Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Оптимизированные протоколы для doi: 10.3791/50620 Published: March 23, 2014

Summary

Микобактерией лепры, возбудитель проказы, не растет в пробирке. Мы описываем легко следовать протоколу подготовить бактериальная подвеска для обеспечения поддержания большого количества М. лепры для различных приложений. Протоколы для распространения с помощью мыши в подушечку лапы прививки, оценки жизнеспособности, замораживания и оттаивания бактериальной складе подробно описаны.

Abstract

Проказа, вызванные Mycobacterium лепры, является важным инфекционное заболевание, которое по-прежнему эндемическим во многих странах по всему миру, включая Бразилию. Там в настоящее время нет известных методов для выращивания М. лепры в пробирке, представляя собой серьезное препятствие в изучении этого патогена в лаборатории. Таким образом, техническое обслуживание и рост M. Штаммы лепры предпочтительно осуществляют в бестимусных голых мышей (NU-Foxn1 NU). Лабораторные условия для использования мышей легко доступны, легко выполнить, и позволяют стандартизации и разработку протоколов для достижения воспроизводимых результатов. В настоящем докладе мы описываем простой протокол для очистки бацилл из обнаженных подушечек лап мыши, используя трипсин, который дает суспензию с минимальным мусора клеток и с высокой бактериальной индекса жизнеспособности, как это определено флуоресцентной микроскопии. Модификация стандартного метода для бактериальной подсчета по Циля-Нильсенаокрашивания и световой микроскопии также продемонстрировал. Кроме того, мы опишем протокол для замораживания и оттаивания бациллярных запасов в качестве альтернативного протокола для технического обслуживания и хранения М. штаммы лепры.

Introduction

Проказа, заболевание, вызываемое микобактериями лепры, является важной проблемой общественного здравоохранения во многих странах по всему миру 1,2. Несмотря на то, известен как инфекционного заболевания, которое влияет как на кожу и периферические нервы, есть еще несколько пробелов в знаниях о механизмах, участвующих в комплексной иммунопатогенезе заболевания.

Среди сложных характеристик М. лепры, которые мешают его изучение является его неспособность расти в искусственных питательных сред и его время относительно долго удвоения (примерно 14 дней) 3,4. Большинство экспериментальных процедур, которые используют М. лепры настроены бациллами очищенных от поражения кожи больных проказой или из экспериментальных моделях на животных, таких, как броненосцы и несколько линий мышей 5,6.

В течение многих лет исследователи зависит от очистки М. лепры от поражения кожи мультибациллярная LeprOsy пациентов для использования в экспериментальных процедур. Несколько лабораторные условия для выращивания в пробирке или поддержания живой М. лепры были попытки, но на сегодняшний день, модели на животных доказали, что наиболее подходит для исследовательских целей. В 1960-х и 1970-х годов, исследователи начали использовать мышей и броненосцы для обнаружения и оценки М. лепры жизнеспособность, мониторинг роста бактерий в ответ на анти-М. лепры препараты, и в росте и поддержании штаммов микобактерий 2,4.

Модели животных имеют некоторые ограничения, особенно в броненосцев и приматов, в том числе этические проблемы, стоимости обслуживания, специальной инфраструктуры, необходимой для обслуживания животных и плохой воспроизводимости результатов и конечных урожайности. В настоящее время, мыши являются предпочтительным животная модель для лепры исследований. Лабораторные условия для использования мышей легко доступны, легко выполнить, и позволяют стандартных протоколов M. лепры штаммы, поскольку, даже при низких жизнеспособных бацилл нагрузок, Т-клеточный иммунный ответ с дефицитом приводит к избыточной формирования гранулемы и хорошей бактериальной умножения. Таким образом, эта модель животное получило широкое признание в рамках исследовательского сообщества проказы.

В настоящем докладе мы описываем простой протокол для ферментативного очищения бацилл из обнаженных подушечек лап мыши, предназначен для приготовления М. лепры подвеска с минимальным мусора клеток и с высокой бактериальной индекса жизнеспособности. Жизнеспособность определяется флуоресцентной микроскопии, которые могут быть быстро выполненной в лаборатории. Мы также демонстрируют модификацию со стандартным методом для бактериальной подсчета по холодной Циля-Нильсена окрашивания и световой микроскопии. Кроме того, мы представляем альтернативное протокол для обслуживания и хранения М. штаммы лепры, позволяя замораживание и оттаивание бактериальной улocks.

Protocol

1. Подготовка микобактерией лепры подвеска

  1. Перед эвтаназии в бестимусных голых мышь (НУ-Foxn1 ню), приготовления раствора трипсина и питательных сред (протокол реагентов - Протоколы 1, 2 и 3). Усыпить голым мышам 4-5 месяцев после прививки с М. лепры в соответствии с AVMA принципов для эвтаназии животных: 2013 издание 10 (эксперименты и использование образов животных были утверждены и проводятся в соответствии с руководящими принципами по уходу за животными комитета Faculdade де Odontologia де Бауру, USP). Внутри бокс биологической безопасности, используемого для обработки животных, очистить всю мышь с 70% этиловым спиртом.
  2. Держите заднюю лапу помощи гемостаза щипцы дистальных к предплюсневому суставу. Разрежьте лапу от ножницами ниже пинцетом и опустите в нее лапу в 2% йода в течение 20 мин. Затем повторите процедуру для другого задней лапой.
  3. Перенесите лапы, чтобычистой биологической безопасности шкаф для дальнейшей работы. Возьмите лапы из 2% йода, высушить их с стерильную марлю, а затем собрать два разбойников, используя номер 22 или 23 лезвие скальпеля, удаляя все мягкие ткани (дермы, эпидермиса, сухожилий и нервов) близко к кости. Удалите плюсневых костей кости и 1 и 5 фаланг. Поместите материал в стерильную чашку Петри и удалить эпидермис, путем соскоба его с лезвие скальпеля. Разрежьте ткань на мелкие кусочки с ножницами и передавать их на круглым дном трубки. Вес ткани и добавить 1 мл Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS). Держите трубку на льду, чтобы избежать разогрева образца.
  4. Добавить еще 1 мл HBSS и гомогенизации образца с использованием гомогенизатора тканей.
    1. Впервые гомогенизации цикл: 3 импульсы 15 сек на скорости 4 (14450 оборотов в минуту).
    2. Передача супернатант в стерильную 50 мл коническую трубку, пропуская его через клеточный фильтр для устранения оставшегося мусора. Разрешить решение пройти мимо граVity.
    3. Добавить еще 2 мл HBSS, и повторить цикл гомогенизации (раздел 1.4.1), и передать образцы через ячейки фильтра снова.
    4. Промойте фильтр, добавив HBSS, чтобы довести объем до 9 мл. Откажитесь от клеток фильтр.
  5. Оттепель аликвоту 0,5% раствора трипсина. Добавить 1 мл трипсина в 9 мл клеточной суспензии, чтобы получить конечную концентрацию 0,05% трипсина. Откажитесь оставшиеся талой трипсин. Выдержите в течение 60 мин в водяной бане при 37 °. После инкубации довести объем до 40 мл добавлением стерильного физиологического раствора, чтобы разбавить трипсина.
  6. Центрифуга при 1700 мкг в течение 30 мин при 4 ° С.
  7. Жидкость над осадком сливают, тщательно переворачивая пробирку. Ресуспендируют гранул, нажав на трубку, а затем добавить 1 мл стерильного физиологического раствора. Передача суспензии в новую коническую трубку измерительного конечного объема суспензии (рассчитать выход / грамм ткани).
  8. Гомогенизируют бактериальная подвеска с использованием 1 мл инсулин шприц с 26 G иглы при передаче подвеску в новую пробирку.
  9. Выполнение микробиологический контроль суспензии путем размещения по 2 капли (50 мкл) этого в каждую из сред: 7H9 и Lowenstein-Jensen среда и инкубируют при 37 ° С в течение 30 дней, для обнаружения загрязнения микобактерий. Аналогичным образом, инокуляции Brain Heart Infusion (BHI) среде и инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С, для обнаружения загрязнения аэробные бактерии.
  10. Алиготе суспензии в трубах для окрашивания: 35 мкл для холодной Циля-Нильсена окрашивания (протокол 2) и 200 мкл для определения жизнеспособности (протокол 3).
  11. После Циля-Нильсена окрашивания (ZN), рассчитать количество кислот микобактерий / мл (AFB / мл). Для голых мышей прививки, подготовить 1 х 10 8 AFB / мл суспензии; убедитесь, что достаточный объем, чтобы привить 30 мкл / подушечку / животное (протокол 5), и не держать подвески холод до прививки. Для замораживания, подготовить 1 х 10 7 AFB / мл устойпенсия (протокол 4).

2. Холодный Циля-Нильсена Окрашивание

  1. Перед началом окрашивания, приготовления раствора сыворотки / фенол и окрашивания ZN решения (протокола реагентов - Протоколы 4 и 5). Нарисуйте три круга (внутренний диаметр 10 мм) на трех стеклах с использованием иммуногистохимии ручку. Определить слайды: (1) нормальные или неразбавленные, (2) 1:10, и (3) 1:100, используя карандаш номер 2 (Примечание: Некоторые графит исчезает прочь после окрашивания ZN).
  2. Развести бактериальная суспензии (Шаг 1,10) к 1:10 и 1:100 серийных разведений, т.е. добавить 5 мкл неразбавленного подвески и 45 мкл физиологического раствора, а затем взять 5 мкл 1:10 и добавить 45 мкл физиологического раствора.
  3. Добавьте 5 мкл сыворотки / раствора фенола и 10 мкл бактериальной суспензии на круг. Однородный и равномерно вокруг площади круга с ручкой одноразового цикла. Подождите, пока подвеска сушить на сравняли таблице.
  4. После гнении, исправить мазок, передав слайде 3 раза за синей пламени Бунзена горелки (около 20 сек общего) 11.
  5. Для окрашивания, покрывают всю поверхность слайда с фильтрованной Циля-Нильсена carbofuchsine (около 5 мл) в течение 20 мин.
  6. Промойте слайд в проточной воде (медленный поток).
  7. Накройте слайд с 10% спиртового раствора кислоты в течение приблизительно 20 сек.
  8. Вымойте слайд снова в проточной воде.
  9. Накройте слайд с метиленовым синим раствор в течение 5 мин.
  10. Промойте слайд в проточной воде и дайте ему высохнуть при комнатной температуре.
  11. Всего 20 полей / круг (всего 60 полей / слайд) с использованием 100X масло погружения цели. Расчет кислот микобактерий / мл (AFB / мл) делается следующим образом, в соответствии с описанием в лабораторных методов для лепры 12:
    AFB / поле = общее количество бацилл, найденных в 3 круга (60 полей), деленная на 60.
    AFB / мл = AFB / поле х постоянной (площадь кругах 100, деленная на площадь объективной диафрагмы объектива), и если подсчета разбавленной суспензии, умножить число КУМ / мл на коэффициент разбавления (10 или 100).

3. Определение Жизнеспособность

  1. Перед началом подготовки Автоклавированный М. лепры подвеска (Протокол реагентов - Протокол 7). Используйте соответствующий комплект (см. таблицу реагентов и оборудования) для качественного определения М. лепры жизнеспособность в суспензии. Развести решения следующим образом (все процедуры должны быть выполнены при слабом освещении): разбавленный раствор А на коэффициент 10 в физиологическом растворе (1 мкл фондовом плюс 9 мкл физиологического раствора), разбавленным раствором B 20 на коэффициент в солевом растворе (1 мкл запас плюс 19 мкл раствор).
  2. Добавить 3,6 мкл разбавленных раствором А и 6 мкл разбавленных раствора В до 200 мкл бактериальной суспензии быть проверены (шаг 1,10). Ранее в автоклаве М. лепры подвеска обычно используется какegative управления для окрашивания жизнеспособности.
  3. Инкубируйте суспензии в течение 15 мин, при комнатной температуре в темноте.
  4. Центрифуга трубки при 10600 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
  5. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 15 мкл 10% глицерина. Применить 8 мкл на поверхность чистое предметное стекло и покрыть ее с небольшим покровным. Анализ слайд с помощью флуоресцентного микроскопа, содержащей соответствующие фильтры (см. молекулярных зондов рекомендации). Оцените результаты, сравнивая SYTO 9 (SY) окрашивания на пропидийиодидом окрашивания (PI).
    Примечание: Си пятно проникает 100% как умерших, так и живых бактерий, П. И. пятно проникает только бактерии с поврежденными мембранами. В автоклаве суспензию (отрицательный контроль) может образовывать комки из-за бактерий присутствии клеточных остатков. Полуколичественная шкала используется для живой / мертвый оценки изменяется от 0 до 2 +; 0 означает, что менее 30% клеток являются позитивными для PI пятно; 1 + означает от 30 -50% клеток являются позитивными для PI пятно; 2 + означает более 50% клеток являются позитивными для PI пятно. Оценка 0 считается наиболее адекватным для использования.

4. Замораживание / размораживание М. лепры Подвеска

  1. Перед началом подготовки морозильной среды (протокол реагентов - Протокол 6). Для замораживания, выполните действия, описанные ниже:
    1. Добавить 150 мкл суспензии, содержащей 1 × 10 7 AFB / мл в стерильную криопробирку вместе с 1 мл замораживания среды.
    2. Поместите криопробирку в контейнере замерзания и хранить контейнер при температуре -80 ° С в течение 24 часов.
    3. Перенести замороженный флакон в ящике для хранения и хранить его при температуре -80 ° С.
  2. Для оттаивания, выполните действия, описанные ниже:
    1. Удалить криопробирку с замороженной отстранения от -80 ° С и поместите его в водяной бане при 37 ° C, чтобы начать оттаивания суспензии.
    2. Налейте суспензии в пробирку, содержащую 20 мл стерильнойзасолены. Смешайте подвеска мягко, пока оттаивания не будет завершена.
    3. Центрифугируют суспензию в течение 30 мин, при 1700 х г, при 4 ° С.
    4. Удалите супернатант и добавить достаточно стерильного физиологического раствора для достижения желаемого объема. Однородный суспензии путем пропускания его через шприц (этап 1.8).
    5. Для окрашивания ZN, определение жизнеспособности и прививки, следуйте Протоколы 2, 3 и 5.

5. Мышь Прививка

  1. Два человека необходимы для этой процедуры, один сдерживать мышь и другое для администрирования посевной. Животное быть защищен должна производиться в соответствии с этическими принципами и правилами, и все процедуры должны быть утверждены институциональной уходу и использованию животных комитета. Задержите голых мышей с помощью шиворот с лапы вверх.
  2. Гомогенизируют суспензии путем пропускания его через 26 G иглы. С 1 мл шприц, аспирации достаточно бактериальная суспензия для посевного материалаТе два подушечек лап (30 мкл / подушечку).
  3. Удерживая заднюю лапу, очистить подушечку лапы с 70% этиловым спиртом перед инъекцией и ввести иглу внутрикожно с скоса иглы направлен вверх, от проксимального к дистальному стороне подушечку лапы. Введите 30 мкл суспензии. Подушечку лапы инъекции могут быть выполнены в анестезированных мышей.
  4. Подождите 5 секунд до снятия иглу из кожи, чтобы избежать рефлюкс посевного. Мыши должны быть размещены на мягких постельных принадлежностей после инокуляции, и передвигаться и признаки членовредительства должны контролироваться.

Representative Results

Успех протокола могут быть оценены в трех направлениях. Во-первых, оценка качества посевного материала определяется количеством клеточного дебриса и полученный процент жизнеспособных бактерий в конечной суспензии (см. Протокол 3). Как показано на фигурах 1 и 2, конечный бактериальной суспензии содержали очень мало клеточного дебриса и высокую жизнеспособность (оценка 0 +); отметить, что большинство бациллы окрашивали Сыто 9 зеленого флуоресцентного красителя (краситель проникает 100% от обеих мертвых и живых бактерий, Рисунок 1) и лишь немногие бактерии окрашивают в красный PI флуоресцентным красителем (пятно проникает только бактерии с поврежденными мембранами, рисунок 2).

Рисунок 1
Рисунок 1. Сыто 9 окрашивание М. лепры подвеска. Зеленый флуоресцентный демонстрирует наличие живого и мертвого М. лепры. 400X.

Рисунок 2
Рисунок 2. П.И. окрашивание М. лепры подвеска. Красная флуоресценции показывая небольшое количество мертвой М. лепры. 400X.

Во-вторых, инокулят с высокой жизнеспособностью повлияет на размножение бактерий в подушечки лап животных после 4-5 мес после инокуляции, с развитием очевидным макроскопической поражения, как показано на видео (протокол 1). Третий способ оценки успешности протокола является путем оценки выживание и размножение микобактерий в подушечки лап мыши привитых бациллами, которые были заморожены в течение различных периодов (см. Протокол 4).

"CellSpacing =" 0 "> Эксперимент (животное) Количество AFB / мл замороженные в день 0 Оценка жизнеспособности / день 0 Замораживание период (дней) Количество AFB прививку после замораживания Оценка жизнеспособности после замораживания Количество AFB / мл восстановленных после 7 месяцев 1 (1) 1.0 х 10 7 0 + 60 1,7 х 10 5 1 + 2,3 х 10 8 1 (2) 1.0 х 10 7 0 + 60 1,7 х 10 5 1 + 3,8 х 10 7 1 (3) 1.0 х 10 7 0 + 60 1,7 х 10 5 1 + 8,5 х 10 7 1 (4) 1.0 х 10 7 0 + 60 1,7 х 10 5 <TD> 1 + 4,6 х 10 7 2 (1) 1.0 х 10 7 0 + 15 4,2 х 10 5 1 + 1,7 х 10 7 2 (2) 1.0 х 10 7 0 + 15 4,2 х 10 5 1 + 4,8 х 10 6 2 (3) 1.0 х 10 7 0 + 15 4,2 х 10 5 1 + 8,6 х 10 6 3 (1) 1.0 х 10 7 0 + 15 1,7 х 10 5 1 + 1.2 х 10 7 3 (2) 1.0 х 10 7 0 + 15 1,7 х 10 5 1 + 1,8 х 10 7 3 (3) 1.0 х 10 7 15 1,7 х 10 5 1 + 1,8 х 10 7 3 (4) 1.0 х 10 7 0 + 15 1,7 х 10 5 1 + 2,6 х 10 7 3 (5) 1.0 х 10 7 0 + 15 1,7 х 10 5 1 + 3,7 х 10 6

Таблица 1. Результаты М. лепры умножение с использованием суспензий сообщение замораживания.

Таблица 1 показывает результаты М. лепры рост использования суспензий после замораживания. Счет жизнеспособность суспензий после оттаивания было 1 +. Протокол замораживание проводилось в трех независимых экспериментов, чтобы проверить различные периоды замораживания. В обоих экспериментах с инокулятов заморожены в течение 15 или 60 дней, результат был похож, стр.ropagation после замораживания дали 10-1000 раз увеличить количества AFB оправился от каждой лапы после 7 месяцев прививки (табл. 1). Таким образом, замораживание М. лепры суспензии в 7H9 среде с добавлением OADC (олеиновая кислота-альбумин-декстроза-каталазы) привело к поддержанию жизнеспособности.

Три посевной были использованы для оценки М. лепры умножения после двух разных периодов замораживания (на 15 и 60 дней). После 7 месяцев, бациллы были извлечены из Сапоги привитых мышей и подсчитывали после окрашивания Циля-Нильсена. Полуколичественный жизнеспособность шкала: 0 означает отсутствовать до 30% от PI окрашенных клеток; 1 + означает между 30-50% PI окрашенных клеток; 2 + означает более 50% от PI окрашенных клеток. AFB: кислота бациллы.

Discussion

Подробное описание хорошо показано на чертеже, протокол для успешного распространения M. лепры крайне необходимо. Наше исследование показывает, что протокол подготовки посевной фильтрацией и трипсина пищеварения позволяет посевной должны быть получены с очень мало продуктов распада клеток и с высокой жизнеспособности бактерий (оценка 0 +). Гидроксид натрия был использован для разбивки ткани для очистки бацилл 6. Исследования, проведенные в нашей лаборатории, используя гидроксид натрия для очистки М. лепры привело к образованию комков бацилл, препятствуя гомогенизации суспензии для определения жизнеспособности и животного прививки (данные не представлены).

Потенциальные проблемы, связанные с приготовления инокулята фильтрованием и трипсин-переваривание включают большое количество клеточных остатков и загрязнения инокулята с бактериальными или грибковыми агентами. В случае больших количеств клеточной Дебрене наблюдаются после очистки, либо трипсин больше не является активным или существует избыточное количество биологического материала. Ферментативной активности трипсина маточного раствора должен быть оценен. Если чрезмерное количество исходного биологического материала подозревается, материал должен быть разделен на аликвоты и протокол должен осуществляться отдельными партиями. Во избежание загрязнения посевного с бактериальной или грибковой агентов, необходимо позаботиться, чтобы обработать материал в асептических условиях. Если грибковые и / или бактериальное загрязнение обнаружено подвеска следует отказаться.

Ограничением нашего протокола является субъективность оценки жизнеспособности с использованием описанного полу-количественный метод. Жизнеспособность оценивали полуколичественно является более практичным, хотя и менее точным, чем опубликованной количественного метода 6. Жизнеспособность оценка 0 + и 1 + являются удовлетворительными для обеспечения распространения и замораживанияМ. лепры. Лахири и др.. уже показали, что голым мышам инокулированные 80-90% жизнеспособных посевного, привести к подушечек лап, пригодных для сбора урожая (высокая жизнеспособность бациллы) на 4-5 месяцев прививки. Таким образом, ранняя инфекция (около 4-х месяцев) это лучшее время сбора урожая. Для уборки замороженного посевного материала, мыши в настоящем Протоколе поддерживались инокулированный на более длительный срок (7 месяцев) по обеспечению кривые роста. Важным шагом для обеспечения адекватного жизнеспособность является использование свежих суспензий бацилл, предпочтительно в течение 24 часов после сбора биологического материала от хоста и обработки. Кроме того, качество реагентов, свежеприготовленные разбавленные трипсина и жизнеспособность окрашивания решения, которые необходимы, чтобы гарантировать воспроизводимые результаты.

Еще одно ограничение этого протокола является то, что в финал М. лепры подвеска не свободна от хозяина ДНК, РНК, белков и т.д.. Таким образом, другие этапы очистки должны быть добавлены то получения М. лепры подвеска содержащей компоненты клетки-хозяина.

Способ поддержания жизнеспособных бактерий путем замораживания целые образцов тканей из М. лепры поражения сообщалось 9. Тем не менее, исследование Portaels и соавт. продемонстрировали значительные потери жизнеспособности, в диапазоне от 65-97% после замораживания и оттаивания М. лепры инфицированных образцов тканей, полученных из броненосца 9. Наш протокол показали, что индекс жизнеспособность наблюдается в М. лепры суспензии после замораживания и оттаивания упал по сравнению с аликвоты, которые не были заморожены (табл. 1). В самом деле, замораживание М. лепры подвеска в морозильных СМИ дали жизнеспособность в диапазоне от 50-70%, с жизнеспособности счетом 1 +, в то время как жизнеспособность оценка 0 + был получен в незамерзшей подвески. Тем не менее, умножение М. лепры было удовлетворительным после 7 месяцев после прививки голых мышей ( М. лепры подвеска в замораживания средств массовой информации, а образцов зараженных тканей, является более эффективным. Важным шагом нашего протокола является медленное замораживание САФ в морозильной контейнера, необходимых для поддержания бациллы жизнеспособным, о чем свидетельствует Колстона и Hilson 8. Дальнейшие эксперименты должны быть проведены, чтобы оценить жизнеспособность бактерий после длительного замораживания.

Таким образом, поскольку M. лепры не растет в пробирке, наш протокол позволяет быстро и просто альтернатива для поддержания жизнеспособного посевного и успешным шагом замораживания делает возможным поддержание штаммов без постоянного прохода в животных, что позволяет создание банка определенных штаммов.

Этот раздел содержит инструкции для приготовления реагентов для выполнения этого протокола.

1. Трипсин

Трипсин 0,5 г
Дистиллированная вода до 100 мл

Фильтр стерилизуют. Хранить при -20 ° С.

2. 7H9

7H9 бульона база 4,7 г
40% запаса глицерина 5 мл
Дистиллированная вода до 900 мл

Смешайте базу водой, затем добавить глицерин при перемешивании. Автоклаве при 121 ° С в течение 20 мин для стерилизации. Хранить при 4 ° С.

3. Мозг сердце настой (BHI)

BHI 37 г
Дистиллированная вода до 1000 мл

Автоклаве при 121 ° С в течение 15 мин для стерилизации. Хранить при 4 ° С.

4. Фенол сыворотки

4.1) 5% фенола

Фенол 5 мл
Дистиллированная вода до 100 мл

4.2) Сыворотка фенол

фетальной бычьей сыворотки 2 мл
5% фенола 98 мл

Хранить при 4 ° С.

5. Решения для холодной Циля-Нильсена Stain

5.1) CarboFuchsin

Фуксин 1 г
Кристаллы Фенол, слитый с 60 ° С 5 мл
Чистый этиловый спирт 10 мл
Дистиллированная вода до 100 мл

Фильтр перед каждым использованием.

5.2) Метиленовый синий База

Метиленовый синий 3 г
95% этиловый спирт до 200 мл

5.3) Алкоголь кислоты

70% алкоголя 990 мл
chloridric кислоты 10 мл

6. Среда для замораживания:

OADC 10 мл
Глицерин 20 мл
7H9 среднего до 100 мл

Автоклав глицерина перед использованием и стерилизовать OADC путем фильтрации.

7. Автоклавного М. лепры подвеска

Автоклаве при 121 ° С в течение 20 мин. Хранить при -20 ° С.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим Беатрис GC Сартори, Lazara М. Trino, Ана Elisa Fusaro и Клаудия PM Карвалью за техническую помощь. Мы благодарим Пранаба К. Дас для оказания поддержки в создании объекта животного. Мы благодарим LAIS RR Costa пересмотра рукопись. Это исследование было поддержано грантами от Fundação Паулиста противопоказаний Hanseníase и Fundação де Ампаро à Pesquisa сделать Estado де Сан-Паулу (FAPESP 2009/06122-5).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BacLight Bacterial Viability Kit Invitrogen; Molecular Probes L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) Sigma H9269
Cryo 1 °C Freezing Container Nalgene 5100001
Lowenstein-Jensen medium LB Laborclin 901122
Saline TEK Nova Inc S5812
Pen Dako S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base TPP 91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon BD Falcon 352340
Trypsin Sigma T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base Sigma-Aldrich M0178 Fluka
Glycerol Gibco BRL 15514011
Brain heart infusion (BHI) Oxoid LTDA CM1135
Fuchsin Merck Millipore 1159370025
Phenol  Invitrogen 15509037
Ethyl alcohol Merck Millipore EX02764
Cloridric acid Merck 1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) Becton Dickinson 211886
Fetal bovine serum Gibco; LifeTechnologies 26140079

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saúde, M. inistérioda, Brasil, Secretaria de Vigilância em Saúde: situação epidemiológica da hanseníase no Brasil. Informe epidemiológico 2008. Forthcoming.
  2. Scollard, D. M., Adams, L. B., Gillis, T. P., Krahenbuhl, J. L., Truman, R. W., Williams, D. L. The continuing challenges of leprosy. Clin. Microbiol. Rev. 19, (2), 338-381 (2006).
  3. Rosa, P. S., Belone, A. deF., Lauris, J. R., Soares, C. T. Fine-needle aspiration may replace skin biopsy for the collection of material for experimental infection of mice with Mycobacterium leprae and Lacazia loboi. Int. J. Infect. Dis. 14, 49-53 (2010).
  4. Truman, R. W., Krahenbuhl, J. L. V. iableM. leprae as a research reagent. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 69, (1), 1-12 (2001).
  5. Levy, L., Ji, B. The mouse foot-pad technique for cultivation of Mycobacterium leprae. Lepr. Rev. 77, (1), 5-24 (2006).
  6. Lahiri, R., Randhawa, B., Krahenbuhl, J. Application of a viability-staining method for Mycobacterium leprae derived from the athymic (nu/nu) mouse foot pad. J. Med. Microbiol. 54, (3), 235-242 (2005).
  7. Katoch, V. M. The contemporary relevance of the mouse foot pad model for cultivating. 80, (2), 2-120 (2009).
  8. Colston, M. J., Hilson, G. R. The effect of freezing and storage in liquid nitrogen on the viability and growth of Mycobacterium leprae. J. Med. Microbiol. 12, (1), 1-137 (1979).
  9. Portaels, F., Fissette, K., De Ridder, K., Macedo, P. M., De Muynck, A., Silva, M. T. Effects of freezing and thawing on the viability and the ultrastructure of in vivo grown mycobacteria. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 56, (4), 580-587 (1988).
  10. American Veterinary Medical Association. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. Edition. Schaumburg, Illinois, USA, https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf. 1-102 (2013).
  11. Saúde, M. inistérioda, Brasil, Guia de procedimentos técnicos - Baciloscopia em hanseníase, Série A: Normas e manuais técnicos. (2010).
  12. Health Organization, W. orld, Geneva, Laboratory techniques for leprosy Forthcoming.
Оптимизированные протоколы для<em&gt; Микобактерией лепры</em&gt; Штамм Управление: Замороженные со сохранения и поддержания у бестимусных голых мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).More

Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter