Summary
Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.
Abstract
Biz, paralel çok sayıda tek hücre içi biyomoleküllerin nicel tespitine olanak sağlayan bir mikroakışkan cihaz sunmaktır. Bu amaç için, hücreler, pasif bir microchamber ortasında tutulur. Kontrol katmanı aktivasyonu üzerine, hücre küçük bir oda içinde çevreleyen hacim izole edilir. Çevredeki hacmi daha sonra izole edilmiş hücre etkilemeden değiştirilebilir. Bununla birlikte, haznenin kısa açma ve kapama sırasında, odacık içindeki çözelti birkaç yüz milisaniye içinde değiştirilebilir. Nedeniyle odaların düzelmesi için, hücreler, inkübasyon, yıkama, ve son olarak, hücre erimesi için, örneğin, bir çok kontrol edilebilir bir şekilde farklı çözüm sırayla maruz edilebilir. Sıkıca kapatılmış microchambers, lizat tutulmasını sağlayacak en aza indirmek ve hücre lizi sonrasında seyreltme kontrol eder. Parçalama ve analiz aynı yerde meydana geldiği, yüksek hassasiyet muhafaza edilir, çünkü başka bir danalitlerin ilution veya zarar taşıma sırasında ortaya çıkar. Microchamber tasarım, bu nedenle tek tek hücrelerden salınan hücre içi moleküller (attomoles, zeptomoles) çok küçük kopya numaralarının, güvenilir ve tekrarlanabilir bir analiz sağlar. Ayrıca, birçok microchambers uygun optik aletler izlenmesi için kullanılan göz önüne alındığında, aynı anda bir çok hücre analizini sağlayan bir dizi biçimde düzenlenebilir. Biz zaten hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörlerin ve göreli veya mutlak ölçülebilir şekilde ikinci haberciler analiz etmek proof-of-concept çalışmaları için bir platform kullandık.
Introduction
Geçmişte birçok çalışmalar, hücre-hücre geniş bir hücre popülasyonu içinde 1-3 farklılıklar, özellikle sinyal 4 işler ya da bu tür proteinler 5,6, metabolitleri ve kofaktörler gibi hücre içi 7,8 biyomoleküllerin miktarlarını ortaya koymuştur. Bu heterojenliklerdir hücre uyumu ve evrimi 9 için temelde önemli olabilir, ama aynı zamanda kanser 10-13 gibi hastalıkların ortaya çıkması ve tedavisinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Bu yüzden, tek hücre düzeyinde çalışmalar, bu çalışmalar, biyolojik olarak aktif kimyasal maddeler ile muamele edildikten sonra, farklı hücresi tepkilerini ortaya çıkarmak, özellikle biyolojik ve farmakolojik araştırmalar yüksek ilgi çekmektedir.
Son yıllarda, çok sayıda analitik platformlar tek bir canlı hücrelerin analizi ya da hücre içeriği kimyasal kompozisyona geliştirilmiştir. Floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) altın st ikenandard tek bir canlı hücre çok yüksek verimli analizi için, yöntem, hücre içi veya salgılandığı bileşiklerin miktar tayini için kullanılabilir olamaz. Mikroakışkan platformların ortaya çıkması konumlandırma, tedavi ve tek hücre gözlem için yeni analitik stratejiler söz verdi. Mikroakiskan bir dönüm noktası Quake ve arkadaşları 14,15 tarafından gerçekleştirilen esnek PDMS vanaların entegrasyonu ile ulaşıldı. Onlar yonga üzerinde bölgeleri izole çünkü bu vanalar yararlıdır, örneğin iki kültürü 16 ayrı. Dahası, tek bir hücre analizi için özellikle uygun olan ve bu nedenle de bir analit sulandırma sorunlarını azaltmak için yardımcı olur. Tek hücre analizi için bu yaklaşımın gücü son Hansen ve 17 paralel olarak tek bir hücre yüzlerce gen ekspresyonunu analiz arkadaşları tarafından gösterilmiştir.
Proteinler ve metabolitleri hedeflerken, analiz nedeniyle uygun olmaması için çok zordurmplification yöntemleri, farklı buluşa ait bileşiklerin, kimyasal yapıları ve bunların varyasyonlarının çok sayıda. Ayrıca, çoğu hücre içi biyomoleküller birkaç on bin 18 sırasına göre, düşük kopya sayısında mevcut olması beklenmektedir, bu yüzden, kullanılan analitik yöntem, yüksek bir hassasiyete sahip olmalıdır. Bu tür bağışıklık ve enzim-bağlantılı bağışıklık denemeler (ELISA) gibi daha güçlü deneyleri da birkaç yıkama ve inkübasyon aşaması hem de yüzey immobilizasyon gerektiğinden mikroakışkan cihazlara entegre zordur.
Yaşanan bu zorluklar nedeniyle, bu proteinler ya da metabolitleri tek hücre düzeyinde üzerinde rakama dökülmüştür burada sadece birkaç örnek rapor edilmiş olması şaşırtıcı değildir. Örneğin, floresan bileşikleri salgılaması üzerindeki çalışmalar 19,20 bildirilmiştir. Son zamanlarda, ELISA ile uygulama, bir hücre kültüründen salgılanan (nonfluorescent) protein (THP-1 hücreleri) 21 ve bir (i analizi için sunulmuşturmmune) hücreler 10. Hücre içi proteinleri hedefleyen, Shi et al. Bir bağışıklık 11 vasıtasıyla tümör hücrelerinde sinyal yollarının analizi için hücre içi proteinlerin tanımlanmasını kolaylaştırılmış bir mikroakışkan cihaz geliştirmiştir. Bununla birlikte, proteinlerin, sadece nispi miktarları tespit edilmiştir ve herhangi bir enzimatik amplifikasyon düşük bolluk proteinleri için sinyali geliştirmek için kullanıldı.
Son zamanlarda, floresan deneyleri 8 ve bağışıklık 22 ile tek-hücre yakalama mikrocihazda (Şekil 1) birleştirmek mümkün. Hücreler pasif arz ve hücrelerin herhangi bir hareketi olmadan orta ve diğer kimyasal maddelerin (hızlı) değişimine izin mikroölçülerdeki engel yapılarda, içinde sıkışıp kalırlar. Her bir tuzak etrafında halka şeklinde bir kapak, çok küçük bir hacme ("microchamber") olarak hücre izolasyonunu sağlar. Bu valf hemen o, bir hücre-yokedici (hypoosmolar) tampon tanıttıktan sonra çalıştırılırnce uzaklaşacak şekilde yayılan moleküllerin hücre içi ya da salgılanan moleküller önler. En önemli olarak, hacim (625 ul) içinde küçük boyutu, moleküllerin büyük bir seyreltme önlenir. Parçalama ve analiz çip aynı pozisyonda yapılmaktadır Bundan başka, taşıma nedeniyle analitlerin kaybı yoktur. Burada açıklanan çip tasarımı 60 microchambers toplam 7 veya 8 ya microchambers 8 alternatif satır içerir. Bir hat boyunca çapraz kontaminasyon engellenir, böylece odalar, sıralar halinde kumanda edilir.
Platform floresan denemelerinde hem de immünolojik tayinler (Şekil 1d) ile kombinasyon halinde de kullanılabilir. Ikincisi için, çip, üretim ve montaj işlemi ile uyumlu olan antikorların, hareketsiz hale getirmek için protokoller kurulmuştur. Dolayısıyla platformu tek hücre düzeyinde, hassas, güvenilir ve ölçülebilir deneyleri için yolu açar. Şimdiye kadar, i analizi için cihaz kullanmıştırntracellular ve salgılanan enzimler (enzim deneyleri ile görece nicel), hücre içi kofaktörler, proteinler ve küçük moleküller (nokta tahlilleri ya da ELISA ile kesin miktar). Aşağıda, microcontact baskı ve yüzey kimyası vasıtası ile çok katmanlı yumuşak litografi ve antikor modelleme için protokol vasıtasıyla çip imalat sürecini tarif eder. Ayrıca, yonga kullanımı ve operasyonların bazı örnekler verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. SU-8 Asil Fabrikasyon
Aşağıdaki protokole ancak farklı maske desenler ile (şema ve boyutlar Şekil 2 için, akışkan ve kontrol) kanalları için her iki ana kalıp hazırlayın. Bu süreç Şekil 3a'da gösterilmektedir.
- 180 ° C'de 10 dakika boyunca 4 inç silikon gofret ısıtılarak Başlangıç Bir spin-lak susuz gofret yükleyin ve spin kaplama SU-8 2015 için aşağıdaki protokol kullanın:
- (Dağıtma sonra bu adım, yakın kapak sırasında SU-8 dağıtmak, spin-lak açık kapak) 20 sn boyunca 100 rpm'de gofret Spin.
- 10 saniye boyunca 500 rpm'de Spin gofret (bu bütün gofret üzerinde karşı yayar.)
- 30 saniye boyunca 1,750 rpm'de Spin gofret (20 um karşı yüksekliğini tanımlar).
- Bu aksi takdirde bir sonraki adımda sıcak plaka sopa gibi, aseton (bir bez kullanın) gofretin kenarından karşı çıkarın. Ah gofret aktarın4 dakika boyunca 95 ° C sıcaklıkta otplate. Softbake sonra, (365 nm'de ölçülen 150 mJ / cm 2) UV ışığı ile bir maske hizalayıcısı cam Sodalime bantlanmış bir photomask yoluyla direnmeyi ortaya.
- Maruz kaldıktan sonra, bir sıcak plaka üzerinde 5 dakika boyunca 95 ° C'de yeniden gofret ısı. RT'ye gofret soğutun ve daha sonra 4 dakika süreyle SU-8 geliştirici bir banyo içine batırmayın. Kalmayan SU-8 çıkarmak için hafifçe sallayın. Temiz oda dereceli izopropanolle gofret yıkayın ve azot ile kuru darbe. Gelişme (özellikle hücre tuzaklar) başarılı olursa bir mikroskop altında kontrol edin. Hücre tuzakları tamamen geliştirilirse, silikon gofret yansıması görünür olmalıdır. Eğer gerekirse, birkaç dakika boyunca tekrar gofret gelişir.
- Tüm çözgen kalıntılarını uzaklaştırmak için 180 ° C'de 2 saat boyunca bir fırın içinde pişirmeye gofret. Bir basamak Profiler ile kanal yüksekliğini kontrol edin. Yüksekliği istenilen yüksekliğe farklıysa, bu protokol yeni bir gofret ile adım 1.1 'de başlayan ve tekrarspin-hızı (adım 1.1.3) değiştirebilirsiniz. 1H, 1H, 2H, gece boyunca bir kurutucu içinde 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silan ile gofret Silanizing ile ana kalıbın imalat tamamlayın.
2. Microcontact Baskı Master İmalatı
- Microcontact baskı için ana kalıp hazırlamak için, 180 ° C'de 10 dakika boyunca bir silikon gofret dihidrat (Karşı Silanlanmış yüzeye daha iyi yapışır) 30 saniye boyunca 7,500 rpm'de bu gofret üzerine 1 ml HDMS-kapladıkları Spin. AZ1518 spin-kat 2 ml pozitif bu protokol ile karşı:
- Statik Dağıtım gofret direnmek.
- 500 rpm'de 5 saniye için gofret Spin.
- 4000 rpm'de 60 saniye boyunca gofret Spin.
- Bir ocak üzerinde 100 ° C'de 50 saniye softbake sonra, maruz bir photomask boyunca ve bir maske hizalayıcısı UV ışık (365 nm 21 mJ / cm 2) için direnmek. 75 saniye için AZ 726 bir banyosuna karşı geliştirin. DI-su ve darbe d ile geliştirilen gofret durulayınazot ile ry. 50 saniye boyunca 115 ° C de ısıtmak suretiyle gofret, kalan solventin çıkması. Gece boyunca, vakum altında gofret Silanize.
3. Mikroakışkan Chip Fabrikasyon
İki katman cihazın tasarımı, bu deneyler için kullanılır. Çip son olarak bir cam slayt (Şekil 3b) üzerine bağlandığı önceki iki kat, ayrı ayrı hazırlanır ve birbirine bağlanır. Bu adım, PDMS tabakaların üretim ve microcontact baskı için PDMS damga açıklar.
- 10:1 'lik bir PDMS karışımı ve bir sertleştirme ajanı hazırlayın. Toplam yaklaşık 80 gr PDMS hazırlayın (bizim tasarımlar kullanılarak, bu 10 cips neden olacaktır). Karışım ücretsiz bubble (~ 30 dk) kadar şiddetle ve hem degas parçaları PDMS karıştırın.
- Alt üzerine bir Petri kabı ve bantla bunu iç kontrol katmanı ile gofret yerleştirin. Daha sonra, üstte PDMS ~ 50 g dökün ve tam sağlamak için 80 ° C'de bir fırın içinde en az 2 saat boyunca gofretin koymakPDMS kür. ~ 20 g PDMS gereklidir bunun için, microcontact baskı gofret için aynı işlemi tekrarlayın.
- Spin-kat gofret PDMS 2000 rpm'lik bir dönme hızında akışkan tabakası ile yaklaşık 40 mikron yüksek PDMS bir tabaka oluşturmak için. 80 ° C'de en az 1 saat boyunca bir fırın içinde PDMS Cure
- Iki parça tedavi zaman, gofret, kontrol tabakası kaldırmak ve bir tıraş bıçağı ile parçalar halinde kesilir. 1 mm biyopsi zımba kullanılarak basınç bağlantısı delikler. Depolama için, bu kanal üzerinden bir bant parçası koymak için tavsiye edilir.
- Iki kat bağ için, spin-kaplı gofret ve üst kısmı almak ve bir plazma temizleyici 23 yerleştirin. Plazma muameleden sonra, hızlı bir şekilde büyük bir çalışma mesafesi bir mikroskop altında her iki parça hizalayın. Yerleştirilen üst parçaların etrafında bazı yedek PDMS ekleyin. Bu adım, ancak bu gofret PDMS kaldırılmasını kolaylaştırır, zorunlu değildir. En az 1 saat boyunca 80 ° C'de bir fırın içinde gofretin yerleştirin.
- Dikkatli gofret PDMS kaldırmak ve mikroçip kesmek için bir neşter kullanın. 1.5 mm biyopsi zımba ile akışkan bağlantıları için erişim delikler.
- PDMS çip şimdi bitti ve ay boyunca saklanabilir. İsteğe bağlı: çip bir rezervuar ile kullanılırsa, 200 ul pipet üst kısmını kesip üstüne yapıştırmak için bazı yedek, yarı işlenmiş PDMS kullanabilirsiniz. En az 1 saat boyunca 80 ° C'de yeniden fırında çipi koyun.
4. Cam Slide Bonding
Direkt enzimatik tahliller için cihazı kullanmak için, yapıştırma sonra gerekli tek adım yüzeylerin engelleme olduğunu. Bu protokol için, immünodeneyler veya ELISA'lan için mikroakışkan çipi kullanmak Ancak, A. geçin, sadece (yani TIRF mikroskopi veya SPR'nin için) cam slayt bağlanma sitelerini sınırlandırmak için protokol B başvurun. Bu kısıtlama önemli değilse, A'ya bakınız, ancak adım 4.3 biotinli konjugatlarını kullanın ve adım 4.8 ile devam edinProtokol B tamamen işlevsel bir yüzey oluşturmak için.
Önceki protokol A ve B gerçekleştirmeden: Bu önce çipin içine tanıtmak için kullanılan protein tüm çözümleri filtre tavsiye edilir. Moloz ve protein agregatları, aksi böylece analiz için kullanılabilir bölmelerin sayısını azaltarak, hücre tuzakları engelleyebilir. Bu amaç için, kanalların içine verilmeden önce bütün çözümler filtre protein olmayan adsorbe edici bir filtre birimi kullanır.
Protokol A (enzim tahlilleri)
- Mikroakışkan cihaz sonuçlandırmak için, bir cam slayt üzerine PDMS parçaları bağ. Bunu yapmak için, önce sabun, damıtılmış su ve etanol ile bir cam slayt temizleyin. , Bir nitrojen akışı kullanılarak slayt kurutun. Seloteyple PDMS kısmını temizleyin.
- Sıkı bir bağ temin etmek için 18 W da 45 saniye boyunca plazma temizleyici içine PDMS bölümü ve temizlenmiş cam slayt bir ifadeyle, 5 dakika boyunca bir sıcak levha (100 ° C) üzerindeki çip koydu.
- Bağlamadan sonra, f çip doldurunLUIDs. Bunu başarmak kolay bir yolu merkezkaç kuvvet kullanmaktır. 200 ul pipet ucunun alt kısmı kesilir. Akışkan kanal için, bloklama çözeltisi ile doldurun (sığır serum albümini (% 4 a / h) ya da poli-L-lizin) aşılanmış polietilen glikol (0.05% w / v) ve girişleri içine ipuçları yerleştirin. Su ile veya bir isosmotic çözelti, örneğin, PBS ile kontrol katmanı girişleri doldurun. 5 dakika boyunca santrifüj (800 x g) içine çip yerleştirin. Kanallar artık tamamen sıvı ile dolu olmalıdır. Eğer değilse, bu adımı tekrarlayın.
- , Oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca bloke çözeltisi inkübe edin. Bir şırınga pompası kullanılarak 10 ul / dk 'lık bir akış hızında PBS ile sıvı tabakanın dışarı çözeltisi yıkayın. Cihaz artık cep deneyler için hazır.
Protokol B (bağışıklık)
Itibaren aşama 4,7 yüzey modifikasyonu tam bir genel bakış için, Tablo 1'e bakınız.
- IçindeBir bBSA / BSA çözeltisi (örneğin 1-100) ile microcontact baskı için cubate PDMS pulları. 30 dakika sonra damıtılmış su ile iyice pulları temizlemek ve bir nitrojen akışı altında pul kurutun. Hızlı bir şekilde temizlenmiş cam slayt (Şekil 4) damgaları yerleştirin.
- Birlikte, bir plazma temizleme maksimum güç (W 18) 45 saniye boyunca oksijen plazma mikroakışkan çip üst kısmı ile damga ile cam slayt Açığa. Plazma tedaviden sonra, damga kaldırmak ve cihazın microchambers altında yazdırılan yüzeye hizalamak. 50 ° C 'de sıcak bir plaka üzerinde 30 dakika boyunca çip yerleştirin
- Geri kalan yüzeyi engellemek için, santrifüj ile yonga içine steril olarak filtre edilmiş BSA çözeltisi (% 4 (w / v) PBS içinde) (adım 4.2) tanıtmak. 1 saat boyunca inkübe edilir ve PBS ile akışkan tabaka (adım 4.3) üzerinden çözeltisi yıkayın. Çip, daha sonra bir nemli kutu içinde 4 ° C'de doğrudan kullanılabilir ya da 2 haftaya kadar saklanabilir.
- Tamamen işlevsel bir bağlanma için Surface, rezervuar, streptavidin (0.025% (w / v) PBS içinde) sunar. Akışkan kanallardan avidin çözeltisi çekilme 30 dakika boyunca 5 ul / dk 'lık bir akış hızı kullanarak. Daha sonra, 10 dakika boyunca PBS yıkayın. Iyice rezervuar durulayın.
- Daha sonra, Protein G (% 0.0025 (w / v) PBS içinde) ve diğer bir 30 dakika boyunca çalkalama ekleyin. Daha sonra başka bir 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın. Daha sonra, 10 dakika süre ile, ilgi konusu antikoru (% 0.0001 (w / v) PBS içinde) ilave edin. 10 dakika sonra, bağlayıcı izin vermek için 15 dakika boyunca akışını durdurmak. Daha sonra, 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın.
5. Hücre Deneyler
Protokol nedeniyle olası tahlillerinin çeşitli genel olarak yazılmıştır. Bir örnek olarak, G6PDH toksisite deneyi için gerekli olan reaktif maddeler verilir. Cihazın ilk hücre hapsi verimi yani 200 hücre üzerinden 5 tuzağa olacak,% 2.5 civarındadır. Hücre tuzakların son doluluk kuvvetle kullanılan hücre hattı, askıya protokole bağlıdırhücre soyu ve zaman hücreler kanalı ile temizlendi. Doğal (örneğin, U937 gibi) süspansiyon içinde büyüyen hücreler için, tek hücreler, bir kaç dakika sonra, odalar yaklaşık% 75 bulunabilir. Diğer odalar ya da dolu ya da iki ya da daha çok hücre tarafından işgal edilmez. Genel olarak, tek hücreli bir kişi yapışık hücre çizgileri için daha küçüktür. Burada yer alan oldukça hafif süspansiyon protokolünü kullanırken, yüzde (HEK MLT hücreleri) yaklaşık% 30 azalır. Tek hücreli bir kişi, hücrelerin tripsin muamelesi ile artırılabilir, ama bu da deneylerin sonuçlarını değiştirebilir.
Hedef moleküle bağlı olarak, PDMS adsorpsiyon ya da emme sonuçlarını etkileyebilir. Adsorpsiyon BSA veya PLL-PEG-g ile yüzeylerin bloke ederek azaltılabilir. Emilim en hidrofilik biyomoleküllere için olası değildir, ancak (küçük) lipofilik hücre bileşenleri için kontrol edilmelidir.
- Özel protokole göre hücreleri hazırlayın (örneğin,
- , Bir şırınga pompası ve ileri akış kullanılarak çip üzerine hücreleri yük yerine, hücre süspansiyonu çekilme. Kanal duvarlarına hücre spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için bu yana yapışkan hücreler için süspansiyon hücre hatları ve 10-20 | il / dk 'lık yüksek akış oranları için 5 ul / dk' lık bir akış hızı kullanarak.
- Trans dolu olduğunda, odacıkları kapatın. Birçok hücre yüzeyine spesifik olmayan yapışma ise, 10-30 ul / dk 'lık bir akış oranında hücre ayrışma tamponu ile aşındırmak deneyin.
Protokol A (enzim tahlilleri)
- Yongası ile lizis tamponu çekiniz. Bu örnek için, bu tampon ilave Tween 20 (10 mM Tris-HCI, 10 ile bir hypoosmolar tampondurmM KCI, 1.5 mM MgCI2, 1% (v / v) Tween 20). Liziz için, hızlı bir şekilde açılır ve kapanır bölmeleri (örneğin 10-50 ul / dak 7,21 akış oranları için 500 msn). G6PDH deneyi için, 2 mM glikoz-6-fosfat, 0.5 mM NADP, 0.5 U / ml diaforaz ve lizis tamponuna 0.3 mM resazurin ekleyin. Liziz hemen sonra kinetik reaksiyon izleme başlatın.
Not: tahlil için uygun olan herhangi bir tampon seçin (Triton, SDS) gibi güçlü deterjanlar lyse hücreler hemen ve oda açılması sırasında analit kaybına yol açacaktır aklınızda ancak çıplak.
Protokol B (bağışıklık)
ELISA hücre deneylerinde (debileri, oda durumu, vb) kısa bir açıklama için, Tablo 1'e bakınız.
- ELISA için, doğrudan liziz tamponu için gerekli saptama reajanı (ör. ikincil antikor, etiketli antijen) ekleyin. Bu tarifnamede Twee eklendin 20 spesifik olmayan adsorpsiyon azaltır. 5.4 aşamasına göre Lyse hücreler. (Kullanılan antijen ve antikor bağlı inkübasyon süresi) bağlanmaya imkan vermek için 10-15 dakika için karışımın inkübe edin.
- Kanal duvarlarına spesifik olmayan adsorbe antikor enzim konjugatları, halihazırda hazne ve kanal içindeki saptama reaktif bir dönüşüme yol açabilir. Bu emilmesidir sorunların azaltılması (saptama reaktif maddesi ilave edilmeden önce, oda kapalı) inkübasyon süresi esnasında yongası ile kullanılan algılama enzim inhibitörü, bir sürekli temizleme için. HRP için, kalıcı olarak spesifik olmayan bir adsorbe edilen enzimleri inaktive etmek için su içinde 20 mM HCl kullanımı.
- İnkübasyon süresinden sonra, çip, deteksiyon reajanı (örneğin, Amplex Red ve HRP için hidrojen peroksit) sunar. Uzakta nonbound ikincil antikor yıkamak için kısa bir süre tekrar odaları açın ve algılama reaktifi ekleyin. Hemen kinetik reaksiyon izleme başlatın.
- Kalibrasyon: hareketsizilgi konusu hedef karşı antikor. Yakın odaları. Tampon maddesi içinde ya da off-çip hücre lizatı analit farklı konsantrasyonlarda hazırlayın. Çipine bir konsantrasyon uygulayın ve hızlı bir şekilde odalarına (açılış saati 500 msn) iç hacmi değişimi. Bu açılma süresi ek bir birikimi meydana gelir analit yıkama sağlamak için yeterince kısa ve microchamber hacminden moleküllerin sadece bir belirli sayıda tespit edilir. Çözelti içindeki antijenin bilinen konsantrasyon ve odacığın hacminin (625 pl) itibaren, bölmenin içindeki miktarını hesaplar. Daha sonra, adım 5.5 ile devam edin ve algılama parçasını tanıtmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim platformu içinde mevcut ya da tek hücreleri tarafından üretilen bir hücre içinde çeşitli yanı sıra salgılanmış molekülleri analiz edebilmektedir. Burada, olası deneylerin çeşitliliği vurgulamak için farklı bir örnek çalışmalar sunmak istiyorum. Bir salgılanmış bir enzim (Şekil 5a) ve hem de bir hücre içi enzim (Şekil 5b) ve protein (Şekil 5c ve d) için bir örnek verir. Böyle cofactors veya küçük moleküller gibi daha fazla örnek için, Eyer ve diğ. Eyer vd (2012) bakın ve lütfen. (2013).
İlk olarak, salgılanmış bir enzim (Şekil 5a) için bir tahlil mevcut. Forbol miristat asetat (PMA) ile aktivasyonu üzerine, insan monosit lizozim salgılanmasını, bakteri hücre lizizi indükleyen bir enzimi neden olur. Bu tahlil için, hücre tamponu 4-Metilumbelliferil β-DN, N'-diacetylchitobioside, lysoz için bir alt-tabakayı içerir zayıf floresanyme. Enzim tarafından şeker kalıntılarının ayrılması üzerine, florofor serbest ve odasının içine tespit edilebilir. Burada, microchamber avantajı kısa bir süre içinde düşük enzim konsantrasyonlarında saptanmasını sağlayan, salgılanan enzimin minimize dilüsyonudur. Şekil 5a'da, çeşitli örnek eğrileri bir uyarılmış U937 hücrelerinden salgılanan lizozim enzimatik ciro temsil gösterilmiştir. U937 hücre hattı, histiyositik lenfoma, bir hastadan türetilmiştir, ve terminal monositik farklılaşmasına neden olabilir. Hücre soyu, PMA ile uyarıldıktan sonra TNFa, lizozim ve β2-mikroglobulin üretir. Resim devir açık odaları ya da hücre barındırmayan odalarına (kesik çizgi) olarak tespit edilebilir.
Şekil 5b, bir hücre içi enzim, burada glukoz 6-fosfat dehidrojenaz (G6PDH) nispi niceliğini gösterir. G6PDH, aynı doku kaynağından gelen bir temizlik protein ve hücreleri olmamalıdır bunların G6PDH konsantrasyon 24 büyük ölçüde değişir. Burada, U937 hücreleri, oda içinde hapsedecek ve liziz tamponu ile birlikte G6PDH tespiti için bir floresan deneyi sağlanır. Bu, glikoz-6-fosfat, NADPH, enzim Diaphorase G6PDH ve mevcut olduğunda parlak resorufine dönüştürülür substrat resazurin, oluşur. Zaman boyunca flöresandaki artış oranı G6PDH miktarına karşılık gelir. Mikroçip ayrıca, belirli bir süre (60 dk) için bir toksin (burada kamptotesin) ile hücrelerin inkübasyonu ile, örneğin toksik bileşiklerin etkisi üzerinde çalışmalar kolaylaştırır. Bu muameleden sonra, serbest enzim boşaltılabilir ve hücreler lize edildi ve G6PDH düzeyi ölçülmüştür. Gerçekten de, hücre içi enzim içeriğinin önemli bir kayıp nedeniyle floresan daha yavaş bir artış (Şekil 5b'de kırmızı çizgiler ve sütunlar) görülebiliyordu. Bu çalışmanın ayrıntıları Eyer et al bulunabilir. 8
e_content "> Ayrıca, hücre içi GFP miktarlarının analizi için bir bağışıklık elde edilen sonuçları göstermektedir. kaynaklı ekspresyon için, T-REx ifade sistemi ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleri., bu sistemde, GFP ekspresyonu, tetrasiklin eklenmesi ile indüklenebilir . inkübasyon 8 saat sonra, hücreler süspansiyon haline getirildi çip üzerine boşaltıldı, tuzak ve daha sonra anti-GFP antikorlar, hücreden serbest GFP bağlamak için burada sunulan protokol izlenerek, cam yüzey üzerinde immobilize edildi yakalama. lize. Şekil 5c antikora GFP bağlanma kinetikleri gösterir. Örneğin, GFP dolayı direkt proteinin floresan toplam iç floresan mikroskobu ile ölçülebilir. O özelliğine sahip olmayan proteinleri de bir sandviç ELISA veya benzeri ile tespit edilebilir vurgulamak istiyoruz formatlar. Bunun için, gerekli tahlil bileşenlerinin yıkama aşamalarından sonra dahil edilebilir. ELISA avantajı sebebiyle sinyalin kuvvetlendirilmesi olanenzime, microchamber içine biriktirildiği bir floresan ürün elde edilmiştir.Son olarak, biz hedef proteini gibi GAPDH'ye tek hücreli sandviç ELISA sunmak istiyorum. Bu süspansiyon, U937 hücrelerinde GAPDH hem de yapışık HEK293 hücreleri (Şekil 5d) tespit edilmiştir. Bunun için, anti-GAPDH'nin antikoru (yakalama antikor) hareketsiz. Hücre parçalama sonra, ikinci bir enzim etiketli antikor (tarama antikoru) ilave edildi. Hazneler açılmış nedeniyle akışına bağlı olmayan saptama antikorları yıkanmış ve Amplex Red odacık tanıtıldı. HRP (tarama antikoru) ile resorufin saçabilme Amplex Red dönüşümü, aynı anda 60 microchambers zaman içinde izlenmiştir. Reaksiyonun doğrusal kısmından eğim belirlenmiştir. Bu eğim, doğrudan analit konsantrasyonuna, bu yüzden enzimin konsantrasyonu ile ilişkilidir. Tek U937 hücrelerinden sonuçları ortalama GAPDH gösterdisırasıyla, 2.0 ve 3.2 attomol, minimum ve maksimum değerleri ile 2.6 attomol miktarı,. 46 HEK hücrelerinin veri analizi bu hücrelerin ortalama 2.5 attomol GAPDH (; maksimal 4,1 attomol en az 0,9 attomol) içerdiği ortaya koydu.
Şekil 1. Farklı tahlillerin microdevice ve şematik a.) Monte mikrocihazda sundu. Burada, bölmeler görselleştirme (yeşil flüoresan) için floresan ile doldurulur. Ayrıca görünür rezervuar olduğu, kontrol katmanı için bağlantıları (basınç, arka 2x4 konnektörleri sol ve ön sağ) ve şırınga pompası (ön) için bağlantı. B) microchamber alanda büyüt. Bu bölmelerin çoğu bir dizi içinde düzenlenebilir. Görselleştirme için, turuncu bir gıda boyası, oysa odası içinde izole edilmiştir yeşil gıda boyası kanallar aracılığıyla temizlendi. Basınç kontrol katmanı cihazı operasyonun tek microchamber. D) şematik su. C) Zoom ile doludur. Bir microchamber (yan görünüm) içinde, bir tek hücre tuzak ve izole edilir. Hücre, uyarılmış inkübe edildi, yıkandı ve son olarak da çip içinde lize edilebilir. Hücresel içeriği enzim veya bir fluoresan kısım reaksiyonu (sol) üzerine oluşturulur koenzimler için tahliller ile direkt olarak analiz edilebilir. Diğer proteinler için, yüzey hedef proteinin (sağ) spesifik olarak bağlanan antikorlar ile modifiye edilebilir. Antijen yüzeye bağlı olduğu için, lizat yıkanıp edilebilir ve sekonder antikor olarak tespit molekülleri hedef proteini miktarını belirlemek için ilave edilebilir. büyük resim görüntülemek için .
e 2 "fo: İçerik-width =" "src =" / files/ftp_upload/50618/50618fig2.jpg 5in "width =" 500px "/>
Şekil 2. Akışkan tabakanın kanal sistemleri ile microchamber boyutları şematik a.) Maske tasarımı. Akışkan tabaka (soldan sağa) bir çıkış, odacık bölge, parçacıklar ve hücre kümeleri korumak için bir filtre ve bir giriş oluşur. Çok ince bisküvi içindeki bir 4 ila 10 yongaları üretimi için yapıları barındırabilir. Mukabil kontrol tabakasının b) Maske tasarımı. Nedeniyle uyum için gerekli alanı, gofret bir 4 5 fiş hizalanmış katmanları. C) şematik (solda) üretimi için yapıları içerir ve bir hücre tuzak (sağda), hem de uzunluk ölçüleri ile gösteren genişleme. görüntülemek için buraya tıklayın büyüt .
Şekil 3,. SU-8 işleme ve PDMS üretiminin şematik a.) SU-8 işlem protokolünün şematik. Bir silikon gofret spin-kaplı SU-8 ve 4 dakika boyunca 95 ° C 'de yumuşak pişirilir. İstenen mikroakışkan kanal tasarımı bir fotomaske ve UV ışığı maruz kullanılarak SU-8 aktarılır. 2 saat boyunca maruziyet sonrası fırında (95 ° C, 5 dakika) sonra, SU-8 geliştirilen ve 180 ° C'de sabit pişmiş. Mikroakışkan çip üretim b) şematik. PDMS oligomer ve sertleştirme maddesinin bir karışımı, spin-kaplı akışkan kanal için ana form üzerine, ve kontrol tabakası için ana formu üzerine döküldü. Kanal negatif pembe tasvir edilmektedir. Her iki tabaka da bir fırın içinde vulkanize edilir. Kontrol tabaka çipi parça (mavi kontrol kanalı) gofretin sökülmüş ve basınç bağlantıları için delikler (beyaz) delinir. Parça-kontrol ve hem deSıvı tabaka, oksijen plazma içine yerleştirilir ve daha sonra, aynı hizada ve yapıştırılır. Bütün yonga sonra (kırmızı sıvı kanal) akışkan ana formundan söktürür ve akışkan giriş delikleri (beyaz) delinir. Son olarak, yonga ve bir cam slayt oksijen plazma yüzey aktivasyonu sonra yapıştırılır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Yumuşak litografi için microcontact baskı şematik. A) Yüksek Lisans fabrikasyon. (1) A PDMS damga protein (bBSA) çözeltisi ile inkübe edilir. (2) Solüsyon çıkarılır, damga yıkanır ve protein, bir tek tabakalı damga kalır. (3) bu şekilde damga proteinler cam sur aktarılır, bir cam slayt üzerine yerleştirilir yüz. Bu süre boyunca, camın üzerine damga ile birlikte mikroçip, bir oksijen plazma maruz kalmaktadır. (4) damga çıkarılır ve mikroçip cam slayt üstüne yapıştırılır. Görselleştirme için, iki örnek yapıları, gösterilen floresan BSA-floresein eşleniği ile basılır. Bölmesi başına b) Microcontact basılı alan. Baskı ve odaları uyumlu olmadığından, biz bağlama üç farklı yongaları (sayılar 1-3) noktalar (basılı alan) ve 60 microchambers üzerinde varyasyonları değerlendirildi. Bunun bir sonucu olarak, oda-to-bölmesi değişkenlik (% 2.5 <) göreceli olarak küçüktür ve yonga talaşa değişkenlik odalarına basılı yapıları hizalamak için gerek gerçekten var olduğunu gösterir (<% 1) ihmal edilebilir. Click Burada büyük resmi görebilmek için .
18/50618fig5.jpg "width =" 500px "/>
Şekil 5,. G6PDH, lizozim, GFP ve GAPDH deneyleri sonuçları. Tek hücrelerden Örnek sonuçlar a.) Enzim salgılama. Sol: salgılanmış bir enzim tahlilinin şematik, burada lizozim. Lizozim, tek, PMA ile aktive edilmiş U937 hücreleri tarafından salgılanan ve floresan 4-metilumbelliferon üretimini katalize yerde, kapalı microchambers içinde birikir. Sağ: Bir salgı deneyden elde edilen veriler. Yeşil eğimler ayrıca, hücre içermeyen bir bölme (siyah nokta nokta çizgi) de gösterilmiştir Mukayese için, bir hücre tarafından işgal edilen odalar için zaman içinde floresan yoğunluğunu gösterir. Tek hücreleri içinde hücre içi enzimlerin b) belirlenmesi. Sol: hücre içi enzim G6PDH tahlilinin şematik. Hücre lizizi üzerine, hücre içi G6PDH, bir enzimatik reaksiyon kaskadının için diğer bileşenler mevcut olan haznenin içine salınır. Sağ: Örnek eğrileri ve temsilci veri. Tek U937hücreler, enzim içeriğine (siyah) için analiz edilmiştir. Tek hücre içi proteinlerin membran permeabilizes kamptotesin, toksik etkisi üzerine, enzim üçte ikisi (turuncu) kayboldu. C) Immunoassay. Sol: bir bağışıklık şematik, burada hücre içi protein GFP için. Anti-GFP antikorlar, burada tarif edilen yüzey göre protokolü üzerinde immobilize edilmiştir. Hücreler daha sonra, çip üzerinde lize edilmiş ve bağlayıcı noktalar TIRF mikroskopi kullanılarak zaman içinde izlenmiştir. Sağ: hareketsizleştirilmiş antikorlara GFP bağlanma kinetiklerini gösteren böyle bir deneyden grafik. Zaman noktası 1 liziz tamponu giriş işaretleri. Süresi 2 noktasında, GFP hücre parçalama oluştu, yani yüzeyde birikmeye başlıyor. GFP antikorlara bağlanması, bir zaman noktasında 3. D) tek bir hücre içi proteinlerin Sandwich ELISA tamamlanır. Sol: hücre içi protein GADPH için burada bir sandviç ELISA, şematik. Anti--GAPDH antikorlar, burada tarif edilen protokol uyarınca yüzey üzerinde immobilize edilmiştir. Daha sonra hücreler lize edildi ve bir çip üzerinde inkübe edildi. Antikora bağlanan serbest GPADH, odacık yıkandı ve saptama antikoru (HRP-birleştirilmiş) ilave edildi. Son bir adımda, nonbound Tarama antikoru, uzak yıkandı saptama reaktif maddesi ilave edildi ve reaksiyon süresi boyunca izlendi. Sağ:. U937 ve HEK293 hücre içindeki GAPDH'ye miktarının büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .
ELISA için yüzey modifikasyonu protokol
| Adım | Zaman | Konsantrasyon | Akış hızı | Flow-inkübasyon süresi | Chamber açık / kapalı | ||
| [Dk] | (W / v)% | [Ml / dk] | [Dk] | </ Td> | |||
| BSA | 30 | 4 | - | Açık | |||
| PBS | 10 | 5 | Açık | ||||
| Avidin | 30 | 0.025 | 5 | Açık | |||
| PBS | 10 | 5 | Açık | ||||
| Protein G, biotin | 30 | 0.0025 | 5 | Açık | |||
| PBS | 10 | 5 | Açık | ||||
| Antikor | 20 | 0.0001 | 5 | 15 | Açık | ||
| PBS | 10 | 5 | Açık | ||||
| Hücreler (300000 hücre / ml) | ~ 5 | 30 | Tuzakları dolu olduğunda kapatın. | ||||
| Liziz tamponu | 5 | 30 | Açık kısa | ||||
| Önleyici (örneğin 20 mM HCl) | 15 | 10 | Kapalı | ||||
| PBS | 2 | 30 | Kapalı | ||||
| Saptama reaktif | 5 | 30 | Açık kısa | ||||
| Başlangıç reaksiyon izleme | |||||||
Tablo 1. Yüzey modificatioELISA için n protokolü. Açıklama için, metni görürsünüz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroakiskan teknoloji tek-hücre analizi için yeni ve ilginç olanaklar açtı. Özellikle, tuzak olasılığı ve mikroakışkan araçları hücreleri tek tek hareketsiz tek hücre özellikleri ve tepki üzerine sistematik kısa ve uzun vadeli çalışmalar izin verdi. Buna ek olarak, bir mikro çip üzerinde oluşturulan mikro damlacıkların yüksek frekans, hücrelerin kapsüllenmesi, geleneksel sitometrisi cihazlarla gerçekleştirilemez tek hücre salgısı çalışmalar, sağladı. Mikrodamlacık yaklaşım, ancak, inkübasyon ve yıkama adımları analitik protokolü için gerekli olan bazı sınırlamalar vardır. Yaklaşımımız hücre yakalama ve tecrit her iki kavram birleştirir ve bu nedenle, yüzey hareketsizleştirilmiş antikorlara dayanan bağışıklık testleri de dahil olmak üzere daha karmaşık bir performans kolaylaştırır. Buna ek olarak, yöntem, uygulama ve hedef analit ile ilgili çok esnektir.
Mikroçip tasarımı (i) effi sağlarcient hücre yakalama, çeşitli tamponlar ve reaktifler (ii) kaynağı ve çok küçük bir hacim içinde (iii) güvenilir bir yalıtım gerekmektedir. Bu şekilde hedef moleküllerin seyreltme önlenir. Altmış microchambers ve (yüzlerce) paralel olarak birçok deney sağlayan tek bir cihazda konumlandırılmış. Microchambers kapanış yuvarlak şekilli vanaları bitişik odaları çapraz kontaminasyon önlenmelidir zaman önemli olan, satır veya sütuna göre birlikte veya ayrı ayrı ele alınabilir. Microchambers kapalı olan kanalları bu tuzak hücreleri etkilemeden temizlik için, hidroklorik asit gibi zararlı çözümleri ile tedavi edilebilir. Öte yandan, microchamber içindeki hacmin hızlı değişimi mümkündür. Önceki 200 msn bir asgari zaman tam olarak bölmeyi açmak ve (microchamber hacminin tam değişimi için, akış hızı dikkate alınmalıdır), yeni reaktif tanıtmak için gereklidir.
Bizim yöntem çok rel ikeniable ve tekrarlanabilir, bir çip üretim ve operasyon protokolde iki ana kritik noktalar vardır ki akılda tutmak gerekir. İlk olarak, plazma hale getirilmesinden sonra, iki çip tabakaların bağlanma çabuk yapılması gerekir. Hizalama bağ dönüşümsüz olduğu, aksi takdirde bazı odalar, hatta bütün çip, kullanışlı değildir, önemlidir. Bu adım bir eğitimden sonra daha az deneyimli laboratuar çalışanları genellikle iyi sonuçlar elde, ancak, deneyimsiz kullanıcılar için zor olabilir. İkinci kritik nokta montaj ve mikroçip kullanımı sırasında temizlik olduğunu. Toz parçacıkları yonganın yüzeyi üzerinde mevcut ise, bu kontrol kanalları ve valf uzlaşma hatta PDMS-PDMS veya PDMS cam bağının bir kırılma yol açabilir. Bu nedenle temizlik işlemlerinde ilgi çok harcamak. Bu (bir temiz oda gerçekleştirilen) ana formu imalat yanı sıra, biz üretmek ve normal laboratuvar ortamında, toz a'da mikroçipler kullanmak unutulmamalıdırnd parçacıklar mevcut.
Odaları doğru kapanış değilse tüm bakım rağmen, bu basınç hatları ya engellenir ya da spin kaplama işlemi doğru membran kalınlığı vermedi ki olabilir. Aynı zamanda, zaman zaman biz, iki PDMS tabakalar arasında bağın kırılması ile sonuçlanır yetersiz yapışma görülmektedir. Aynı partiden birçok cips bu sorunu gösteriyor, bu plazma aktivasyonu ve uyum arasındaki süre çok uzun olması mümkündür. Bazen, biz düzgün kaldırıldı olamazdı gofret yapışkan PDMS deneyimli ve gofret yetersiz silanizasyon bir sonucudur.
Üretim yöntemi kurulduktan sonra, mikroakışkan platformu tek hücre düzeyinde çok farklı çalışmaları için kullanılabilir. Burada, farklı deneyleri ile hücre içi ve salgılanan ajanlar algılama gösterdi, ancak bir çok diğer deneyler, çip üzerinde uygulanabilir. Çoğu protein florasan değildir ve kendi debağışıklık ile ması kolay değildir. Çipin içine ELISA uygulanması birçok faydalar getirecektir. İlk olarak, deneyi (uygun antikorlar mevcut olduğu zaman), istenilen protein için çok özel olarak tasarlanabilir. İkinci olarak, ELISA gelen bilgi, hücre içinde mevcut protein ya da molekül kopya sayısını veren, daha düşük konsantrasyon seviyesi de hesaplanabilir.
Mevcut chip bir memeli hücrelerinin analizi için tasarlanmıştır. Ancak, bu tür bakteri, yosun, maya ve diğer hücreler için çip modifikasyonu, mümkün olmalıdır. Şimdiye kadar, deneyler için tek sınırlama, floresan dayalı bir tahlilin ihtiyacıdır. Ancak, şu anda bir algılama tekniği olarak kütle spektrometresi uygulanmasını okuyor. Bu kurulduktan sonra, platformu ile araştırılabilir analitik sorunların aralığı daha geniş olacaktır. Bundan başka, her analiz hücre parçalama tampon mevcudiyetinde mümkün olduğu için, bizşu anda da platformunda çeşitli parçalama teknikleri değerlendiriyoruz. Biz burada sunulan çok yönlü mikroakışkan platformu proteom, metabolome ve secretome düzeyinde yeni bir tek-hücre çalışmaları için temel sağlar eminiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar minnetle el yazması, özel yapılmış basınç kontrol sisteminin yapımı için C. BÄRTSCHI ve H. Benz prova okuma Tom Robinson kabul. Biz de temiz oda tesisi İLK ve hem ETH Zürich Işık Mikroskopi Merkezi (LMC) kullanımını kabul etmek istiyorum. Çalışma 7. Çerçeve Programı (ERC Grant başlayarak, proje yok. 203.428, nμLIPIDs) altında Merck Serono ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | n.a. | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane | ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| AZ 726 developer | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Bovine serum albumin, biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Cell dissociation buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Hydrochloric acid | Fluka | 84422 | |
| Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) | n.a. | |
| PBS | Invitrogen | 10010-031 | |
| PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| PLL-g-PEG grafted biotin | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| Potassium chloride | Fluka | 60132 | |
| Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| Silicon wafer | Si-Mat (Kaufering, Germany) | n.a. | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | 1610716 | |
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| 0.22 µm PES syringe filter | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 mm biopsy puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics filter 20 µm | Partec | 04-004-2325 | |
| Centrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a. | |
| Hotplate HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| MA-6 mask aligner | Karl Suess | n.a. | |
| Multizoom AZ100M microscope | Nikon Corporation | n.a. | |
| Photomask | Microlitho, Essex, U.K. | n.a | |
| Plasma Cleaner PDC-32G | Harrick | n.a. | |
| Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a. | |
| Spin Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| Step profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni | n.a. |
References
- Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
- Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
- Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
- Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
- Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
- Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
- Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).
- Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
- White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
- Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
- Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
- Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
- Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
- Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).
