Summary
Vores laboratorium udviklet en ny high-throughput automatiseret billeddannende system, der er nyttige til påvisning af flere forskellige adfærd i 7 dage gammel zebrafisk larver. Systemet kan bruges til at detektere små ændringer i adfærd, når æggene er blevet udsat for miljøgiftstoffer eller lægemidler.
Abstract
Vi har skabt en ny high-throughput imaging system til analyse af adfærd i 7 dage gammel zebrafisk larver i flersporede plader. Dette system måler spontane adfærd og reaktionen på et afskrækningsmiddel stimulus, som vises til larver via en PowerPoint-præsentation. De optagne billeder analyseres med en ImageJ makro, der automatisk opdeler farvekanalerne, subtrahere baggrunden, og anvender en tærskel for at identificere individuelle larver placering i de baner. Vi kan derefter importere koordinaterne til et Excel-ark til at kvantificere svømme hastighed, præference for kant eller side af lane, hvilende adfærd thigmotaxis, afstanden mellem larver og undgåelse adfærd. Subtile ændringer i adfærd er let afsløres ved hjælp af vores system, der gør det nyttigt for adfærdsmæssige analyser efter udsættelse for giftige stoffer i miljøet eller lægemidler.
Introduction
Zebrafisk bliver en populær model for genetiske, udviklingsmæssige og adfærdsmæssige videnskaber 1-4. De klækker fra deres chorions med 2-3 dage efter befrugtning (DPF), udvikler fuldt fungerende organer med 4-5 dpf, og udviser et stort antal adfærd med 7 dpf 5,6. Zebrafisk larver er velegnet til high-throughput analyser på grund af deres lille størrelse 7,8. Softwaren er kommercielt tilgængelige til automatiserede analyser af adfærd i larver og voksne zebrafisk 9-14. Dog kan denne software være dyrt og har begrænsede muligheder for at måle komplekse adfærd af zebrafisk larver i multi-brønds plader.
Vi skabte en ny high-throughput billeddannende system, der er billig at sætte op og kan kvantificere en række forskellige adfærd hos 7 dpf zebrafisk larver 15,16. Systemet giver os mulighed for hurtigt og effektivt at teste subtile adfærdsmæssige abnormiteter efter embryonale eksponering for en rækkelægemidler og miljøgiftstoffer 16-18.
Systemet blev bygget ved hjælp af træ kabinetter, som huset en digital kamera i toppen af skabet. Kameraet vender nedad til bunden af kabinettet, hvor en bærbar computer er placeret med skærmen opad 15.. Tid bortfalder billeddannelse bruges til at fange placeringen af larver i banerne. Larver kan holdes i op til fire multi-well eller flersporede plader, der er placeret på toppen af den bærbare computer skærmen. Vi bruger en PowerPoint præsentation som et afskrækningsmiddel stimulus, som larverne reagerer ved at flytte væk (undgåelse) og svømning mod kanten (thigmotaxis) 15,17. Billederne importeres til ImageJ hvor en automatiseret makro anvendes til at opdele farvekanalerne, trække baggrunden, og anvender en tærskel for at identificere individuelle larver. Koordinaterne er angivet for hver larve i hvert billede, og kan indsættes i en Excel-fil, som vi bruger til at kvantificere undgåelse og thigmotaXis adfærd, fisk at fiske distance, svømme hastighed og mængde hvile 16.
Protocol
1.. Indsamling af Zebrafisk embryoner og Raising Larver
- Pyrex retter med "falske" græs (lavet fra grøn garn) (figur 1) bør indsættes i tankene ved daggry og venstre i to timer for at samle zebrafisk embryoner. Glasset skåle indeholdende embryoner bør hældes over en håndholdt si og skyllet med deioniseret vand. Disse embryoner skal derefter dyrkes i æg vand. Ægget vand indeholder 60 mg / L af Instant Ocean i deioniseret vand og 0,25 mg / l methylenblåt, der anvendes som en støbeform-inhibitor.
- Afhængig af hypotesen om det enkelte eksperiment kan fostre behandles omgående eller under bestemte stadier af udvikling ved hjælp af giftstoffer eller lægemidler. De giftstoffer og lægemidler normalt opløst i DMSO (ved en 1.000 x koncentration) og bør fortyndes yderligere direkte i ægget vand medium.
- Under embryonisk og larvernes behandling med lægemidler eller giftstofs, kan larverne og embryoner anbringes i dybe petriskåle med en tæthed på omkring 50-60 larver pr 50 ml, indtil de adfærdsmæssige analyser på 7 dpf (æg vand opløsning bør skiftes mindst hver anden dag for at undgå svampeangreb / bakterievækst fra døde fostre).
2.. Forberedelse forme til Behavioral Analyser
- Specielt udviklet plast forme, som måler 11,7 cm x 7,6 cm x 5 mm blev specialbygget i huset. Formene er nødvendige for at skabe baner med agarose som hældes i enkelt boring plastplader fra Thermo Scientific. Den enkelt brønd plader foranstaltning 12,4 cm x 8,1 cm x 1,2 cm.
- Formene indeholder fem baner, hvor siderne er vinklet ved 60 °. Banerne i formene er 3,5 mm højt med en base på 18 mm i toppen, som er den bredeste hvorimod bundbredde er 14 mm. Der er en 4 mm mellem banerne i formen (figur 2).
- Til fremstilling af de baner hælde 50 ml smeltet agarose (0,8% agarose i deionized vand med 60 mg / L Instant Ocean) i en enkelt brønd plade. Formen skal derefter placeres meget langsomt på toppen af flydende agarose at fjerne enhver bobledannelse og kan fjernes, når agarose er afkølet (som tager ca 45 min).
- Agarosen baner bør gøres tidligst end én dag før den adfærdsmæssige forsøg skal køres (for at undgå agarose udtørring) Banerne kan opbevares ved stuetemperatur med låg på skålene for op til ca 36 timer. Agarosen baner bør kun anvendes til et eksperiment og skal derefter kasseres.
3.. Billedoverførsel
- Op til 20 larver kan placeres i hver bane af pladerne. Typisk 5 larver pr bane anvendes til at lette den mest nøjagtige sporing af svømme hastighed og at reducere antallet af larver, der er nødvendige pr eksperiment. Banerne kan fyldes med æg vand med eller uden lægemidler eller giftstoffer afhængig af eksperimentet. Dog bør baner ikke være filled op hele vejen, indtil de er placeret i de billeddannende frysere; dette vil forhindre overløb. For konsekvensen bør larverne have en akklimatisering periode på ti minutter, efter de er placeret i agarose forme og placeret på toppen af den bærbare computer skærmen. Effektiv flytte larverne fra petriskålen til agarose bane vil bidrage til at mindske larver stress. Dette er nemmest, når larverne er opstaldet i lavvandede tanke eller petriskåle.
- De billeddiagnostiske kabinetter omfatter et Canon digital kamera, der anvendes til time-lapse fotografering og en bærbar computer. Kameraet skal placeres i toppen af kabinettet og rettet mod at bunden af kabinettet, hvor en 15,6 tommer skærm laptop bør placeres med skærmen vender opad (figur 3). Fire plader skal placeres manuelt direkte på toppen af den bærbare computer skærmen. På dette tidspunkt banerne kan toppede med æg vand eller kemisk behandling, således at det er i niveau med toppen af lane (for at eliminere skygger på kanterne af lAnes i billederne).
- En PowerPoint præsentation er brugt som et afskrækningsmiddel stimulus for larverne. I de seneste bevægelige røde kugler blev vist at zebrafisk larver i 6 eller 12 multi-brøndsplader 15,17,18. Den nuværende PowerPoint starter med en tom hvid baggrund i 15 minutter, efterfulgt af 15 min på en bevægende rød bar på øverste halvdel af pladen (figur 4). For at fjerne overophedning af larver, er det bedst at købe en bærbar computer med en skærm temperatur, som ikke går over 28 ° C. At undgå fordampning af væsken i agarose baner, bør den maksimale billeddannelse tid holdes på under en time.
- Det digitale kamera bør programmeres til time-lapse fotografering, tage billeder hver 6 sek til i alt 300 billeder pr eksperiment. Dog kan hyppigheden og varigheden justeres afhængigt af eksperimentet og adfærdsmæssige kvantificering. I de seneste udvidede billedoptagning var ansat ved hjælp længere intervaller mellem hvert billede. Den cameren kan indstilles ved en lavere opløsning for billeddannelse ved video hastighed (30 frames per sekund). Mens lavere opløsning begrænser optagelserne til en enkelt flerbrøndsplade, videooptagelserne er passende for billeddannelse hurtige svømning begivenheder 15..
4.. Image Analysis
- Billederne bør åbnes med ImageJ og bruges med en makro, der var specielt skrevet in-house. Makroen automatisk opdeler farvekanalerne så den røde farve kan fjernes, subtrahere baggrunden, anvender en tærskel, og identificerer den larver ved partikel analyse. Den mest aktuelle makro til fem lane larve analyse Zebrafish_macro25k. Brug vejledningen i makro til at indstille antallet af billeder, farve, der skal trækkes fra, billedet tærskel, etc.
- Når alle billederne er kørt gennem ImageJ makroen, vil en resultatorienteret fil vises, og vil indeholde x, y-koordinaterne for den enkelte larver for hvert billede sammen med billedet nummer og lane nummer. Resultaterne filen skal gemmes i et Excel-format og sorteres baseret på blank baggrund vs bevægende bar baggrund og derefter godt nummer. En Excel-skabelon bør anvendes, der har ligninger indbygget, der automatisk bestemmer placering af larver i brøndene, afstanden mellem larver, hastighed bevægelighed, og mængden af resten. Den mest aktuelle Excel skabelon 25ib skabt i Creton lab, som er til rådighed efter anmodning. Grafer, der viser de forskellige behandlingsgrupper bør være indbygget i Excel-ark sammen med t-test for sammenligning mellem behandlingsgrupper og kontroller. Yderligere statistiske analyse kan udføres ved hjælp af SPSS.
Representative Results
I vores tidligere assays, ved hjælp af hoppende bold aversiv stimulus, der er ubehandlet vildtype larver reagere på bevægelse bolden ved at svømme ned i brønden (undgåelse adfærd) og mod kanterne af brønden (thigmotaxis opførsel) 15. Vi senere bekræftede, at thigmotaxis adfærd i dette assay er et mål for angst-relateret adfærd i zebrafisk larver 17.. Der var signifikante forskelle i larverne bevægelse væk fra bolden og præference for kanten i forhold til den tomme hvide baggrund. Disse adfærdsmønstre er også blevet bekræftet i vores nye assay ved hjælp af bevægelige røde bjælke, og er endnu mere robust 16. Desuden kan vi nu prøve et større antal af adfærd i en enkelt assay, herunder svømme hastighed, hvile, præference for enden eller på siden af brønden, og afstanden mellem fisk (figur 5). Kontrol larver dyrket i æg vand viser en øget præference for at være nede i skålen og på kanten af banen etfter de bliver præsenteret med et afskrækningsmiddel stimulus (flytning rød bjælke). Lignende resultater opnås, når larverne dyrkes i æg vand indeholdende 1 ug / ml DMSO, et opløsningsmiddel, der almindeligvis anvendes til at opløse forskellige lægemidler og giftstoffer som 1.000 x stamopløsninger.
Repræsentative resultater er vist i figur 5 i larver behandlet med æg vand og DMSO (som kontrol) og varierende koncentrationer af et organophosphat pesticid almindeligvis findes i ikke-økologiske fødevarer. De viste resultater er et udsnit fra et eksperiment. Men når gentaget, viser resultaterne, at svømme hastighed og thigmotaxis adfærd ændres ved lave koncentrationer af organofosfatpesticider, som efterligner niveauer i human fødevareforbruget 18.
Figur 1. Opsamlingsbakkerne. Pyrex retter bruges til at indsamle embryos fra de voksne fisk kampvogne. Låg fra Pyrex retter blev skåret og indsat med plast net og grønt garn blev syet på nettene i plastic. Dette skaber et avlsprogram atmosfære for den voksne zebrafisk ved at efterligne det naturlige miljø.
Figur 2. Plastic skimmel og agarose baner. A) Formen er vist til venstre. 0,8% agarose hældes i en én-brønds plade, formen langsomt indsat og derefter fjernes, når agarose er afkølet B) Pladen til højre viser banerne skabt i agarose ved plast støber..
Figur 3. Imaging Skabe. Imaging kabinetter var specially bygget i vores laboratorium og anvendt til high-throughput adfærdsmæssige analyser. En 15 megapixel digitalkamera var fastgjort til toppen af kabinettet vender nedad for at samle time lapse billeder af larver i flersporede plader placeret på toppen af skærmen på en bærbar computer. Mellem pladerne og skærmen er der en plastafdækning der bruges til at forhindre moiré-mønstre i de indsamlede billeder.
Figur 4.. Blank baggrund og PowerPoint aversiv stimulus. Dette er den nuværende PowerPoint, der bruges til at fremkalde adfærdsændringer hos zebrafisk larver. Det giver robuste adfærdsmæssige forskelle mellem A) emnet baggrund og B) den bevægelige røde bjælke.
Figur 5. Behaviors kvantificeret i high-throughput assay. Eksempel på den adfærd, der er kvantificeret fra vores adfærdsmæssige assay i Excel-ark, som vi bruger til x, y koordinaterne larverne. De hvide søjler viser data fra larver udsættes for en tom baggrund og de røde søjler viser data fra larverne udsat for røde bevægelige bar i PowerPoint. Graferne viser de målinger, der kan fås fra adfærdsanalyse A) Procentdel af larver ned i lane, B) Procentdel af larver på enden af banen, C) Procentdel af larver på kanten af banen, D) Afstand mellem fisk (mm), E) Swim hastighed larver (mm / min), F) Procent resten af larver. I de viste grafer er data fra treatment af larver med DMSO-kontrol og flere koncentrationer af et pesticid spænder ,001-,1 uM (niveauer almindeligvis findes i den menneskelige kost). Klik her for at se større figur .
Discussion
Mens vi hele tiden forbedrer vores roman adfærdsmæssige assay, har det altid været nyttigt til påvisning af undgåelse og thigmotaxis adfærd i zebrafisk larver 15.. Mange forsøg er blevet udført for at optimere resultaterne af assayet, såsom brugte farve af stimulus ideelle antal larver pr bane, og længden af adfærdsmæssige assay. Tidligere brugte vi flere brønde (med 6 eller 12 brønde) 15,17,18. Men for nylig har vi skabt romanen lane formen for at skabe en større svømning plads til larverne tillader os at samle et større antal adfærdsmæssige foranstaltninger i et enkelt assay 16 (figur 5). Andre modifikationer omfatter variationer af PowerPoint vist (ændret bevægelse eller længden af assay) og størrelsen af de baner, der anvendes (vi har også forme til mere smalle baner).
I øjeblikket er denne high-throughput automatiseret system er enestående i sin evne til at måle en stor vifte af adfærd i zebrafish larver samtidig såsom hastighed, undgåelse, nærhed til andre larver og thigmotaxis i flersporede plader. Resultater kan opnås hurtigt og et stort antal larver kan analyseres ved billeddannelse. Systemet er både billig at bygge og hurtig og nem at sætte op. En begrænsning ved dette system er, at 3-D-bevægelser ikke kan vurderes i zebrafisk larver. Automatiserede systemer der sporer voksen zebrafisk har 3-D-kapacitet og kan identificere en bredere vifte af adfærd, såsom bevægelse op eller ned i vandsøjlen 10,19. En anden begrænsning er, at vores imaging system i øjeblikket er ikke optimeret til high-throughput analyser på video hastighed. Video hastighed imaging er mulig ved indstilling af kameraet til en lavere opløsning 15, men det begrænser analysen til en enkelt plade.
Ved at bruge det nyoprettede "lane"-metoden, brug flere dele af analysen skal udføres på en præcis måde. Når du placerer larverne i than baner, er det vigtigt at sørge for væskeniveauet er meget lavvandet indtil pladerne er placeret på toppen af den bærbare computer skærmen. Hvis banerne er også fuld af væske, vil larverne undslippe ind i periferien af pladen. Desuden, når der indsættes formen i agarosen skal der drages omsorg for at sænke støbeformen meget langsomt. Hvis formen er indsat for hurtigt, vil bobler dannes i agarose og vil blive identificeret ved Image J makro som yderligere larver. Det anbefales, at hvis agarose baner har selv et par bobler, er det bedst at gøre nye.
I fremtiden vil vi gerne optimere vores adfærdsmæssige assay til at analysere andre komplekse adfærd såsom læring i zebrafisk larver og undersøge, hvordan læring kan blive påvirket af udsættelse for giftstoffer og lægemidler i den tidlige udviklingsfase. Vi arbejder i øjeblikket på analyser, der kan være nyttige til at analysere læring adfærd, hvor de adfærdsmæssige resultater kan lette bestemmelse af, hvilke områder i hjernen erpåvirket af visse giftstoffer eller lægemidler under udvikling. Automatiserede assays er blevet udviklet til at måle indlæring adfærd i zebrafisk larver 20 og disse assays kan kunne ændres til high-throughput screening ved hjælp af robuste undgåelse respons i flersporede plader.
Vi foreslår, at dette adfærdsmæssige assay kunne anvendes i fremtidige undersøgelser for at teste de udviklingsmæssige effekter af et stort antal lægemidler og giftstoffer. Sådanne undersøgelser vil give et væld af oplysninger om specifikke risikofaktorer og bidrage til etablering af bedre sundhed og sikkerhed retningslinjer for gravide kvinder og børn.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Sean Pelkowski om bistand til optimering af adfærdsmæssige analyse. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Child Health and Human Development, R01 HD060647 og National Institute of Environmental Health Sciences, F32 ES021342 og R03 ES017755.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
| Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
| Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
| Equipment | |||
| One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
| Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
| Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
| Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
| Camera Lens | Canon | EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens | |
| Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
| Software | |||
| PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Excel 2010 | Microsoft | ||
| Statistical software | SPSS 20 | ||
References
- Gerlai, R., Lahav, M., Guo, S., Rosenthal, A. Drinks like a fish: zebra fish (Danio rerio) as a behavior genetic model to study alcohol effects. Pharmacol. Biochem. Behav. 67, 773-782 (2000).
- Selderslaghs, I. W. T., Hooyberghs, J., De Coen, W., Witters, H. E. Locomotor activity in zebrafish embryos: A new method to assess developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol. 32, 460-471 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neuroscience. 11, 90 (2010).
- Levin, E. D., Cerutti, D. Ch. 15. Methods of behavioral analysis in neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T.
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5 edn, Univ of Oregon Press. (2007).
- Kokel, D., Bryan, J., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6, 231-237 (2010).
- Rihel, J., Prober, D. A., et al. Zebrafish Behavioral Profiling Links Drugs to Biological Targets and Rest/Wake Regulation. Science. 327, 348-351 (2010).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat. Protoc. 5, 1786-1799 (2010).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Three-Dimensional Neurophenotyping of Adult Zebrafish Behavior. PLoS ONE. 6, e17597 (2011).
- Sledge, D., Yen, J. Critical duration of exposure for developmental chlorpyrifos-induced neurobehavioral toxicity. Neurotoxicol. Teratol. 33, 742-751 (2011).
- Stewart, A., Wu, N. Pharmacological modulation of anxiety-like phenotypes in adult zebrafish behavioral models. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 1421-1431 (2011).
- Eddins, D., Cerutti, D., Williams, P., Linney, E., Levin, E. D. Zebrafish provide a sensitive model of persisting neurobehavioral effects of developmental chlorpyrifos exposure: comparison with nicotine and pilocarpine effects and relationship to dopamine deficits. Neurotoxicol. Teratol. 32, 99-108 (2010).
- Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. A behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities. J. Vis. Exp. (20), e923 (2008).
- Pelkowski, S., Kapoor, M., et al. A novel high-throughput imaging system for automated analyses of avoidance behavior in zebrafish larvae. Behav. Brain Res. 223, 135-144 (2011).
- Richendrfer, H., Pelkowski, S., et al. Assessment of developmental toxicity by automated analyses of behavior in zebrafish larvae. Unpublished observations. , (2012).
- Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R. M., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behav. Brain Res. 228, 99-106 (2012).
- Richendrfer, H. A., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. Developmental sub-chronic exposure to chlorpyrifos reduces anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Neurotoxicol. Teratol. , (2012).
- Egan, R. J., Bergner, C. L., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).
- Colwill, R., Creton, R. Zebrafish protocols for neurobehavioral research. Kalluef, A., Stewart, A. 66, Springer Protocols. (2012).
