Summary
Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios.
Abstract
Apresenta-se um dispositivo de microfluidos, que permite a determinação quantitativa de biomoléculas intracelulares em várias células individuais em paralelo. Para este efeito, as células são passivamente preso no meio de uma microcâmara. Após a activação da camada de controlo, a célula é isolado a partir do volume em torno de uma pequena câmara. O volume circundante podem ser trocados sem afetar a célula isolada. No entanto, aquando da abertura e fecho curto da câmara, a solução na câmara pode ser substituído dentro de algumas centenas de milisegundos. Devido à reversibilidade das câmaras, as células podem ser expostas a soluções diferentes sequencialmente, de uma forma altamente controlável, por exemplo por incubação, lavagem, e finalmente, a lise celular. Microchambers hermeticamente seladas permitir a retenção do ligado, minimizar e controlar a diluição após a lise celular. Uma vez que a lise e análise ocorrer no mesmo local, de alta sensibilidade é mantida porque não mais dilution ou perda dos analitos ocorre durante o transporte. Por isso, o projeto MicroChamber permite a análise confiável e reprodutível de números muito pequenos de cópia de moléculas intracelulares (atomoles, zeptomoles) liberadas a partir de células individuais. Além disso, muitos microchambers podem ser dispostos num formato de matriz, permitindo a análise de muitas células de uma só vez, uma vez que os instrumentos ópticos adequados são usadas para a monitorização. Nós já usou a plataforma para estudos de prova de conceito para analisar proteínas intracelulares, enzimas, cofatores e segundos mensageiros em forma quantificável relativo ou absoluto.
Introduction
Muitos estudos no passado revelaram diferenças célula-a-célula dentro de uma população de células grandes 1-3, em particular os processos de sinalização 4, ou as quantidades de biomoléculas intracelulares, tais como proteínas, metabolitos 5,6, 7,8 e cofactores. Estas heterogeneidades são considerados fundamentalmente importante para a adaptação e evolução de 9 células, mas também desempenham um papel chave na emergência e tratamento de doenças como o cancro 10-13. Portanto, os estudos sobre o nível de uma única célula são de grande interesse na pesquisa biológica e farmacológica, principalmente se esses estudos revelam as diferentes respostas de células após o tratamento com substâncias químicas bioativas.
Nos últimos anos, muitas plataformas de análise foram desenvolvidos para facilitar a análise de células vivas individuais ou a composição química do conteúdo da célula. Embora células fluorescentes ativadas (FACS) é o ouro ruaandard para análise muito maior taxa de transferência de células vivas individuais, o método não pode ser utilizado para a quantificação de compostos intracelulares ou segregadas. O surgimento de plataformas microfluídicos prometeu novas estratégias analíticas de posicionamento, tratamento e observação de células individuais. Um marco na microfluídica foi alcançado com a integração das válvulas PDMS flexíveis realizados por Quake e colegas de trabalho 14,15. Estas válvulas são úteis, pois podem isolar regiões no chip, por exemplo, separar duas culturas 16. Além disso, são especialmente aplicável para a análise de uma única célula e, portanto, ajudar a reduzir os problemas de diluição de analitos. O poder desta abordagem para a análise de uma única célula foi recentemente demonstrado por Hansen e colegas de trabalho, que analisou a expressão gênica de centenas de células individuais em paralelo 17.
Ao alvejar proteínas e metabolitos, a análise é muito difícil devido à falta de uma adequadamétodos mplification, o grande número de compostos diferentes presentes, e suas variações de natureza química. Além disso, a maioria das biomoléculas intracelulares espera-se estar presente em número de cópias baixo, na ordem de algumas dezenas de milhar de 18, portanto, o método analítico utilizado deve possuir uma sensibilidade elevada. Os ensaios mais potentes, tais como imunoensaios e ensaios imunológicos ligados a enzimas (ELISA), são difíceis de integrar em dispositivos de microfluidos, uma vez que requerem vários passos de lavagem e de incubação, assim como a imobilização de superfície.
Devido a estes desafios, não é surpreendente que apenas alguns exemplos em que foram reportados foram quantificadas proteínas ou metabolitos no nível de uma única célula. Por exemplo, estudos sobre a secreção de compostos fluorescentes têm sido relatados 19,20. Recentemente, a aplicação de ELISA, foi apresentado para a análise de secretadas (não fluorescentes) proteínas de uma cultura de células (células THP-1) 21 e único (immune) células 10. Segmentação de proteínas intracelulares, Shi et al. Desenvolvido um dispositivo de microfluidos, que facilitou a identificação de proteínas intracelulares para a análise das vias de sinalização nas células tumorais por meio de um imunoensaio 11. No entanto, apenas as quantidades relativas de proteínas foram determinadas e sem amplificação enzimática foi utilizada para aumentar o sinal para as proteínas de baixa abundância.
Recentemente, fomos capazes de combinar uma microdispositivo trapping de uma única célula com ensaios de fluorescência 8 e imunoensaios 22 (Figura 1). As células são passivamente preso em estruturas obstáculo micronizada, o que permite a oferta ea (rápida) troca de médio e outros agentes químicos, sem qualquer movimento das células. Uma válvula em forma de anel em torno de cada armadilha permite o isolamento da célula em um volume muito pequeno ("microcâmara"). Esta válvula é acionada imediatamente após a introdução de um tampão de lise celular (hypoosmolar), eledno impedindo moléculas intracelulares ou moléculas secretadas para difundir para longe. Mais importante, devido ao pequeno tamanho do volume (625 pl) grande diluição das moléculas é evitado. Além disso, uma vez que a lise e de análise são realizadas no na mesma posição no chip, não há qualquer perda de substância a analisar devido ao transporte. O design de chips aqui descrito compreende 8 linhas alternadas de ambos os 7 ou 8 microchambers, totalizando 60 microchambers. As câmaras são acionados em linhas, de modo que a contaminação cruzada ao longo de uma linha está impedida.
A plataforma pode ser utilizada em combinação com ensaios de fluorescência, bem como ensaios imunológicos (Figura 1d). Para este último, que estabeleceu protocolos para a imobilização dos anticorpos, que são compatíveis com a produção de chips e processo de montagem. Daí a plataforma abre o caminho para ensaios sensíveis, confiáveis e quantificáveis ao nível de célula única. Até agora, temos usado o dispositivo para a análise de ienzimas ntracellular e secretadas (quantificação relativa por ensaios enzimáticos), co-fatores intracelulares, proteínas e pequenas moléculas (quantificação absoluta por ensaios de ponto de extremidade ou ELISA). No que se segue, descreve-se o processo de fabricação de chips por meio de litografia suave multicamadas e os protocolos para a modelação dos anticorpos por meio de impressão microcontact e química de superfície. Além disso, alguns exemplos de utilização e as operações de chip são dadas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SU-8 Fabricação mestre
Prepare dois moldes mestres para os canais (fluídicos e controle, para esquemas e dimensões veja a Figura 2) com o seguinte protocolo, mas com diferentes padrões de máscara. O processo é mostrado na Figura 3a.
- Começar por aquecimento de uma bolacha de silício de 4 polegadas por 10 min a 180 ° C. Carregue o wafer desidratado em um spin-coater e use o seguinte protocolo para spin-coating SU-8 de 2015:
- Gire wafer a 100 rpm por 20 s (tampa aberta de spin-coater, dispensar SU-8 durante esta etapa, feche a tampa depois da dispensa).
- Wafer de rotação a 500 rpm durante 10 seg (isto vai espalhar a resistir ao longo de toda a bolacha).
- Wafer de rotação a 1750 rpm durante 30 seg (define a altura do resistir a 20 um).
- Retirar resistir a partir da borda da pastilha com acetona (usar um cotonete) como esta vai ficar de outro modo para a placa de aquecimento no passo seguinte. Transfira a bolacha para ahotplate a 95 ° C e aquecer durante 4 min. Após a softbake, expor a resistir através de um photomask colado Sodalime vidro em um alinhador de máscara com luz UV (150 mJ / cm 2, medido a 365 nm).
- Após a exposição, aquecer a bolacha novamente a 95 ° C durante 5 minutos numa placa de aquecimento. Refresque-se a hóstia para RT e depois mergulhe em um banho de SU-8 desenvolvedor para 4 min. Agite suavemente para remover não exposto SU-8. Lave o wafer com sala limpa classe isopropanol e seque com nitrogênio. Verifique sob um microscópio se o desenvolvimento foi bem sucedida (especialmente as armadilhas de células). Se as armadilhas de células estão completamente desenvolvidos, a reflexão da bolacha de silício deve ser visível. Se for necessário, realizar a bolacha de novo durante alguns minutos.
- Cozer a bolacha numa estufa durante 2 horas a 180 ° C para remover todo o dissolvente residual. Verifique a altura dos canais com um perfilador passo. Se a altura é diferente da altura desejada, repita este protocolo começando no passo 1.1 com uma nova bolacha emudar o spin-velocidade (passo 1.1.3). Finalizar a fabricação do molde mestre de silanização o wafer com 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodecilo-dimethylchloro-silano num exsicador durante a noite.
2. Fabricação Mestre para impressão microcontact
- De modo a preparar moldes de mestre para impressão microcontact, desidratar uma bolacha de silício de 10 min a 180 ° C. Gire-coat 1 ml HDMS para esta wafer a 7.500 rpm por 30 segundos (a resistir adere melhor a uma superfície silanizada). Spin-coat 2 ml de AZ1518 resistir positivo com este protocolo:
- Dispense estática da resistência sobre a bolacha.
- Gire wafer por 5 segundos a 500 rpm.
- Gire wafer por 60 segundos a 4000 rpm.
- Após 50 seg softbake a 100 ° C numa placa de aquecimento, expor a resistir à luz UV (21 mJ / cm 2 de 365 nm) através de uma fotomáscara e em um alinhador de máscara. Desenvolver a resistir em um banho de AZ 726 por 75 seg. Lavar o wafer desenvolvido com DI-água e golpe dry com nitrogênio. Remover o solvente residual por aquecimento da bolacha a 115 ° C durante 50 seg. Silanizadas a bolacha sob vácuo durante a noite.
3. Fabricação do chip microfluídico
A concepção do dispositivo de duas camadas é utilizada para estas experiências. As duas camadas são preparadas separadamente e são ligados em conjunto, antes de o chip é finalmente ligado sobre uma lâmina de vidro (Figura 3b). Este passo descreve a produção de camadas de PDMS e o selo PDMS para impressão microcontacto.
- Prepare uma mistura de PDMS 10:01 e agente de cura. Prepare aproximadamente 80 g de PDMS no total (usando nossos projetos, isso irá resultar em 10 fichas). Misturar ambas as partes vigorosamente e desgaseifique os PDMS até que a mistura está livre de bolhas (~ 30 min).
- Coloque o wafer com a camada de controle dentro de uma placa de Petri e fita-lo para o fundo. Em seguida, despejar ~ 50 g de PDMS em cima e colocar a bolacha durante pelo menos 2 horas numa estufa a 80 ° C para assegurar completacura do PDMS. Repetir o mesmo procedimento para a bolacha impressão microcontact, para este ~ 20 g PDMS é necessário.
- Spin-revestimento PDMS sobre a bolacha com a camada fluidificada, a uma velocidade de rotação de 2000 rpm de modo a formar uma camada de elevada PDMS aproximadamente 40 pm. Curar o PDMS numa estufa durante pelo menos 1 hora a 80 ° C.
- Quando as duas partes são curados, remover a camada de controlo da bolacha e cortado em pedaços com uma lâmina de barbear. Faça furos de conexão pressão usando uma biópsia perfurador de 1 mm. Para o armazenamento, é aconselhável colocar um pedaço de fita adesiva sobre os canais.
- Para unir as duas camadas, tomar a hóstia spin-revestido e a parte de cima e colocá-los em um aspirador de plasma 23. Após o tratamento de plasma, alinhar rapidamente as duas partes em um microscópio com grande distância de trabalho. Adicione algumas peças PDMS em torno das peças principais colocados. Este passo não é obrigatório, no entanto, que facilita a remoção do PDMS da bolacha. Coloque a bolacha num forno a 80 ° C durante pelo menos 1 hr.
- Usar um bisturi para remover cuidadosamente o PDMS da bolacha e para cortar os microchips. Faça furos de acesso para as ligações fluídicas com uma biópsia perfurador de 1,5 mm.
- O chip PDMS está terminada e pode ser armazenado durante meses. Opcional: Se o chip é utilizado com um reservatório, cortar a parte superior de uma pipeta de ponta de 200 ul e utilizar alguns de reposição, PDMS semi-curado a mantê-la no topo. Colocar o chip no forno novamente a 80 ° C durante pelo menos 1 hr.
4. Colagem de lâmina de vidro
Para usar o dispositivo para ensaios enzimáticos directos, a única etapa necessária após a ligação é o bloqueio das superfícies. Para este protocolo, proceder à A. No entanto, para usar o chip de microfluídica para imunoensaios ou ELISA, consulte o protocolo B para restringir os locais obrigatórios apenas para a lâmina de vidro (ou seja, para a microscopia TIRF ou SPR). Se essa restrição não é importante, referem-se a A, mas use conjugados biotinilados no passo 4.3 e continue com o passo 4.8no protocolo B para criar uma superfície totalmente funcional.
Antes de realizar o protocolo A e B: É aconselhável filtrar todas as soluções de proteína utilizadas antes de os introduzir no chip. Detritos e agregados de proteína podem de outra forma bloquear armadilhas de células, reduzindo desse modo o número de câmaras, que podem ser utilizados para a análise. Para esta finalidade, utilizam uma unidade de filtro de absorção não proteico para filtrar todas as soluções antes de introduzi-las no interior dos canais.
Um protocolo (ELISA)
- Para finalizar o dispositivo micro, unir as partes PDMS sobre uma lâmina de vidro. Para isso, em primeiro lugar limpar a lâmina de vidro com sabão, água destilada e etanol. Seque a lâmina utilizando uma corrente de azoto. Limpe a parte de PDMS com fita adesiva.
- Coloque a parte PDMS ea lâmina de vidro limpa para o limpador de plasma por 45 segundos a 18 W. Para assegurar uma ligação apertada, colocar o chip em uma placa quente (100 ° C) por 5 min.
- Após a colagem, preencher o chip com fLUIDs. Uma maneira fácil de fazer isso é usar a força centrífuga. Corte a parte inferior de 200 mL ponteira. Para os canais de fluidos, enchê-los com a solução de bloqueio (albumina de soro de bovino (4% w / v), ou poli-L-lisina) glicol de polietileno enxertado (0,05% w / v) e colocar as pontas para as entradas. Encha as entradas de controlo de camada com água ou com uma solução isosmótica, por exemplo, PBS. Colocar o chip no centrifugador (800 xg) durante 5 min. Os canais devem ser agora preenchido com fluido completamente. Se não, repita este passo.
- Incubar a solução de bloqueio durante, pelo menos, 30 minutos à temperatura ambiente. Lava-se a solução para fora da camada de fluido com PBS a uma taxa de fluxo de 10 mL / min usando uma bomba de seringa. O dispositivo está pronto para experimentos com células.
Protocolo B (imunoensaios)
Para uma visão completa da modificação da superfície do passo 4.7 em diante, por favor, consulte a Tabela 1.
- EmPDMS Cubate selos para impressão microcontact com uma solução BBSA / BSA (por exemplo, 1-100). Após 30 min, limpar os selos cuidadosamente com água destilada e secar o selo, sob uma corrente de azoto. Colocar rapidamente os selos em uma lâmina de vidro limpa (Figura 4).
- Expor a lâmina de vidro com o selo junto com a parte superior do chip microfluídico de plasma de oxigênio por 45 s na potência máxima (18 W) em um aspirador de plasma. Após o tratamento por plasma, remover o selo e alinhar a superfície impressa debaixo microchambers do dispositivo. Colocar o chip durante 30 min sobre uma placa quente a 50 ° C.
- Para bloquear a superfície restante, introduzir solução esterilizada por filtração de BSA (4% (w / v) em PBS) para o chip com uma centrífuga (ver passo 4.2). Incubar durante 1 hora e lava-se a solução para fora da camada de fluido com PBS (ver passo 4.3). O chip pode, então, ser utilizada directamente ou armazenada durante cerca de 2 semanas a 4 ° C numa caixa húmida.
- Para um surfac ligação totalmente funcionale, introduzir avidina (0,025% (w / v) em PBS) para dentro do reservatório. Use uma taxa de fluxo de 5 ul / min durante 30 minutos para retirar a solução de avidina através dos canais de fluído. Depois, lave PBS durante 10 min. Lave o reservatório completamente.
- Em seguida, adicionar Proteína G (0,0025% (w / v) em PBS) e lave durante mais 30 min. Lavar com PBS durante mais 10 min depois. Em seguida, adicionar o anticorpo de interesse (0,0001% (w / v) em PBS) durante 10 min. Depois de 10 minutos, interromper o fluxo durante 15 minutos para permitir a ligação. Em seguida, lava-se com PBS durante 10 min.
5. Experimentos com células
O protocolo é escrito em termos gerais, por causa da variedade de possíveis ensaios. Como um exemplo, os reagentes necessários para o ensaio de toxicidade de G6PDH são dadas. A célula prendendo eficiência inicial do aparelho é de cerca de 2,5%, ou seja, 5 de 200 células será preso. A ocupação final das armadilhas de células depende fortemente da linha celular utilizada, o protocolo para suspendera linha de células e o tempo que as células são lavadas por meio do canal. Para as células que crescem naturalmente em suspensão (por exemplo, U937), células isoladas pode ser encontrada em cerca de 75% das câmaras após alguns minutos. As outras câmaras ou não são preenchidas, ou ocupados por duas ou mais células. Em geral, a ocupação de uma única célula é menor para as linhas de células aderentes. Quando se utiliza o protocolo de suspensão bastante leve aqui apresentado, a percentagem diminui para cerca de 30% (HEK, células MLT). A ocupação de uma única célula pode ser melhorada por tratamento com tripsina das células, mas esta pode também alterar os resultados das experiências.
Dependendo da molécula alvo, a adsorção ou a absorção de PDMS pode influenciar os resultados. Adsorção pode ser reduzida através do bloqueio das superfícies com a BSA ou PLL-g-PEG. A absorção é improvável para a maioria das biomoléculas hidrofílicas, mas deve ser verificado para os componentes celulares lipofílicos (pequenas).
- Preparar as células de acordo com o protocolo específico (por exemplo,
- Carregar as células para o chip utilizando uma bomba de seringa e de fluxo para a frente, em vez de se retirar a suspensão de células. Use uma taxa de fluxo de 5 ul / min para as linhas de células de suspensão e maiores taxas de fluxo de 10-20 mL / min para as células adesivas uma vez que a redução de fixação não específica das células nas paredes do canal.
- Quando as armadilhas são preenchidos, feche as câmaras. Se várias células aderir de forma não específica à superfície, tentar lavá-los com um tampão de dissociação celular, a uma taxa de fluxo de 10-30 mL / min.
Um protocolo (ELISA)
- Retirar tampão de lise através do chip. Para este exemplo, este tampão é um tampão com hypoosmolar adicionado Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM de KCl, 1,5 mM MgCl2, 1% (v / v) de Tween 20). Para a lise, as câmaras rapidamente abrir e fechar (ou seja, 500 ms para as taxas de fluxo de 10-50 mL / min 7,21). Para o ensaio de G6PDH, adicionar 2 mM de glicose-6-fosfato, NADP 0,5 mM, 0,5 U / ml de diaforase e 0,3 mM de resazurina para o tampão de lise. Inicie o controlo da cinética da reacção imediatamente após a lise.
Nota: Escolha qualquer tampão, que é adequado para o ensaio, no entanto ter em mente que os detergentes fortes (como Triton, SDS) lise das celulas imediatamente e vai levar a uma perda de analito durante a abertura da câmara.
Protocolo B (imunoensaios)
Para uma breve descrição das experiências de ELISA de células (taxas de fluxo, status de câmara, etc), por favor, consulte a Tabela 1.
- Para ELISA, adicionar o reagente de detecção é necessária (por exemplo, o anticorpo secundário, o antigénio marcado) directamente para o tampão de lise. O aqui adicionado Tween 20 reduz a adsorção não específica. Lise das células de acordo com o passo 5.4. Incubar a mistura durante 10-15 minutos para permitir a ligação do (tempo de incubação de acordo com o antigénio e o anticorpo utilizado).
- Conjugados de enzimas e anticorpos que adsorvido inespecificamente as paredes do canal pode conduzir a uma conversão do reagente de detecção, já no interior do reservatório e canais. Para reduzir os riscos de o processo de adsorção, lave um inibidor estável da enzima de detecção utilizado através do chip durante o tempo de incubação (câmaras fechadas, antes da adição do reagente de detecção). Para HRP, use HCl 20 mM em água para inativar as enzimas permanentemente inespecífica adsorvido.
- Após o tempo de incubação, introduzir o reagente de detecção (por exemplo, Vermelho Amplex e peróxido de hidrogénio para HRP) para o chip. Abrir as câmaras logo novamente para lavar o anticorpo secundário nonbound longe e para adicionar o reagente de detecção. Inicie o controlo da cinética da reacção imediatamente.
- Calibração: Imobilizaro anticorpo contra o alvo de interesse. Fechar câmaras. Prepare a diferentes concentrações de analito em tampão ou em lisado de células fora do chip. Aplique uma concentração para o chip e trocar rapidamente o volume dentro das câmaras (500 ms de tempo de abertura). Este tempo de abertura é suficientemente curto para assegurar que não ocorre acumulação adicional de analito de lavagem, e apenas um número específico de moléculas a partir do volume da microcâmara são detectados. A partir da concentração conhecida do antigénio no interior da solução e o volume da câmara (625 pl), calcular a quantidade dentro da câmara. Em seguida, continue com o passo 5.5 e introduzir a porção de detecção.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nossa plataforma é capaz de analisar uma variedade de intracelular, bem como moléculas segregadas presentes em ou produzidos por células individuais. Aqui, nós gostaríamos de apresentar diferentes estudos exemplo para sublinhar a variedade de possíveis ensaios. Vamos dar um exemplo, para uma enzima secretada (Figura 5a), bem como uma enzima intracelular (Figura 5b) e de proteína (Figuras 5c e d). Para mais exemplos, como cofatores ou pequenas moléculas, consulte Eyer et al. (2012) e Eyer et al. (2013).
Primeiro, apresentamos um ensaio para uma enzima secretada (Figura 5a). Após a activação com forbol miristato acetato de forbol (PMA), os monócitos humanos, induzem secreção de lisozima, uma enzima que provoca a lise das células bacterianas. Para este ensaio, a memória intermédia de célula contém 4-metilumbeliferil β-DN, N'-diacetylchitobioside, um substrato fracamente fluorescente para lysozyme. Após a clivagem dos resíduos açúcar por a enzima, o fluoróforo é libertado e pode ser detectado no interior da câmara. Aqui, a vantagem da microcâmara é minimizada a diluição da enzima segregada, permitindo a detecção de concentrações baixas de enzima dentro de um período curto de tempo. Na Figura 5a, várias curvas de exemplo são apresentados representando o volume enzimática da lisozima secretada a partir de células U937 estimuladas individuais. A linha de células U937 deriva de um paciente com linfoma histiocítico, e pode ser induzida a diferenciação monocítica terminal. A linha de células produz TNFa, lisozima e β2-microglobulina após estimulação com PMA. Sem rotatividade é detectável em câmaras ou câmaras abertas isentas de células (linha tracejada).
A Figura 5b mostra a quantificação relativa de uma enzima intracelular, aqui glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH). G6PDH é uma proteína de limpeza e as células a partir do mesmo tecido de origem não deve variar largamente na sua concentração de G6PDH 24. Aqui, as células U937 foram presos na câmara, e que fornecido um ensaio de fluorescência para a detecção de G6PDH em conjunto com o tampão de lise. Ele consiste em glicose-6-fosfato, NADPH, a enzima diaforase e a resazurina substrato, o qual é convertido em resorufina fluorescente quando G6PDH está presente. A taxa de aumento da fluorescência ao longo do tempo corresponde à quantidade de G6PDH. O microchip facilita ainda mais estudos sobre o efeito de compostos tóxicos, por exemplo, por incubação das células com uma toxina (aqui camptotecina) por um tempo definido (60 min). Após este tratamento, a enzima libertada foi lavada afastado e as células foram lisadas, e o nível de G6PDH foi medido. Com efeito, uma perda significativa do teor de enzima intracelular era visível devido a um aumento mais lento de fluorescência (linhas vermelhas e colunas na Figura 5b). Os detalhes deste estudo pode ser encontrado em Eyer et al. 8
e_content "> Além disso, se os resultados de um imunoensaio para a análise dos valores GFP intracelular. Para a expressão induzida, as células HEK293, onde transfectadas com o sistema de expressão de T-REx. Neste sistema, a expressão da GFP pode ser induzida através da adição de tetraciclina . Após 8 horas de incubação, as células foram suspensas, corou para o chip, presa, e subsequentemente lisadas. Captura de anticorpos anti-GFP foram imobilizados na superfície do vidro, seguindo o protocolo apresentado aqui para ligar o GFP libertada a partir da célula. Figura 5c mostra a cinética de ligação do anticorpo para o GFP. Neste exemplo, a GFP pode ser medido directamente através de microscopia de fluorescência total de interna devido à fluorescência da proteína. Queremos destacar que as proteínas não fluorescentes também pode ser detectada por meio de um ELISA sanduíche, ou semelhante formatos. Para isso, os componentes de ensaio necessários podem ser introduzidos após as etapas de lavagem. A vantagem da técnica de ELISA é a amplificação do sinal devidopara a enzima, obtendo-se um produto fluorescente que se acumula no interior da microcâmara.Finalmente, gostaríamos de apresentar um ELISA sanduíche de uma única célula com GAPDH como a proteína alvo. Determinou-se a GAPDH em células U937 suspensão, bem como células HEK293 aderentes (Figura 5d). Para isso, foi imobilizado anticorpo anti-GAPDH (anticorpo de captura). Após a lise celular, o segundo anticorpo marcado com enzima (anticorpo de detecção) foi introduzido. As câmaras foram abertas e, devido ao fluxo, detecção de anticorpos não ligados foram lavados e Amplex Red foi introduzido para a câmara. A conversão de Amplex Red a fluorescente resorufina por HRP (anticorpo de detecção) foi monitorizada ao longo do tempo, em todos os 60 microchambers ao mesmo tempo. A inclinação da parte linear da reacção foi determinada. Esta inclinação está directamente correlacionada com a concentração da enzima e, portanto, para a concentração da substância a analisar. Os resultados a partir de células U937 individuais mostrou uma média de GAPDHquantidade de 2,6 attomol, com valores mínimos e máximos de 2,0 e 3,2 attomol, respectivamente. A análise dos dados de 46 células HEK revelou que as células contidas em média 2,5 GAPDH attomol (mínimo 0,9 attomol; máximo 4,1 attomol).
Figura 1. O microdispositivo e esquemas dos diferentes ensaios apresentados a.) O microdispositivo montado. Aqui, as câmaras são cheias com fluoresceína para visualização (fluorescência verde). Também é visível o reservatório, as conexões para a camada de controle (pressão, conectores 2x4 na parte traseira esquerda e dianteira direita) ea ligação à bomba de seringa (frente). B) Zoom na área de MicroChamber. Muitas destas câmaras podem ser dispostas em matriz. Para visualização, corante laranja foi isolado dentro das câmaras, ao passo que corante alimentar verde é liberada através dos canais. A camada de controlo de pressão é enchido com água. C) zoom numa única microcâmara. D) Esquema de funcionamento do dispositivo. Dentro de um MicroChamber (vista lateral), uma única célula é preso e isolado. A célula pode ser estimulada, incubada, lavada e, finalmente, lisadas dentro do chip. O conteúdo celular pode ser analisada directamente com os ensaios para as enzimas ou co-enzimas, onde uma porção fluorescente é gerado na reacção (esquerda). Por outras proteínas, a superfície pode ser modificado com anticorpos que se ligam especificamente à proteína alvo (direita). Uma vez que o antigénio é ligado à superfície, o lisado pode ser removido por lavagem e detecção de moléculas, tais como anticorpos secundários podem ser adicionados para quantificar a proteína alvo. clique aqui para ampliar .
e 2 "fo: content-width =" 5 polegadas "src =" / files/ftp_upload/50618/50618fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figura 2. Esquemática de sistemas de canais e dimensões do MicroChamber. A) Projeto da máscara da camada fluídica. A camada fluidificada consiste de (a partir da esquerda para a direita) da tomada, a região da câmara, um filtro para reter as partículas e aglomerados de células e uma entrada. A 4 de wafer podem abrigar as estruturas para a produção de 10 fichas. B) Projeto da máscara da camada de controle correspondente. Devido ao espaço necessário para o alinhamento, a 4 de wafer contém as estruturas para a produção de 5 chips. C) esquemáticos de camadas alinhadas (esquerda) e alargamento mostrando uma armadilha célula (à direita), ambos com escalas de comprimento. Clique aqui para ver Ampliar Imagem .
Figura 3. Esquemática do de SU-8 processamento e produção PDMS. A) esquemática do protocolo de processamento SU-8. Uma bolacha de silício é com SU-8 e suave-cozido a 95 ° C durante 4 min spin-revestido. O projeto do canal microfluídicos desejada é transferida para o SU-8, utilizando um photomask e exposição de luz UV. Depois de um cozimento pós-exposição (95 ° C, 5 min), SU-8 é desenvolvido e dura cozido a 180 ° C durante 2 horas. B) esquemática da fabricação de chip de microfluidos. Uma mistura de PDMS oligômero e agente de cura é para o formulário principal para os canais fluídicos spin-revestido, e serviu para o formulário principal para a camada de controle. Os negativos de canal estão representados na cor rosa. Ambas as camadas são curados num forno. A parte camada de controle de chip é desmontada do wafer (canal de controle em azul) e furos para as conexões de pressão são perfurados (branco). Ambas peças de controle elayer-se fluido colocado em plasma de oxigênio, e mais tarde, eles estão alinhados e colados. Todo o chip é então desmontado de forma mestre fluídica (canal de fluido em vermelho) e orifícios de acesso de fluidos são perfuradas (branco). Finalmente, o chip e uma lâmina de vidro são coladas após a ativação da superfície em plasma de oxigênio. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. Esquemática da impressão microcontact. A) fabricação Mestre para litografia macia. (1) Um selo PDMS é incubado com uma solução de proteína (BBSA). (2) A solução é removida, o selo é lavada e uma monocamada de proteína permanece sobre o selo. (3) A marca é colocada numa lâmina de vidro, deste modo, as proteínas são transferidas para o vidro sur face. Durante este tempo, o circuito integrado, juntamente com o selo no vidro são expostas a um plasma de oxigénio. (4) O selo é removido e o circuito integrado é ligado à lâmina de vidro. Para visualização, duas estruturas de exemplo são mostrados, impressos com fluorescente conjugado BSA-fluoresceína. B) área microcontact impressas por câmara. Desde a impressão e as câmaras não estão alinhados, avaliamos as variações nos pontos de ligação (área impressa) sobre três chips diferentes (números 1-3) e todos os 60 microchambers. Como resultado, a variabilidade da câmara-de-câmara é relativamente pequeno (<2,5%) e variabilidade de chip para chip foi insignificante (<1%), demonstrando que não há de fato necessidade de alinhar as estruturas impressas à das câmaras. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
"Width =" 18/50618fig5.jpg 500px "/>
Figura 5. Os resultados de G6PDH, lisozima, GFP e ensaios de GAPDH. Os resultados representativos. A) a secreção de enzimas a partir de células individuais. Esquerda: esquemática do ensaio de uma enzima segregada, aqui lisozima. A lisozima é secretada por células U937 PMA activados individuais e se acumula no interior das microchambers fechados, em que catalisa a produção de fluorescente 4-metilumbeliferona. Direita: Dados obtidos a partir de um experimento de secreção. As curvas verdes mostram a intensidade de fluorescência ao longo do tempo para as câmaras ocupadas por uma célula, também é mostrada uma câmara sem células (preto, linha pontilhada) para comparação. B) Detecção de enzimas intracelulares em células individuais. Esquerda: Esquema do ensaio para a enzima G6PDH intracelular. Após a lise celular, G6PDH intracelular é liberado na câmara, onde os outros componentes para uma cascata de reação enzimática estão presentes. Direita: curvas de exemplo, e dados representativos. Único U937As células foram analisadas quanto ao seu teor de enzima (preto). Mediante a influência tóxica de camptotecina, que permeabiliza a membrana, dois terços da enzima foi perdido (laranja). C) Imunoensaio de proteínas intracelulares de células individuais. Esquerda: Esquema de um imunoensaio, aqui para a GFP proteína intracelular. Os anticorpos anti-GFP foram imobilizados sobre o protocolo de acordo com a superfície aqui descrito. As células foram então lisadas no chip e os pontos de ligação foram monitorizados ao longo do tempo usando microscopia TIRF. Direita: Gráfico de tal experimento mostrando a cinética de ligação de GFP aos anticorpos imobilizados. Ponto de tempo uma marca a introdução do tampão de lise. No ponto de tempo de 2, GFP está a começar a acumular-se sobre a superfície, o que significa que a lise das células ocorreu. A ligação de GFP aos anticorpos é concluído no ponto de tempo 3. D) ELISA em sanduíche de proteínas intracelulares de células individuais. Esquerda: Esquema de um ELISA sanduíche, aqui para a GADPH proteína intracelular. Antianticorpos-GAPDH foram imobilizados sobre o protocolo de acordo com a superfície aqui descrito. As células foram então lisadas no chip e incubado. GPADH libertado ligada ao anticorpo, a câmara foi lavada e o anticorpo de detecção (HRP-acoplado) foi introduzido. Num último passo, o anticorpo de detecção nonbound foi lavado, o reagente de detecção foi introduzido e a reacção foi monitorizada ao longo do tempo. Direita:. Quantificação de GAPDH dentro das células U937 e HEK293 Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Protocolo de modificação de superfície para ELISA
| Passo | Tempo | Concentração | Vazão | Tempo de incubação livre-Flow | Câmara aberto / fechado | ||
| [Min] | (W / v)% | [Il / min] | [Min] | </ Td> | |||
| BSA | 30 | 4 | - | Aberto | |||
| PBS | 10 | 5 | Aberto | ||||
| Avidin | 30 | 0.025 | 5 | Aberto | |||
| PBS | 10 | 5 | Aberto | ||||
| Proteína G, biotina | 30 | 0,0025 | 5 | Aberto | |||
| PBS | 10 | 5 | Aberto | ||||
| Anticorpo | 20 | 0,0001 | 5 | 15 | Aberto | ||
| PBS | 10 | 5 | Aberto | ||||
| Células (300.000 células / ml) | ~ 5 | 30 | Feche quando armadilhas estão ocupados. | ||||
| O tampão de lise | 5 | 30 | Abrir logo | ||||
| Inibidor (por exemplo, 20 mM de HCl) | 15 | 10 | Fechado | ||||
| PBS | 2 | 30 | Fechado | ||||
| O reagente de detecção | 5 | 30 | Abrir logo | ||||
| Comece monitorando reação | |||||||
Tabela 1. Superfície modificatioprotocolo n para ELISA. Para uma explicação, veja o texto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tecnologia microfluídica abriu novas e fascinantes possibilidades de análise de uma única célula. Em particular, a possibilidade de capturar e imobilizar células individualmente por ferramentas microfluídicos tem permitido estudos sistemáticos de curto e longo prazo sobre as propriedades de uma única célula e resposta. Além disso, a encapsulação de células em microgotículas de alta frequência, gerados por um circuito integrado, permitiu estudos de secreção de células individuais, que não podem ser realizados com os dispositivos convencionais de citometria. A abordagem em microgotículas, no entanto, tem algumas limitações quando de incubação e de lavagem são necessários para o protocolo de análise. A nossa abordagem combina ambos os conceitos de aprisionamento de células e o isolamento e, portanto, facilita a realização de ensaios mais complexos incluindo os imunoensaios baseados em anticorpos imobilizados de superfície. Além disso, o método é muito flexível no que diz respeito às aplicações e analitos alvo.
O design do microchip permite (i) efiente aprisionamento de células, (ii) fornecimento de vários tampões e reagentes, e (iii) isolamento fiável num volume muito pequeno, quando necessário. Deste modo, a diluição das moléculas alvo é evitada. Sessenta (centenas) de microchambers estão posicionados em um único dispositivo que permita muitas experiências em paralelo. As válvulas de formato circular, fechando microchambers podem ser tratadas em conjunto ou separadamente por filas e colunas, o que é importante quando a contaminação cruzada de câmaras adjacentes deve ser evitada. Com microchambers fechado, os canais podem ser tratados com soluções prejudiciais, tais como o ácido clorídrico para fins de limpeza, sem afectar as células aprisionadas. Por outro lado, é possível, rápida troca do volume interior da microcâmara. Actualmente é necessário um mínimo de tempo de 200 ms para abrir totalmente a câmara e para introduzir novos reagentes (por troca completa do volume microcâmara, o caudal tem de ser considerada).
Enquanto o nosso método é muito reliable e reprodutível, deve-se ter em mente que existem dois principais pontos críticos do protocolo de fabricação de chips e operação. Em primeiro lugar, a ligação das duas camadas de chips depois da activação de plasma tem de ser feito rapidamente. O alinhamento é crítico, caso contrário, algumas câmaras ou mesmo de todo o chip não pode ser utilizado, uma vez que a ligação é irreversível. Este passo pode ser difícil para usuários inexperientes, no entanto, depois de algum treinamento até menos experiente trabalhadores de laboratório normalmente obter bons resultados. O segundo ponto crítico é a limpeza durante a montagem e utilização do microchip. Se as partículas de pó estão presentes na superfície do chip, que pode comprometer a canais de controlo e as válvulas ou mesmo conduzir a um rompimento do PDMS-PDMS ou ligação PDMS-vidro. Nós, portanto, gastar um monte de atenção aos procedimentos de limpeza. Note-se que, além da forma de fabricação de master (realizado em uma sala limpa), que produzem e usam os microchips em um ambiente de laboratório normal, onde a poeira umª partículas estão presentes.
Apesar de todo o cuidado, se as câmaras não estão a fechar correctamente, é possível que, quer as linhas de pressão estão bloqueados ou o processo de revestimento por rotação não proporcionar a espessura da membrana direita. Além disso, ao longo do tempo foi observada a ligação insuficiente, resultando em quebra da ligação entre as duas camadas de PDMS. Se muitas batatas fritas a partir do mesmo lote estão mostrando este problema, é possível que o tempo entre a activação e o alinhamento de plasma é muito longo. Às vezes, é experimentado PDMS pegajoso sobre as bolachas que não pode ser adequadamente removidos e foi um resultado de silanização insuficiente da bolacha.
Uma vez que o método de produção é estabelecida, a plataforma de microfluidos pode ser utilizado para diversos estudos sobre o nível da célula individual. Aqui, mostramos a detecção de agentes intracelulares e secretadas com ensaios diferentes, mas muitos outros ensaios são possíveis no chip. A maioria das proteínas não são fluorescentes e de seusproteção via imunoensaios não é simples. Implementação de ELISA para o chip vai trazer muitos benefícios. Em primeiro lugar, o ensaio pode ser desenhado de maneira muito específica para a proteína desejada (quando os anticorpos adequados estão presentes). Em segundo lugar, a informação de ELISA pode ser quantificada, mesmo nos limites mais baixos de concentração, dando o número de cópias da molécula de proteína ou presentes na célula.
Nosso atual chip é projetado para a análise de células de mamíferos individuais. No entanto, a modificação do chip para outras células, tais como bactérias, algas e fungos, deve ser possível. Até agora, a única limitação para experiências é a necessidade de um ensaio baseado em fluorescência. No entanto, estamos actualmente a estudar a implementação de espectrometria de massa como uma técnica de detecção. Uma vez que esta é estabelecida, o leque de problemas analíticos que podem ser investigados com a plataforma será ainda mais amplo. Além disso, uma vez que nem todas as análises é possível na presença de tampões de lise celular, nósActualmente estão também a avaliação de vários outras técnicas de lise na plataforma. Temos certeza de que a plataforma microfluídica versátil aqui apresentado fornece a base para novos estudos de uma única célula no proteoma, metaboloma e secretoma nível.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem Tom Robinson para leitura de prova do manuscrito, C. Bärtschi e H. Benz para a construção do sistema de controle de pressão custom-built. Gostaríamos também de agradecer o uso da instalação de sala limpa primeiro e Microscopia de Luz Center (LMC), ambos na ETH Zürich. O trabalho foi financiado pela Merck Serono e do Conselho Europeu de Investigação (ERC) no âmbito do 7 º Programa-Quadro (ERC Começando Grant, projeto n º. 203428, nμLIPIDs).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | n.a. | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane | ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| AZ 726 developer | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Bovine serum albumin, biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Cell dissociation buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Hydrochloric acid | Fluka | 84422 | |
| Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) | n.a. | |
| PBS | Invitrogen | 10010-031 | |
| PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| PLL-g-PEG grafted biotin | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| Potassium chloride | Fluka | 60132 | |
| Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| Silicon wafer | Si-Mat (Kaufering, Germany) | n.a. | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | 1610716 | |
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| 0.22 µm PES syringe filter | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 mm biopsy puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics filter 20 µm | Partec | 04-004-2325 | |
| Centrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a. | |
| Hotplate HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| MA-6 mask aligner | Karl Suess | n.a. | |
| Multizoom AZ100M microscope | Nikon Corporation | n.a. | |
| Photomask | Microlitho, Essex, U.K. | n.a | |
| Plasma Cleaner PDC-32G | Harrick | n.a. | |
| Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a. | |
| Spin Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| Step profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni | n.a. |
References
- Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
- Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
- Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
- Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
- Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
- Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
- Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).
- Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R.
- Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
- White, A. K., VanInsberghe, M., et al.
- Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
- Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
- Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
- Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
- Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).
