Summary
Notre laboratoire a développé un système d'imagerie automatisé à haut débit roman qui est utile pour la détection de plusieurs comportements différents dans 7-day-old larves de poisson zèbre. Le système peut être utilisé pour détecter des changements subtils dans le comportement après que les larves ont été exposés à des substances toxiques de l'environnement ou des produits pharmaceutiques.
Abstract
Nous avons créé un système d'imagerie à haut débit roman pour l'analyse du comportement des larves de poisson zèbre 7-day-old dans des plaques multi-voies. Ce système mesure les comportements spontanés et la réponse à un stimulus aversif, qui est représentée aux larves sur une présentation PowerPoint. Les images enregistrées sont analysées avec une macro ImageJ, qui divise automatiquement les canaux de couleurs, soustrait le fond, et applique un seuil pour déterminer le placement des larves individu dans les ruelles. Nous pouvons alors importer les coordonnées dans une feuille Excel pour quantifier la vitesse de nage, la préférence pour le bord ou sur le côté de la voie, le comportement de repos, thigmotaxis, la distance entre les larves et le comportement d'évitement. Des changements subtils dans le comportement sont facilement détectés par notre système, ce qui est utile pour des analyses du comportement après une exposition à des substances toxiques de l'environnement ou des produits pharmaceutiques.
Introduction
Le poisson zèbre est devenu un modèle populaire pour les sciences génétiques, développementaux et comportementaux 1-4. Ils sortent de leurs chorions de 2-3 jours après la fécondation (DPF), développer pleinement organes fonctionnant par 4-5 dpf, et présentent un grand nombre de comportements de 7 DPF 5,6. Les larves de poisson zèbre sont parfaitement adaptés pour des analyses à haut débit en raison de leur petite taille 7,8. Le logiciel est disponible dans le commerce pour des analyses automatisées du comportement larvaire et adulte poisson zèbre 9-14. Toutefois, ce logiciel peut être cher et a des options limitées pour mesurer les comportements complexes de larves de poisson zèbre en plaques multi-puits.
Nous avons créé un système d'imagerie à haut débit roman qui est peu coûteux à mettre en place et permet de quantifier un certain nombre de comportements différents en 7 DPF poisson zèbre larves 15,16. Le système nous permet de tester rapidement et efficacement des anomalies comportementales subtiles après une exposition embryonnaire à un certain nombre deproduits pharmaceutiques et des substances toxiques de l'environnement 16-18.
Le système a été construit en utilisant des armoires en bois, qui abritent un appareil photo numérique au sommet de l'armoire. La caméra orientée vers le bas au fond de l'armoire, où un ordinateur portable est placé avec l'écran vers le haut 15. imagerie laps de temps est utilisé pour capturer le placement des larves dans les ruelles. Les larves peuvent se loger dans un maximum de quatre plaques multi-puits ou à plusieurs voies qui sont positionnées sur le dessus de l'écran d'ordinateur. Nous utilisons une présentation PowerPoint comme un stimulus aversif à laquelle les larves répondre en s'éloignant (évitement) et nager vers le bord (thigmotaxis) 15,17. Les images sont importées dans ImageJ dans lequel une macro automatique est utilisé pour diviser les canaux de couleurs, il faut soustraire le fond et appliquer un seuil d'identifier les larves individu. Les coordonnées sont répertoriés pour chaque larve dans chaque image et peuvent être insérées dans un fichier Excel que nous utilisons pour quantifier l'évitement et thigmotaxis comportement, poisson à la distance de poisson, nager vitesse et temps de repos 16.
Protocol
1. Collection d'embryons de poisson zèbre et Raising larves
- Verre plats en pyrex avec de l'herbe "faux" (à partir de fils vert) (Figure 1) doivent être insérés dans les réservoirs à l'aube et ont quitté pendant deux heures afin de recueillir des embryons de poisson zèbre. Les plats en verre contenant les embryons doivent être versé sur un tamis de poche et rincées à l'eau déminéralisée. Les embryons doivent ensuite être cultivées dans l'eau d'œuf. L'eau d'oeuf contient 60 mg / L d'Instant Ocean dans de l'eau déminéralisée et 0,25 mg / l de bleu de méthylène, qui est utilisé comme un inhibiteur de moisissures.
- Selon l'hypothèse de l'expérience individuelle, les embryons peuvent être traités immédiatement ou au cours des étapes spécifiques du développement de l'utilisation des substances toxiques ou des produits pharmaceutiques. Les substances toxiques et les produits pharmaceutiques sont généralement dissous dans du DMSO (à une concentration de 1000 X) et devraient être davantage dilués directement dans le milieu de l'eau d'œuf.
- Pendant le traitement embryonnaire et larvaire avec des produits pharmaceutiques ou des substances toxiquess, les larves et les embryons peuvent être logés dans des boîtes de Pétri profondes à une densité d'environ 50-60 larves par 50 ml jusqu'à ce que les analyses comportementales au 7 DPF (solution d'eau œuf doit être changé au moins tous les deux jours pour éviter la croissance de champignons / bactéries à partir d'embryons morts).
2. Préparation de Moules pour les analyses comportementales
- Spécialement développé des moules en plastique qui mesurent 11,7 cm x 7,6 cm x 5 mm ont été construit sur mesure en interne. Les moules sont nécessaires pour créer les voies à l'aide d'agarose qui est versé dans des assiettes en plastique et simples de Thermo Scientific. La seule mesure de plaques ainsi 12.4 cm x 8.1 cm x 1.2 cm.
- Les moules contiennent cinq voies dans lesquelles les faces sont inclinées à 60 °. Les voies de circulation dans les moules sont de 3,5 mm de hauteur avec une base de 18 mm dans la partie supérieure qui est la plus large tandis que la largeur du bas est de 14 mm. Il ya un écart de 4 mm entre voies dans le moule (Figure 2).
- Pour préparer les voies versez 50 ml de fondue agarose (0,8% d'agarose dans désioniserd eau avec 60 mg / L Instant Ocean) dans une assiette bien seul. Le moule doit alors être placée très lentement au-dessus de l'agarose liquide pour éliminer toute formation de bulles et peut être retiré lors de l'agarose soit refroidi (ce qui prend environ 45 min).
- Les voies d'agarose doivent être faites au plus tôt un jour avant l'expérience comportementale doit être exécuté (pour éviter le dessèchement agarose) Les voies peuvent être conservés à température ambiante avec les couvercles sur les plats jusqu'à environ 36 h. Les voies d'agarose ne devraient être utilisés pour une expérience et doivent ensuite être jetés.
3. Capture d'image
- Jusqu'à 20 larves peut être placé dans chaque voie des plaques. Typiquement 5 larves par voie sont utilisés pour faciliter le suivi plus précis de la vitesse de nage et de réduire le nombre de larves qui sont nécessaires par expérience. Les voies peuvent être remplis avec de l'eau d'œuf avec ou sans médicaments ou des produits toxiques en fonction de l'expérience. Toutefois, les voies ne doivent pas être filled tout le chemin jusqu'à ce qu'ils soient placés dans les armoires d'imagerie, ce qui va empêcher le débordement. Par souci de cohérence, les larves doivent avoir une période d'acclimatation de dix minutes après ils sont placés dans des moules agarose et positionnées sur le dessus de l'écran du portable. Déplacer efficacement les larves de la boîte de Pétri sur la voie agarose aidera à réduire le stress des larves. C'est plus facile lorsque les larves sont logés dans des réservoirs peu profonds ou des boîtes de Pétri.
- Les cabinets d'imagerie incluent un appareil photo numérique Canon utilisé pour la photographie time-lapse et un ordinateur portable. L'appareil doit être placé en haut de l'armoire et dirigé vers le bas de l'armoire où un ordinateur portable à écran 15,6 pouces devrait être placé avec écran vers le haut (figure 3). Quatre plaques doivent être positionnés à la main directement sur l'écran du portable. À cette époque, les voies peuvent être surmontés avec de l'eau de l'œuf ou de traitement chimique afin qu'il soit au niveau du haut de la voie (pour éliminer les ombres sur les bords de la lanes dans les images).
- Une présentation PowerPoint est utilisé comme un stimulus aversif pour les larves. Dans les mobiles dernières boules rouges ont été sans poisson-zèbre larves dans les 6 ou 12 plaques multi-puits 15.17.18. La PowerPoint courant commence avec un fond blanc pendant 15 min, puis 15 min d'une barre rouge en mouvement sur la moitié supérieure de la plaque (figure 4). Afin d'éliminer les larves de surchauffe, il est préférable d'acheter un ordinateur portable avec une température de l'écran qui ne dépasse pas 28 ° C. Pour éviter l'évaporation du liquide dans les couloirs d'agarose, le temps d'imagerie maximale doit être maintenue au-dessous d'une heure.
- La caméra numérique devrait être programmé pour time-lapse photography, prendre des photos toutes les 6 sec pour un total de 300 images par expérience. Toutefois, la fréquence et la longueur peut être ajustée en fonction de l'expérience et de la quantification du comportement. Au cours des dernières fois d'imagerie longues étaient employés en utilisant des intervalles plus longs entre chaque image. Le camerun peut être réglé à une résolution plus faible pour l'imagerie à la vitesse de la vidéo (30 images par seconde). Alors que la résolution plus faible limite les enregistrements sur une plaque multi-puits unique, les enregistrements vidéo sont appropriés pour l'imagerie épreuves de natation rapides 15.
4. Analyse d'Image
- Les images devraient être ouvertes avec ImageJ et sont utilisés avec une macro qui a été écrit spécifiquement en interne. La macro divise automatiquement les canaux de couleur de sorte que la couleur rouge peut être enlevé, soustrait le fond, applique un seuil, et identifie les larves par analyse de particules. La macro la plus récente pour cinq voies analyse larvaire est Zebrafish_macro25k. Utilisez les invites de la macro pour définir le nombre d'images, la couleur doit être soustrait, le seuil d'image, etc
- Après que toutes les images sont exploités par la macro ImageJ, un fichier de résultats sera affichée et contiendra des coordonnées x, y de la larve individuel pour chaque image avec le numéro de l'image et le nombre de voie. Le fichier de résultats doit être sauvegardé en format Excel et triées en fonction de fond blanc ou vers le fond de bar, puis le numéro bien. Un modèle Excel doit être utilisé qui a équations construites en qui détermine automatiquement le placement des larves dans les puits, la distance entre les larves, la vitesse de mouvement et temps de repos. Le modèle Excel plus courant est 25ib créé dans le laboratoire Creton, qui est disponible sur demande. Graphes montrant les différents groupes de traitement doivent être intégrées dans la feuille Excel avec des tests t pour la comparaison entre les groupes de traitement et de contrôle. Une analyse statistique plus peut être réalisée en utilisant SPSS.
Representative Results
Dans nos tests précédents, en utilisant le stimulus aversif balle qui rebondit, le type larves sauvages qui ne sont pas traités répondre à la balle se déplaçant à la nage dans le (comportement d'évitement) et bien vers les bords du puits (comportement thigmotaxis) 15. Plus tard nous avons confirmé que le comportement thigmotaxis dans cet essai est une mesure du comportement liés à l'anxiété chez les larves de poisson zèbre 17. Il y avait des différences importantes dans le mouvement des larves loin de la balle et la préférence pour le bord par rapport à l'arrière-plan blanc vierge. Ces comportements ont également été confirmés dans notre nouveau test en utilisant la barre rouge en mouvement et sont encore plus robuste 16. En outre, nous pouvons maintenant déguster un grand nombre de comportements dans un seul essai, y compris la vitesse de nage, le repos, la préférence pour la fin ou le côté du bien, et la distance entre les poissons (figure 5). larves de contrôle cultivées dans l'eau d'oeuf présentent une préférence accrue soit vers le bas dans la cuvette et sur le bord de la voie deprès avoir elles sont présentées avec un stimulus aversif (déplacement barre rouge). Des résultats similaires sont obtenus lorsque les larves sont cultivées dans l'eau d'oeufs contenant 1 pg / ml de DMSO, un solvant qui est couramment utilisé pour dissoudre les divers produits pharmaceutiques et les produits toxiques que 1000 solutions de stock X.
Les résultats représentatifs sont présentés dans la figure 5 en larves traitées avec de l'eau d'œuf et du DMSO (les contrôles) et des concentrations variables d'un pesticide organophosphoré trouve couramment dans les aliments non biologiques. Les résultats sont présentés un échantillon d'une expérience. Toutefois, lorsqu'il est répété, les résultats indiquent que la vitesse de nage et le comportement des thigmotaxis est altérée par de faibles concentrations de pesticides organophosphorés, qui imitent les niveaux de consommation alimentaire humaine 18.
Figure 1. Bacs de collecte. des plats en verre Pyrex sont utilisés pour collecter embryos provenant des réservoirs de poissons adultes. Couvercles de plats en Pyrex ont été coupés et insérés avec des grilles en plastique et fil vert a été cousu sur les grilles dans le plastique. Cela crée une atmosphère de reproduction pour le poisson zèbre adulte en mimant l'environnement naturel.
Figure 2. Moule en plastique et les voies d'agarose. A) Le moule est indiqué sur la gauche. 0,8% d'agarose est versé dans une plaque d'un puits, le moule est progressivement inséré et ensuite retiré lorsque l'agarose a refroidi B) La plaque de droite montre les voies créées dans l'agarose par le moule en plastique..
Figure 3. Armoires imagerie. Armoires d'imagerie étaient specially construit dans notre laboratoire et utilisé pour des analyses comportementales à haut débit. A 15 mégapixels appareil photo numérique a été fixée au sommet de l'armoire vers le bas, afin de recueillir des images de déchéance du temps des larves en plaques multivoies placés sur le dessus de l'écran d'un ordinateur portable. Entre les plaques et l'écran se trouve un diffuseur en plastique qui est utilisé pour prévenir les effets de moiré dans les images recueillies.
Figure 4. Fond blanc et PowerPoint aversion stimulus. C'est le PowerPoint actuel qui est utilisé pour évoquer les changements de comportement chez les larves de poisson zèbre. Il fournit des différences de comportement robustes entre A) le fond blanc et B) la barre rouge en mouvement.
Figure 5. Comportements quantifiés dans l'analyse à haut débit. Exemple des comportements qui sont quantifiés à partir de notre analyse comportementale au sein de la feuille Excel que nous utilisons pour coordonnées x, y de la larve. Les barres blanches indiquent les données de larves exposées à un fond blanc et les barres rouges indiquent les données du larves exposées à la barre mobile rouge dans le PowerPoint. Les graphiques indiquent les mesures qui peuvent être obtenus à partir de l'analyse du comportement A) Pourcentage de larves dans la ruelle, B) Pourcentage de larves à l'extrémité de la ruelle, C) Pourcentage de larves sur le bord de la voie, D) Distance entre poisson (mm), E) vitesse de nage des larves (mm / min), F) Pourcentage de repos des larves. Dans les graphiques ci, les données sont de traitement des larves avec contrôle DMSO et plusieurs concentrations d'un pesticide allant de 0,001 à 0,1 uM (niveaux communément trouvés dans l'alimentation humaine). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Discussion
Alors que nous améliorons sans cesse notre nouveau test de comportement, il a toujours été utile pour la détection de comportement d'évitement et de thigmotaxis chez les larves de poisson zèbre 15. De nombreux essais ont été effectués afin d'optimiser les résultats de l'essai, comme la couleur du stimulus utilisé, le nombre idéal de larves par voie et la durée du test comportemental. Auparavant, nous utilisions des plaques multi-puits (avec 6 ou 12 puits) 15.17.18. Toutefois, récemment, nous avons créé le roman moule de voie pour créer un espace de baignade plus grande pour les larves qui nous permet de rassembler un grand nombre de mesures comportementales dans un seul essai 16 (Figure 5). D'autres modifications comprennent les variations de l'montrée PowerPoint (mouvement altéré ou la durée de dosage) et de la taille des voies utilisées (nous avons également des moules pour les voies plus étroites).
Actuellement, ce système automatisé à haut débit est unique dans sa capacité à évaluer une large gamme de comportements dans zebrLes larves de afish en même temps comme la vitesse, l'évitement, la proximité des autres larves, et thigmotaxis dans des plaques multi-voies. Les résultats peuvent être obtenus rapidement et un grand nombre de larves peuvent être analysés au moment de l'imagerie. Le système est à la fois peu coûteux à construire et rapide et facile à mettre en place. Une limitation de ce système est que les mouvements en 3-D ne peuvent pas être évalués dans le poisson zèbre. Les systèmes automatisés qui suivent le poisson zèbre pour adultes ont la capacité 3-D et peuvent identifier un large éventail de comportements tels que le mouvement vers le haut ou vers le bas dans la colonne d'eau 10,19. Une autre limitation est que notre système d'imagerie est actuellement pas optimisé pour les analyses à haut débit à la vitesse de la vidéo. imagerie de la vitesse de la vidéo est possible lors de la configuration de l'appareil photo à une résolution inférieure 15, mais cela restreint l'analyse à une seule plaque.
En utilisant la méthode "lane" nouvellement créé, plusieurs parties de l'analyse nécessaires pour être exécuté d'une manière précise. Lorsque vous placez les larves dans til voies, il est essentiel de s'assurer que le niveau de liquide est très faible jusqu'à ce que les plaques sont placées sur le dessus de l'écran du portable. Si les voies sont trop plein de liquide, les larves s'échapper dans la périphérie de la plaque. En outre, lors de l'insertion du moule dans de l'agarose, des précautions doivent être prises pour abaisser le moule très lentement. Si le moule est inséré trop rapidement, des bulles se formeront dans l'agarose et seront identifiés par le J macro de l'image sous forme de larves supplémentaire. Il est conseillé que si les voies d'agarose ont même un peu de bulles, il est préférable de s'en faire de nouveaux.
À l'avenir, nous aimerions optimiser notre analyse comportementale pour analyser d'autres comportements complexes tels que l'apprentissage chez les larves de poisson zèbre et d'examiner comment l'apprentissage peut être affectée par l'exposition à des substances toxiques et des produits pharmaceutiques dans le développement précoce. Nous travaillons actuellement sur des tests qui peuvent être utiles pour analyser le comportement d'apprentissage dans lequel les résultats comportementaux peuvent faciliter déterminer quelles zones du cerveau sonttouchés par certaines substances toxiques ou des produits pharmaceutiques au cours du développement. Tests automatisés ont été développés pour mesurer les comportements chez les larves de poisson zèbre 20 et ces tests d'apprentissage peut être amendable pour le criblage à haut débit en utilisant la réaction d'évitement robuste en plaques multi-voies.
Nous proposons que cette analyse comportementale pourrait être utilisé dans de futures études pour tester les effets sur le développement d'un grand nombre de produits pharmaceutiques et les produits toxiques. Ces études fourniraient une mine de renseignements sur les facteurs de risque spécifiques et contribuer à la mise meilleures lignes directrices sur la santé et la sécurité pour les femmes enceintes et les enfants.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions Sean Pelkowski d'assistance dans l'optimisation de l'analyse comportementale. Ce travail a été financé par l'Institut national de la santé infantile et le développement humain, R01 HD060647 et l'Institut national de l'environnement Sciences de la santé, F32 ES021342 et ES017755 R03.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
| Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
| Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
| Equipment | |||
| One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
| Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
| Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
| Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
| Camera Lens | Canon | EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens | |
| Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
| Software | |||
| PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Excel 2010 | Microsoft | ||
| Statistical software | SPSS 20 | ||
References
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