Vid klyvning av sockerresterna av enzymet, är fluoroforen frigöres och kan detekteras inne i kammaren. Här är fördelen med den mikrokammare med minimerad utspädning av det utsöndrade enzymet, vilket tillåter detektion av låga enzymkoncentrationer inom en kort tidsperiod. I figur 5a, finns flera exempel på kurvor som visas representerar den enzymatiska omsättning av lysozym utsöndras från enstaka stimulerade U937-celler. The U937-cellinjen härrör från en patient med histiocytiskt lymfom och kan induceras att terminal monocytisk differentiering. Den cellinje producerar TNF, lysozym och β2-mikroglobulin efter stimulering med PMA. Ingen omsättning är detekterbar i öppna kammare eller cellfria kammare (streckad linje).

Figur 5b visar den relativa kvantifieringen av ett intracellulärt enzym, här glukos 6-fosfatdehydrogenas (G6PDH). G6PDH är en hushållning protein och celler från samma vävnad ursprung bör inte varierar kraftigt i sin G6PDH koncentration ^24. Här ades U937-celler infångas i kammaren, och vi har levererat en fluorescensanalys för detekteringen av G6PDH tillsammans med lysbuffert. Den består av glukos-6-fosfat, NADPH, enzymet diaforas och substratet resazurin, som omvandlas till fluorescerande resorufin när G6PDH är närvarande. Ökningstakten i fluorescens över tiden motsvarar mängden G6PDH. Mikroprocessorn underlättar ytterligare studier om effekten av toxiska föreningar, t.ex. genom inkubation av cellerna med ett toxin (här kamptotecin) under en definierad tid (60 min). Efter denna behandling var det frisatta enzymet spolas bort och cellerna lyserades, och nivån av G6PDH mättes. I själva verket en betydande förlust av intracellulära enzymet innehållet var synligt på grund av en långsammare ökning av fluorescens (röda linjer och kolumner i fig. 5b). Detaljer av denna studie återfinns i Eyer et al. ^Åtta

e_content "> Dessutom visar vi resultaten från en immunanalys för analys av intracellulära GFP belopp. För inducerat uttryck, HEK293 celler där transfekterade med T-Rex expressionssystem. I detta system, GFP uttryck kan induceras genom tillsats av tetracyklin . Efter 8 h av inkuberingen suspenderades cellerna, spolas upp på chip, har fångats och därefter lyseras. Fånga anti-GFP-antikroppar immobiliserades på glasytan enligt det protokoll som presenteras här för att binda den frigjorda GFP från cellen Figur 5c. visar bindningen kinetiken för GFP till antikroppen. I detta exempel kan GFP mätas direkt genom total inre fluorescensmikroskopi på grund av fluorescens hos proteinet. Vi vill understryka att icke-fluorescerande proteinerna kan också detekteras genom användning av en sandwich-ELISA eller liknande format. För detta kan de nödvändiga analyskomponenterna kan införas efter tvättsteg. Fördelen med ELISA är signalförstärkning på grundtill enzymet, vilket ger en fluorescerande produkt som ackumuleras inuti mikrokammaren.

Till sist vill vi presentera en encelliga sandwich-ELISA med GAPDH som målprotein. Vi bestämde GAPDH i U937 suspensionsceller liksom adherenta HEK293-celler (fig. 5d). För detta immobiliserade vi anti-GAPDH antikropp (infångande antikropp). Efter cell-lys, den andra enzymmärkta antikroppen (detektionsantikropp) introduceras. Kamrarna öppnades och på grund av flödet, var obundna antikroppar upptäckt tvättas bort och Amplex Red introducerades till kammaren. Omvandlingen av Amplex Red till fluorescerande resorufin genom HRP (detektionsantikropp) övervakades över tid i alla 60 microchambers samtidigt. Lutningen från den linjära delen av reaktionen bestämdes. Denna lutning är direkt korrelerad till koncentrationen av enzymet och följaktligen, till koncentrationen av analyten. Resultaten från enstaka U937-celler visade en genomsnittlig GAPDHmängd av 2,6 attomol, med minimala och maximala värden av 2,0 och 3,2 attomol, respektive. Analysen av 46 HEK celler uppgifter framgick att de celler som finns i genomsnitt 2,5 attomol GAPDH (minimal 0,9 attomol, maximalt 4,1 attomol).

Figur 1. Den mikroanordning och scheman för de olika analyserna presenteras. A) Den monterade mikroanordning. Här är kamrarna fyllda med fluorescein för visualisering (grön fluorescens). Också synlig är reservoaren, anslutningarna för styrlagret (tryck, 2x4 anslutningar i ryggen vänster och höger fram) och anslutningen till sprutpumpen (fram). B) Zooma in i mikrokammarområdet. Många av dessa kammare kan ordnas i en array. För visualisering, var apelsin mat färgämne isolerade inuti kamrarna, medan grön mat färgämne spolas genom kanalerna. Tryckregleringsskiktet är fylld med vatten. C) Zoom på en enda mikrokammare. D) Schematisk bild av enhetens funktion. Inom en mikrokammare (från sidan), är en enda cell instängd och isolerad. Cellen kan stimuleras, inkuberas, tvättas och slutligen lyseras i chipet. Det cellulära innehållet kan analyseras direkt med analyser för enzymer eller koenzymer där en fluorescerande del alstras vid reaktion (vänster). För andra proteiner kan ytan modifieras med antikroppar som specifikt binder till målproteinet (höger). Eftersom antigenet är bundet till ytan, kan lysatet tvättas bort och upptäckt molekyler som sekundära antikroppar kan tillsättas för att kvantifiera målprotein. Klicka här för att visa en större bild .

e 2 "fo: innehåll-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50618/50618fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figur 2. Schematisk bild av kanalsystemen och dimensioner mikrokammaren. A) Mask utformning av fluidic lagret. Fluidskiktet består av (från vänster till höger) ett utlopp, varvid kammaren region, en filter för att hålla kvar partiklar och cellkluster och ett inlopp. A 4 i wafer kan hamnen strukturerna för produktion av 10 chips. B) Mask utformningen av motsvarande styrlagret. På grund av att det behövs utrymme för anpassning, en 4 i wafer innehåller strukturer för produktion av fem marker. C) Schematisk bild av linje lager (till vänster) och utvidgningen visar en cellfälla (höger), båda med längdskalor. Klicka här för att se större bild .

Figur 3. Schematisk av SU-8 bearbetning och PDMS produktion. A) Schematisk av SU-8 bearbetningsprotokoll. En kiselskiva är spinnbelades med SU-8 och mjuk-bakades vid 95 ° C under 4 min. Den önskade mikroflödeskanaldesignen överförs till SU-8 med användning av en fotomask och UV-ljusexponering. Efter en efterexponerings baka (95 ° C, 5 min) är SU-8 utvecklas och hårdhärdades vid 180 ° C under 2 timmar. B) Schematisk ritning av microfluidic chip tillverkning. En blandning av PDMS-oligomeren och härdningsmedlet är spinnbelades på huvudformuläret för de fluidiska kanaler, och hälldes på masterform för kontrollskiktet. Kanal negativ avbildas i rosa. Båda skikten härdas i en ugn. Styrskiktet chipsdel ​​nedmonteras från skivan (styrkanalen i blått) och hål för tryckanslutningarna stansas (vit). Båda delar-kontroll ochvätskeskikt-placeras i syreplasma, och efteråt, de är i linje och bundna. Hela chipet är sedan isär från fluidic huvudform (vätskekanal i rött) och fluidåtkomst hål stansas (vit). Slutligen chip och en glasskiva bunden efter ytan aktivering i syrgasplasma. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. Schematisk av microcontact utskrift. A) mastertillverkning för mjuk litografi. (1) En PDMS-stämpel inkuberas med proteinet (bBSA)-lösning. (2) Lösningen avlägsnas stämpeln tvättas och ett monoskikt av proteinet förblir på stämpeln. (3) Stämpeln placeras på ett objektglas, varigenom proteinerna överförs till glas sur ansikte. Under denna tid har mikrochipset ihop med en stämpel på glaset exponeras för ett syreplasma. (4) Stämpeln avlägsnades och mikrochip är bunden till ett objektglas. För visualisering, är två exempel på strukturer som visas, tryckt med fluorescerande BSA-fluoresceinkonjugat. B) Microcontact tryckyta per kammare. Eftersom utskrift och kammare inte är i linje, vi utvärderade variationerna på bindande fläckar (tryckt område) på tre olika marker (nummer 1-3) och alla 60 micro. Som ett resultat, är kammar-till-kammar variationen relativt liten (<2,5%) och chip-to-chip variabiliteten var försumbar (<1%), vilket visar att det verkligen finns något behov av att anpassa de tryckta konstruktioner till kamrarna. Klicka här för att visa en större bild .

18/50618fig5.jpg "width =" 500px "/>
Figur 5. Resultat från G6PDH, lysozym, GFP och GAPDH analyser. Representativa resultat. A) Enzymutsöndring från enstaka celler. Vänster: schema över analysen för ett utsöndrat enzym, här lysozym. Lysozym utsöndras av enkel-, PMA-aktiverade U937-celler och ackumuleras inne i slutna micro, där det katalyserar produktionen av fluorescerande 4-metylumbelliferon. Höger: Data som erhållits från en sekre experiment. De gröna kurvorna visar fluorescensintensiteten över tiden för kammare upptas av en cell, visas också en kammare utan celler (svart, streckad linje) för jämförelse. B) Upptäckt av intracellulära enzymer i enskilda celler. Vänster: Schematisk bild av analysen för den intracellulära enzymet G6PDH. Vid cell-lys, är intracellulär G6PDH släpps in i kammaren, där de övriga komponenterna för en enzymatisk reaktion kaskad är närvarande. Höger: Exempel kurvor och representativa uppgifter. Single U937celler analyserades för deras enzymhalt (svart). Vid den toxiska inverkan av kamptotecin, som permeabilizes membranet, var två tredjedelar av enzymet förlorat (orange). C) Immunanalys av intracellulära proteiner av enstaka celler. Vänster: Schematisk bild av en immunanalys, för det intracellulära proteinet GFP här. Anti-GFP-antikroppar immobiliserades på ytan enligt protokoll som beskrivs häri. Celler lyserades sedan på chipet och bindningspunkterna övervakades över tiden med användning av TIRF mikroskopi. Höger: Diagram från ett sådant experiment som visar de bindande kinetik för GFP till de immobiliserade antikropparna. Tidpunkt 1 markerar införandet av lyseringsbuffert. Vid tidpunkt 2, är GFP börjar ansamlas på ytan, vilket innebär att cell lys har skett. Bindning av GFP till antikropparna är fullbordad vid tidpunkt 3. D) Sandwich-ELISA av intracellulära proteiner av enstaka celler. Vänster: Schematisk bild av en sandwich-ELISA, här i den intracellulära protein GADPH. Anti-GAPDH-antikroppar immobiliserades på ytan enligt protokoll som beskrivs häri. Celler lyserades sedan på chipet och inkuberas. Frisatt GPADH bunden till antikroppen, var kammaren tvättas och detektionsantikroppen (HRP-kopplad) infördes. I ett sista steg till nonbound detektionsantikropp tvättades bort, detektionsreagenset infördes och reaktionen övervakades med tiden. Höger:. Kvantifiering av GAPDH inne U937 och HEK293 celler Klicka här för att visa en större bild .

Ytmodifiering protokoll för ELISA

Steg		Tid	Koncentration	Flödeshastighet	Flödesfria inkubationstid	Avdelningen öppen / stängd
		[Min]	(Vikt / volym)%	[J, l / min]	[Min]		</ Td>
BSA		30	4	-		Öppet
PBS		10		5		Öppet
Avidin		30	0,025	5		Öppet
PBS		10		5		Öppet
Protein G, biotin		30	0,0025	5		Öppet
PBS		10		5		Öppet
Antikropp		20	0,0001	5	15	Öppet
PBS		10	5		Öppet
Celler (300000 celler / ml)		~ 5		30		Stäng när fällorna är upptagna.
Lysbuffert		5		30		Öppna kort
Hämmare (t.ex. 20 mM HCl)		15		10		Stängt
PBS		2		30		Stängt
Detektionsreagens		5		30		Öppna kort
Börja övervaka reaktion

Tabell 1. Surface modification protokoll för ELISA. För förklaring, se text.

Discussion

Mikrofluidik teknik har öppnat nya och spännande möjligheter för encelliga analys. Framför allt har möjlighet att fånga och immobilisera celler individuellt av mikroflödes verktyg tillåts systematiska kort och långtidsstudier på fastigheter encelliga och svar. Dessutom inkapsling av celler i höga mikrodroppar frekvens, som genereras på ett mikrochip, har möjliggjort enstaka cell sekre studier som inte kan utföras med konventionella cytometry enheter. Den mikrodroppe tillvägagångssätt har emellertid vissa begränsningar när inkubations-och tvättsteg erfordras för den analytiska protokoll. Vårt tillvägagångssätt kombinerar båda begreppen cell fånga och isolering och därför underlättar det att utföra mer komplexa tester inkluderande immun baserade på yt-immobiliserade antikroppar. Dessutom är metoden mycket flexibel med avseende på tillämpning och målanalyter.

Utformningen av mikrochipet möjliggör (i) effektiligt cell fångstmetoder, (ii) leverans av olika buffertar och reagenser, och (iii) tillförlitlig isolering i en mycket liten volym när det behövs. På detta sätt kan den utspädning av målmolekylerna undviks. Sextio (till hundratals) microchambers är placerade på en enda anordning som medger många experiment parallellt. De runda formade ventiler som stängs av micro kan behandlas tillsammans eller var för sig av rader eller kolumner, vilket är viktigt när korskontaminering till intilliggande kammare bör förhindras. Med de microchambers stängd kan kanalerna behandlas med skadliga lösningar såsom saltsyra för rengöringsändamål, utan att påverka de infångade cellerna. Å andra sidan är det möjligt att snabbt utbyte av volymen inne i mikrokammaren. För närvarande krävs det en minimal tid av 200 ms för att helt öppna kammaren och att införa nya reagens (för fullständigt utbyte av mikrokammarvolymen, har flödeshastigheten som skall beaktas).

Även om vår metod är mycket reliable och reproducerbar, bör man ha i åtanke att det finns två huvudsakliga kritiska punkter i protokollet av chip tillverkning och drift. För det första har bindning av två chip lagren efter plasma aktivering göras snabbt. Anpassningen är kritisk, annars några kamrar eller till och med hela chipet är inte användbar, eftersom bindningen är irreversibel. Detta steg kan vara svårt för oerfarna användare, men efter lite träning även mindre erfarna laboratoriearbetare får oftast bra resultat. Den andra kritiska punkten är den renhet vid montering och användning av mikrochipet. Om dammpartiklar är närvarande på ytan av chipet, de kan äventyra styrkanaler och ventiler, eller till och med leda till en brytning av PDMS-PDMS eller PDMS-glasbindningen. Vi tillbringar därför en hel del uppmärksamhet på städrutiner. Det bör noteras att det utöver befälhavaren formen tillverkning (utförs i ett rent rum), vi producerar och använder mikrochips i en normal laboratoriemiljö, där damm and partiklar är närvarande.

Trots all den omsorg, om kamrarna inte stänger på rätt sätt, kan det vara så att antingen tryckledningar är blockerade eller spinnbeläggningsprocessen inte ger rätt membrantjockleken. Också, från tid till tid som vi observerade otillräcklig bindning, vilket resulterar i brott på bindningen mellan de två PDMS lagren. Om många marker från samma sats visar detta problem, är det möjligt att tiden mellan plasma aktivering och anpassning är för lång. Ibland upplevde vi klibbiga PDMS på kiselskivor som inte kunde ordentligt bort och var en följd av otillräcklig silanisering av skivan.

När produktionsmetoden är etablerad kan den microfluidic plattform kan användas för många olika studier på singelcellnivå. Här visade vi upptäckt av intracellulära och utsöndrade medel med olika analyser, men många andra analyser är möjliga på chipet. De flesta proteiner inte är fluorescerande och deras deskydd via immunanalyser är inte okomplicerat. Genomförande av ELISA i chipet kommer att medföra många fördelar. För det första kan analysen konstrueras mycket specifikt för det önskade proteinet (när lämpliga antikroppar är närvarande). För det andra kan information från ELISA kvantifieras även vid gränser låg koncentration, som ger det antal protein eller molekyl kopior som föreligger i cellen.

Vår nuvarande chip är utformad för analys av enstaka mammalieceller. Emellertid modifiering av chipset för andra celler, såsom bakterier, alger och jäst, bör vara möjliga. Hittills är den enda begränsningen för experiment behovet av en analys baserad på fluorescens. Men vi studerar för närvarande genomförandet av masspektrometri som en detektionsteknik. När detta är etablerat, kommer utbudet av analytiska problem som kan undersökas med plattformen vara ännu bredare. Vidare, eftersom inte varje analys är möjlig i närvaro av cellys buffertar, vinärvarande utvärderar även olika andra lys tekniker på plattformen. Vi är säkra på att den mångsidiga mikroflödes plattformen presenteras här utgör grunden för nya encelliga studier proteomet, metabolomen och secretome nivå.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS:
Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)	n.a.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane	ABCR (Karlsruhe, Germany)	AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate	Sigma Aldrich	M9763
Acetone	Merck VWR (Darmstadt, Germany)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)	n.a.
AZ 726 developer	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)	n.a.
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A-4503
Bovine serum albumin, biotin	Sigma Aldrich	A-8549
Cell dissociation buffer	Invitrogen	13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Hydrochloric acid	Fluka	84422
Isopropanol	Merck VWR (Darmstadt, Germany)	109634
Magnesium chloride hexahydrate	Fluka	63068
MR developer 600	Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)	n.a.
PBS	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG grafted	SuSoS, (Dübendorf, Switzerland)	n.a.
PLL-g-PEG grafted biotin	SuSoS, (Dübendorf, Switzerland)	n.a.
Potassium chloride	Fluka	60132
Protein G, biotin	Sigma Fine Chemicals	41624
Silicon wafer	Si-Mat (Kaufering, Germany)	n.a.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Biorad	1610716
Tween 20	Biorad	1706531
EQUIPMENT:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
0.22 µm PES syringe filter	TRP	99722
1/1.5 mm biopsy puncher	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm	Partec	04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.
Hotplate HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Switzerland	n.a.
MA-6 mask aligner	Karl Suess	n.a.
Multizoom AZ100M microscope	Nikon Corporation	n.a.
Photomask	Microlitho, Essex, U.K.	n.a
Plasma Cleaner PDC-32G	Harrick	n.a.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.
Spin Modules SM 180 BM	Sawatec, Sax, Switzerland	n.a.
Step profiler Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.
Syringe pump neMESYS	Cetoni	n.a.