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Immunology and Infection

के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल doi: 10.3791/50620 Published: March 23, 2014

Summary

माइकोबैक्टीरियम लेप्री, कुष्ठ रोग की प्रेरणा का एजेंट, इन विट्रो में नहीं उगते. हम एम. की बड़ी मात्रा का रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए एक बैसीलरी निलंबन तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए एक आसान वर्णन आवेदनों की एक किस्म के लिए लेप्री. माउस लुटेरा टीका, व्यवहार्यता का मूल्यांकन, ठंड और विगलन बैसीलरी स्टॉक द्वारा प्रचार के लिए प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित हैं.

Abstract

माइकोबैक्टीरियम लेप्री की वजह से कुष्ठ, ब्राजील सहित दुनिया भर के कई देशों में अभी भी स्थानिक है कि एक महत्वपूर्ण संक्रामक रोग है. एम. उगाने के लिए कोई ज्ञात तरीकों वर्तमान में लेप्री में इन विट्रो, प्रयोगशाला में इस रोगज़नक़ के अध्ययन में एक प्रमुख बाधा पेश. इसलिए, एम. के रखरखाव और विकास लेप्री उपभेदों अधिमानतः athymic नग्न चूहों (परमाणु Foxn1 यू) में प्रदर्शन कर रहे हैं. चूहों का उपयोग के लिए प्रयोगशाला परिस्थितियों में आसानी से उपलब्ध है, प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए मानकीकरण और प्रोटोकॉल के विकास की अनुमति. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित रूप में उपस्थित रिपोर्ट में, हम, न्यूनतम सेल मलबे के साथ और उच्च बैक्टीरियल व्यवहार्यता सूचकांक के साथ एक निलंबन जो पैदावार trypsin, का उपयोग नग्न माउस पैरों के पंजों से बेसिली की शुद्धि के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन. Ziehl-Neelsen द्वारा बैसीलरी गिनती के लिए मानक विधि के लिए एक संशोधनधुंधला और प्रकाश माइक्रोस्कोपी भी प्रदर्शन किया है. इसके अतिरिक्त, हम एम. के रखरखाव और भंडारण के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल के रूप में ठंड और विगलन बैसीलरी शेयरों के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन लेप्री उपभेदों.

Introduction

कुष्ठ रोग, माइकोबैक्टीरियम लेप्री के कारण बीमारी, दुनिया 1,2 भर के कई देशों में एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या है. त्वचा और परिधीय तंत्रिकाओं को प्रभावित करता है कि एक संक्रामक रोग के रूप में जाना जा रहा है के बावजूद, रोग की जटिल immunopathogenesis में शामिल तंत्र के बारे में ज्ञान में कई अंतराल वहाँ अब भी कर रहे हैं.

एम. के चुनौतीपूर्ण विशेषताओं के अलावा अपने अध्ययन में बाधा कि लेप्री कृत्रिम संस्कृति मीडिया और अपने अपेक्षाकृत लंबे दुगनी समय (लगभग 14 दिन) 3,4 में विकसित करने के लिए अपनी असमर्थता हैं. एम. उपयोग करने वाले अधिकांश प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं लेप्री कुष्ठ रोगियों की त्वचा के घावों से या ऐसे armadillos और चूहों 5,6 के कई उपभेदों के रूप में प्रयोगात्मक पशु मॉडल, से शुद्ध बेसिली के साथ स्थापित कर रहे हैं.

कई सालों के लिए, शोधकर्ताओं ने एम. के शोधन पर निर्भर है लेप्री multibacillary lepr की त्वचा के घावों सेप्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में उपयोग के लिए osy रोगियों. लाइव एम. के इन विट्रो खेती या रखरखाव के लिए कई प्रयोगशाला की स्थिति लेप्री प्रयास किया गया है, लेकिन आज तक, पशु मॉडल अनुसंधान प्रयोजनों के लिए सबसे उपयुक्त साबित हुई है. 1960 के दशक और 1970 के दशक में शोधकर्ताओं ने एम. का पता लगाने और मूल्यांकन के लिए चूहों और armadillos का उपयोग शुरू किया विरोधी एम. के जवाब में बैक्टीरियल वृद्धि निगरानी लेप्री व्यवहार्यता, लेप्री दवाओं, और माइक्रोबैक्टीरियल उपभेदों 2,4 के विकास और रखरखाव में.

पशु मॉडल नैतिक चिंताओं, रखरखाव की लागत, पशु रखरखाव के लिए आवश्यक विशेष बुनियादी ढांचे, और परिणाम के गरीब reproducibility और अंतिम पैदावार सहित, विशेष रूप से armadillos और nonhuman primates में, कुछ सीमाएं हैं. वर्तमान में, चूहों कुष्ठ रोग अनुसंधान के लिए पसंदीदा मॉडल जानवर हैं. चूहों का उपयोग के लिए प्रयोगशाला परिस्थितियों प्रदर्शन करने के लिए आसान, आसानी से उपलब्ध हैं, और मानकीकृत प्रोटोकॉल की अनुमति एम. के रखरखाव में इस्तेमाल किया गया है यहां तक कि कम व्यवहार्य बैसीलरी भार के साथ, टी सेल की कमी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया विपुल ग्रेन्युलोमा गठन और अच्छा बैसीलरी गुणन की ओर जाता है, क्योंकि लेप्री उपभेदों. इस प्रकार, इस पशु मॉडल कुष्ठ रोग अनुसंधान समुदाय के भीतर व्यापक स्वीकृति प्राप्त की है.

वर्तमान रिपोर्ट में, हम नग्न माउस पैरों के पंजों से बेसिली के enzymatic शुद्धि के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन, एक एम की तैयारी के लिए करना न्यूनतम सेल मलबे के साथ और उच्च बैक्टीरियल व्यवहार्यता सूचकांक के साथ लेप्री निलंबन. व्यवहार्यता तेजी से प्रयोगशाला में किया जा सकता है जो फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, द्वारा निर्धारित किया जाता है. हम भी ठंड Ziehl-Neelsen धुंधला और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा बैसीलरी गिनती के लिए मानक विधि के लिए एक संशोधन का प्रदर्शन. इसके अतिरिक्त, हम एम. के रखरखाव और भंडारण के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल पेश लेप्री उपभेदों की अनुमति ठंड और बैसीलरी सेंट की विगलनocks.

Protocol

1. माइकोबैक्टीरियम लेप्री निलंबन की तैयारी

  1. Athymic नग्न माउस (परमाणु Foxn1 यू) euthanizing से पहले, trypsin समाधान और संस्कृति मीडिया तैयार (अभिकर्मकों के प्रोटोकॉल - प्रोटोकॉल 1, 2, और 3). नग्न चूहों एम. के साथ 4-5 महीने के बाद टीका euthanize लेप्री पशु की इच्छामृत्यु के लिए AVMA दिशा निर्देशों के अनुसार: 2013 संस्करण 10 (जानवरों की छवियों के प्रयोगों और उपयोग को मंजूरी दी और Faculdade डी Odontologia डे Bauru, खासियत के पशु की देखभाल समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था). 70% इथेनॉल शराब के साथ पूरे माउस साफ, पशुओं को संभालने के लिए इस्तेमाल एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर.
  2. टखने की हड्डियों का संयुक्त करने के लिए बाहर का hemostatic संदंश का उपयोग रियर पंजा पकड़ो. संदंश नीचे कैंची से पंजा कट और 20 मिनट के लिए 2% आयोडीन में पंजा विसर्जित कर दिया. फिर, अन्य रियर पंजा के लिए प्रक्रिया को दोहराने.
  3. एक को पंजे स्थानांतरणआगे के काम के लिए स्वच्छ जैविक सुरक्षा कैबिनेट. , 2% आयोडीन से बाहर पंजे लो बाँझ धुंध के साथ उन्हें सूखी और फिर हड्डी के करीब सभी नरम ऊतक (डर्मिस, बाह्य त्वचा, tendons, और तंत्रिकाओं) को हटाने, संख्या 22 या 23 स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर दो पैरों के पंजों को इकट्ठा. Metatarsals हड्डियों और 1 और 5 वीं phalanges निकालें. एक बाँझ पेट्री डिश में सामग्री प्लेस और स्केलपेल ब्लेड के साथ बंद scraping द्वारा, बाह्य त्वचा को हटा दें. कैंची के साथ छोटे टुकड़ों में ऊतक में कटौती और एक दौर नीचे ट्यूब को हस्तांतरण. वजन ऊतक और हैंक्स बैलेंस्ड नमक समाधान (HBSS) के 1 मिलीलीटर जोड़ें. नमूना के ऊपर वार्मिंग से बचने के लिए बर्फ पर ट्यूब रखें.
  4. HBSS के एक और 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक ऊतक homogenizer का उपयोग नमूना homogenize.
    1. सबसे पहले homogenization चक्र: गति 4 (14,450 आरपीएम) में 15 सेकंड के 3 दालों.
    2. शेष मलबे को खत्म करने के लिए एक सेल झरनी के माध्यम से इसे पारित, एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. समाधान gra द्वारा पारित करने की अनुमतिvity.
    3. HBSS के एक अतिरिक्त 2 मिलीलीटर जोड़ें, और homogenization चक्र (धारा 1.4.1) दोहराने, और फिर सेल झरनी के माध्यम से नमूने गुजरती हैं.
    4. 9 मिलीलीटर मात्रा लाने के लिए HBSS जोड़कर झरनी कुल्ला. सेल झरनी त्यागें.
  5. 0.5% trypsin समाधान के एक विभाज्य पिघलना. एक अंतिम एकाग्रता 0.05% trypsin प्राप्त करने के लिए सेल निलंबन के 9 मिलीलीटर trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें. शेष thawed trypsin त्यागें. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 60 मिनट के लिए सेते हैं. ऊष्मायन के बाद, trypsin पतला करने के लिए बाँझ खारा जोड़कर 40 मिलीलीटर मात्रा को ले आओ.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1700 XG पर अपकेंद्रित्र
  7. ध्यान से ट्यूब inverting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें. ट्यूब दोहन द्वारा गोली Resuspend और फिर बाँझ खारा के 1 मिलीलीटर जोड़ें. निलंबन (ऊतक की उपज / ग्राम गणना करने के लिए) की अंतिम मात्रा को मापने के लिए एक नया शंक्वाकार ट्यूब निलंबन स्थानांतरण.
  8. एक 1 मीटर का उपयोग बैसीलरी निलंबन homogenizeएक 26 जी सुई के साथ एल इंसुलिन सिरिंज एक नया ट्यूब निलंबन स्थानांतरित करते हुए.
  9. प्रत्येक माध्यम में इसका 2 बूँदें (50) उल रखकर निलंबन के सूक्ष्मजीवविज्ञानी नियंत्रण कार्य करें: 7H9 और Lowenstein-जेन्सेन मध्यम और माइक्रोबैक्टीरिया contaminating का पता लगाने के लिए, 30 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. इसी तरह, एक ब्रेन हार्ट आसव (भी) मध्यम टीका लगाना और एरोबिक बैक्टीरिया contaminating का पता लगाने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सेते हैं.
  10. धुंधला के लिए ट्यूब में निलंबन विभाज्य: ठंड Ziehl-Neelsen धुंधला (प्रोटोकॉल 2) के लिए 35 μl, और व्यवहार्यता निर्धारण (प्रोटोकॉल 3) के लिए 200 μl.
  11. Ziehl-Neelsen धुंधला (ZN) के बाद, एसिड तेज बेसिली / एमएल (एएफबी / एमएल) की संख्या की गणना. नग्न चूहों टीका के लिए, एक 1 x 10 8 एएफबी / एमएल निलंबन तैयार, 30 μl / लुटेरा / पशु (प्रोटोकॉल 5) टीका लगाना करने के लिए पर्याप्त मात्रा में करना सुनिश्चित करें, और टीका जब तक निलंबन ठंड रख. ठंड के लिए, एक 1 10 x 7 एएफबी / एमएल SUS तैयारपेंशन (प्रोटोकॉल) 4.

2. शीत Ziehl-Neelsen धुंधला

  1. धुंधला हो जाना शुरू करने से पहले, सीरम / फिनोल समाधान और Zn धुंधला समाधान तैयार (अभिकर्मकों के प्रोटोकॉल - प्रोटोकॉल 4 और 5). एक immunohistochemistry कलम का उपयोग कर तीन गिलास स्लाइड पर तीन हलकों (आंतरिक व्यास 10 मिमी) आकर्षित. (1) सामान्य या undiluted, (2) 1:10, और (3) 1:100 एक नंबर 2 पेंसिल (नोट: कुछ ग्रेफाइट ZN धुंधला के बाद बंद fades) का उपयोग: स्लाइड पहचानें.
  2. 1:10 और 1:100 धारावाहिक dilutions को बैसीलरी निलंबन (1.10 चरण) पतला, यानी undiluted निलंबन के 5 μl और खारा के 45 μl जोड़ने, तो 1:10 के 5 μl लेने और खारा के 45 μl जोड़ें.
  3. सीरम / फिनोल समाधान के 5 μl और चक्र प्रति बैसीलरी निलंबन के 10 μl जोड़ें. Homogenize और एक डिस्पोजेबल पाश की संभाल के साथ सर्कल के आसपास के क्षेत्र में समान रूप से फैला. निलंबन एक समतल मेज पर सूखे की प्रतीक्षा करें.
  4. डी के बादrying, एक लेम्प बर्नर (लगभग 20 सेकंड कुल) 11 के नीले लौ पर स्लाइड 3 बार से गुजर रहा धब्बा तय कर लो.
  5. धुंधला के लिए, 20 मिनट के लिए फ़िल्टर Ziehl-Neelsen carbofuchsine (लगभग 5 एमएल) के साथ स्लाइड की पूरी सतह को कवर किया.
  6. पानी (धीमी प्रवाह) चलाने में स्लाइड कुल्ला.
  7. के बारे में 20 सेकंड के लिए एक 10% एसिड शराब समाधान के साथ स्लाइड कवर.
  8. पानी चलाने में फिर से स्लाइड धो लें.
  9. 5 मिनट के लिए एक methylene नीले समाधान के साथ स्लाइड कवर.
  10. पानी चलाने में स्लाइड कुल्ला और कमरे के तापमान पर इसे सूखा.
  11. एक 100X तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग 20 क्षेत्रों / वृत्त (कुल 60 क्षेत्रों / स्लाइड) गणना. इस प्रकार के रूप एसिड तेज बेसिली / एमएल (एएफबी / एमएल) की गणना कुष्ठ 12 के लिए प्रयोगशाला तकनीक में विवरण के अनुसार किया जाता है:
    एएफबी / क्षेत्र = 60 से विभाजित 3 हलकों (60 क्षेत्रों) में पाया बेसिली की कुल संख्या.
    एएफबी / एमएल = एएफबी / क्षेत्र एक्स निरंतर चक्र का (क्षेत्रX 100) उद्देश्य लेंस एपर्चर के क्षेत्र से विभाजित है, और एक पतला निलंबन गिनती, तो कमजोर पड़ने कारक (10 या 100) द्वारा एएफबी / एमएल की संख्या गुणा.

3. व्यवहार्यता निर्धारण

  1. शुरू करने से पहले, autoclaved एम. तैयार लेप्री निलंबन (अभिकर्मकों के प्रोटोकॉल - प्रोटोकॉल 7). एम. के गुणात्मक निर्धारण के लिए उपयुक्त किट (अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका देखें) का प्रयोग करें निलंबन में लेप्री व्यवहार्यता. के रूप में निम्नानुसार (सभी प्रक्रियाओं मंद प्रकाश के तहत किया जाना चाहिए) समाधान जलमिश्रित:, खारा में 10 का एक पहलू (1 μl स्टॉक प्लस 9 μl खारा) द्वारा समाधान के लिए एक पतला खारा में एक कारक के द्वारा समाधान बी 20 पतला (1 μl शेयर प्लस 19 μl खारा).
  2. परीक्षण किया जाना बैसीलरी निलंबन (कदम 1.10) के 200 μl को पतला समाधान के लिए एक के 3.6 μl और पतला समाधान बी के 6 μl जोड़ें. एक पहले autoclaved एम. लेप्री निलंबन नियमित एक के रूप में प्रयोग किया जाता हैव्यवहार्यता धुंधला के लिए egative नियंत्रण.
  3. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए निलंबन सेते हैं.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 10,600 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र
  5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 10% ग्लिसरॉल के 15 μl में गोली resuspend. एक साफ ग्लास स्लाइड की सतह को 8 μl लागू करें और एक छोटा सा कवर पर्ची के साथ कवर. (आण्विक जांच सिफारिशों देखें) उपयुक्त फिल्टर युक्त, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग स्लाइड का विश्लेषण करें. आयोडाइड (पीआई) धुंधला propidium को धुंधला Syto 9 (SY) की तुलना द्वारा परिणामों का मूल्यांकन.
    नोट: SY दाग दोनों मृत और जीवित बैक्टीरिया के 100% प्रवेश, और पीआई दाग क्षतिग्रस्त झिल्ली के साथ ही बैक्टीरिया प्रवेश. autoclaved निलंबन (नकारात्मक नियंत्रण) सेलुलर मलबे की उपस्थिति के कारण बैक्टीरिया के clumps फार्म कर सकते हैं. लाइव / मृत मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल semiquantitative पैमाने 0 से 2 तक की हो सकती; 0 कोशिकाओं का कम से कम 30% पीआई दाग के लिए सकारात्मक रहे हैं इंगित करता है कि, 1 + 30 के बीच का मतलब है -कोशिकाओं के 50% पीआई दाग के लिए सकारात्मक रहे हैं, 2 + कोशिकाओं के 50% से अधिक पीआई दाग के लिए सकारात्मक रहे हैं मतलब है. 0 का स्कोर इस्तेमाल के लिए सबसे पर्याप्त माना जाता है.

4. ठंड / विगलन एम. लेप्री सस्पेंशन

  1. शुरू करने से पहले, ठंड मध्यम (- प्रोटोकॉल 6 अभिकर्मकों के प्रोटोकॉल) तैयार करते हैं. ठंड के लिए, नीचे वर्णित चरणों का उपयोग करें:
    1. जिसमें निलंबन के 150 μl जोड़ें 1 10 x 7 मध्यम ठंड के 1 मिलीलीटर के साथ एक बाँझ cryovial मिलीलीटर एएफबी /.
    2. एक ठंड कंटेनर में cryovial प्लेस और 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर कंटेनर की दुकान.
    3. एक भंडारण बॉक्स के लिए जमे हुए शीशी स्थानांतरण और -80 डिग्री सेल्सियस पर यह स्टोर
  2. विगलन के लिए, नीचे वर्णित चरणों का उपयोग करें:
    1. -80 डिग्री सेल्सियस से जमे हुए निलंबन के साथ cryovial निकालें और निलंबन विगलन शुरू करने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह है.
    2. बाँझ 20 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में निलंबन डालोखारा. विगलन पूर्ण होने तक धीरे निलंबन मिलाएं.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर, 1700 XG पर 30 मिनट के लिए निलंबन अपकेंद्रित्र
    4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और इच्छित मात्रा तक पहुँचने के लिए पर्याप्त बाँझ खारा जोड़ें. एक सिरिंज (कदम 1.8) के माध्यम से इसे पारित करके निलंबन homogenize.
    5. ZN धुंधला हो जाना, व्यवहार्यता दृढ़ संकल्प और टीका के लिए, प्रोटोकॉल 2, 3 और 5 का पालन करें.

5. माउस टीका

  1. दो लोगों को इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक हैं, एक inoculum प्रशासन के लिए माउस और एक अन्य को नियंत्रित करने के लिए. टीका होने के लिए पशु नैतिक दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए और सभी प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए. पंजे का सामना करना पड़ के साथ गर्दन के कूड़ा द्वारा नग्न माउस सीमित रखें.
  2. एक 26 जी सुई के माध्यम से इसे पारित करके निलंबन homogenize. Inocula के लिए एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ, महाप्राण पर्याप्त बैसीलरी निलंबनते दो पैरों के पंजों (30 μl / लुटेरा).
  3. , रियर पंजा पकड़ इंजेक्शन के लिए पहले 70% इथेनॉल शराब के साथ लुटेरा साफ और सुई के उठाव के साथ सुई intradermally परिचय समीपस्थ से लुटेरा के बाहर का पक्ष करने के लिए, ऊपर की ओर इशारा किया. निलंबन के 30 μl इंजेक्षन. लुटेरा इंजेक्शन anesthetized चूहों में किया जा सकता है.
  4. Inoculum का भाटा से बचने के लिए त्वचा से सुई वापस लेने से पहले 5 सेकंड रुको. चूहे नरम बिस्तर पद टीका पर रखा जाना चाहिए, और ambulation और आत्म विकृति के लक्षण नजर रखी जानी चाहिए.

Representative Results

प्रोटोकॉल की सफलता को तीन तरीके से आकलन किया जा सकता है. सबसे पहले, inoculum की गुणवत्ता का मूल्यांकन सेलुलर मलबे की राशि और अंतिम निलंबन में व्यवहार्य बेसिली के परिणामस्वरूप प्रतिशत (प्रोटोकॉल 3 देखें) द्वारा निर्धारित किया जाता है. आंकड़े 1 और 2 में दिखाया गया है, अंतिम बैसीलरी निलंबन बहुत कम सेल मलबे और उच्च व्यवहार्यता (+ 0 अंक) निहित, सबसे बेसिली Syto 9 हरी फ्लोरोसेंट दाग (दाग मृत और जीवित बैक्टीरिया दोनों के 100% प्रवेश के साथ दाग ध्यान दें कि, चित्रा 1) और लाल पीआई फ्लोरोसेंट दाग (दाग क्षतिग्रस्त झिल्ली, चित्रा 2) के साथ ही बैक्टीरिया प्रवेश के साथ दाग केवल कुछ बेसिली.

चित्रा 1
चित्रा 1. Syto के 9 धुंधला एम. लेप्री निलंबन. हरी प्रतिदीप्ति जीवित और मृत एम. की उपस्थिति को दर्शाता है लेप्री. 400X.

चित्रा 2
चित्रा 2. एम. के पीआई धुंधला मृत एम. के छोटे संख्या दिखा लेप्री निलंबन. लाल प्रतिदीप्ति लेप्री. 400X.

वीडियो (प्रोटोकॉल 1) के रूप में दिखाया दूसरा, उच्च व्यवहार्यता के साथ एक inoculum, स्पष्ट macroscopic घाव के विकास के साथ, 4-5 महीने के बाद टीका के बाद जानवरों के पैरों के पंजों में बेसिली की गुणन पर असर होगा. प्रोटोकॉल की सफलता का आकलन करने के लिए तीसरा रास्ता (प्रोटोकॉल 4 देखें) विभिन्न अवधियों के लिए जमा किया गया था कि बेसिली साथ inoculated माउस पैरों के पंजों में एएफबी के अस्तित्व और गुणन का मूल्यांकन कर रहा है.

"Cellspacing =" 0 "> प्रयोग (जानवर) 0 दिन में एएफबी / एमएल जमी की संख्या व्यवहार्यता स्कोर / 0 दिन अवधि बर्फ़ीली (दिन) ठंड के बाद टीका एएफबी की संख्या ठंड के बाद व्यवहार्यता स्कोर 7 महीने बाद बरामद एएफबी / एमएल की संख्या 1 (1) 1.0 10 x 7 0 + 60 1.7 x 10 5 1 + 2.3 x 10 8 1 (2) 1.0 10 x 7 0 + 60 1.7 x 10 5 1 + 3.8 10 x 7 1 (3) 1.0 10 x 7 0 + 60 1.7 x 10 5 1 + 8.5 10 x 7 1 (4) 1.0 10 x 7 0 + 60 1.7 x 10 5 <टीडी> 1 4.6 10 x 7 2 (1) 1.0 10 x 7 0 + 15 4.2 x 10 5 1 + 1.7 10 x 7 2 (2) 1.0 10 x 7 0 + 15 4.2 x 10 5 1 + 4.8 x 10 6 2 (3) 1.0 10 x 7 0 + 15 4.2 x 10 5 1 + 8.6 x 10 6 3 (1) 1.0 10 x 7 0 + 15 1.7 x 10 5 1 + 1.2 10 x 7 3 (2) 1.0 10 x 7 0 + 15 1.7 x 10 5 1 + 1.8 10 x 7 3 (3) 1.0 10 x 7 15 1.7 x 10 5 1 + 1.8 10 x 7 3 (4) 1.0 10 x 7 0 + 15 1.7 x 10 5 1 + 2.6 10 x 7 3 (5) 1.0 10 x 7 0 + 15 1.7 x 10 5 1 + 3.7 x 10 6

तालिका 1. एम. के परिणाम पोस्ट ठंड निलंबन का उपयोग लेप्री गुणा.

तालिका 1 एम. के परिणामों को दर्शाया गया है ठंड के बाद निलंबन का उपयोग लेप्री विकास. विगलन के बाद निलंबन की व्यवहार्यता स्कोर 1 + था. ठंड प्रोटोकॉल अलग ठंड अवधि का परीक्षण करने के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोगों में किया गया. 15 या 60 दिनों के लिए जमे हुए inocula साथ दोनों प्रयोगों में, परिणाम इसी तरह, पी थीठंड के बाद ropagation 10-1,000 बार टीका (तालिका 1) के 7 महीनों के बाद हर लुटेरा से बरामद एएफबी की संख्या में वृद्धि झुकेंगे. इसलिए, एम. की ठंड OADC (ओलिक एसिड albumin जाने डेक्सट्रोज-Catalase) के साथ पूरक 7H9 मध्यम में लेप्री निलंबन व्यवहार्यता के रखरखाव में हुई.

तीन inocula एम. मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया लेप्री दो अलग ठंड अवधि (15 और 60 दिन) के बाद गुणा. 7 महीने बाद बेसिली टीका चूहों के पैरों के पंजों से बरामद किए गए और Ziehl-Neelsen धुंधला के बाद गिना. Semiquantitative व्यवहार्यता पैमाने: 0 साधन पीआई दाग कोशिकाओं के 30% तक अनुपस्थित, 1 + पीआई दाग कोशिकाओं के 30-50% के बीच का मतलब है, 2 + पीआई दाग कोशिकाओं के 50% से ऊपर का मतलब है. एएफबी: एसिड तेज बेसिली.

Discussion

एम. के प्रचार के लिए एक अच्छी तरह से सचित्र, सफल प्रोटोकॉल का एक विस्तृत विवरण लेप्री बहुत जरूरत है. हमारे अध्ययन से छानने का काम और trypsin पाचन द्वारा inoculum तैयारी के प्रोटोकॉल inocula (+ 0 अंक) बहुत कम सेलुलर मलबे के साथ और बेसिली की उच्च व्यवहार्यता के साथ प्राप्त करने की अनुमति देता है कि यह दर्शाता है. सोडियम हाइड्रोक्साइड बेसिली 6 की शुद्धि के लिए ऊतक disaggregate के लिए इस्तेमाल किया गया है. एम. की शुद्धि के लिए सोडियम हाइड्रोक्साइड का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन अध्ययन लेप्री व्यवहार्यता दृढ़ संकल्प और पशु टीका (नहीं दिखाया डेटा) के लिए निलंबन के homogenization में बाधा, बेसिली के clumps के गठन में हुई.

निस्पंदन और trypsin पाचन द्वारा inoculum तैयारी के साथ सामना करना पड़ा संभावित समस्याओं बैक्टीरियल या फंगल एजेंट के साथ inoculum के सेलुलर मलबे और प्रदूषण की बड़ी राशि शामिल है. मामले में सेलुलर debr की बड़ी मात्रा मेंशोधन के बाद मनाया, या तो trypsin अब सक्रिय नहीं है या जैविक सामग्री का एक अत्यधिक राशि है रहे है. Trypsin शेयर समाधान के enzymatic गतिविधि मूल्यांकन किया जाना चाहिए. प्रारंभिक जैविक सामग्री की अत्यधिक मात्रा में संदिग्ध है, सामग्री aliquots में विभाजित किया जाना चाहिए और प्रोटोकॉल अलग बैचों में बाहर किया जाना चाहिए. बैक्टीरियल या फंगल एजेंट के साथ inoculum के संक्रमण से बचने के लिए, देखभाल सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत सामग्री पर कार्रवाई करने के लिए लिया जाना चाहिए. कवक और / या जीवाणु संक्रमण का पता चला रहे हैं, तो निलंबन खारिज किया जाना चाहिए.

हमारे प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि वर्णित अर्द्ध मात्रात्मक पद्धति का उपयोग व्यवहार्यता के मूल्यांकन की आत्मीयता है. प्रकाशित मात्रात्मक विधि 6 से कम सटीक हालांकि अर्द्ध मात्रात्मक आकलन किया व्यवहार्यता, और अधिक व्यावहारिक है. 0 + और 1 की व्यवहार्यता स्कोर प्रचार और ठंड के रखरखाव के लिए संतोषजनक रहे हैंएम. लेप्री. लाहिड़ी एट अल. पहले से ही 80-90% व्यवहार्य inoculum साथ inoculated नग्न चूहों, टीका के 4-5 महीनों में (उच्च व्यवहार्यता बेसिली) कटाई के लिए उपयुक्त पैरों के पंजों में परिणाम दिखाया है. इसलिए, (4 महीने के आसपास) जल्दी संक्रमण सबसे अच्छा कटाई का समय है. जमे हुए inocula की कटाई के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल में चूहों विकास घटता गारंटी करने के लिए लंबी अवधि (7 माह) के लिए टीका बनाए रखा गया. पर्याप्त व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम अधिमानतः मेजबान और प्रसंस्करण से जैविक सामग्री इकट्ठा करने के बाद 24 घंटे के भीतर, ताजा बेसिली निलंबन का इस्तेमाल होता है. इसके अलावा, अभिकर्मकों की गुणवत्ता, हौसले से तैयार पतला trypsin और व्यवहार्यता धुंधला समाधान, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम की गारंटी करने के लिए आवश्यक हैं.

इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा है कि अंतिम एम. लेप्री निलंबन मेजबान डीएनए, आरएनए, प्रोटीन, आदि से मुक्त नहीं है. इसलिए, अन्य शुद्धि चरणों टी जोड़ा जाना चाहिएओ एक एम. प्राप्त लेप्री निलंबन मेजबान सेल घटकों से मुक्त.

एम. के पूरे ऊतक नमूनों ठंड से व्यवहार्य बेसिली को बनाए रखने के लिए एक विधि लेप्री घावों 9 सूचित किया गया है. हालांकि, Portaels एट अल द्वारा अध्ययन. ठंड और एम. के विगलन के बाद 65-97% के बीच लेकर व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया उल्लेखनीय कमी, लेप्री Armadillo 9 से प्राप्त ऊतक नमूनों संक्रमित. हमारे प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है कि एम. में मनाया व्यवहार्यता सूचकांक (तालिका 1) जमे हुए नहीं किया गया था कि विभाज्य की तुलना में जब ठंड और विगलन के बाद लेप्री निलंबन गिरा. दरअसल, एम. ठंड ठंड मीडिया में लेप्री निलंबन लेकर व्यवहार्यता झुकेंगे व्यवहार्यता स्कोर 1 + के साथ 50-70%, व्यवहार्यता स्कोर 0 + unfrozen निलंबन में प्राप्त हुई थी जबकि से. बहरहाल, एम. के गुणन लेप्री (नग्न चूहों की 7 महीने के बाद टीका के बाद संतोषजनक था एम. ठंड बजाय संक्रमित ऊतक नमूनों की ठंड मीडिया में लेप्री निलंबन, और अधिक कुशल है. हमारे प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम Colston और हिल्सन 8 द्वारा प्रदर्शन के रूप में बेसिली व्यवहार्य बनाए रखने के लिए आवश्यक एक ठंड कंटेनर में एएफबी की धीमी ठंड, है. भविष्य प्रयोगों अब ठंड की अवधि के बाद बेसिली की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए आयोजित किया जाएगा.

संक्षेप में, क्योंकि एम. लेप्री विट्रो में नहीं उगते, हमारे प्रोटोकॉल व्यवहार्य inoculum के रखरखाव के लिए एक तेज और आसान विकल्प के लिए अनुमति देता है, और सफल ठंड कदम इस प्रकार परिभाषित उपभेदों के एक बैंक की स्थापना को सक्षम करने, पशुओं में निरंतर पारित होने के बिना उपभेदों के रखरखाव संभव बनाता है.

यह खंड इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए अभिकर्मकों तैयार करने के लिए निर्देश शामिल हैं.

1. क्लोम - रस

क्लोम - रस 0.5 ग्राम
आसुत जल अप करने के लिए 100 मिलीलीटर

बाँझ फ़िल्टर. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

2. 7H9

7H9 शोरबा आधार 4.7 जी
40% ग्लिसरॉल स्टॉक 5 मिलीलीटर
आसुत जल अप करने के लिए 900 मिलीलीटर

क्रियाशीलता, जबकि पानी के साथ आधार मिश्रण तो ग्लिसरॉल जोड़ें. बाँझ 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

3. ब्रेन दिल निषेचन (भी)

BHI 37 ग्राम
आसुत जल अप करने के लिए 1000 मिलीलीटर

बाँझ 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

4. फिनोल सीरम

4.1) 5% फिनोल

फिनोल 5 मिलीलीटर
आसुत जल अप करने के लिए 100 मिलीलीटर

4.2) सीरम फिनोल

भ्रूण गोजातीय सीरम 2 मिलीलीटर
5% फिनोल 98 मिलीलीटर

4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

5. ठंड Ziehl-Neelsen दाग के लिए समाधान

5.1) CarboFuchsin

Fuchsin 1 ग्राम
फिनोल क्रिस्टल 60 डिग्री सेल्सियस से इनकार 5 मिलीलीटर
शुद्ध एथिल शराब 10 मिलीलीटर
आसुत जल अप करने के लिए 100 मिलीलीटर

प्रत्येक उपयोग से पहले तक.

5.2) methylene नीले बेस

Methylene नीले 3 जी
95% एथिल शराब अप करने के लिए 200 मिलीलीटर

5.3) शराब एसिड

70% शराब 990 मिलीलीटर
chloridric एसिड 10 मिलीलीटर

6. ठंड के लिए मध्यम:

OADC 10 मिलीलीटर
ग्लिसरोल 20 मिलीलीटर
7H9 मध्यम अप करने के लिए 100 मिलीलीटर

उपयोग से पहले ग्लिसरॉल आटोक्लेव और निस्पंदन द्वारा OADC बाँझ.

7. Autoclaved एम. लेप्री निलंबन

20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए बिएट्रिज़ जीसी Sartori, Lázara एम. Trino, एना एलिसा Fusaro और क्लाउडिया PM कार्वाल्हो धन्यवाद. हम जानवरों की सुविधा की स्थापना का समर्थन के लिए प्रणव कुमार दास ने धन्यवाद. हम पांडुलिपि में संशोधन के लिए Lais आरआर कोस्टा धन्यवाद. इस अध्ययन Fundação पौलिस्टा कॉन्ट्रा Hanseníase और Pesquisa à Fundação डे Amparo से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया एस्टाडो डी साओ पाउलो (FAPESP 2009/06122-5) करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BacLight Bacterial Viability Kit Invitrogen; Molecular Probes L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) Sigma H9269
Cryo 1 °C Freezing Container Nalgene 5100001
Lowenstein-Jensen medium LB Laborclin 901122
Saline TEK Nova Inc S5812
Pen Dako S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base TPP 91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon BD Falcon 352340
Trypsin Sigma T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base Sigma-Aldrich M0178 Fluka
Glycerol Gibco BRL 15514011
Brain heart infusion (BHI) Oxoid LTDA CM1135
Fuchsin Merck Millipore 1159370025
Phenol  Invitrogen 15509037
Ethyl alcohol Merck Millipore EX02764
Cloridric acid Merck 1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) Becton Dickinson 211886
Fetal bovine serum Gibco; LifeTechnologies 26140079

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References

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  6. Lahiri, R., Randhawa, B., Krahenbuhl, J. Application of a viability-staining method for Mycobacterium leprae derived from the athymic (nu/nu) mouse foot pad. J. Med. Microbiol. 54, (3), 235-242 (2005).
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के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल<em&gt; माइकोबैक्टीरियम लेप्री</em&gt; तनाव प्रबंधन: athymic नग्न चूहों में जमे हुए शेयर संरक्षण और रखरखाव
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Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).More

Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).

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