Summary
Vårt laboratorium utvecklat en ny high-throughput automatiserad bildbehandling system som är användbart för att upptäcka flera olika beteenden i 7 dagar gamla zebrafisk larver. Systemet kan användas för att upptäcka subtila förändringar i beteende efter larverna har utsatts för miljögifter eller läkemedel.
Abstract
Vi har skapat en ny high-throughput imaging system för analys av beteendet i 7 dagar gamla zebrafisk larver i flerfiliga plattor. Detta system mäter spontana beteenden och svaret på en aversiv stimulus, som bevisligen larverna via en PowerPoint-presentation. De inspelade bilderna analyseras med en ImageJ makro som automatiskt delar upp färgkanaler, subtraherar bakgrunden, och tillämpar en tröskel för att identifiera enskilda larver placering i körfält. Vi kan sedan importera koordinaterna i ett Excel-ark för att kvantifiera simma hastighet, preferens för kant eller sida av körfältet, vila beteende, thigmotaxis, avståndet mellan larver, och undvikande beteende. Subtila förändringar i beteende kan lätt upptäckas med hjälp av vårt system, vilket gör det lämpligt för beteendeanalyser efter exponering för miljögifter eller läkemedel.
Introduction
Zebrafisk blir en populär modell för genetiska, utvecklings-och beteendevetenskap 1-4. De kläcks ur sina chorions med 2-3 dagar efter befruktningen (DPF), utvecklas fullt fungerande organ med 4-5 dpf, och uppvisar ett stort antal beteenden från 7 DPF 5,6. Zebrafisk larver är idealiska för high-throughput analyser på grund av sin ringa storlek 7,8. Programvaran är kommersiellt tillgängliga för automatiserade analyser av beteendet i larver och vuxna zebrafisk 9-14. Dock kan detta program vara dyra och har begränsade alternativ för att mäta komplexa beteenden av zebrafisk larver i flerbrunnsplattor.
Vi skapade en ny high-throughput bildhanteringssystem som är billig att installera och kan kvantifiera ett antal olika beteenden i 7 DPF zebrafisk larver 15,16. Systemet gör att vi snabbt och effektivt testa subtila beteendeavvikelser efter embryonal exponering mot ett antalläkemedel och miljögifter 16-18.
Systemet byggdes med hjälp av trä skåp, vilket hus en digital kamera på toppen av skåpet. Kameran är riktad nedåt mot botten av skåpet där en bärbar dator är placerad med skärmen vänd uppåt 15. Time lapse avbildning används för att fånga placeringen av larver i de banorna. Larver kan hållas i upp till fyra med flera brunnar eller flerfilig plattor som är placerade på toppen av den bärbara skärmen. Vi använder en PowerPoint-presentation som en obehaglig stimulans som larverna svara genom att flytta bort (undvikande) och simma mot kanten (thigmotaxis) 15,17. Bilderna importeras till ImageJ där en automatiserad makro används för att dela upp färgkanaler, subtrahera bakgrunden, och tillämpar ett tröskelvärde för att identifiera enskilda larver. Koordinater listas för varje larv i varje bild och kan sättas in i en Excel-fil som vi använder för att kvantifiera undvikande och thigmotaX är beteende, fisk till fisk avstånd, bada hastighet och mängd vila 16.
Protocol
Ett. Insamling av Zebrafish embryon och höja Larver
- Pyrex rätter med "falska" gräs (tillverkad av grönt garn) (figur 1) skall införas i tankarna i gryningen och lämnade in under två timmar för att samla zebrafisk embryon. Glaset skålar innehållande embryona bör hällas över en handhållen sil och sköljdes med avjoniserat vatten. De embryon bör därefter odlas i ägg vatten. Ägget vatten innehåller 60 mg / L av Omedelbar Ocean i avjoniserat vatten och 0,25 mg / L av metylenblått, som används som en mögelinhibitor.
- Beroende på hypotesen om den individuella experiment, kan embryon behandlas omedelbart eller under vissa stadier av utveckling med hjälp av gifter eller läkemedel. De gifter och läkemedel är oftast löst i DMSO (på en 1000 X koncentration) och bör spädas ytterligare direkt i ägget vatten mediet.
- Under embryots och larver behandling med läkemedel eller toxiskas, kan larverna och embryon inrymmas i djupa petriskålar med en täthet av ca 50-60 larver per 50 ml tills beteendemässiga analyser på 7 DPF (ägg vattenlösning bör bytas minst varannan dag för att undvika svamp / bakterietillväxt från döda embryon).
2. Förbereda Formar för Behavioral Analyser
- Speciellt utvecklat plastformar som mäter 11.7 cm x 7.6 cm x 5 mm var specialbyggt in-house. Formarna behövs för att skapa banor med hjälp av agaros som hälls i enda väl plastplattor från Thermo Scientific. Den enda bra plattor mått 12.4 cm x 8.1 cm x 1.2 cm.
- Formarna innehåller fem banor i vilka sidorna är vinklade 60 °. Banorna i formarna är 3,5 mm höga med en bas av 18 mm vid toppen som är den bredaste medan bottentemperaturen bredd är 14 mm. Det finns en 4 mm spalt mellan körfält i formen (Figur 2).
- För att framställa banorna Häll 50 ml smält agaros (0,8% agaros i deionized vatten med 60 mg / L Omedelbar oceanen) i en enda brunnar. Formen bör sedan placeras mycket långsamt på toppen av den flytande agaros att eliminera varje bubbelbildning och kan avlägsnas när agarosen har svalnat (som tar ungefär 45 min).
- Agarosen körfält bör göras tidigast en dag före beteendeförsök ska köras (för att undvika agaros uttorkning) Banorna kan förvaras i rumstemperatur med lock på disken för upp till ungefär 36 timmar. Agarosen körfält bör endast användas för ett experiment och skall därefter kasseras.
Tre. Bildinsamling
- Upp till 20 larver kan placeras i varje spår av plattorna. Typiskt 5 larver per bana används för att underlätta den mest exakta spårning av simma hastighet och för att minska antalet larver som behövs per experiment. Banorna kan fyllas med ägg vatten med eller utan läkemedel eller gifter beroende på experimentet. Dock bör körfält inte filled upp hela vägen tills de placeras i bildbehandling skåp, detta kommer att förhindra spill. För konsekvensens skull bör larverna ha en acklimatisering period på tio minuter efter att de placeras i agaros formarna och placeras ovanpå den bärbara skärmen. Effektivt flytta larverna från petriskål till agaros körfält kommer att bidra till att minska larver stress. Detta är lättast när larverna är inrymt i grunda tankar eller petriskålar.
- De avbilda skåp har en Canon digitalkamera som används för time-lapse fotografering och en bärbar dator. Kameran bör placeras på toppen av skåpet och riktad mot till botten av skåpet där en 15,6 tums skärm bärbar dator bör placeras med skärmen vänd uppåt (Figur 3). Fyra plattor bör placeras för hand direkt ovanpå den bärbara skärmen. Vid denna tidpunkt banorna kan toppad med ägg vatten eller kemisk behandling så att den är i nivå med toppen av banan (för att eliminera skuggor på kanterna av LAnes i bilder).
- En PowerPoint-presentation används som en obehaglig stimulans för larverna. Under de senaste rörliga röda bollar visade sig zebrafisk larver i 6 eller 12 flerbrunnsplattor 15,17,18. Den nuvarande PowerPoint börjar med en tom vit bakgrund under 15 minuter, följt av 15 min av en rörlig röd stapel på den övre halvan av plattan (Figur 4). För att eliminera överhettning larverna, är det bäst att köpa en bärbar dator med en skärm temperatur som inte går över 28 ° C. För att undvika avdunstning av vätskan inom agaros körfält, bör den maximala avbildningstiden hållas till under en timme.
- Den digitala kameran ska programmeras för time-lapse fotografering, ta bilder varje 6 sek för totalt 300 bilder per experiment. Däremot kan frekvensen och längden justeras beroende på experimentet och beteendemässiga kvantifiering. Under de senaste förlängda imaging tider var anställda med längre intervall mellan varje bild. Den cameren kan ställas in på en lägre upplösning för att avbilda på video hastighet (30 bilder per sekund). Även den lägre upplösningen begränsar inspelningarna till en enda flerkällsplatta, videoinspelningarna är lämplig för avbildning snabba simtävlingar 15.
4. Bildanalys
- Bilderna bör öppnas med ImageJ och används med ett makro som specifikt skriven in-house. Makrot delar automatiskt färgkanalerna så att den röda färgen kan avlägsnas, subtraherar bakgrunden, tillämpar ett tröskelvärde, och identifierar larver genom partikelanalys. Den mest aktuella makrot för fem körfält larver analys är Zebrafish_macro25k. Använd instruktionerna i makrot för att ange antalet bilder, färg som ska subtraheras, bild tröskel, etc.
- Efter alla bilder körs genom ImageJ makro, kommer en resultat fil visas och innehåller x, y-koordinaterna för den enskilde larver för varje bild tillsammans med bildnumret och körfält numret. Den resultat-filen ska sparas i ett Excel-format och sorteras baserat på blank bakgrund kontra rörlig bar bakgrunden och sedan väl numret. En Excel-mall ska användas som har ekvationer inbyggda som automatiskt bestämmer placeringen av larver i brunnar, avstånd mellan larver, rörelsehastighet och mängd vila. Den mest aktuella Excel-mall 25ib skapas i Creton labbet, vilket finns tillgängligt på begäran. Diagram som visar olika behandlingsgrupperna bör byggas in i Excel-arket längs med t-test för jämförelse mellan behandlingsgrupper och kontroller. Ytterligare statistisk analys kan utföras med hjälp av SPSS.
Representative Results
I våra tidigare analyser, med användning av den studsande bollen aversiv stimulus, som är obehandlade vildtyp larver svara på den rörliga kulan genom att simma ner i brunnen (undvikande beteende) och mot kanterna av det väl (thigmotaxis beteende) 15. Vi bekräftade senare att thigmotaxis beteende i denna analys är ett mått av ångest-relaterade beteenden i zebrafisk larver 17. Det fanns signifikanta skillnader i larver rörelse bort från bollen och preferens för kanten jämfört med den tomma vita bakgrunden. Dessa beteenden har också bekräftats i vår nya analys med hjälp av rörliga röda baren och är ännu mer robust 16. Dessutom kan vi prova nu ett större antal beteenden i en enda analys inklusive simma hastighet, vila, preferens för slutet eller sidan av brunnen, och avståndet mellan fisk (Figur 5). Kontroll larver odlas i ägg vatten visar en ökad preferens för att vara nere i skålen och på kanten av banan enfter de presenteras med en obehaglig stimulus (flytta röd stapel). Liknande resultat erhålles när larver odlas i ägg vatten innehållande 1 ^ g / ml DMSO, ett lösningsmedel som ofta används för att upplösa olika läkemedel och gifter som 1000 X stamlösningar.
Representativa resultat visas i figur 5 i larver behandlades med ägg vatten och DMSO (som kontroller) och varierande koncentrationer av en organophosphatebekämpningsmedel vanliga i icke-ekologiska livsmedel. De visade resultaten är ett urval från ett experiment. Men när de repeteras, tyder resultaten på att simma hastighet och thigmotaxis beteende ändras genom låga koncentrationer av organophosphatebekämpningsmedel, som efterliknar nivåer i livsmedelskonsumtion 18.
Figur 1. Collection Brickor. Glas Pyrex rätter används för att samla embryos från de vuxna akvarier. Lock från Pyrex rätter skars och införas med plastgaller och grönt garn syddes på gallren i plasten. Detta skapar en avel atmosfär för den vuxna zebrafisk genom att härma den naturliga miljön.
Figur 2. Plast mögel och agaros körfält. A) Formen visas till vänster. 0,8% agaros hälls i en en-brunnar, formen sakta in och sedan tas bort när agaros svalnat B) Plattan till höger visar de köer som skapats i agaros av plast mögel..
Figur 3. Imaging Skåp. Imaging skåp var specially byggt i vårt laboratorium och används för high-throughput beteendemässiga analyser. En 15 megapixel digitalkamera fästes till toppen av skåpet neråt för att samla bilder time lapse av larver i flerfiliga plattor placerade på toppen av skärmen på en bärbar dator. Mellan plattorna och skärmen finns det en plast diffusor som används för att förhindra moarémönster i de insamlade bilderna.
Figur 4. Blank bakgrund och PowerPoint aversiv stimulans. Detta är den nuvarande PowerPoint som används för att framkalla beteendeförändringar hos zebrafisk larver. Det ger robusta beteendemässiga skillnader mellan A) den tomma bakgrunden och B) den rörliga röda baren.
Figur 5. Beteenden kvantifieras vid hög genomströmning analys. Exempel på beteenden som kvantifieras från vårt beteende analys inom Excel-ark som vi använder för x, y-koordinater för larverna. De vita staplarna visar data från larver exponerade för en tom bakgrund och de röda staplarna visar data från larver exponeras för röda rörliga baren i PowerPoint. Diagrammen visar de mätningar som kan erhållas från beteendeanalys A) Procent av larver nere i lane, B) Procent av larver på slutet av banan, C) Procent av larver på kanten av banan, D) Avstånd mellan fisk (mm), E) simma hastighet av larverna (mm / min), F) Procentuell resten av larver. I de visade graferna är data från treatment av larver med DMSO kontroll och flera koncentrationer av ett bekämpningsmedel som sträcker sig från 0,001 till 0,1 uM (nivåer som förekommer allmänt i människans kost). Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
Medan vi ständigt förbättra vår nya beteende analys, har det alltid varit användbara för detektion av undvikande och thigmotaxis beteende i zebrafisk larver 15. Många försök har gjorts för att optimera resultaten av analysen, t.ex. färg användes av stimulus, ideal antalet larver per körfält och längd beteende analys. Tidigare använde vi flerbrunnsplattor (med 6 eller 12 brunnar) 15,17,18. Men nyligen har vi skapat den nya körfält formen för att skapa ett större bad utrymme för larverna att tillåta oss att samla ett större antal beteendemässiga åtgärder i en enda analys 16 (Figur 5). Andra modifieringar innefattar variationer av PowerPoint visad (förändrad rörelse eller längd assay) och storleken på de köer som används (vi har även formar för mer smala körfält).
För närvarande är denna hög genomströmning automatiserat system unik i sin förmåga att mäta ett stort spektrum av beteenden i zebrafish larver samtidigt som hastighet, undvikande, närhet till andra larver, och thigmotaxis i flerfiliga plattor. Resultat kan erhållas snabbt och ett stort antal larver kan analyseras vid tiden för avbildning. Systemet är både billig att bygga och snabb och enkel att installera. En begränsning av detta system är att 3-D-rörelserna inte kan bedömas i zebrafisk larver. Automatiserade system som spårar vuxna zebrafisk har 3-D-förmåga och kan identifiera ett bredare spektrum av beteenden såsom rörelse upp eller ned i vattenmassan 10,19. En annan begränsning är att vårt bildsystem för närvarande inte är optimerad för hög kapacitet analyser på video hastighet. Video speed imaging är möjligt när du ställer in kameran till en lägre upplösning 15, men detta begränsar analysen till en enda skylt.
Vid användning av den nyskapade "lane" metoden, behövs flera delar av analysen som ska utföras på ett exakt sätt. Vid placering av larver i tHan körfält, är det viktigt att se till att vätskenivån är väldigt grunt tills plattorna är placerade ovanpå den bärbara skärmen. Om banorna är alltför fullt av vätska, så kommer larverna fly in i plattans periferi. Dessutom, vid insättning formen i agarosen, måste försiktighet iakttas för att sänka formen mycket långsamt. Om formen är insatt för snabbt, kommer bubblor bildas i agaros och kommer att identifieras av Image J makro som extra larver. Det rekommenderas att om agarospartiklar körfält har även några bubblor, är det bäst att göra nya.
I framtiden vill vi optimera vår beteende analys för att analysera andra komplexa beteenden såsom lärande i zebrafisk larver och undersöka hur lärande kan påverkas av exponering för miljögifter och läkemedel i tidig utveckling. Vi arbetar för närvarande på analyser som kan vara användbara för att analysera lärande beteende där de beteendemässiga resultaten kan underlätta avgöra vilka hjärnområden ärpåverkas av vissa toxiska substanser eller läkemedel under utveckling. Automatiserade analyser har utvecklats för att mäta inlärning beteenden i zebrafisk larver 20 och dessa analyser kan vara möjligt att ändra för high-throughput screening med hjälp av robusta undvikande svar i flerfiliga plattor.
Vi föreslår att detta beteende analys skulle kunna användas i framtida studier för att testa de utvecklingseffekter av ett stort antal läkemedel och gifter. Sådana studier skulle ge en mängd information om specifika riskfaktorer samt bidra till bildandet bättre hälsa och säkerhet riktlinjer för gravida kvinnor och barn.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Sean Pelkowski för hjälp i optimering av beteendemässiga analysen. Detta arbete stöddes av National Institute of Child Health and Human Development, R01 HD060647 och National Institute of Environmental Health Sciences, F32 ES021342 och R03 ES017755.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
| Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
| Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
| Equipment | |||
| One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
| Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
| Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
| Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
| Camera Lens | Canon | EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens | |
| Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
| Software | |||
| PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Excel 2010 | Microsoft | ||
| Statistical software | SPSS 20 | ||
References
- Gerlai, R., Lahav, M., Guo, S., Rosenthal, A. Drinks like a fish: zebra fish (Danio rerio) as a behavior genetic model to study alcohol effects. Pharmacol. Biochem. Behav. 67, 773-782 (2000).
- Selderslaghs, I. W. T., Hooyberghs, J., De Coen, W., Witters, H. E. Locomotor activity in zebrafish embryos: A new method to assess developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol. 32, 460-471 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neuroscience. 11, 90 (2010).
- Levin, E. D., Cerutti, D. Ch. 15. Methods of behavioral analysis in neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T.
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5 edn, Univ of Oregon Press. (2007).
- Kokel, D., Bryan, J., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6, 231-237 (2010).
- Rihel, J., Prober, D. A., et al. Zebrafish Behavioral Profiling Links Drugs to Biological Targets and Rest/Wake Regulation. Science. 327, 348-351 (2010).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat. Protoc. 5, 1786-1799 (2010).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Three-Dimensional Neurophenotyping of Adult Zebrafish Behavior. PLoS ONE. 6, e17597 (2011).
- Sledge, D., Yen, J. Critical duration of exposure for developmental chlorpyrifos-induced neurobehavioral toxicity. Neurotoxicol. Teratol. 33, 742-751 (2011).
- Stewart, A., Wu, N. Pharmacological modulation of anxiety-like phenotypes in adult zebrafish behavioral models. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 1421-1431 (2011).
- Eddins, D., Cerutti, D., Williams, P., Linney, E., Levin, E. D. Zebrafish provide a sensitive model of persisting neurobehavioral effects of developmental chlorpyrifos exposure: comparison with nicotine and pilocarpine effects and relationship to dopamine deficits. Neurotoxicol. Teratol. 32, 99-108 (2010).
- Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. A behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities. J. Vis. Exp. (20), e923 (2008).
- Pelkowski, S., Kapoor, M., et al. A novel high-throughput imaging system for automated analyses of avoidance behavior in zebrafish larvae. Behav. Brain Res. 223, 135-144 (2011).
- Richendrfer, H., Pelkowski, S., et al. Assessment of developmental toxicity by automated analyses of behavior in zebrafish larvae. Unpublished observations. , (2012).
- Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R. M., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behav. Brain Res. 228, 99-106 (2012).
- Richendrfer, H. A., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. Developmental sub-chronic exposure to chlorpyrifos reduces anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Neurotoxicol. Teratol. , (2012).
- Egan, R. J., Bergner, C. L., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).
- Colwill, R., Creton, R. Zebrafish protocols for neurobehavioral research. Kalluef, A., Stewart, A. 66, Springer Protocols. (2012).
