Summary
В нашей лаборатории разработали новый высокой пропускной автоматизированной системы формирования изображения, которая полезна для обнаружения несколько различное поведение в 7-дневных личинки данио. Система может быть использована для обнаружения тонких изменений в поведении после личинки подвергались воздействию экологических токсикантов или фармацевтических препаратов.
Abstract
Мы создали новую высокую пропускную способность системы визуализации для анализа поведения в 7-дневные личинки данио в многополосных пластин. Эта система измеряет спонтанное поведение и реакция на стимул отвращение, которое показано на личинок с помощью презентации PowerPoint. Записанные изображения анализируются с ImageJ макроса, который автоматически разбивает цветовых каналов, вычитание фона, и применяет порог для идентификации отдельных размещение личинок в переулках. Мы можем затем импортировать координаты в листе Excel для количественной скорость плавания, предпочтение края или стороне переулка, отдыхая поведения, thigmotaxis, расстояние между личинками и избегающего поведения. Тонкие изменения в поведении легко обнаружить с помощью нашей системы, что делает его полезным для поведенческого анализа после воздействия экологических токсикантов или фармацевтических препаратов.
Introduction
Данио рерио становятся популярной моделью для генетических, развития и поведенческих наук 1-4. Они выводятся из их хорионов на 2-3 сутки после оплодотворения (денье), разработки полностью функционирующей органов на 4-5 денье, и обладают большим количеством поведения на 7 5,6 денье. Личинки данио идеально подходят для высокопроизводительного анализа из-за их малого размера 7,8. Программное обеспечение является коммерчески доступным для автоматизированного анализа поведения в личинок и взрослых данио 9-14. Тем не менее, это программное обеспечение может быть дорогим и имеет ограниченные возможности для измерительного комплекса поведения личинки данио в мульти-луночных планшетах.
Мы создали новую высокую пропускную способность системы визуализации, которая недорого создать и может количественно различные поведения в 7 DPF личинки данио 15,16. Система позволяет нам быстро и эффективно проверить тонкие поведенческие отклонения после эмбрионального воздействия рядафармацевтических препаратов и экологических токсикантов 16-18.
Система построена с использованием деревянных шкафов, в которых размещается цифровая камера в верхней части шкафа. Камера обращена вниз к нижней части корпуса, где ноутбук помещается с экраном вверх 15. Временной интервал изображения используется для захвата размещение личинок в полос. Личинки могут быть размещены в четырех мульти-и или несколькими полосами пластин, которые расположены в верхней части экрана ноутбука. Мы используем PowerPoint презентации как отвращение раздражитель, на который отвечают личинки, уходя (предотвращение) и плавание к краю (thigmotaxis) 15,17. Изображения импортируются в ImageJ в которых автоматизирован макросов используется для разделения цветовых каналов, вычитания фона, а также применять порог для идентификации отдельных личинок. Координаты перечислены для каждого личинки в каждом изображении и могут быть вставлены в файл Excel, который мы используем для количественного избегания и thigmotaXis поведения, рыбу ловить рыбу расстояние, скорость плавания, и количество отдыха 16.
Protocol
1. Коллекция Эмбрионы рыбок данио и повышение Личинки
- Блюда из термостойкого стекла с "поддельные" трава (сделанный из зеленой пряжи) (рис. 1) должны быть вставлены в танки на рассвете и покинул его в течение двух часов с целью сбора эмбрионов рыбок данио. Стеклянной посуды содержащий зародыши должны быть выливают на портативный фильтр и промывали деионизированной водой. Затем эмбрионы должны быть выращены в воде яйцо. Яйцо вода содержит 60 мг / л мгновенных океана в деионизированной воды и 0,25 мг / л метиленового синего, который используется в качестве ингибитора плесени.
- В зависимости от гипотезы отдельном эксперименте, эмбрионы могут быть обработаны немедленно или в течение определенных стадиях развития с использованием токсичных веществ или фармацевтических препаратов. Токсикантов и фармацевтика, как правило, растворяли в ДМСО (в 1000 концентрация X) и должны быть дополнительно разбавляют непосредственно в водной среде яйца.
- Во время эмбрионального и личиночного лечении фармацевтических средств или токсических веществс, личинки и эмбрионы не могут быть размещены в глубоких чашках Петри при плотности около 50-60 личинок на 50 мл до поведенческого анализа на 7 DPF (яйцо водный раствор должен быть изменен по крайней мере через день, чтобы избежать грибковых / рост бактерий от мертвых эмбрионов).
2. Подготовка формы для поведенческого анализа
- Специально разработанные пластиковые формы, которые измеряют 11,7 см х 7,6 см х 5 мм, изготовленный на заказ в дом. Формы, необходимые для создания полос использованием агарозы которое заливают в одной скважине пластиковых пластин от Thermo Scientific. Одной скважины мера пластин 12,4 см х 8,1 см х 1,2 см.
- Формы содержать пять полос в котором стороны расположены под углом в 60 °. Дорожки в формах в 3,5 мм с основанием 18 мм наверху, который является самым широким в то время как нижняя ширина составляет 14 мм. Существует 4 мм между полосами движения в форме (рис. 2).
- Для приготовления полосы залить 50 мл расплавленной агарозы (0,8% агарозы в деионизацииг воды с 60 мг / л мгновенных океана) в одном луночный планшет. Пресс-форма должна быть помещена очень медленно в верхней части жидкой агарозы, чтобы устранить любые образование пузырьков и могут быть удалены, когда агарозном остынет (которая занимает примерно 45 мин).
- Агарозном полос должна быть сделана не ранее чем за один день до поведенческого эксперимента должна быть выполнена (чтобы избежать высыхания агарозы) полос может храниться при комнатной температуре с крышками на посуде до примерно 36 часов. Агарозном полос должна быть использована только для одного эксперимента и должны быть отброшены.
3. Image Capture
- До 20 личинок могут быть размещены на каждой дорожке пластин. Обычно 5 личинок на полосу используются для облегчения наиболее точное отслеживание плавать скорость и уменьшить количество личинок, которые необходимы в эксперименте. Полосы могут быть заполнены водой яйцо с или без фармацевтических средств или токсических веществ в зависимости от эксперимента. Однако полос не должно быть еыть убитым всю дорогу, пока они не помещаются в шкафах изображений, это позволит предотвратить переполнение. Для согласованности, личинки должны иметь период акклиматизации десять минут после их помещают в формы агарозы и расположены на верхней части экрана ноутбука. Эффективное перемещение личинок из чашки Петри в агарозном Lane поможет уменьшить стресс личинки. Проще всего это когда личинки расположены в неглубоких резервуаров или чашки Петри.
- Изображений шкафы включают в себя камеру Canon Digital используется для замедленной киносъемки и ноутбук. Камера должна быть помещена в верхней части шкафа и направленной на нижней части корпуса, где 15,6-дюймовый экран ноутбука должны быть размещены с экраном вверх (рис. 3). Четыре пластины должны быть установлены вручную непосредственно на экране ноутбука. В это время полосы может быть превысила покинуть с водой яйцом или химической обработке, чтобы он на одном уровне с верхней части полосы (для устранения теней на краях лAnes в изображениях).
- Презентация PowerPoint используется как отвращение стимулом для личинок. В прошлом движущихся красных шаров были показаны личинки данио в 6 или 12 мульти-и пластин 15,17,18. Нынешний PowerPoint начинается с пустой белый фон в течение 15 мин, затем 15 мин движущейся красной полосой на верхней половине из них (Рис. 4). В целях устранения перегрева личинок, то лучше приобрести ноутбук с экраном, что температура не поднимается выше 28 ° С. Во избежание испарения жидкости внутри полосы в агарозном, максимальное время визуализации должно быть сведено к ниже одного часа.
- Цифровой фотоаппарат должен быть запрограммирован на замедленной киносъемки, съемки в 6 сек на общую сумму 300 изображений на эксперимент. Однако частота и длина может регулироваться в зависимости от поведенческого эксперимента и количественного определения. В прошлом Срок изображений были заняты использовании более длинных промежутках между каждого изображения. Камерможет быть установлен на более низком разрешении проведения исследований в скорости видео (30 кадров в секунду). В то время как низкое разрешение ограничивает записи на одну пластину многоямного, видеозаписями подходят для быстрой визуализации плаванию 15.
4. Анализ изображения
- Изображения должны быть открыты и использованы ImageJ с помощью макроса, которая была специально написана в доме. Макро автоматически разбивает цветовых каналов таким образом, что красный цвет может быть удалена, вычитание фона, применяет порог, и идентифицирует личинок анализа частиц. Самый последний макрос для анализа пяти Lane является личиночной Zebrafish_macro25k. Пользоваться подсказками в макро задать количество изображений, цвет, который будет вычитаться, изображения порогом чувствительности и т.д.
- После того как все изображения проходят через ImageJ макро, файл результатов будет отображаться и будет содержать х, у координаты отдельных личинок для каждого изображения, а также количество изображений и номера дорожки. Результаты файл должен быть сохранен в формате Excel и сортируются в зависимости от пустой фон против движущемся фоне бара, а затем номер скважины. Шаблон Excel следует использовать уравнения, которое имеет встроенный, который автоматически определяет размещение личинок в колодцы, расстояние между личинками, скорость движения и количество отдыха. Самая последняя Excel шаблон 25ib создан в Creton лабораторию, которая может быть предоставлена по запросу. Графики, показывающие различные группы лечения должна быть встроена в лист Excel вместе с т-тестов для сравнения между группами лечения и контроля. Дальнейшего статистического анализа можно выполнить с помощью SPSS.
Representative Results
В наших предыдущих анализах с использованием живой шар отвращение раздражитель, дикий тип личинки, которые необработанной реагировать на перемещение шара вплавь вниз в скважине (избегания) и к краям хорошо (thigmotaxis поведение) 15. Позже мы подтвердили, что thigmotaxis поведение в этом анализе, является мерой тревожность поведения, связанного в личинки данио 17. Были существенные различия у личинок движение от мяча и предпочтение края по сравнению с пустой белый фон. Такие действия были подтверждены также в нашем новом анализе с использованием движущейся красной полосой и еще более надежной 16. Более того, теперь мы можем попробовать большее количество поведений в одном анализе, включая скорость плавания, отдыха, предпочтение конце или сбоку Ну, а расстояние между рыбами (рис. 5). Управление личинок, выращенных в яйце водное шоу увеличилось предпочтение будет вниз на блюдо и на краю полосыосле они представлены стимул отвращение (перемещение красная полоса). Аналогичные результаты получены, когда личинки выращивают в яйцо воды, содержащей 1 мкг / мл ДМСО, растворитель, который обычно используют для растворения различных фармацевтических препаратов и токсических веществ в качестве решения 1000 X наличии.
Типичные результаты показаны на рисунке 5 личинок получавших яйцо воды и ДМСО (в качестве контроля) и различные концентрации фосфорорганических пестицидов обычно находится в неорганические продукты. Результаты показаны выборки из одного эксперимента. Однако, когда повторяется, результаты показывают, что скорость плавания и thigmotaxis поведение изменяется при низкой концентрации фосфорорганических пестицидов, которые имитируют уровня потребления человеком питания 18.
Рисунок 1. Коллекция лотков. Блюда из термостойкого стекла используются для сбора адресов электроннойmbryos от взрослых рыб танков. Крышки от блюд Pyrex были вырезаны и вставлены пластиковые сетки и зеленые нити был сшит на сеток в пластик. Это создает питательную атмосферу для взрослых данио, имитируя природную среду.
Рисунок 2. Пластиковые формы и агарозном переулков. А) пресс-формы показано на левой стороне. 0,8% агарозном выливают в один-луночный планшет; пресс-формы медленно вставлена, а затем удаляется, когда агарозном остынет B) пластины справа показывает полосы в агарозном созданный на пластиковые формы..
Рисунок 3. Шкафы изображений. Изображений шкафы были специальнаяY построен в нашей лаборатории и использовать для высокой пропускной поведенческого анализа. 15-мегапиксельная цифровая камера была прикреплена к верхней части шкафа вниз, чтобы собрать промежуток времени изображения личинок в многополосной пластины размещены в верхней части экрана ноутбука. Между пластинами и экраном расположен пластиковый диффузор, который используется для предотвращения муара на изображении собраны.
Рисунок 4. Пустые фона и PowerPoint отвращение раздражитель. Это текущее PowerPoint, который используется, чтобы вызвать изменения в поведении личинки данио. Это обеспечивает надежную поведенческие различия между) пустой фон и B) движущейся красной полосой.
Рисунок 5. Поведение количественно в высокой пропускной способности анализа. Пример поведения, которые количественно нашего поведенческого анализа в листе Excel, который мы используем для х, у координаты личинок. Белые полосы показывают данные из гусениц, подвергнутых воздействию пустой фон и красная полосы показывают данные из гусениц, подвергнутых воздействию движущихся красных бара в PowerPoint. Графики показывают измерения, которые могут быть получены из анализа поведения) Процент личинки вниз в переулок, б) процент личинок на конце переулка, С) в процентах личинок на краю полосы, D) Расстояние между рыбы (мм), Е) плавать скорость личинки (мм / мин), F) Процент остальной части личинок. На графиках показано, данные из сточных вЛОР личинок с ДМСО контроля и нескольких концентраций пестицидов в пределах от 0,001 до 0,1 мкм (уровни обычно встречаются в рационе человека). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Discussion
В то время как мы постоянно совершенствуем наш роман поведенческого анализа, это всегда было полезно для обнаружения и предотвращения thigmotaxis поведения в личинки данио 15. Многие испытания были проведены, чтобы оптимизировать результаты анализа, такие как цвет стимул использованы, идеальное количество личинок на полосу, а длина поведенческого анализа. Ранее мы использовали мульти-и пластин (с 6 или 12 скважин) 15,17,18. Однако в последнее время мы создали форму романа полосу, чтобы создать большее пространство бассейна для личинок позволяет нам собрать большее количество поведенческих мер в одном анализе 16 (рис. 5). Другие модификации включают вариации PowerPoint показанным (изменено движение или длину анализ) и размер полос использовали (мы также формы для более узких полос).
В настоящее время эта высокой пропускной автоматизированная система является уникальной в своем способностью измерять широкий спектр поведений в ZEBRafish личинок в то же время, такие как скорость, избегание, близость к другим личинок и thigmotaxis в многополосной пластин. Результаты могут быть получены быстро, и большое количество личинок могут быть проанализированы в момент съемки. Система является и недорого построить и быстро и легко настроить. Ограничением этой системы является то, что 3-D движения не могут быть оценены в личинки данио. Автоматизированные системы, которые отслеживают взрослых данио имеют 3-D возможности и может определить более широкий спектр поведения, таких как движение вверх или вниз в толще воды 10,19. Другим ограничением является то, что наша система формирования изображения в настоящее время не оптимизирован для высокой пропускной способности анализа на видео скорости. Видео-скорость визуализации можно при установке камеры на более низкое разрешение 15, но это ограничивает анализ одной пластине.
В используя только что созданный "переулок" метод, несколько частей анализа, требующие выполнения точным образом. При размещении личинок в тОн полосами, очень важно, чтобы убедиться, что уровень жидкости очень мелкая, пока плиты не расположены на верхней части экрана ноутбука. Если полосы слишком заполнен жидкостью, личинки будут попадать в периферии пластины. Кроме того, при вставке формы в агарозном, необходимо соблюдать осторожность, чтобы понизить форму очень медленно. Если форма вводится слишком быстро, пузырьки образуются в агарозном и будут определены макро J изображения в качестве дополнительных личинок. Он сообщил, что если агарозном переулков даже несколько пузырей, то лучше, чтобы сделать новые.
В будущем мы хотели бы оптимизировать наши поведенческие анализа для анализа других сложных поведения, такие как обучение в личинки данио и изучить, как обучение могут быть затронуты в результате воздействия токсичных веществ и фармацевтических препаратов в раннем развитии. В настоящее время мы работаем над анализами, которые могут быть полезны для анализа поведения обучения, в котором поведенческие результаты могут облегчить определение которой области мозга являютсявлияют определенные токсикантов или фармацевтических препаратов в процессе разработки. Автоматизированные анализы были разработаны для измерения обучения поведению в личинки данио 20 и эти анализы могут быть исправимо для высокопроизводительного скрининга с помощью мощного ответа избегания у многополосных пластин.
Мы предполагаем, что это поведенческий тест может быть использован в дальнейших исследованиях для проверки эффекта развития большого числа лекарственных препаратов и токсических веществ. Такие исследования дают богатую информацию о конкретных факторов риска и вклад в установление лучшего здоровья и труда для беременных женщин и детей.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Шон Pelkowski за помощь в оптимизации поведенческого анализа. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья ребенка и развития человека, R01 HD060647 и Национального института гигиены окружающей среды наук, F32 и R03 ES021342 ES017755.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
| Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
| Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
| Equipment | |||
| One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
| Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
| Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
| Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
| Camera Lens | Canon | EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens | |
| Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
| Software | |||
| PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Excel 2010 | Microsoft | ||
| Statistical software | SPSS 20 | ||
References
- Gerlai, R., Lahav, M., Guo, S., Rosenthal, A. Drinks like a fish: zebra fish (Danio rerio) as a behavior genetic model to study alcohol effects. Pharmacol. Biochem. Behav. 67, 773-782 (2000).
- Selderslaghs, I. W. T., Hooyberghs, J., De Coen, W., Witters, H. E. Locomotor activity in zebrafish embryos: A new method to assess developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol. 32, 460-471 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neuroscience. 11, 90 (2010).
- Levin, E. D., Cerutti, D. Ch. 15. Methods of behavioral analysis in neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. , 203-253 (1995).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5 edn, Univ of Oregon Press. (2007).
- Kokel, D., Bryan, J., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6, 231-237 (2010).
- Rihel, J., Prober, D. A., et al. Zebrafish Behavioral Profiling Links Drugs to Biological Targets and Rest/Wake Regulation. Science. 327, 348-351 (2010).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat. Protoc. 5, 1786-1799 (2010).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Three-Dimensional Neurophenotyping of Adult Zebrafish Behavior. PLoS ONE. 6, e17597 (2011).
- Sledge, D., Yen, J. Critical duration of exposure for developmental chlorpyrifos-induced neurobehavioral toxicity. Neurotoxicol. Teratol. 33, 742-751 (2011).
- Stewart, A., Wu, N. Pharmacological modulation of anxiety-like phenotypes in adult zebrafish behavioral models. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 1421-1431 (2011).
- Eddins, D., Cerutti, D., Williams, P., Linney, E., Levin, E. D. Zebrafish provide a sensitive model of persisting neurobehavioral effects of developmental chlorpyrifos exposure: comparison with nicotine and pilocarpine effects and relationship to dopamine deficits. Neurotoxicol. Teratol. 32, 99-108 (2010).
- Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. A behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities. J. Vis. Exp. (20), e923 (2008).
- Pelkowski, S., Kapoor, M., et al. A novel high-throughput imaging system for automated analyses of avoidance behavior in zebrafish larvae. Behav. Brain Res. 223, 135-144 (2011).
- Richendrfer, H., Pelkowski, S., et al. Assessment of developmental toxicity by automated analyses of behavior in zebrafish larvae. Unpublished observations. , (2012).
- Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R. M., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behav. Brain Res. 228, 99-106 (2012).
- Richendrfer, H. A., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. Developmental sub-chronic exposure to chlorpyrifos reduces anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Neurotoxicol. Teratol. , (2012).
- Egan, R. J., Bergner, C. L., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).
- Colwill, R., Creton, R. Zebrafish protocols for neurobehavioral research. Kalluef, A., Stewart, A. 66, Springer Protocols. (2012).
