Summary
Vårt laboratorium utviklet en ny high-throughput automatisert avbildning, som er nyttig for påvisning av en rekke forskjellige virkemåter i 7 dager gamle larver zebrafisk. Systemet kan brukes for å påvise subtile endringer i atferd etter at larvene har vært utsatt for miljøgifter eller legemidler.
Abstract
Vi har opprettet en ny high-throughput imaging system for analyse av atferd i syv dager gamle sebrafisk larver i flerfelts plater. Dette systemet måler spontane atferd og responsen på en motvilje stimulus, som er vist til larver via en PowerPoint-presentasjon. De innspilte bildene ble analysert med en ImageJ makro som automatisk deler fargekanalene, trekker bakgrunnen, og gjelder en terskel for å identifisere enkelte larver plassering i baner. Vi kan deretter importere koordinatene i et Excel-ark for å kvantifisere svømme hastighet, preferanse for edge eller på siden av kjørefelt, hvile atferd, thigmotaxis, avstand mellom larver, og unngåelsesatferd. Subtile endringer i atferd er lett oppdages ved hjelp av vårt system, noe som gjør det nyttig for atferdsmessige analyser etter eksponering for miljøgifter eller legemidler.
Introduction
Sebrafisk er blitt en populær modell for genetiske, utviklingsmessige og atferdsmessige vitenskaper 1-4. De klekkes fra sine chorions etter 2-3 dager etter befruktning (DPF), utvikle fullt fungerende organer med 4-5 DPF, og viser et stort antall atferd ved 7 DPF 5,6. Sebrafisk larver er ideell for high-throughput analyser på grunn av sin lille størrelse 7,8. Programvaren er kommersielt tilgjengelig for automatiserte analyser av atferd i larve og voksen sebrafisk 9-14. Imidlertid kan denne programvaren være dyrt og har begrensede muligheter for å måle komplekse atferd av sebrafisk larver i multi-brønn plater.
Vi skapte en roman high-throughput imaging system som er billig å sette opp og kan kvantifisere en rekke forskjellige virkemåter i 7 DPF sebrafisk larver 15,16. Systemet gjør det mulig for oss å raskt og effektivt teste subtile atferdsmessige abnormiteter etter embryonale eksponering til en rekkelegemidler og miljøgifter 16-18.
Systemet ble bygget ved hjelp av tre skap, som huset et digitalt kamera på toppen av kabinettet. Kameraet vender nedover til bunnen av kabinettet hvor en bærbar PC er plassert med skjermen vendt opp 15. Tidsinnstilte avbildning brukes til å fange plassering av larvene i de baner. Larver kan bli plassert i opptil fire multi-brønn eller flerfelts plater som er plassert på toppen av den bærbare skjermen. Vi bruker en PowerPoint-presentasjon som en motvilje stimulans som larvene svare ved å gå bort (unngåelse) og svømming mot kanten (thigmotaxis) 15,17. Bildene er importert til ImageJ der en automatisert makro brukes til å splitte de fargekanalene, trekke bakgrunnen, og bruke en terskel for å identifisere individuelle larver. Koordinatene er oppført for hver larve i hvert bilde, og kan settes inn i en Excel-fil som vi bruker til å kvantifisere unngåelse og thigmotaXIS atferd, fisk til fisk avstand, svømme hastighet og mengde hvile 16.
Protocol
En. Innsamling av sebrafisk embryoer og Raising Larver
- Glass Pyrex retter med "fake" gress (laget av grønt garn) (figur 1) skal settes inn i tankene ved daggry og igjen i to timer for å samle sebrafisk embryoer. Glasset skåler som inneholder embryoene bør helles over en håndholdt sil og skylt med avionisert vann. Embryoene skal deretter dyrkes i egg vann. Egget vann inneholder 60 mg / l av Instant Ocean i avionisert vann og 0,25 mg / L av metylenblått, som brukes som en støpeform inhibitor.
- Avhengig av hypotesen om den enkelte eksperiment, kan embryoene bli behandlet umiddelbart eller under bestemte faser av utvikling ved hjelp toksikanter eller legemidler. De giftstoffer og legemidler er vanligvis oppløst i DMSO (ved en konsentrasjon 1000 X) og fortynnes videre direkte i egg vann medium.
- Under embryonal og larve behandling med legemidler eller toxicants, kan larvene og embryoer bli plassert i dype petriskåler med en tetthet på ca 50-60 larver per 50 ml til de atferdsmessige analyser på 7 DPF (egg vannløsning bør byttes minst annenhver dag for å unngå sopp / bakterievekst fra døde embryoer).
2. Forbereder Former for Behavioral Analyser
- Spesielt utviklet plast muggsopp som måler 11,7 cm x 7,6 cm x 5 mm ble custom-bygget på huset. Formene er nødvendig for å lage baner ved hjelp av agarose som helles inn i enkeltrom vel plast plater fra Thermo Scientific. Singelen vel plater måler 12,4 cm x 8,1 cm x 1,2 cm.
- Formene inneholde fem baner hvor sidene er vinklet ved 60 °. Banene i formene er 3,5 mm høye med en base av 18 mm på toppen som er den bredeste, mens den nederste bredde er 14 mm. Det er en 4 mm åpning mellom banene i formen (fig. 2).
- For å forberede banene helle 50 ml smeltet agarose (0,8% agarose i deionized vann med 60 mg / L Instant Ocean) i en enkelt brønn plate. Støpeformen bør da plasseres meget langsomt på toppen av væsken agarose å eliminere enhver bobledannelse og kan fjernes når den er avkjølt agarose (noe som tar omtrent 45 min).
- Agarose baner bør gjøres noe tidligere enn én dag før eksperimentet atferdsmessige skal drives (for å unngå uttørking agarose) Banene kan lagres ved romtemperatur og med lokkene på serviset i opp til omtrent 36 timer. Agarose baner bør bare brukes for ett eksperiment, og bør deretter kastes.
3. Image Capture
- Opp til 20 larver kan plasseres i hver bane av platene. Typisk 5 larver pr kjørefelt er brukt for å lette den mest nøyaktig sporing av svømme hastighet og for å redusere antall larver som er nødvendig for hvert forsøk. Banene kan fylles med egg vann med eller uten legemidler eller giftstoffer avhengig av eksperimentet. Imidlertid bør ikke være baner filled opp hele veien før de er plassert i bildebehandling skap, og dette vil hindre overløp. For konsistens, bør larvene har en akklimatiseringsperiode på ti minutter etter at de er plassert i agarose formene og plassert på toppen av den bærbare skjermen. Effektivt bevege larvene fra petriskålen til agarose kjørefelt vil bidra til å redusere larver stress. Dette er enklest når larvene er plassert i grunne tanker eller petriskåler.
- Imaging skap inkluderer et Canon digitalt kamera som brukes for time-lapse fotografering og en bærbar datamaskin. Kameraet bør plasseres på toppen av skapet og rettet i retning til bunnen av kabinettet hvor en 15,6 tommers skjerm bærbar bør plasseres med skjermen vendt opp (figur 3). Fire plater bør plasseres for hånd direkte på toppen av laptop skjermen. På dette tidspunktet banene kan etterfylles med egg vann eller kjemisk behandling, slik at den er på nivå med toppen av kjørefelt (for å eliminere skygger på kantene av lanes i bildene).
- En PowerPoint-presentasjon er brukt som en motvilje stimulans for larvene. I de siste bevegelige røde ballene ble vist til sebrafisk larver i 6 eller 12 multi-brønn plater 15,17,18. Den nåværende PowerPoint starter med en blank hvit bakgrunn i 15 minutter, etterfulgt av 15 minutter av en bevegelig rød bar i øverste halvdel av platen (figur 4). For å eliminere overoppheting av larver, er det best å kjøpe en bærbar PC med en skjerm temperatur som ikke går over 28 ° C. For å unngå fordampning av væsken innenfor agarose baner, bør den maksimale avbildning tid holdes på under en time.
- Det digitale kameraet skal programmeres for time-lapse fotografering, ta bilder hver 6 sek for totalt 300 bilder per eksperiment. Imidlertid, kan frekvensen og lengden justeres avhengig av eksperimentet og atferdsmessige kvantifisering. I de siste utvidede bildebehandling ganger var ansatt ved hjelp av lengre intervaller mellom hvert bilde. Den cameren kan settes til en lavere oppløsning for bildebehandling på video hastighet (30 bilder per sekund). Mens lavere oppløsning begrenser opptak til en enkelt multiwell plate, video-opptak som er aktuelle for bildebehandling rask svømming hendelser 15.
4. Bildeanalyse
- Bildene skal åpnes med ImageJ og brukes med en makro som ble spesielt skrevet i huset. Makroen deler automatisk fargen kanaler slik at den røde fargen kan fjernes, trekker bakgrunnen, gjelder en terskel, og identifiserer larvene ved partikkel analyse. Den mest aktuelle makroøkonomiske for fem kjørefelt larve analyse er Zebrafish_macro25k. Bruk instruksjonene i makro for å sette antall bilder, fargen som skal trekkes, bilde terskel, etc.
- Etter at alle bildene er kjørt gjennom ImageJ makro, vil en file vises og vil inneholde x, Y koordinater for den enkelte larver for hvert bilde sammen med bildet nummer og kjørefelt nummer. Den resultater filen skal lagres i et Excel-format og sortert basert på blank bakgrunn vs bevegelig bar bakgrunn og deretter brønn nummer. En Excel-mal bør brukes som har ligninger innebygd som automatisk avgjør plassering av larver i brønnene, avstand mellom larver, hastighet av bevegelse, og mengden av resten. Den mest aktuelle Excelmal er 25ib opprettet i Creton lab, som er tilgjengelig på forespørsel. Grafer som viser ulike behandlingsgruppene bør bygges inn i Excel-ark sammen med t-tester for sammenligning mellom behandlingsgruppene og kontroller. Videre statistisk analyse kan utføres ved hjelp SPSS.
Representative Results
I våre tidligere assays, ved hjelp av retur ball aversivt stimulus, som er ubehandlet villtype larver svare på den bevegelige ballen ved å svømme ned i brønnen (unnvikelsesatferd) og mot kantene av brønnen (thigmotaxis oppførsel) 15. Vi har senere bekreftet at thigmotaxis atferd i denne analysen er et mål på angst-relatert atferd hos sebrafisk larver 17. Det var signifikante forskjeller i larvene bevegelse bort fra ballen og preferanse for kanten i forhold til blank hvit bakgrunn. Disse atferd har også blitt bekreftet i vår nye analysen ved hjelp av bevegelige røde bar og er enda mer robust 16. Videre kan vi nå prøve et større antall atferd i en enkelt analyse inkludert svømme hastighet, hvile, preferanse for slutten eller på siden av godt, og avstanden mellom fisk (figur 5). Kontroll-larver dyrket i egg vann viser en økt preferanse for å være nede i fatet og på kanten av kjørefelt enfter de blir presentert med en motvilje stimulus (flytting rød søyle). Lignende resultater oppnås når larvene er dyrket i egg vann som inneholder 1 mg / ml DMSO, et løsemiddel som vanligvis brukes til å løse opp ulike legemidler og giftstoffer som 1000 X lager løsninger.
Representative resultater er vist i figur 5 i larver behandlet med egg vann og DMSO (som kontroller) og varierende konsentrasjoner av et organofosfat plantevernmiddel som vanligvis finnes i ikke-organisk mat. Resultatene som vises er et prøvetaking fra ett eksperiment. Men når gjentatt, tyder resultatene på at svømme hastighet og thigmotaxis adferd endres ved lave konsentrasjoner av organofosfater plantevernmidler, som etterligner nivåer i menneskelig matforbruk 18.
Figur 1. Samling skuffer. Glass Pyrex retter brukes til å samle embryos fra de voksne karene. Lokk fra Pyrex retter ble kuttet og satt inn med plast nett og grønt garn ble sydd på tavler i plast. Dette skaper en avl atmosfære for den voksne sebrafisk ved å etterligne det naturlige miljøet.
Figur 2. Plastic mold og agarose baner. A) Formen er vist til venstre. 0,8% agarose helles i en en-brønn plate; formen er sakte inn og deretter fjernes når agarose er avkjølt B) Platen til høyre viser banene opprettet i agarose av plast mold..
Figur 3. Imaging Skap. Imaging skap var specially bygget i laboratoriet vårt og brukes for høy gjennomstrømming atferdsmessige analyser. En 15 megapixel digital kamera var festet til toppen av skapet vender nedover for å samle tid forfalle bilder av larvene i multilane plater plassert på toppen av skjermen på en bærbar PC. Mellom platene og skjermen er det en plast skjerm som brukes til å forhindre moiré-mønster i de bilder fanget opp.
Figur 4. Blank bakgrunn og PowerPoint aversivt stimulus. Dette er den gjeldende PowerPoint som brukes til å fremkalle adferdsendringer i zebrafisk larver. Det gir robuste atferdsmessige forskjellene mellom A) den tomme bakgrunnen og B) de bevegelige røde bar.
Figur 5. Atferd kvantifiseres i high-throughput analysen. Eksempel på atferd som er tallfestet fra vår atferdsmessige analysen innen Excel-ark som vi bruker for x, y koordinatene til larvene. De hvite søylene viser data fra larvene utsatt for en blank bakgrunn og de røde søylene viser data fra larvene utsatt for den røde bevegelig bar i PowerPoint. Grafene viser målingene som kan hentes fra atferdsanalyse A) Andel av larver ned i kjørefeltet, B) Prosent av larver på slutten av kjørefelt, C) Prosent av larver på kanten av kjørefelt, D) Avstand mellom fisk (mm), E) Svømme hastigheten på larver (mm / min), F) Prosentvis resten av larver. I grafene vist, er data fra behandlinent av larver med DMSO kontroll og flere konsentrasjoner av et plantevernmiddel som spenner 0,001 til 0,1 mikrometer (nivåer som vanligvis finnes i menneskets kosthold). Klikk her for å se større figur .
Discussion
Mens vi kontinuerlig forbedre vår roman atferdsmessige analysen, har det alltid vært nyttig for påvisning av unngåelse og thigmotaxis atferd i sebrafisk larver 15. Mange forsøk har blitt utført for å optimalisere resultatene av analysen, slik som farge av stimulus anvendes, ideelle antall larver pr lane, og lengden av atferdsmessige assay. Tidligere brukte vi multi-brønn plater (med 6 eller 12 brønner) 15,17,18. Men nylig har vi opprettet romanen kjørefelt mold å skape en større svømming plass for larvene slik at vi kan samle et større antall atferdsmessige tiltak i en enkelt analyse 16 (figur 5). Andre endringer inkluderer varianter av PowerPoint vist (endret bevegelse eller lengden på analyse) og størrelsen på banene som brukes (vi har også støpeformer for mer smale stier).
For tiden er dette high-throughput automatisert system unik i sin evne til å måle et stort spekter av atferd i zebrafish larver samtidig som hastighet, unngåelse, nærhet til andre larver, og thigmotaxis i flerfelts plater. Resultater kan oppnås raskt og et stort antall larver kan analyseres ved tidspunktet for avbildning. Systemet er både billig å bygge og rask og enkel å sette opp. En begrensning med dette systemet er at 3-D bevegelser ikke kan bli vurdert i sebrafisk larver. Automatiserte systemer som sporer voksen sebrafisk har 3-D evne og kan identifisere et bredere spekter av atferd som for eksempel bevegelse opp eller ned i vannsøylen 10,19. En annen begrensning er at vår imaging system er for øyeblikket ikke optimalisert for high-throughput analyser på video hastighet. Videohastigheten bildebehandling er mulig når du setter kameraet til en lavere oppløsning 15, men dette begrenser analysen til en enkelt plate.
Ved å bruke den nyopprettede "lane"-metoden, trengte flere deler av analysen skal utføres på en presis måte. Når du plasserer larvene i than baner, er det avgjørende å sikre at nivået av væsken er veldig grunt til platene er plassert på toppen av den bærbare skjermen. Dersom banene er også full av væske, vil larvene unnslippe inn i periferien av platen. I tillegg, ved innsetting i formen inn i agarosen, må man være forsiktig å senke støpeformen meget langsomt. Hvis formen er satt inn for raskt, vil det dannes bobler i agarose og vil bli identifisert med bilde J makro som ekstra larver. Det er oppmerksom på at hvis agarose baner har enda noen bobler, er det best å lage nye.
I fremtiden ønsker vi å optimalisere våre atferdsmessige analyse for å analysere andre komplekse atferd som for eksempel læring i sebrafisk larver og undersøke hvordan læring kan påvirkes av eksponering for miljøgifter og legemidler i tidlig utvikling. Vi jobber for tiden med analyser som kan være nyttig for å analysere læring atferd der de atferdsmessige resultater kan lette avgjøre hvilke områder av hjernen erpåvirkes av visse miljøgifter eller legemidler under utvikling. Automatiserte analyser er blitt utviklet for måling av læring atferd i zebrafisk larver 20, og disse prøvene kan være foranderlig for high-throughput screening ved hjelp av robuste unngåelse respons i flerfelts platene.
Vi foreslår at dette atferdsmessige analysen kunne brukes i fremtidige studier for testing av effektene på utvikling av et stort antall legemidler og giftstoffer. Slike studier vil gi et vell av informasjon om spesifikke risikofaktorer og bidra til å sette bedre helse og sikkerhet retningslinjer for gravide kvinner og barn.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Sean Pelkowski for å få hjelp i optimalisering av atferdsmessige analysen. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Child Health and Human Development, R01 HD060647 og National Institute of Environmental Health Sciences, F32 ES021342 og R03 ES017755.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
| Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
| Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
| Equipment | |||
| One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
| Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
| Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
| Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
| Camera Lens | Canon | EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens | |
| Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
| Software | |||
| PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Excel 2010 | Microsoft | ||
| Statistical software | SPSS 20 | ||
References
- Gerlai, R., Lahav, M., Guo, S., Rosenthal, A. Drinks like a fish: zebra fish (Danio rerio) as a behavior genetic model to study alcohol effects. Pharmacol. Biochem. Behav. 67, 773-782 (2000).
- Selderslaghs, I. W. T., Hooyberghs, J., De Coen, W., Witters, H. E. Locomotor activity in zebrafish embryos: A new method to assess developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol. 32, 460-471 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neuroscience. 11, 90 (2010).
- Levin, E. D., Cerutti, D. Ch. 15. Methods of behavioral analysis in neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T.
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5 edn, Univ of Oregon Press. (2007).
- Kokel, D., Bryan, J., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6, 231-237 (2010).
- Rihel, J., Prober, D. A., et al. Zebrafish Behavioral Profiling Links Drugs to Biological Targets and Rest/Wake Regulation. Science. 327, 348-351 (2010).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat. Protoc. 5, 1786-1799 (2010).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Three-Dimensional Neurophenotyping of Adult Zebrafish Behavior. PLoS ONE. 6, e17597 (2011).
- Sledge, D., Yen, J. Critical duration of exposure for developmental chlorpyrifos-induced neurobehavioral toxicity. Neurotoxicol. Teratol. 33, 742-751 (2011).
- Stewart, A., Wu, N. Pharmacological modulation of anxiety-like phenotypes in adult zebrafish behavioral models. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 1421-1431 (2011).
- Eddins, D., Cerutti, D., Williams, P., Linney, E., Levin, E. D. Zebrafish provide a sensitive model of persisting neurobehavioral effects of developmental chlorpyrifos exposure: comparison with nicotine and pilocarpine effects and relationship to dopamine deficits. Neurotoxicol. Teratol. 32, 99-108 (2010).
- Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. A behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities. J. Vis. Exp. (20), e923 (2008).
- Pelkowski, S., Kapoor, M., et al. A novel high-throughput imaging system for automated analyses of avoidance behavior in zebrafish larvae. Behav. Brain Res. 223, 135-144 (2011).
- Richendrfer, H., Pelkowski, S., et al. Assessment of developmental toxicity by automated analyses of behavior in zebrafish larvae. Unpublished observations. , (2012).
- Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R. M., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behav. Brain Res. 228, 99-106 (2012).
- Richendrfer, H. A., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. Developmental sub-chronic exposure to chlorpyrifos reduces anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Neurotoxicol. Teratol. , (2012).
- Egan, R. J., Bergner, C. L., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).
- Colwill, R., Creton, R. Zebrafish protocols for neurobehavioral research. Kalluef, A., Stewart, A. 66, Springer Protocols. (2012).
