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Chemistry

ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया से अलगाव और लिपिड एक के रासायनिक लक्षण वर्णन

Published: September 16, 2013 doi: 10.3791/50623
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Section of Molecular Genetics and Microbiology, The University of Texas at Austin, 2Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Texas at Austin, 3The Institute of Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

Summary

ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया से (LPS) lipopolysaccharide के लिपिड किसी डोमेन का अलगाव और लक्षण वर्णन कोशिका की सतह एंटीबायोटिक प्रतिरोध के आधार पर तंत्र, बैक्टीरियल अस्तित्व और फिटनेस, और कैसे रासायनिक विविध लिपिड एक आणविक प्रजातियों विभिन्न मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मिलाना में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.

Abstract

(LPS) lipopolysaccharide बाहरी झिल्ली bilayer के बाहरी पत्रक जमा पर ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के प्रमुख कोशिका की सतह अणु, है. LPS तीन डोमेन में विभाजित किया जा सकता है: बाहर हे polysaccharide, एक कोर oligosaccharide, और लिपिड एक लिपिड से मिलकर एक डोमेन एक आणविक प्रजातियों और 3 डिओक्सी-D-Manno-Oct-2-ulosonic एसिड के अवशेष (KDO). लिपिड एक डोमेन बैक्टीरिया कोशिका अस्तित्व के लिए आवश्यक केवल घटक है. इसके संश्लेषण के बाद, लिपिड एक रासायनिक एंटीबायोटिक यौगिकों के लिए प्रतिरोध को बढ़ावा देने के लिए, और मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मध्यस्थों द्वारा मान्यता से बचने के लिए, पीएच या तापमान के रूप में पर्यावरण तनाव के जवाब में संशोधित किया गया है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया से लिपिड ए के छोटे और बड़े पैमाने पर अलगाव का विवरण. पृथक सामग्री तो रासायनिक पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) या जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) की विशेषता है. इसके अलावा एफ के लेजर desorption / आयनीकरण समय मैट्रिक्स की मदद सेप्रकाश (MALDI-TOF) एमएस, हम भी टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) के लिए युग्मित electrospray ionization (ईएसआई) और नव नियोजित पराबैंगनी photodissociation (UVPD) तरीकों का उपयोग लिपिड एक आणविक प्रजातियों का विश्लेषण करने के लिए मिलकर एमएस प्रोटोकॉल का वर्णन. हमारे एमएस प्रोटोकॉल अद्वितीय या उपन्यास रासायनिक संशोधनों होते हैं कि लिपिड एक अणु के लक्षण वर्णन के लिए सर्वोपरि, रासायनिक संरचना का स्पष्ट निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं. हम भी टीएलसी द्वारा विश्लेषण के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं से लिपिड एक की रेडियोआइसोटोपिक लेबलिंग, और बाद में अलगाव का वर्णन. एमएस आधारित प्रोटोकॉल के सापेक्ष, टीएलसी एक और अधिक किफायती और तेजी से लक्षण वर्णन तरीका प्रदान करता है, लेकिन स्पष्ट रूप से ज्ञात रासायनिक संरचना के मानकों के उपयोग के बिना एक रासायनिक संरचना लिपिड आवंटित करने के लिए प्रयोग नहीं किया जा सकता है. पिछले दो दशकों में लिपिड एक का अलगाव और लक्षण वर्णन ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया, एंटीबायोटिक प्रतिरोध के तंत्र का शरीर विज्ञान के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है कि कई रोमांचक खोजों के लिए प्रेरित कियादूरी, मानव सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और जीवाणुरोधी यौगिकों के विकास में कई नए लक्ष्य प्रदान की है.

Introduction

(LPS) lipopolysaccharide लगभग सभी ग्राम नकारात्मक जीवों के प्रमुख बाहरी सतह अणु है और तीन आणविक डोमेन के होते हैं: एक बाहर का हे प्रतिजन polysaccharide, एक कोर oligosaccharide, और झिल्ली जुड़े लिपिड की बाहरी पत्रक जमा पर डोमेन बाहरी झिल्ली bilayer 1,2. लिपिड एक डोमेन, लिपिड एक हल्के एसिड हाइड्रोलिसिस 1 पर LPS की क्लोरोफॉर्म घुलनशील भाग के रूप में परिभाषित किया जा सकता है जहां 3 डिओक्सी-D-Manno-Oct-2-ulosonic (KDO) के अवशेष और एक लिपिड एक आणविक प्रजातियों के होते हैं, 2. मॉडल जीव Escherichia कोलाई (ई. कोलाई) 1,2 में मनाया प्रमुख लिपिड एक प्रजाति के साथ संगत; मानक लिपिड एक अणु रासायनिक hexa-acylated और बीआईएस phosphorylated है कि एक diglucosamine रीढ़ के रूप में परिभाषित किया जा सकता है. ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया भर में संरक्षित नौ रचनात्मक रूप में व्यक्त जीनों, लिपिड का उत्पादन एक डोमेन (चित्रा 1) 1,2 के लिए जिम्मेदार हैं. अधिकांश बैक्टीरिया लिपिड ए 3 के आगे रासायनिक संशोधन में भाग लेने कि वंशावली संरक्षण की डिग्री में भिन्नता है, जो जीन का एक अतिरिक्त सेट,, है. Dephosphorylation, एसाइल जंजीरों को हटाने, और इस तरह के अमीनो शर्करा (जैसे aminoarabinose) और / या phosphoethanolamine के रूप में रासायनिक moieties के अलावा सबसे अधिक देखी गतिविधियों (चित्रा 1) हैं. लिपिड एक संशोधन के लिए जिम्मेदार एंजाइम से कई सीधे द्विसंयोजक फैटायनों के रूप में पर्यावरण के संकेत, द्वारा सक्रिय कर रहे हैं, या उनकी अभिव्यक्ति दो घटक प्रतिक्रिया नियामक प्रणालियों 3 द्वारा नियंत्रित किया जाता है.

मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा लिपिड एक प्रजाति की मान्यता टोल की तरह रिसेप्टर 4/myeloid भेदभाव कारक 2 (TLR4/MD2) सह रिसेप्टर 4 द्वारा मध्यस्थता है. MD2 और लिपिड एक एसाइल चेन, साथ ही TLR4 और लिपिड एक की 1 और 4 'फॉस्फेट समूहों होंठ के मजबूत सहयोग को बढ़ावा देने के बीच के बीच हाइड्रोफोबिक बलोंTLR4/MD2 4,5 साथ आईडी ए. Acylation राज्य या लिपिड के नकारात्मक प्रभारी एक प्रभाव TLR4/MD2 आधारित लिपिड को बदलने वाले संशोधनों के एक मान्यता और सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बहाव उत्तेजना NF-κB और ऐसे TNFα और IL1-β 6,7 के रूप में सूजन के मध्यस्थों activators. लिपिड एक के नकारात्मक आरोप नकाब कि संशोधन भी सेल सतहों 3,8 नकारात्मक ग्राम के लिए बाध्य करने से जीवाणुनाशक cationic रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स रोका जा सके. कई लिपिड एक संशोधनों ऐसे मानव मेजबान अंदर है या एक पारिस्थितिक आला में के रूप में विशिष्ट पर्यावरण की स्थिति, के तहत बैक्टीरियल फिटनेस बढ़ाने के लिए धारणा रहे हैं. इस कारण से कई संशोधन एंजाइमों रोगाणुरोधी यौगिकों के तर्कसंगत विकास में आकर्षक लक्ष्य कर रहे हैं. लिपिड एक संरचनाओं के रासायनिक विविधता, जीव और / या पर्यावरण, और इन विविध संरचनाओं का जैविक प्रभाव के संबंध में लिपिड एक की संरचनात्मक लक्षण वर्णन टी में एक महत्वपूर्ण प्रयासवह ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया का अध्ययन करते हैं.

पूरे बैक्टीरिया से लिपिड एक अणुओं का अलगाव एक अंतिम शोधन प्रक्रिया 9-11 द्वारा पीछा बैक्टीरिया कोशिका की सतह से LPS की निकासी, लिपिड एक आजाद कराने के लिए एक hydrolytic कदम शामिल है. सबसे अक्सर उद्धृत LPS निष्कर्षण प्रक्रिया पहले Westphal और Jann 10 से शुरू की, गर्म फिनोल पानी निकासी प्रक्रिया है. निकासी पूरी LPS रासायनिक लिपिड एक के बाहर का glucosamine चीनी (चित्रा 1) के 6'-हाइड्रॉक्सिल से KDO जो अलग हल्के एसिड हाइड्रोलिसिस, के अधीन है, के बाद. कई नुकसान एक उच्च खतरा अभिकर्मक के उपयोग सहित गर्म फिनोल पानी की प्रक्रिया के लिए मौजूद हैं, सह निकाले न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन, और कई दिनों से नीचा करने की जरूरत प्रोटोकॉल 10 पूरा करना आवश्यक है.

पहले Caroff और Raetz 12,13 द्वारा विकसित रूप में हमारी प्रयोगशाला आगे लिपिड एक की निकासी और अलगाव विकसित की है. गर्म फिनोल पानी प्रक्रियाओं की तुलना में, यहाँ प्रस्तुत विधि और अधिक तेजी से और कुशल है और 5 मिलीग्राम से कई लीटर संस्कृति संस्करणों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त है. इसके अलावा, गर्म फिनोल पानी एक्सट्रेक्शन के विपरीत, हमारे विधि लिपिड एक प्रजाति के इष्टतम वसूली प्रदान करने, LPS के किसी न किसी या चिकनी प्रकार के लिए चयन नहीं होता है. हमारे प्रोटोकॉल में, पूरे बैक्टीरियल कोशिकाओं के रासायनिक सेल LPS centrifugation द्वारा pelleted किया जा सकता है, जहां क्लोरोफॉर्म, मेथनॉल और पानी के मिश्रण का प्रयोग किया जाता है. हल्के एसिड hydrolysis और विलायक एक्सट्रेक्शन (Bligh-डायर) का एक संयोजन covalently संलग्न polysaccharide से लिपिड एक आजाद कराने के लिए उपयोग किया जाता है. Bligh और डायर की विधि पहले 14 ऊतकों, पशु और संयंत्र की एक किस्म से लिपिड प्रजातियों की निकासी के लिए लागू इस अंतिम जुदाई चरण में लिपिड ए से hydrolyzed पोलीसेकेराइड अलग करने के लिए यहाँ संशोधित किया गया था, क्लोरोफॉर्म घुलनशील लिपिड चुनिंदा कम जैविक में विभाजन चरण. इसके अलावा, लिपिड एक शुद्ध करने के लिए रिवर्स चरण याanionic विनिमय कॉलम क्रोमैटोग्राफी 12 इस्तेमाल किया जा सकता है.

पूरे कोशिकाओं से लिपिड एक प्रजाति के अलगाव के बाद, विश्लेषणात्मक तरीकों की एक संख्या में इस तरह के एनएमआर, टीएलसी, और एमएस के आधार पर विश्लेषण के रूप में अलग सामग्री की रासायनिक संरचना को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एनएमआर गैर विनाशकारी संरचनात्मक व्याख्या के लिए अनुमति देता है, और glycosidic लिंकेज, एसाइल श्रृंखला पदों की स्पष्ट असाइनमेंट, और aminoarabinose या phosphoethanolamine 15-17 जैसे लिपिड एक संशोधन के लिए लगाव साइटों के काम से संबंधित ढांचागत विस्तार प्रदान करता है. लिपिड एक की एनएमआर विश्लेषण हमारे प्रोटोकॉल के भीतर चर्चा नहीं है, लेकिन कहीं 15,16 पर्याप्त रूप से वर्णित किया गया है. तेजी से विश्लेषण के लिए टीएलसी तरीकों अक्सर इस्तेमाल किया जाता है आधारित है, लेकिन ठीक रासायनिक संरचना के बारे में प्रत्यक्ष जानकारी प्रदान करने में विफल. एमएस आधारित प्रोटोकॉल लिपिड एक संरचनाओं 18,19 चिह्नित करने के लिए सबसे अक्सर कार्यरत तरीका है. मैट्रिक्स जुड़े लेजर desorption आयनीकरण (MALDI) एमएस अक्सर शुरू में बरकरार लिपिड एक प्रजाति सर्वेक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अकेले आयनों का आरोप लगाया analyte हमारे निष्कर्षण प्रक्रिया के अनुसार तैयार से उत्पन्न कर रहे हैं. अधिक ठीक संरचनात्मक विश्लेषण आवश्यक है, एमएस / एमएस आधारित विधियों MALDI एमएस से अधिक जानकारीपूर्ण साबित होते हैं. संरचनात्मक रूप से जानकारीपूर्ण उत्पाद आयनों 18,20,21 उत्पन्न करने के लिए, (ईएसआई) का पूर्वाभ्यास आयनों की टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) या पराबैंगनी photodissociation (UVPD) से आगे खंडित कर रहे हैं अकेले या गुणा आरोप लगाया लिपिड आयनीकरण electrospray के लिए युग्मित. एक अग्रदूत के आयनों लिपिड से तटस्थ नुकसान उत्पादों को भी अक्सर संरचनात्मक जानकारी का एक अतिरिक्त परत प्रदान ईएसआई एमएस दौरान उत्पन्न कर रहे हैं.

अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस / एमएस) लिपिड एक संरचनाओं की व्याख्या के लिए एक अनिवार्य और बहुमुखी विधि साबित हो गया है. एमएस / एमएस के दौरान, आयनों अग्रदूत आयन की संरचना को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक नैदानिक ​​विखंडन पैटर्न उपज को सक्रिय कर रहे हैं. सबसे व्यापक रूप से शुक्रियाilable एमएस / एमएस विधि सीआईडी ​​है. इस विधि हदबंदी की ओर जाता है कि ऊर्जा बयान में जिसके परिणामस्वरूप, एक आभ्यांतरिक लक्ष्य गैस के साथ चयनित अग्रदूत आयन की टक्कर के माध्यम से टुकड़ा आयनों पैदा करता है. सीआईडी ​​बैक्टीरियल प्रजातियों 22-33 की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लिपिड संरचना के काम में एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो गया है.

सीआईडी ​​सबसे सार्वभौमिक कार्यान्वित एमएस / एमएस विधि है, यद्यपि यह उत्पाद आयनों की एक सीमित सरणी उत्पन्न करता है. 193 एनएम UVPD एक वैकल्पिक और पूरक एमएस / एमएस विधि है. इस विधि आयनों को चमकाना एक लेजर का उपयोग करता है, और फोटॉनों का अवशोषण आयनों और बाद हदबंदी के विद्युतीकरण में यह परिणाम है. इस उच्च ऊर्जा एमएस / एमएस तकनीक सीआईडी ​​से उत्पाद आयनों की एक अधिक विविध सरणी पैदा करता है और इस प्रकार अधिक जानकारीपूर्ण विखंडन पैटर्न प्रदान करता है. विशेष रूप से, UVPD glycosidic, amine एसाइल और सीसी जुड़े बांड 18,21,34 में चोली पर आधारित लिपिड एक प्रजाति में सूक्ष्म परिवर्तनों के बारे में जानकारी देता है.

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Protocol

सभी समाधान ultrapure पानी और HPLC ग्रेड मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म के साथ तैयार किया जाना चाहिए. ऐसे मेथनॉल, क्लोरोफॉर्म, या pyridine और केंद्रित एसिड या आधार के रूप में कार्बनिक सॉल्वैंट्स शामिल तैयार है कि समाधान के लिए तैयार है और एक रासायनिक धूआं हुड के तहत इस्तेमाल किया जाना चाहिए. सभी समाधान आरटी पर संग्रहीत किया जा सकता है. सॉल्वैंट्स टोपियां लाइन में खड़ा एक स्नातक गिलास सिलेंडर में मापा और PTFE साथ कांच विलायक बोतलों में संग्रहित किया जाना चाहिए. लंबी अवधि के भंडारण के लिए क्लोरोफॉर्म युक्त सॉल्वैंट्स विषैली गैस का उत्पादन, एक उच्च प्रतिक्रियाशील एसिड क्लोराइड से बचने के लिए रंगा हुआ एम्बर कांच की बोतलों में संग्रहित किया जाना चाहिए. PTFE अपकेंद्रित्र ट्यूब और रोटरी बाष्पीकरण बोतल उपयोग करने से पहले मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म साथ rinsed होना चाहिए. सॉल्वैंट्स और / या रेडियोधर्मी कचरे के निपटान जब आवश्यक संघीय, राज्य और / या संस्थागत अपशिष्ट निपटान के नियमों का पालन करें.

1. बड़े पैमाने पर लिपिड एक निष्कर्षण (50 मिलीलीटर एल 1.5)

  1. एक एकल चरण Bligh-डायर मिश्रण तैयार: क्लोरोफार्म मेथनॉल 1X फॉस्फेट खारा (पीबीएस), 7.4 पीएच बफर; 1:2:0.8 वी / वी). क्लोरोफॉर्म की 200 मिलीलीटर, 1 एल विलायक बोतल में पीबीएस के 400 मेथनॉल के मिलीग्राम और 160 मिलीग्राम का मिश्रण. कैप बोतल और उलटा द्वारा मिक्स (> 30x). वेंट और सील स्टोर करने के लिए मिश्रण के दौरान समय - समय टोपी थोड़ा ढीला.
  2. एक पूर्व equilibrated दो चरण Bligh-डायर मिश्रण के क्लोरोफॉर्म तैयार: मेथनॉल: पानी (2:2:1.8 वी / वी). क्लोरोफॉर्म की 400 एमएल, 400 मेथनॉल के मिलीग्राम और 1 एल विलायक बोतल में पानी की 180 मिलीलीटर का मिश्रण. कैप बोतल और उलटा द्वारा मिश्रण, बाहर निकलने के लिए मिश्रण के दौरान समय - समय टोपी ढीला करने के लिए सुनिश्चित कर रही है. ओ / एन और दुकान सील संतुलित करना.
  3. हल्के एसिड हाइड्रोलिसिस बफर तैयार (50 मिमी सोडियम एसीटेट, 4.5 पीएच, 1% सोडियम सल्फेट dodecyl (एसडीएस)). हल्के एसिड हाइड्रोलिसिस बफर के 500 एमएल के लिए, सोडियम एसीटेट की 2.05 ग्राम वजन और 500 मिलीलीटर बीकर को हस्तांतरण. फिर 50 मिलीलीटर की 10% एसडीएस जोड़ने, ~ 350 मिलीलीटर और हलचल की एक मात्रा के लिए पानी जोड़ें. मिक्स और, 4.5 पीएच को समायोजित एक स्नातक सिलेंडर के लिए स्थानांतरण, और 500 मिलीलीटर पानी जोड़ें.
  4. तैयार करनाक्लोरोफॉर्म: मेथनॉल (4:1, वी / वी): क्लोरोफॉर्म की 100 मिलीलीटर उपाय और बोतल विलायक करने के लिए स्थानांतरण. मेथनॉल के 25 एमएल उपाय और क्लोरोफॉर्म के साथ मिश्रण. एम्बर कांच की बोतल में स्टोर.
  5. एक ही बैक्टीरियल कॉलोनी से मीडिया के 5 एमएल (Luria शोरबा या अन्य) टीका लगाना. 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन हो जाना, या कम से विकास के लिए सी डिग्री की आवश्यकता है. निष्कर्षण प्रक्रिया का एक आरेख चित्रा 2 में दिखाया गया है.
  6. अगले दिन, 600 आयुध डिपो को मापने और 0.05 की एक प्रारंभिक 600 आयुध डिपो के लिए संस्कृति के 200 मिलीलीटर टीका लगाना 5 एमएल हे / एन संस्कृति का उपयोग करें. 0.8-1.0 से 600 तक पहुँच जाता है एक आयुध डिपो तक कोशिकाओं को विकसित.
  7. 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर centrifugation के माध्यम से हार्वेस्ट कोशिकाओं. लंबे समय तक spins खराब गोली कि उपभेदों के लिए आवश्यक हो सकता है. मीडिया पर तैरनेवाला डालो.
  8. 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 50 एमएल के साथ सेल गोली धो लें. गोली कोशिकाओं centrifugation दोहराएँ. -20 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला और दुकान सेल गोली डालो, या 1.9 कदम आगे बढ़ना.
  9. 40 एमएल में Resuspend कोशिकाओं1x पीबीएस और (सेल निलंबन / ट्यूब की 20 मिलीलीटर उपज) दो 250 मिलीलीटर PTFE अपकेंद्रित्र ट्यूबों के बीच विभाजन की. एक एकल चरण Bligh-डायर के लिए, प्रत्येक ट्यूब क्लोरोफॉर्म की 25 एमएल और मेथनॉल के 50 एमएल जोड़ें (: मेथनॉल: क्लोरोफॉर्म पानी, 1:2:0.8 वी / वी) (चित्रा 2). उलटा द्वारा मिक्स और पूरा सेल सुनिश्चित करने के लिए> 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
  10. 20 मिनट के लिए 2,000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र. हालांकि, phospholipids, isoprenyl लिपिड, और छोटे, हाइड्रोफोबिक पेप्टाइड्स सतह पर तैरनेवाला में रहेगा; LPS प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड (चित्रा 2) के साथ गोली जाएगा. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  11. ~ 100 मिलीलीटर एकल चरण Bligh-डायर मिश्रण के साथ LPS गोली धो लें. 20 मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें. ई. से लिपिड एक अलग जब कोली या साल्मोनेला, केवल एक धोने की आवश्यकता है, लेकिन, अतिरिक्त धोने कदम कुछ जीवों से लिपिड एक अलग जब फॉस्फोलिपिड प्रदूषण को कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
  12. मील का 27 मिलीलीटर जोड़ेंएलडी एसिड हाइड्रोलिसिस बफर LPS गोली (50 मिमी सोडियम एसीटेट, 4.5 पीएच; 1% एसडीएस कदम 1.3 देखें), और केवल छोटे कणों रहना जब तक ऊपर और नीचे pipetting और से मिश्रण. Sonicate एक ही ढंग से 50% उत्पादन में 20 सेकंड के लिए एक निरंतर शुल्क साइकिल पर जांच टिप sonicator साथ समाधान में LPS गोली resuspend. नमूना 2x (फटने के बीच 20 सेकंड / फट, ~ 5 सेकंड) के sonication दोहराएँ.
  13. 30 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में उबाल लें नमूनों. सावधानी: टोपी तंग है, लेकिन पूरी तरह से सील नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करें. विब्रियो (वी. कोलरा) जैसे कुछ जीवों, पानी के स्नान से बोतलों निकालें और नमूना आगे बढ़ने से पहले आरटी को शांत करने के लिए अनुमति देने के लिपिड ए की कुल उपज बढ़ाने के लिए लंबे समय तक ऊष्मायन टाइम्स (1 घंटा) की आवश्यकता होती है.
  14. , हाइड्रोलिसिस के बाद लिपिड निकालने के एक क्लोरोफॉर्म के लिए, क्लोरोफॉर्म की 30 मिलीलीटर और मेथनॉल के 30 मिलीलीटर जोड़कर एक दो चरण Bligh-डायर (चित्रा 2) के मिश्रण में एसडीएस समाधान कन्वर्ट करने के लिए: मेथनॉल: पानी (2:2:1.8, वी / वी) मिश्रण. उलटा द्वारा मिक्स और 2 पर 10 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र,000 x जी. एक गिलास पिपेट का उपयोग कर एक स्वच्छ PTFE अपकेंद्रित्र ट्यूब में कम चरण निकालें.
  15. कदम 1.14 से ऊपरी चरण के लिए, एक पूर्व equilibrated दो चरण Bligh-डायर मिश्रण (1.2 चरण) से कम चरण की 30 मिलीलीटर जोड़कर एक दूसरे निष्कर्षण प्रदर्शन. मिक्स, फिर 10 मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र. कम चरण निकालें, और कदम 1.14 में निकाले कम चरण के साथ पूल.
  16. मेथनॉल: पूर्व equilibrated दो चरण Bligh-डायर ऊपरी चरण एक दो चरण Bligh-डायर मिश्रण (क्लोरोफॉर्म बनाने के लिए (1.2 चरण) के 114 मिलीलीटर जोड़कर जमा कम चरणों (60 मिलीलीटर कुल) को धोकर जल, 02:02: 1.8, वी / वी). मिलाएं. 10 मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
  17. रोटरी वाष्पीकरण (चित्रा 2) का उपयोग कर एक साफ ग्लास रोटरी बाष्पीकरण फ्लास्क और सूखी नमूने के निचले चरण निकालें.
  18. कुप्पी की तरफ से लिपिड के निलंबन में सहायता करने के लिए रोटरी कुप्पी मेथनॉल (4:1, वी / वी), और स्नान sonicate (> 30 सेकंड): 5 क्लोरोफॉर्म की मिलीलीटर जोड़ें. एक साफ करने के लिए लिपिड स्थानांतरित करने के लिए एक गिलास हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करेंग्लास ट्यूब (13 x 100 मिमी या बड़ा) PTFE के साथ छाया हुआ phenolic पेंच टोपी खड़े हैं. एक नाइट्रोजन ड्रायर का उपयोग नाइट्रोजन की एक धारा के तहत शुष्क नमूना.
  19. क्लोरोफॉर्म के 1 मिलीलीटर में सूखे लिपिड Resuspend: मेथनॉल (4:1, वी / वी). छोटे संस्करणों का उपयोग कर अधिक मात्रात्मक मेजबान के लिए एक पतला आधार (उपकरण / अभिकर्मकों की तालिका देखें) के साथ छोटे गिलास नमूना शीशी (12 X 32 मिमी) पर स्थानांतरण. एक नाइट्रोजन ड्रायर का उपयोग कर शुष्क.
  20. सूखे नमूना बाद टीएलसी (प्रोटोकॉल 2) या एमएस विश्लेषण (प्रोटोकॉल 3, 4 या 5) जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है. (नोट: सामग्री अलग और बाद प्रोटोकॉल में इस्तेमाल की राशि सबसे जीवों के लिए पर्याप्त है, उसके आधार पर सुझाव दिया है कि एक ही लिपिड नमूना प्रोटोकॉल 2-5 में इस्तेमाल किया जा सकता है, हटाया% सामग्री के नोट लेने में अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें...).

2. पतली परत क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से लिपिड एक प्रजाति के दृश्य

  1. टीएलसी मोबाइल चरण विलायक प्रणाली तैयार (: pyridine: 88% चींटी एसिड: क्लोरोफॉर्म पानी, 50:50:16:5 वी / वी). COMBINक्लोरोफॉर्म की ई 200 मिलीलीटर, pyridine की 200 मिलीलीटर, एक 1 एल विलायक बोतल में 64 से 88% चींटी एसिड के मिलीलीटर, और मिलीलीटर पानी की 20. कैप बोतल, उलटा कई बार द्वारा मिश्रण है, और वेंट.
  2. 20 x 20 सेमी प्लेटों को समायोजित करेगा कि एक टीएलसी टैंक का उपयोग करें. ~ 40 सेमी क्रोमैटोग्राफी पत्र के साथ टीएलसी टैंक.
  3. Pyridine: 88% चींटी एसिड: पानी (50:50:16:5, वी / वी) मिश्रण टीएलसी की टंकी के लिए क्लोरोफॉर्म की 200 मिलीलीटर जोड़ें. टैंक अक्सर हे / एन पसंद किया जाता है और अधिक सुविधाजनक,> 3 घंटे के लिए पूर्व संतुलित करने की अनुमति दें.
  4. फ्रीजर से सूखे लिपिड नमूने निकालें (1.20 कदम) और आरटी के लिए गर्म करते हैं.
  5. एक रेजर के साथ एक सिलिका जेल 60 टीएलसी थाली के ऊपरी किनारे से बालू निकाल दें. एक सुस्त पेंसिल का प्रयोग, प्लेट के नीचे, नीचे से 2 सेमी के समानांतर एक रेखा खींचना. इस लाइन के नमूने खोलना के लिए मूल है. मार्क 1 सेमी अलग नमूने हाजिर करने के लिए इस संदर्भ रेखा के साथ वेतन वृद्धि.
  6. क्लोरोफॉर्म की 200 μl में 2.4 कदम से सूखे लिपिड भंग: मेथनॉल (4:1, वी / वी), भंवर और sonicate (3x, ~ 15 सेकंड प्रत्येक), पैदावार ~ 100 -ई. से निकाले 500 एनजी / μl लिपिड एक अगर कोलाई.
  7. 2.5 कदम में चिह्नित के रूप में एक microcapillary कांच pipet का प्रयोग, टीएलसी थाली पर मात्रा (20 μl) के दसवें हाजिर. 15 मिनट ~ के लिए टीएलसी थाली पर हवा शुष्क नमूनों की अनुमति दें. (नोट: छोटे कांच की शीशियों में नमूने एक नाइट्रोजन ड्रायर का उपयोग कर सूखे और प्रोटोकॉल 3-5 में बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता हटाया% सामग्री का नोट ले लो.).
  8. पूर्व equilibrated टैंक में देखा नमूनों युक्त टीएलसी थाली रखें. विलायक सामने टीएलसी थाली (~ 2.5-3 मानव संसाधन) के शीर्ष तक पहुँच जाता है, थाली और हवा शुष्क (> 60 मिनट) को हटा दें. एक ठंडी हवा में बंदूक पूरा सूखापन सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  9. थाली सूख रहा है, वहीं charring के लिए 250 डिग्री सेल्सियस पर गर्म थाली पर बारी.
  10. एक हवादार रासायनिक धूआं हुड में, सिलिका टीएलसी थाली पर हल लिपिड charring के लिए 10% सल्फ्यूरिक एसिड इथेनॉल मिश्रण तैयार (केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड: 100% इथेनॉल, 01:09 वी / वी). सल्फ्यूरिक एसिड के 10 एमएल उपाय और 100% इथेनॉल के 90 मिलीलीटर के लिए धीरे धीरे जोड़ने. सावधानीपूरी तरह से मिश्रण और एक गिलास chromatographic अभिकर्मक हाथ की पिचकारी को हस्तांतरण.
  11. धूआं हुड में, 10% सल्फ्यूरिक एसिड इथेनॉल मिश्रण के साथ सूखे टीएलसी थाली स्प्रे करने के लिए एक गिलास chromatographic अभिकर्मक हाथ की पिचकारी का उपयोग करें. समान रूप से थाली भर में मिश्रण का छिड़काव करें.
  12. जले लिपिड नमूने काला / भूरे रंग के धब्बे (<1 मिनट) के रूप में दिखाई देते हैं जब तक 250 डिग्री सेल्सियस गर्म थाली पर टीएलसी थाली रखें. इस पूरी थाली भूरे रंग की बारी का कारण है और लिपिड एक प्रजाति के दृश्य मुश्किल कर देगा, थाली overexpose मत करो.

3. MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से लिपिड एक की संरचनात्मक लक्षण वर्णन

  1. कदम 1.20, (या कदम 2.7) से फ्रीजर से लिपिड एक नमूना हटाने और आर टी को गर्म करते हैं. सूखे लिपिड ~ में एक नमूना Resuspend 20 μl क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल (4:1, वी / वी) और ई. से निकाले अगर एक ~ 1-5 ग्राम / μl लिपिड का समाधान प्राप्त करने के भंवर कोलाई. (नोट: 10% कम केंद्रित अगर कदम 2.7 से सामग्री का इस्तेमाल किया).
  2. ATT मैट्रिक्स घटकों तैयार करें. संतृप्त 6 AZA50% acetonitrile में-2-thiothymine: एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब पानी के 500 μl और acetonitrile के 500 μl जोड़ने के लिए, और उसके बाद add> 10 मिलीग्राम 6 AZA-2-thiothymine 50% acetonitrile सुपर संतृप्त है कि इतनी. संतृप्त त्रिभास्मिक अमोनियम साइट्रेट समाधान: वेग, 500 μl पानी के लिए> 1 मिलीग्राम जोड़ें तत्काल स्पष्ट होना चाहिए. उपयोग से पहले भंवर और अपकेंद्रित्र समाधान, केवल संतृप्त सतह पर तैरनेवाला प्रयोग किया जाता है.
  3. ATT मैट्रिक्स मिश्रण तैयार: 50% acetonitrile में संतृप्त 6 AZA-2-thiothymine, संतृप्त त्रिभास्मिक अमोनियम साइट्रेट (20:01, वी / वी). MALDI थाली करने के लिए आवेदन करने से पहले 500 μl microcentrifuge ट्यूब, मिश्रण करने के भंवर, और अपकेंद्रित्र में त्रिभास्मिक अमोनियम साइट्रेट समाधान संतृप्त 1 μl को ATT समाधान के 20 μl जोड़कर एक साथ मैट्रिक्स घटकों का मिश्रण.
  4. सबसे सटीक जन / प्रभारी अनुपात दृढ़ संकल्प प्रदान करने, नमूने जमा किए जाएंगे, जहां के निकट एक स्थान पर MALDI प्लेट 0.5 μl calibrant मिश्रण जोड़कर MALDI थाली तैयार है.
  5. 0.5 μl जमालिपिड एक नमूना जमा किया जाएगा जहां हर मौके पर MALDI थाली पर ATT मैट्रिक्स की.
  6. थाली पर मिश्रण, और इष्टतम आयन संकेतों के लिए स्कैनिंग नमूना द्वारा स्पेक्ट्रा (चित्रा 3) के अधिग्रहण की ATT मैट्रिक्स की मौके पर जमा नमूना के 0.5 μl (कुल नमूना के 2.5%),. नोट: सबसे इष्टतम एमएस संकेत के लिए राशि जीव के साथ बदलती हैं और अनुभव से निर्धारित करने की आवश्यकता कर सकते हैं. अधिक सामग्री जोड़ने के लिए एक 0.5 μl देखा मिश्रण अधिक नमूने के अलावा बीच में सूखे की अनुमति कई बार हाजिर कर सकते हैं. नमूना भी (एक छोटी मात्रा में सूखी और resuspend) केंद्रित या आवश्यक के रूप में पतला किया जा सकता है. अधिक प्रारंभिक सामग्री (सेल संस्कृति शुरू करने की मात्रा) भी (चर्चा देखें) का इस्तेमाल किया जा सकता है.

4. Electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री और लिपिड एक की टक्कर प्रेरित पृथक्करण

  1. एक क्लोरोफॉर्म तैयार: मेथनॉल विलायक मिश्रण (1:1, v / v) एक गिलास प में 200 मिलीलीटर HPLC ग्रेड क्लोरोफॉर्म साथ HPLC ग्रेड मेथनॉल की एक 200 μl शेयर मिश्रण सेबोतल वेंट.
  2. (कदम 1.20, 2.7, या प्रोटोकॉल 3 के बाद सूखे से उदाहरण के लिए) लिपिड एक साथ शीशी मेथनॉल विलायक मिश्रण और लिपिड 5 मिनट के लिए या सभी सामग्री को भंग कर दिया है जब तक एक समाधान sonicate: क्लोरोफॉर्म की 200 μl स्थानांतरण.
  3. नकारात्मक मोड electrospray ionization के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर सेट करें.
  4. एक 250 μl सिरिंज और एक सिरिंज पंप का उपयोग, सीधे 2.0-3.5 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर पतला लिपिड एक नमूना दिखे.
  5. आयन प्रकाशिकी ट्यूनिंग द्वारा अनुकूलन और लिपिड एक आयन संकेत में वृद्धि. एक पूर्ण जन स्पेक्ट्रम अब लिपिड एक प्रजाति (चित्रा 4) के एकत्र किया जा सकता है.
  6. पृथक और एमएस / एमएस विधि के रूप में सीआईडी ​​का चयन करके लक्ष्य लिपिड एक सक्रिय करें.
  7. एक प्रजाति उच्चतम आयन उत्पाद की तुलना में लगभग 10% रिश्तेदार बहुतायत है अग्रदूत लिपिड जब तक सीआईडी ​​वोल्टेज (या सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा, एनसीई) बढ़ाएँ.
  8. संकेत करने वाली शोर पर्याप्त वीं के लिए हासिल की है, जब तक मोल और औसत स्पेक्ट्राई उत्पाद आयनों. जरूरत स्कैन की संख्या मूल अग्रदूत के संकेत तीव्रता पर निर्भर है और 3-300 स्कैन (चित्रा 5A) से लेकर कर सकते हैं.

5. पराबैंगनी Photodissociation द्वारा लिपिड एक पर एमएस / एमएस

  1. कदम 4.1-4.5 में के रूप में नमूना और मास स्पेक्ट्रोमीटर तैयार करें.
  2. मास स्पेक्ट्रोमीटर को interfaced लेजर पर मुड़ें. मास स्पेक्ट्रोमीटर एक 193 एनएम excimer लेजर के साथ outfitted और साधन की HCD सेल में यूवी सक्रियण की अनुमति के लिए संशोधित किया गया था. Photodissociation पहले 35 में वर्णित है कि एक समान ढंग से लागू किया गया था. हम उच्च ऊर्जा सी जाल हदबंदी (HCD) सेल में फोटॉनों संचारित करने के लिए एक सीएएफ 2 ऑप्टिकल खिड़की के साथ एक संशोधित वैक्यूम कई गुना का उपयोग करें. लेजर एक नाड़ी / देरी जनरेटर के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर से एक ट्रांजिस्टर ट्रांजिस्टर तर्क (टीटीएल) संकेत द्वारा एमएस / एमएस के दौरान शुरू हो रहा है.
  3. लेजर excimer लेजर ट्रिगर किया जाएगा कि इतने साधन सॉफ्टवेयर को सेट करते हैंआयनों HCD सेल में प्रवेश. इस सॉफ्टवेयर की एक मामूली संशोधन की आवश्यकता है.
  4. लेजर हर 2 मिसे (500 हर्ट्ज) स्पंदित है कि इस तरह के पल्स जनरेटर चालू करें.
  5. एमएस / एमएस विधि के रूप में HCD चयन करके लिपिड का पूर्वाभ्यास आयन अलग करने और 1% एनसीई को collisional ऊर्जा को समायोजित. इस HCD सेल के भीतर पराबैंगनी हदबंदी के लिए अग्रदूत आयनों के अलगाव की अनुमति देता है. HCD सेल का इस्तेमाल किया जाता है, सॉफ्टवेयर इस अंतराल के दौरान UVPD प्रदर्शन करने के लिए संशोधित किया गया है.
  6. लेजर ऊर्जा में वृद्धि और लेजर दालों की संख्या का समायोजन करके अलग लिपिड एक आयन सक्रिय करें. एक ठेठ UVPD प्रयोग दस 6 मिलीग्राम दालों का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाएगा.
  7. पर्याप्त संकेत करने वाली शोर UVPD उत्पाद आयनों के लिए हासिल की है जब तक कदम 4.8 में के रूप में, अधिग्रहण और औसत स्पेक्ट्रा. जरूरत स्कैन की संख्या मूल अग्रदूत के संकेत तीव्रता पर निर्भर है और 3-300 स्कैन (चित्रा 5 ब) से लेकर कर सकते हैं.

6. 32 पी लेबलिंगलिपिड ए और बाद के अलगाव की

  1. एक ही कॉलोनी से मीडिया (Luria शोरबा या अन्य मीडिया) के 5 एमएल टीका लगाना. 37 डिग्री सेल्सियस पर या आवश्यक तापमान में ओ / एन बढ़ें.
  2. अगले दिन, 600 आयुध डिपो को मापने और एक मानक 20 x 150 मिमी डिस्पोजेबल गिलास संस्कृति ट्यूब में उगाई ~ 0.05 की एक प्रारंभिक आयुध डिपो के 600, संस्कृति के 7 मिलीलीटर टीका लगाना हे / एन संस्कृति का उपयोग करें. अकार्बनिक 32 पी. के 2.5 μCi / एमएल जोड़ें 0.8-1.0 से 600 तक पहुँच जाता है एक आयुध डिपो तक कोशिकाओं को विकसित. संघीय, राज्य और / या रेडियोधर्मी सामग्री के सुरक्षित और समुचित से निपटने के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें.
  3. PTFE के साथ 16 x 125 मिमी ग्लास ट्यूब में हार्वेस्ट कोशिकाओं 10 मिनट के लिए 1500 XG पर एक निश्चित कोण नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र का उपयोग टोपी खड़े हैं. उपयुक्त रेडियोधर्मी अपशिष्ट कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला निकालें. बाद के चरणों में उत्पन्न सभी रेडियोधर्मी अपशिष्ट (जैसे तरल, ग्लास, Biohazard) संघीय, राज्य के अनुसार निपटाया, और / या संस्थागत जीयूआई किया जाना चाहिएdelines.
  4. 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 5 मिलीलीटर के साथ सेल गोली धो लें. 1500 x जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  5. एकल चरण Bligh-डायर मिश्रण के 5 एमएल क्लोरोफॉर्म से मिलकर चित्रा (2) में Resuspend कोशिकाओं: मेथनॉल: पानी (1:2:0.8, वी / वी). भंवर मिश्रण है, और पूरा सेल सुनिश्चित करने के लिए> 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
  6. 20 मिनट के लिए 1500 XG पर नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र में अपकेंद्रित्र. धीरे phospholipids और isoprenyl लिपिड होता है जो सतह पर तैरनेवाला, टपकना.
  7. 50 मिमी सोडियम एसीटेट, पीएच 4.5 से 1.8 मिलीग्राम में LPS गोली Resuspend, 1% एसडीएस बफर vortexing द्वारा. गोली समान रूप से छितरी हुई है जब तक एक स्नान sonicator का उपयोग Sonicate नमूना (~ 30 सेकंड).
  8. नहाने के पानी उबलते में 30 मिनट के लिए नमूना सेते हैं. यकीन टोपियां तंग लेकिन बंद नहीं कर रहे हैं.
  9. पानी के स्नान से निकालें और नमूना 5-10 मिनट के लिए आरटी पर शांत करने के लिए अनुमति देते हैं.
  10. क्लोरोफॉर्म के 2 मिलीग्राम और 2 मिलीलीटर जोड़कर एक दो चरण Bligh-डायर मिश्रण में समाधान कन्वर्टमेथनॉल, एक क्लोरोफॉर्म उपज: मेथनॉल: जलीय (2:2:1.8 वी / वी) मिश्रण. मिश्रण करने के लिए भंवर, और अलग चरणों के लिए 1,500 XG पर नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र में 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  11. एक गिलास विंदुक (पहले निकासी) का उपयोग कर एक साफ ग्लास अपकेंद्रित्र ट्यूब में कम चरण निकालें.
  12. चरण 11 से शेष ऊपरी चरण के लिए (1.2 चरण में तैयार के रूप में) पूर्व equilibrated दो चरण Bligh-डायर कम चरण के 2 मिलीलीटर जोड़कर नमूना पर एक दूसरे निष्कर्षण प्रदर्शन. भंवर और अपकेंद्रित्र 10 मिनट. कम चरण निकालें और पहले निकासी से कम चरण के साथ गठबंधन.
  13. मेथनॉल: जमा कम चरण (~ 4 मिलीलीटर कुल मात्रा) के लिए, एक दो चरण Bligh-डायर समाधान (क्लोरोफॉर्म उपज, पूर्व equilibrated ऊपरी चरण (1.2 चरण) के 7.6 मिलीलीटर जोड़ने का पानी, 2:2:1.8, वी / वी). 10 मिनट के लिए भंवर और अपकेंद्रित्र.
  14. एक साफ ग्लास ट्यूब को कम चरण निकालें और एक नाइट्रोजन ड्रायर का उपयोग कर शुष्क. सूखे नमूने आगे उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.

7. Visualiपतली परत क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से 32 पी लेबल लिपिड एक प्रजाति के zation

  1. कदम 2.1-2.8 में वर्णित के रूप में 32 पी लेबल लिपिड एक नमूना, टीएलसी टैंक, और टीएलसी प्लेटों की तैयारी.
  2. 04:01 क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल (वी / वी) के 500 μl में 32 पी लेबल नमूना भंग. भंवर और स्नान sonicate पूरी तरह से लिपिड सामग्री भंग करने के लिए. जगमगाहट कॉकटेल के 5 मिलीलीटर युक्त जगमगाहट शीशी को नमूने के 5 μl जोड़ें. जगमगाहट काउंटर में गणना और नमूना की कुल मायने रखता है / मिनट की गणना.
  3. Radiolabeled लिपिड प्रजातियों visualizing करते हैं, तो 10 x 20 सेमी या 20 x 20 सेमी टीएलसी प्लेटों का इस्तेमाल किया जा सकता है. थाली का सबसे लंबा आयाम (मूल में देखा यानी नमूने 10 सेमी किनारे के ऊपर 2 सेमी चिह्नित) कार्यक्षेत्र है कि इतनी 10x20 सेमी प्लेटों के लिए, नमूने 2.5 कदम में चिह्नित मूल के साथ देखा जाना चाहिए.
  4. एक microcapillary विंदुक का प्रयोग, थाली पर 10,000-20,000 सीपीएम / नमूना हाजिर और धब्बे (> 15 मिनट) शुष्क करने की अनुमति देते हैं. नमूने के तहत सूखने से ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता हो सकती हैनाइट्रोजन और 10,000-20,000 मायने रखता है / मिनट / स्पॉट (<10 μl कुल के लिए एक बार में 2 μl या 2 μl) प्राप्त करने के लिए, एक उचित मात्रा में resuspended.
  5. पूर्व equilibrated टैंक में radiolabeled नमूनों युक्त टीएलसी थाली रखें. विलायक सामने टीएलसी थाली (~ 3 घंटा) के शीर्ष तक पहुँच जाता है, थाली और हवा शुष्क (> 60 मिनट) को हटा दें. सावधानी: pyridine की मात्रा का पता लगाने phosphorimaging स्क्रीन को नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में pyridine की उपस्थिति में चलाने टीएलसी प्लेटें, एक रासायनिक धूआं हुड में अच्छी तरह से सूख जाना चाहिए. एक ठंडी हवा में बंदूक पूरा सूखापन सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  6. प्लास्टिक की चादर में प्लेट लपेटें और एक autoradiography कैसेट हे / एन में phosphorImager स्क्रीन को बेनकाब अगली सुबह, छवि (चित्रा 6) प्राप्त करने के लिए स्क्रीन स्कैन. छवि densitometry विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग, इस विधि लिपिड एक प्रजाति के सही रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है.

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Representative Results

ई. के विहित लिपिड एक और 4 'पदों - कोलाई और साल्मोनेला enterica serovar typhimurium एक hexa-acylated 1 में फॉस्फेट समूहों के साथ glucosamine की disaccharide है. अमीर मीडिया (जैसे Luria शोरबा) में वृद्धि के दौरान लिपिड ए के एक हिस्से को एक Tris-phosphorylated प्रजातियों 36 (चित्रा 1) से बेदखल 1 की स्थिति पर एक पायरोफास्फेट समूह होता है. KDO (3 डिओक्सी-D-Manno-octulosonic एसिड), में संलग्न है 6'-हाइड्रॉक्सिल और LPS के शेष कार्बोहाइड्रेट डोमेन (यानी कोर oligosaccharide और हे प्रतिजन डोमेन) को लिपिड एक कड़ी के लिए एक सेतु के रूप में कार्य करता है. ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया लिपिड के लिए एक संरक्षित मार्ग का हिस्सा हालांकि ई. के समान एक जैवसंश्लेषण कोलाई कश्मीर 12, लिपिड एक ढांचे में विविधता की एक बड़ी राशि है. यह विविधता पर्यावरण उत्तेजनाओं के जवाब में सक्रिय रहे हैं जो लिपिड संरचना, संशोधित कि अव्यक्त एंजाइमों की कार्रवाई से उत्पन्न होती है. Examp के लिएएस में ले, या एक phosphoethanolamine छाछ (चित्रा 1, मैजेंटा) के साथ, लिपिड एक की enterica फॉस्फेट समूहों cationic चीनी एल-4-aminoarabinose (नीला चित्रा 1) के साथ संशोधित किया जा सकता है. साल्मोनेला में इन संशोधनों के दो घटक प्रतिक्रिया नियामक प्रणाली द्वारा विनियमित रहे हैं, कम [2 मिलीग्राम +] के जवाब में हल्के अम्लीय पीएच, और cationic रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स की उपस्थिति गयी. 8; इसके अतिरिक्त साल्मोनेला में, Palmitate (हरा चित्रा 1) cationic रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स के लिए प्रतिरोध को बढ़ावा देता है जो एक hepta-acylated लिपिड एक फार्म के लिए जोड़ा जा सकता है. अन्य संशोधनों में शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, फॉस्फेट समूहों और एसाइल चेन, या dioxygenase को हटाने जीवों 1,3 की एक संख्या में मनाया 3'से जुड़े माध्यमिक एसाइल श्रृंखला के लिए एक हाइड्रॉक्सिल समूह के अलावा उत्प्रेरित.

कैरो की विधि के बारे में हमारी संशोधन करके पूरे कोशिकाओं से बरकरार लिपिड एक का अलगावएफएफ और Raetz प्रोटोकॉल 1 (चित्रा 2) में वर्णित है. इस अलगाव विधि लिपिड ए के 10 6 अणुओं ई. के बैक्टीरिया कोशिका प्रति मौजूद है कि अनुमान किया गया है कोली 37. निम्नलिखित प्रोटोकॉल 1 और 3, ई. से लिपिड एक की नकारात्मक आयन MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रम कोलाई कश्मीर 12 (W3110) अकेले deprotonated आयन ([महाराष्ट्र] -) पैदावार एक किराए मनाया प्रजाति के रूप में एम / Z 1,796.20 (चित्रा 3) पर. MALDI-TOF एमएस वर्णक्रमीय संकल्प में सुधार करने के लिए नकारात्मक reflectron मोड में प्रदर्शन किया गया था. (चित्रा 4) - वैकल्पिक रूप से, नकारात्मक मोड नैनो ईएसआई (प्रोटोकॉल 4) के अधीन एक ही लिपिड नमूना [एम 2H] 2 से चिह्नित एम / Z 898.1 पर मुख्यतः दोगुना deprotonated लिपिड एक आयनों पैदावार. अकेले deprotonated लिपिड एक आयनों [महाराष्ट्र] - एम / Z पर 1,796.20 प्रत्यक्ष कर रहे हैं, लेकिन [एम 2H 2] को कम रिश्तेदार बहुतायत से हैं - आयन (चित्रा 4). गुणा आरोप लगाया प्रजातियों predomiनैट ईएसआई का उपयोग करते समय. एक आयन मी / z 1,796.20 लिपिड - सीआईडी ​​(चित्रा 5A) या 193 एनएम UVPD (चित्रा 5 ब) द्वारा विखंडन [महाराष्ट्र] पर प्रदर्शन किया गया था. इन तकनीकों में बेहतर विशेष रूप से संशोधन, या पहले से uncharacterized रासायनिक संशोधनों का जटिल मिश्रण युक्त लिपिड एक प्रजाति के रासायनिक संरचना, आवंटित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विखंडन के प्रोफाइल दरार साइटों का प्रतिनिधित्व धराशायी लाइनों के साथ दिखाया जाता है और प्रत्येक प्रदान की संरचना नीचे मी / z मूल्यों (चित्रा 5) के साथ मिलान कर रहे हैं. मी / z मूल्यों और दरार साइटों UVPD के साथ जुड़े अनूठा उत्पाद आयनों का प्रतिनिधित्व लाल फ़ॉन्ट में प्रकाश डाला.

प्रोटोकॉल 6 और दो ​​अलग ई. से अलग 7, 32 पी लेबल लिपिड ए में वर्णित है कोलाई कश्मीर 12 उपभेदों टीएलसी (चित्रा 6) द्वारा विश्लेषण किया गया था. W3110 ज्यादातर बीआईएस और Tris-phosphorylated लिपिड एक (चित्रा 6 होता है;बाईं लेन), एक अधिक जटिल टीएलसी पैटर्न ई. से अलग 32 पी लिपिड एक साथ मनाया जाता है, जबकि कोलाई तनाव WD101 (6 चित्रा, सही लेन) 38. WD101 भारी aminoarabinose (एल Ara4N) और phosphoethanolamine (PETN) के साथ संशोधित लिपिड एक पैदा करता है. और 4 '- - दोनों से 1 फॉस्फेट संशोधन के लिए उपलब्ध हैं, WD101 से लिपिड एक फॉस्फेट, या दोगुना दोनों फॉस्फेट एक मिश्रित ढंग से संशोधित कर रहे हैं जहां संशोधित या तो एक एल Ara4N या PETN केवल युक्त, के रूप में अकेले संशोधित वर्णित किया जा सकता है. और 4 '- - 1 में संशोधन के अलावा फॉस्फेट, Palmitate अलावा भी मनाया (चित्रा 1 देखें) और इस विलायक प्रणाली में लिपिड एक प्रजाति के आर एफ मूल्य (चित्रा 6) बढ़ जाती है. अगर वांछित, एक phosphorimager का उपयोग densitometry विश्लेषण, एक ही नमूना भीतर लिपिड एक प्रजाति के अनुमान के रिश्तेदार मात्रा quantifiably करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.


चित्रा 1. ई. से प्रतिनिधि लिपिड एक डोमेन संरचनाओं कोलाई कश्मीर 12 और एस enterica serovar typhimurium. संरक्षित लिपिड एक संरचना में संशोधन प्रतिनिधि परिणाम में वर्णित के रूप में, (सही) दिखाए जाते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. लिपिड के योजनाबद्ध एक अलगाव की प्रक्रिया. रेखांकित एकल चरण Bligh-डायर मिश्रण, LPS गोली lysate के centrifugation, हल्के एक का उपयोग बैक्टीरिया कोशिका गोली की रासायनिक सेल को दर्शाया गया है सीआईडी ​​जुड़ी polysaccharide से लिपिड एक आजाद कराने के लिए हाइड्रोलिसिस, और दो ​​चरण Bligh-डायर निकासी का उपयोग लिपिड ए के अंतिम शुद्धि. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. ई. से अलग लिपिड एक की MALDI एमएस विश्लेषण कोलाई कश्मीर 12 (W3110). स्पेक्ट्रा> 300 शॉट्स की औसत से प्राप्त की. सच्चाई से शुल्क लिया [महाराष्ट्र] - लिपिड एक सही पर दिखाया संरचना का एक deprotonated प्रजातियों से मेल खाती है जो एम / Z 1,796.2, पर आणविक आयन के रूप में मनाया जाता है.

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चित्रा 4. ई. से अलग लिपिड एक के ईएसआई एमएस विश्लेषण कोलाई कश्मीर 12 (W3110) अकेले [महाराष्ट्र] और दोगुना चार्ज [एम 2H] 2 -. लिपिड एक प्रजाति क्रमशः, मी / z 1,796.2 और एम / Z 898.1 का आणविक आयनों के रूप में मनाया जाता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. ई. से अलग लिपिड एक के एमएस / एमएस विश्लेषण कोलाई कश्मीर 12 (W3110). टक्कर प्रेरित पृथक्करण (ए) या ​​पराबैंगनी photodissociation (बी) के अग्रदूत आयन मी / z 1,796.2 टुकड़ा करने के लिए इस्तेमाल किया गया. UVPD विशिष्ट उत्पाद आयनों लाल रंग में संकेत कर रहे हैं. एक विखंडन का नक्शा काली लाइनें सीआईडी ​​और UVPD दोनों के साथ जुड़े विखंडन से संकेत मिलता है, और लाल लाइनों UVPD विशेष संकेत मिलता धराशायी धराशायी जहां (सी), प्रदान की जाती हैcific विखंडन. विखंडन का नक्शा नीचे सूचीबद्ध मूल्यों [महाराष्ट्र] के सटीक जनता के अनुरूप -. उत्पाद आयनों बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6
चित्रा 6. ई. से अलग लिपिड एक प्रजाति के टीएलसी आधारित जुदाई कोलाई कश्मीर 12 ए W3110 (बाईं लेन) या WD101 (सही लेन) से अलग और क्लोरोफॉर्म युक्त एक टीएलसी टैंक विलायक प्रणाली में अलग हो गया था 32 पी लेबल लिपिड:. pyridine: 88% चींटी एसिड: पानी (50:50:16 : 5 वी / वी).

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में हम बैक्टीरिया के पूरे कोशिकाओं से लिपिड एक प्रजाति के अलगाव विस्तृत, और रासायनिक यह अलग सामग्री चिह्नित करने के लिए टीएलसी या एमएस आधारित विश्लेषणात्मक विधियों का वर्णन किया है. अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैविक यौगिकों की नए सिरे से संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली रणनीति है, और प्रकृति में मनाया लिपिड एक अणुओं की आड़ में रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए अमूल्य है. सीआईडी ​​और UVPD लिपिड एक अणुओं के लिए कुंजी उंगलियों के निशान प्रदान कि उत्पाद आयनों के विभिन्न प्रकार बना है कि दो पूरक सक्रियण तरीके हैं. सीआईडी ​​और UVPD दोनों का उपयोग एमएस / एमएस विखंडन की अनुमति देता है रासायनिक संरचना कार्य के लिए बेहतर विस्तार प्रदान करने लिपिड एक संरचनाओं के सूक्ष्म अंतर की व्याख्या. इस प्रकार के डेटा लिपिड एक आणविक प्रजातियों के जीव विज्ञान में सटीक सहसंबंधी संरचना / समारोह संबंधों की स्थापना के लिए आवश्यक हैं. हम भी एस में 32 पी radiolabeling लिपिड एक प्रजाति के लिए प्रक्रिया का वर्णन किया है32 पी लिपिड एक प्रजाति के रासायनिक पैटर्न टीएलसी और autoradiography का उपयोग कर देखे जा सकते हैं जहां मॉल पैमाने पर बैक्टीरियल संस्कृतियों,.

किसी भी उपयोगकर्ता के बारे में पता होना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल के लिए सुविधाओं की एक संख्या हैं. बड़े पैमाने पर लिपिड एक तैयारी (प्रोटोकॉल 1) के लिए, बैक्टीरिया गोली की राशि के लिए विलायक शुरू करने का अनुपात कुल उपज में सुधार करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हालांकि यह अनुपात केवल अनुभव से निर्धारित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित मात्रा सबसे अधिक जीवाणु उपभेदों के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व करते हैं. लिपिड एक निष्कर्षण और अलगाव के लिए संस्कृति मात्रा में भी आप के साथ काम कर रहे हैं बैक्टीरियल तनाव के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, वी. के लिए ई. के लिए हालांकि, संस्कृति मात्रा, कोलरा उच्च गुणवत्ता जन स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए संस्कृति के कम से कम 200 मिलीलीटर की आवश्यकता कोली 5 मिलीलीटर से नीचे पहुंचा जा सकता है. अधिक प्रारंभिक सामग्री (बड़ा संस्कृति संस्करणों) कुछ बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए आवश्यक है क्योंकि hydrolysपूरे LPS से लिपिड एक विज्ञप्ति कि कदम कम कुशल है. उदाहरण के लिए एक कार्यात्मक KDO dioxygenase या KDO kinase प्रदर्शनी युक्त जीवों हल्के एसिड हाइड्रोलिसिस 39 के बाद लिपिड एक पैदावार कम किया है. अक्सर, बदल LPS / लिपिड एक संरचना या एक विशेष बैक्टीरियल प्रजातियों के साथ म्यूटेंट अक्सर सेल फसल के दौरान गोली के लिए मुश्किल हैं. इन उपभेदों के लिए, centrifugation की लंबाई उपज बढ़ाने के लिए बढ़ाया जा सकता है. नोट के अलावा, एक एकल चरण Bligh-डायर मिश्रण और LPS में सेल के बाद (कदम 1.9 देखें) pelleted है, अतिरिक्त धोने कदम फॉस्फोलिपिड प्रदूषण को कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है. ई. से लिपिड एक अलग जब कोली या साल्मोनेला, केवल एक धोने की आवश्यकता है. अन्य जीवों (जैसे वी. कोलरा या हेलिकोबेक्टर) से लिपिड एक अलग हालांकि, अगर अतिरिक्त धोने कदम आवश्यक हैं.

एसडीएस, कम hydrophobicity (यानी अधिक फोटो के साथ लिपिड एक प्रजाति की पैदावार में हल्के एसिड hydrolysis के बाद> 2 sphate समूहों या उससे कम एसाइल चेन <5) एक अम्लीय Bligh-डायर निकासी का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है. प्रोटोकॉल धारा 1 में इस्तेमाल किया संस्करणों के लिए, क्लोरोफॉर्म की 30 मिलीलीटर और क्लोरोफॉर्म के एक दो चरण Bligh-डायर मिश्रण के लिए मेथनॉल के 30 मिलीलीटर द्वारा पीछा hydrolyzed लिपिड युक्त एसडीएस समाधान केंद्रित एचसीएल के 225 μl जोड़ें: मेथनॉल: 0.1 एम एचसीएल (2:2:1.8, वी / वी). मेथनॉल: प्रोटोकॉल धारा 6 में इस्तेमाल संस्करणों क्लोरोफॉर्म के 2 मिलीलीटर और एक क्लोरोफॉर्म उपज मेथनॉल के 2 मिलीलीटर द्वारा पीछा hydrolyzed लिपिड युक्त एसडीएस समाधान केंद्रित एचसीएल की 15 μl जोड़ने के लिए 0.1 एम एचसीएल (2:2:1.8, वी / वी) मिश्रण. एक अम्लीय Bligh-डायर निकासी के बाद, pyridine एसिड (अंतिम नमूना मात्रा की pyridine / 2 मिलीलीटर की 1 ड्रॉप) को बेअसर करने के लिए जमा कम चरणों से जोड़ा जा सकता है. इस अतिरिक्त कदम एक रासायनिक धूआं हुड में, नमूना सुखाने से पहले किया जाना चाहिए. एस्टर से जुड़े फैटी एसिड को दूर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो अतिरिक्त pyridine, उपयोग करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा. साथ ही, अगर लिपिड sampLe, नाइट्रोजन के तहत शुष्क क्लोरोफॉर्म की कुछ मिलीलीटर जोड़ने के लिए मुश्किल है: मेथनॉल (4:1, वी / वी) कुप्पी और पूरा करने के लिए नमूना सुखाने के लिए जारी है.

कुछ जीवों (जैसे वी. कोलरा, Yersinia pseudotuberculosis) में मनाया लिपिड एक प्रजाति के जटिल रासायनिक विविधता कभी कभी टीएलसी या एमएस आधारित विश्लेषण कठिन बना सकते हैं. कॉलम क्रोमैटोग्राफी अधिक सरल मिश्रण में पृथक लिपिड एक प्रजाति पूर्व fractionate को इन विश्लेषणात्मक तकनीकों के अपस्ट्रीम नियोजित किया जा सकता. Diethylaminoethyl साथ आयनों एक्सचेंज (DEAE) सेलूलोज़ सबसे अधिक 40 प्रयोग किया जाता है. ऐसे aminoarabinose या phosphoethanolamine के रूप में गैर अम्लीय समूहों के साथ, फॉस्फेट स्थिति में या तो संशोधित एक सामान्य दिशानिर्देश लिपिड एक के रूप में, असंशोधित लिपिड एक प्रजाति 40 से पहले elutes. इसी Tris-phosphorylated लिपिड एक अच्छी तरह असंशोधित bisphosphorylated प्रजातियों 36,40 के बाद elutes. रिवर्स चरण क्रोमैटोग्राफी लिपिड एक नकदी fractionate करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैhydrophobicity 41 की डिग्री बदलती के एस. कॉलम क्रोमैटोग्राफी भी हल्के एसिड hydrolysis और बाद में Bligh-डायर लिपिड एक निष्कर्षण कदम के बाद अवशिष्ट एसडीएस को हटाने में उपयोगी है. अवशिष्ट एसडीएस के उच्च स्तर हमारे संवेदनशील ईएसआई एमएस प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त स्पेक्ट्रा में दमन संकेत करने के लिए योगदान कर सकते हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम भी JSB को R01GM103655 अनुदान वेल्श फाउंडेशन अनुदान F1155 और एनआईएच द्वारा समर्थित किया गया स्वास्थ्य (NIH) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान AI064184 और AI76322 द्वारा और MST अनुसंधान करने के लिए सेना के अनुसंधान कार्यालय से अनुदान 61789-Ma-MUR द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1

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References

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रसायन विज्ञान अंक 79 झिल्ली लिपिड टोल की तरह रिसेप्टर्स endotoxins glycolipids Lipopolysaccharides लिपिड ए सूक्ष्म जीव विज्ञान लिपिड लिपिड ए Bligh-डायर पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) lipopolysaccharide मास स्पेक्ट्रोमेट्री टकराव प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी ) Photodissociation (पीडी)
ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया से अलगाव और लिपिड एक के रासायनिक लक्षण वर्णन
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Henderson, J. C., O'Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).

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