Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Isolering og kemisk karakterisering af lipid A fra gramnegative bakterier

Published: September 16, 2013 doi: 10.3791/50623
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Section of Molecular Genetics and Microbiology, The University of Texas at Austin, 2Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Texas at Austin, 3The Institute of Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

Summary

Isolering og karakterisering af lipid A-domænet af lipopolysaccharid (LPS) fra gram-negative bakterier giver indsigt i celleoverflade mekanismer antibiotikaresistens, bakteriel overlevelse og fitness, og hvor kemisk forskellige lipid A molekylspecies differentielt modulere værtens medfødte immunresponser.

Abstract

Lipopolysaccharid (LPS) er den vigtigste celleoverflademolekylet af gram-negative bakterier, anbragt på den ydre blad af ydre membran-dobbeltlaget. LPS kan opdeles i tre områder: den distale O-polysaccharid, en kerne oligosaccharid og lipid Et domæne bestående af et lipid A molekylære arter og 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic syrerester (KDO). Lipid A domæne er den eneste komponent af afgørende betydning for bakteriecelle overlevelse. Efter sin syntese, er lipid A kemisk modificeret som reaktion på miljømæssige påvirkninger såsom pH eller temperatur, for at fremme resistens over for antibiotika forbindelser, og for at undgå anerkendelse af mediatorer af svar værtens medfødte immunforsvar. Følgende protokol beskriver de små-og store isolation af lipid A fra gram-negative bakterier. Isolerede materiale derefter kemisk karakteriseret ved tyndtlagskromatografi (TLC) eller massespektrometri (MS). Ud over at matrix-assisteret laser desorption / ionisering tid for flys (MALDI-TOF) MS, vi også beskrive tandem MS-protokoller til at analysere lipid A molekylære arter ved hjælp af elektrospray (ESI) koblet til kollision induceret dissociation (CID) og nyansatte ultraviolet photodissociation (UVPD) metoder. Vores MS protokoller gør det muligt for entydig bestemmelse af kemisk struktur, altafgørende for karakterisering af lipid A molekyler, der indeholder unikke eller nye kemiske modifikationer. Vi beskriver også den radioisotopisk mærkning og efterfølgende isolation af lipid A fra bakterieceller til analyse ved TLC. I forhold til MS-baserede protokoller, TLC giver en mere økonomisk og hurtig karakterisering metode, men kan ikke anvendes til utvetydigt at tildele lipid A kemiske strukturer uden anvendelse af standarder med kendt kemisk struktur. I løbet af de sidste to årtier isolering og karakterisering af lipid A har ført til mange spændende opdagelser, der har forbedret vores forståelse af fysiologi af gram-negative bakterier, mekanismer af antibiotika resistensafstanden, respons menneskets medfødte immunforsvar, og har givet mange nye mål i udviklingen af ​​antibakterielle forbindelser.

Introduction

Lipopolysaccharid (LPS) er den største ydre overflade molekyle næsten alle gramnegative organismer og består af tre molekylære domæner: en distal O-antigen-polysaccharid, en kerne oligosaccharid, og membran-associeret lipid Et domæne aflejret på den ydre blad af ydre membran-dobbeltlag 1,2. Lipid Et domæne består af 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) restkoncentrationer og en lipid A molekylære arter, hvor lipid A kan defineres som den chloroform opløselige del af LPS på mild sur hydrolyse 1, 2. Standarden lipid A molekyle kan kemisk defineret som en diglucosamine rygrad, der er hexa-acyleret og bis-phosphoryleret, i overensstemmelse med de store lipid A-arter observeret i modelorganismen Escherichia coli (E. coli) 1,2. Ni konstitutivt udtrykte gener, konserverede hele gram-negative bakterier, der er ansvarlige for produktion af lipid A-domæne (figur 1) 1,2. De fleste bakterier har et ekstra sæt af gener, som varierer i graden af fylogenetiske bevarelse, der deltager i yderligere kemisk modifikation af lipid A 3. Dephosphorylering, fjernelse af acylkæder, og tilsætning af kemiske dele, såsom aminosukkere (f.eks aminoarabinose) og / eller phosphoethanolamin er de mest almindeligt observerede aktiviteter (figur 1). Mange af de enzymer, der er ansvarlige for lipid En ændring påvirkes direkte af miljømæssige signaler, såsom divalente kationer, eller deres ekspression reguleres af to komponent respons-regulator systemer 3.

Anerkendelse af lipid A arter af værten medfødte immunsystem er medieret af Toll-lignende receptor 4/myeloid differentiering faktor 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Hydrofobe kræfter mellem MD2 og lipid A acylkæder samt mellem TLR4 og 1 og 4 'phosphatgrupper af lipid A fremmer den stærke associering læbeid A med TLR4/MD2 4,5. Ændringer, der ændrer acylering stat eller den negative ladning af lipid A indvirkning TLR4/MD2 baserede lipid A anerkendelse og nedstrøms stimulering af medfødt immunrespons aktivatorer NF-KB og mediatorer af inflammation, såsom TNFa og IL1-β 6,7. Modifikationer, der maskerer den negative ladning af lipid A også forhindre baktericide kationiske antimikrobielle peptider binde til gramnegativ celleoverflader 3,8. Mange lipid A modifikationer hypotese at øge bakteriel kondition under specifikke miljøforhold, såsom inde i den menneskelige vært eller i en økologisk niche. Af denne grund mange modifikationsenzymer er attraktive mål i en rationel udvikling af antimikrobielle forbindelser. Kemiske diversitet af lipid A-strukturer med hensyn til organisme og / eller miljø, og de biologiske konsekvenser af disse forskellige strukturer gør den strukturelle karakterisering af lipid A en vigtig bestræbelse i than studere af gram-negative bakterier.

Isolering af lipid A molekyler fra hele bakterier involverer ekstraktion af LPS fra den bakterielle celleoverfladen, hydrolytisk trin til at frigøre lipid A, efterfulgt af en endelig rensning procedure 9-11. Det hyppigst citerede LPS udvinding procedure er hot-phenol vand ekstraktion procedure, først introduceret af Westphal og Jann 10.. Efter ekstraktion hele LPS underkastes mild syrehydrolyse, som kemisk adskiller Kdo fra 6'-hydroxylgruppen af den distale glucosamin sukker lipid A (figur 1). Mange faldgruber findes for det varme-phenol vand procedure, herunder anvendelse af en høj risiko reagens, er behovet for at nedbryde medekstraheres nukleinsyrer og proteiner, og flere dage kræves for at fuldføre protokol 10.

Vores lab har videreudviklet udvinding og isolering af lipid A som først udviklet af Caroff og Raetz 12,13. Sammenlignet med hot-phenol vand procedurer, metoden præsenteres her er mere hurtig og effektiv og kan rumme en bred vifte af kultur mængder fra 5 ml til flere liter. I modsætning til hot-phenol vand ekstraktioner, vores metode ikke udvælger til ru-eller glat-typer LPS, giver optimal genvinding af lipid A-arter. I vores protokol, er kemisk lysis af hele bakterieceller udført under anvendelse af en blanding af chloroform, methanol og vand, hvor LPS kan pelleteret ved centrifugering. En kombination af mild syrehydrolyse og opløsningsmiddelekstraktionerne (Bligh-Dyer) anvendes til at frigøre lipid A fra covalent bundet polysaccharid. Fremgangsmåden ifølge Bligh og Dyer blev først anvendt til udvinding af lipid arter fra en række dyre-og plantevæv 14, modificeret her at adskille hydrolyserede polysaccharid fra lipid A. I dette sidste separationstrin, chloroform opløselige lipider selektivt opdele i lavere organisk fase. For yderligere at oprense lipid A, omvendt fase elleranionbyttermateriale søjlechromatografi kan anvendes 12.

Efter isolering af lipid A-arter fra hele celler, kan en række analytiske metoder anvendes til at karakterisere den kemiske struktur af det isolerede materiale, såsom NMR, TLC og MS-analyse. NMR giver mulighed for ikke-destruktiv strukturel udredning og tilvejebringer strukturel detalje relateret til glycosidbindinger, utvetydig tildeling af acylkæde positioner, og tildeling af bindingssteder for lipid A modifikationer som aminoarabinose eller phosphoethanolamin 15-17. NMR-analyse af lipid A er ikke drøftet i vores protokol, men er blevet beskrevet tilstrækkeligt andetsteds 15,16. For hurtig analyse TLC baserede metoder bruges ofte, men undlader at give direkte oplysninger om fine kemiske struktur. MS baserede protokoller er den hyppigst anvendte metode til at karakterisere lipid A-strukturer 18,19. Matrix forbundet laser desorption ionisering (MALDI)-MS er ofte bruges i første omgang kortlægge intakte lipid A-arter. Enkeltvis ladede ioner er genereret ud fra analyt fremstilles ifølge vores ekstraktionsprocedurer. Som der kræves mere fint strukturel analyse, MS / MS baserede metoder bevise mere informativ end MALDI-MS. Koblet til elektrosprayionisering (ESI) enkeltvis eller formere ladet lipid en forløber ioner er yderligere fragmenteret ved kollision induceret dissociation (CID) eller ultraviolet photodissociation (UVPD), til at generere strukturelt informative produkt ioner 18,20,21. Neutrale tab produkter fra lipid A precursor ioner er også ofte genereres under ESI-MS giver en ekstra lag af strukturel information.

Tandem massespektrometri (MS / MS) har vist sig at være et uundværligt og alsidig metode til belysning af lipid A strukturer. I MS / MS, er ioner aktiveres til opnåelse af et diagnostisk fragmentering mønster, som kan anvendes til at belyse strukturen af ​​prækursor-ion. Den mest udbredte available MS / MS metode er CID. Denne metode frembringer fragmentionerne via kollisioner af den valgte prækursor-ion med en inert målgas, hvilket resulterer i energi aflejring, der fører til dissociation. CID har vist sig et kritisk værktøj i tildelingen af lipid A struktur for en lang række bakteriearter 22-33.

Selvom CID er den mest universelt implementeret MS / MS metode, det genererer en begrænset vifte af produkt-ioner. 193 nm UVPD er en alternativ og supplerende MS / MS metode. Denne metode bruger en laser til at bestråle ioner, og absorptionen af ​​fotoner resulterer i aktiveringen af ​​ioner og efterfølgende dissociation. Denne højere energi MS / MS-teknik giver en mere mangfoldig vifte af produkt-ioner end CID og dermed giver mere informative fragmenteringsmønstre. Især UVPD giver information om subtile ændringer i lipid A-arter er baseret på skel på glycosidbindingen, amin, acyl-og CC-obligationer 18,21,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle løsninger skal være forberedt med ultrarent vand og HPLC-kvalitet methanol og chloroform. Fremstillede opløsninger, der indeholder organiske opløsningsmidler, såsom methanol, chloroform eller pyridin og koncentrerede syrer eller baser skal fremstilles og anvendes under et stinkskab. Alle opløsninger kan opbevares ved stuetemperatur. Skal måles Opløsningsmidler i en gradueret glascylinder og opbevaret i glasflasker opløsningsmiddel med PTFE foret hætter. Til langtidsopbevaring chloroform-holdige opløsningsmidler bør opbevares i tonede brune glasflasker at undgå produktion af phosgen, en meget reaktive syrechlorid. PTFE centrifugerør og roterende fordamper kolber bør skylles med methanol og chloroform før brug. Følg nødvendige føderale, statslige og / eller bortskaffelse institutionel affald regler ved bortskaffelse af opløsningsmidler og / eller radioaktivt affald.

1.. Large Scale Lipid A Extraction (50 ml til 1,5 L)

  1. Forbered en enfaset Bligh-Dyer blandingen: chlorformular-methanol-1X phosphatpufret saltopløsning (PBS), pH 7,4; 1:2:0.8 v / v). Kombiner 200 ml chloroform, 400 ml methanol og 160 ml PBS i 1 liter opløsningsmiddel flaske. Cap flaske og bland ved inversion (> 30x). Løsn hætten jævnligt under blanding for at lufte og gemme forseglet.
  2. Forbered en præækvilibreret tofaset Bligh-Dyer-blanding-chloroform: methanol: vand (2:2:1.8 v / v). Kombiner 400 ml chloroform, 400 ml methanol og 180 ml vand i 1 liter opløsningsmiddel flaske. Cap flaske og bland ved at vende, og sørg for at løsne hætten jævnligt under blanding til at lufte. Lad ligevægt O / N og butik forseglet.
  3. Forbered mild syrehydrolyse puffer (50 mM natriumacetat, pH 4,5, 1% natriumdodecylsulfat (SDS)). For 500 ml mild sur hydrolyse buffer, vejer 2,05 g natriumacetat og overføres til et 500 ml bægerglas. Tilsæt vand til et volumen på ~ 350 ml og omrøres, derefter tilsættes 50 ml 10% SDS. Bland og justere pH til 4,5, overføre til en måleglas, og tilsæt vand til 500 ml.
  4. Forberedchloroform: methanol (4:1, v / v): Mål 100 ml chloroform og overføres til opløsningsmiddel flaske. 25 ml methanol og blandes med chloroform. Opbevares i glasflaske.
  5. Podes 5 ml medier (Luria bouillon eller andet) fra en enkelt bakteriel koloni. Grow O / N ved 37 ° C, eller på de krævede ° C for vækst. Et diagram af ekstraktionsproceduren er vist i figur 2.
  6. Den næste dag, måle OD600 og bruge 5 ml O / N-kulturen til podning af 200 ml kultur til en start OD600 på 0,05. Dyrk celler indtil en OD600 på 0,8-1,0 er nået.
  7. Harvest celler via centrifugering ved 10.000 x g i 10 min. Længere spins kan kræves for stammer pelletproducenterne dårligt. Hæld media supernatant.
  8. Vask cellepellet med 50 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Gentag centrifugering for at pelletere cellerne. Hæld supernatanten og butik cellepelleten ved -20 ° C, eller fortsæt til trin 1.9.
  9. Resuspender cellerne i 40 ml1X PBS og kløft mellem to 250 ml PTFE centrifugerør (med et provenu 20 ml cellesuspension / rør). Tilsættes 25 ml chloroform og 50 ml methanol til hvert rør til en enkelt fase Bligh-Dyer (chloroform: methanol: vand; 1:2:0.8 v / v) (figur 2). Bland ved inversion og inkuberes ved stuetemperatur i> 20 minutter for at sikre fuldstændig cellelyse.
  10. Centrifuger blandingen ved 2.000 xg i 20 minutter. LPS vil bundfælde sammen med proteiner og nukleinsyrer (figur 2), men vil phospholipider, isoprenyltransferaser lipider, og små, hydrofobe peptider forbliver i supernatanten. Supernatanten.
  11. Vask LPS pellet med ~ 100 ml enkelt fase Bligh-Dyer blanding. Centrifuger ved 2.000 x g i 20 min. Supernatanten kasseres. Ved isolering af lipid A fra E. coli eller Salmonella er kun én vask påkrævet, men kan være behov for yderligere vaske skridt til at reducere phospholipid forurening ved at isolere lipid A fra nogle organismer.
  12. Tilføj 27 ml mild syrehydrolyse puffer (50 mM natriumacetat, pH 4,5, 1% SDS, se trin 1.3) til LPS pelleten, og bland ved at pipettere op og ned, indtil kun små partikler tilbage. Lydbehandles homogent opblande LPS pellet i opløsning med sonden sonikator med en konstant arbejdscyklus i 20 sekunder ved 50% output. Gentag lydbehandling af prøven 2x (20 sek / burst, ~ 5 sek mellem bursts).
  13. Boil prøver i et vandbad i 30 min. Forsigtig: Sørg for hætter er stram, men ikke helt forseglet. Nogle organismer, ligesom Vibrio cholerae (V. cholerae) kræver længere inkubationstider (1 time) for at øge den samlede udbytte af lipid A. Fjern flasker fra vandbadet, så prøve at køle af til stuetemperatur, før du fortsætter.
  14. At ekstrahere lipider efter hydrolyse, konvertere SDS-opløsning i en to-faset Bligh-Dyer (figur 2) blanding ved tilsætning af 30 ml chloroform og 30 ml methanol til chloroform: methanol: vand (2:2:1.8 v / v) blanding. Bland ved at vende og centrifugeres prøven i 10 minutter ved 2,000 x g. Uddrag den nederste fase ind i en ren PTFE centrifuge rør ved hjælp af et glas pipette.
  15. Udfør en anden ekstraktion ved at tilsætte 30 ml lavere fase fra en præækvilibreret tofaset Bligh-Dyer blanding (trin 1.2), til den øverste fase fra trin 1.14. Mix, centrifugeres ved 2.000 x g i 10 min. Uddrag den nederste fase, og pool med den nederste fase udvindes i trin 1.14.
  16. Vask de samlede lavere faser (60 ml i alt) ved tilsætning af 114 ml af præ-ækvilibreret tofaset Bligh-Dyer øvre fase (trin 1.2) for at skabe en tofaset Bligh-Dyer-blanding (chloroform: methanol: vand 02:02: 1,8, v / v). Mix. Centrifuger ved 2.000 x g i 10 min.
  17. Fjern den nederste fase til et rent glas rotationsinddamper kolbe og tør prøve ved anvendelse af rotationsinddampning (figur 2).
  18. Der tilsættes 5 ml chloroform: methanol (4:1, v / v) til roterende kolbe, og bad-sonikat (> 30 sek) til støtte i suspension af lipid fra siderne af kolben. Brug et glas overførselspipetten at overføre lipid til et rentglasrør (13 x 100 mm eller større) udjævnet med PTFE foret phenol skruelåg. Tør prøve under en strøm af nitrogen under anvendelse af en nitrogen-tørretumbler.
  19. Resuspender tørret lipid i 1 ml chloroform: methanol (4:1, v / v). Overførsel til lille glas hætteglas (12 x 32 mm) med en tilspidset base for mere kvantitativ resuspension ved hjælp af små mængder (se tabel i Udstyr / reagenser). Tør bruge en kvælstof tørretumbler.
  20. Tørrede prøve kan opbevares ved -20 ° C indtil efterfølgende TLC (protokol 2) eller MS-analyse (protokol nr. 3, 4 eller 5). (Bemærk: Mængden af ​​materiale, isoleret og bruges i efterfølgende protokoller er foreslået på baggrund af, hvad der er tilstrækkeligt for de fleste organismer Samme lipid prøve kan bruges i protokoller 2-5, der tager til efterretning% materiale fjernet se diskussionen for flere detaljer...).

2. Visualisering af Lipid A Arter via Tyndtlagskromatografi

  1. Forbered TLC mobile fase opløsningsmiddelsystem (chloroform: pyridin: 88% myresyre: vand; 50:50:16:5 v / v). Combine 200 ml chloroform, 200 ml pyridin, 64 ml 88% myresyre og 20 ml vand i en 1 L opløsningsmiddel flaske. Cap flaske, bland ved inversion flere gange, og udluftning.
  2. Brug en TLC tank, der vil rumme 20 x 20 cm plader. Linje TLC tank med ~ 40 cm kromatografi papir.
  3. TLC beholder tilsættes 200 ml chloroform: pyridin: 88% myresyre: vand (50:50:16:5, v / v) blanding. Lad tanken at pre-ligevægt i> 3 timer, ofte O / N foretrækkes og mere bekvem.
  4. Fjern tørrede lipid prøver fra fryseren (trin 1.20), og lad varme til RT.
  5. Med en barberkniv fjerne silica fra den øverste kant af en silicagel 60 TLC-plade. Ved hjælp af en kedelig blyant, tegne en linie parallelt med bunden af ​​pladen 2 cm fra bunden. Denne linje er oprindelsen for spotting prøver. Mark intervaller langs denne referencelinje at spotte prøverne 1 cm fra hinanden.
  6. Opløses tørret lipid fra trin 2.4 i 200 pi chloroform: methanol (4:1, v / v), og prøverne ultralydsbad (3x ~ 15 sek hver), udbytte ~ 100 -500 ng / ul lipid A, hvis ekstraheret fra E. coli.
  7. Ved hjælp af en mikrokapillære glas pipette øje på en tiendedel af volumen (20 pi) på TLC-pladen, som markeret i trin 2.5. Lad prøverne lufttørre på TLC-pladen for ~ 15 min. (Bemærk: Prøver i små hætteglas kan tørres ved hjælp af et nitrogen-tørretumbler og opbevaret ved -20 ° C til senere brug i protokollerne 3-5 Vær opmærksom på% materiale fjernet.).
  8. Anbring TLC-plade indeholdende plettede prøver til præ-ækvilibreret tank. Når væskefronten når toppen af ​​TLC-pladen (~ 2,5-3 timer), skal du fjerne pladen og lufttørre (> 60 min). En kold luft pistol kan bruges til at sikre fuldstændig tørhed.
  9. Mens pladen tørrer, tænde varmeplade ved 250 ° C i forkulning.
  10. I et ventileret stinkskab, forberede 10% svovlsyre-ethanol-blanding for forkulning lipider løst på silicagel TLC-plade (koncentreret svovlsyre: 100% ethanol, 01:09 v / v). Mål 10 ml svovlsyre, og der tilsættes langsomt 90 ml 100% ethanol. Plejefuldt blande og overføre til en Glaschromatografisk reagens forstøver.
  11. I stinkskab, brug en Glaschromatografisk reagens forstøver til at sprøjte tørrede TLC-plade med 10% svovlsyre-ethanol-blanding. Spray blandingen jævnt over pladen.
  12. Placer TLC plade på 250 ° C varmeplade indtil forkullede lipid prøver vises som sorte / brune pletter (<1 min.) Ikke overeksponere pladen, da dette vil medføre, at hele pladen bliver brune og gør visualisering af lipid A-arter vanskelig.

3. Strukturel karakterisering af Lipid A via MALDI-TOF-massespektrometri

  1. Fra trin 1.20 (eller trin 2.7) fjerne lipid En prøve fra fryseren og lad varme til RT. Resuspender tørret lipid A prøven i ~ 20 pi chloroform: methanol (4:1, v / v) og vortex for at opnå en ~ 1-5 pg / pl lipid A-løsning, hvis ekstraheret fra E. coli. (Bemærk: 10% mindre koncentreret om materiale, der anvendes fra trin 2.7).
  2. Forbered ATT matrixbestanddele. Mættet 6-aza-2-thiothymin i 50% acetonitril: add 500 pi vand, og 500 pi af acetonitril til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og derefter tilføje> 10 mg 6-aza-2-thiothymin, således at 50% acetonitril er overmættet. Mættet tribasic ammoniumcitratopløsning: Tilføj> 1 mg til 500 ul vand, bundfald bør være let synlige. Vortex og centrifuger løsninger, før brug, kun mættet supernatant anvendes.
  3. Forbered ATT matrixblandingen: mættet 6-aza-2-thiothymin i 50% acetonitril, mættet tribasisk ammoniumcitrat (20:1, v / v). Bland matrixkomponenter sammen ved tilsætning af 20 pi ATT løsning på 1 ml mættet tribasisk ammoniumcitrat opløsning i 500 ul mikrocentrifugerør, vortex at blande, og centrifugeres før anvendelse til MALDI plade.
  4. Forbered MALDI plade ved at tilsætte 0,5 pi kalibrator blandingen til MALDI plade på et sted i nærheden af ​​hvor prøverne vil blive deponeret, til at give den mest nøjagtige masse / ladningsforhold beslutsomhed.
  5. Indbetal 0,5 piaf ATT matrix på MALDI plade på hver plet, hvor lipid En prøve vil blive deponeret.
  6. Depositum 0,5 ul prøve (2,5% af den samlede stikprøve) på stedet af ATT-matrix, til at blande på plade, og erhverve spektre ved at scanne prøven for optimale ionsignaler (Figur 3). Bemærk: Beløb til den mest optimale MS signal kan variere med organismen og skal bestemmes empirisk. Hvis du vil tilføje mere materiale man kan få øje på 0,5 pi flere gange, tillader spottet blanding til tørre i mellem tilsætning af mere prøve. Prøven kan også koncentreres (tør og resuspender i et mindre rumfang) eller fortyndet efter behov. Mere udgangsmateriale (volumen af ​​start-kultur), kan også anvendes (se diskussion).

4.. Elektrospray massespektrometri og Collision dissociation of Lipid A

  1. Forbered en chloroform: methanol opløsningsmiddelblanding (1:1, v / v) ved at blande en 200 pi bestand af HPLC-kvalitet methanol med 200 ml HPLC-kvalitet chloroform i et glas solvent flaske.
  2. Overfør 200 ul af chloroform: methanol Opløsningsmiddelblanding til hætteglasset med lipid A (fx fra trin 1,20, 2,7 eller tørret efter protokol 3) og sonikeres lipid en løsning i 5 min, eller indtil alt materialet er opløst.
  3. Opsæt massespektrometer til negativ tilstand electrospray ionisering.
  4. Ved hjælp af en 250 pi sprøjte og en sprøjtepumpe, direkte tilføre den fortyndede lipid A prøven ved en strømningshastighed på 2,0-3,5 ul / min.
  5. Optimer og forbedre lipid A ion signal ved tuning ion optik. En fuld massespektrum kan nu opsamles af lipid A-arter (figur 4).
  6. Isolere og aktivere målet lipid A ved at vælge CID som MS / MS metode.
  7. Forøg CID spænding (eller normaliseret kollisionsenergi, NCE) indtil forstadiet lipid A-arter er omkring 10% relativ overflod i forhold til den højeste produkt ion.
  8. Erhverve og gennemsnitlig spektre indtil tilstrækkelig signal-til-støj er opnået for the produkt ioner. Det antal scanninger er nødvendige, afhænger af signalintensiteten af den oprindelige forstadium og kan variere fra 3 til 300 scanninger (figur 5A).

5.. MS / MS på Lipid A ved Ultraviolet Photodissociation

  1. Forbered prøven og massespektrometer som i trin 4.1-4.5.
  2. Tænd laseren grænseflader til massespektrometer. Massespektrometer var udstyret med en 193 nm excimer-laser og modificeret til at tillade UV aktivering i HCD celle af instrumentet. Photodissociation blev implementeret i en lignende måde som beskrevet tidligere 35. Vi bruger en modificeret vakuummanifold med en CaF2 optisk vindue til at overføre fotoner i den højere energi C-fælde dissociation (HCD) celle. Laseren udløses under MS / MS af en transistor-transistor logik (TTL) signal fra massespektrometer til en puls / forsinkelse generator.
  3. Opstil instrumentet softwaren, så laseren vil udløse excimerlaser nårioner træder HCD celle. Dette kræver en beskeden ændring af softwaren.
  4. Tænd impulsgeneratoren, således at laseren pulseres hver 2 msek (500 Hz).
  5. Isoler lipid A prækursor-ion ved at vælge HCD som MS / MS metode og justere collisional energi til 1% NCE. Dette tillader isoleringen af ​​precursor-ioner for ultraviolet dissociation inden HCD celle. Selv HCD celle anvendes, er softwaren modificeret til at udføre UVPD under dette interval.
  6. Aktiver isolerede lipid A ion ved at øge laserenergien og justere antallet af laserpulser. Et typisk UVPD eksperiment vil blive udført ved hjælp af ti 6 ml impulser.
  7. Som i trin 4.8, erhverve og gennemsnitlig spektre indtil tilstrækkelig signal-til-støj er opnået for de UVPD produkt ioner. Det antal scanninger er nødvendige, afhænger af signalintensiteten af den oprindelige forstadium og kan variere fra 3 til 300 scanninger (Figur 5B).

32 P-mærkning 6..of Lipid A og efterfølgende isolering

  1. Inokulere 5 ml medier (Luria-bouillon eller andre medier) fra en enkelt koloni. Grow O / N ved 37 ° C eller ved ønskede temperatur.
  2. Den næste dag, måle OD600 og bruge O / N-kulturen til at pode 7 ml af kulturen til en start OD600 på ~ 0,05, dyrkes i et standard 20 x 150 mm engangs glas kultur rør. Tilføj 2,5 uCi / ml uorganisk 32 s. Dyrk celler indtil en OD600 på 0,8-1,0 er nået. Følg føderale, statslige og / eller institutionelle retningslinjer for sikker og korrekt håndtering af radioaktive materialer.
  3. Harvest celler i 16 x 125 mm glascentrifugerør med PTFE foret hætte med en fast vinkel klinisk centrifuge ved 1500 x g i 10 min. Fjern supernatanten i passende radioaktivt affald container. Skal bortskaffes alt radioaktivt affald (fx væske, glas, biohazard), der genereres i de efterfølgende skridt i overensstemmelse med føderale, statslige og / eller institutionel GUIdelines.
  4. Vask cellepellet med 5 ml 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS). Centrifuger i 10 minutter ved 1.500 x g. Supernatanten kasseres.
  5. Resuspender cellerne i 5 ml enfaset Bligh-Dyer-blandingen (figur 2), der består af chloroform: methanol: vand (1:2:0.8, v / v). Vortex for at blande, og inkuberes ved stuetemperatur i> 20 minutter for at sikre fuldstændig cellelyse.
  6. Centrifuge klinisk centrifuge ved 1500 xg i 20 min. Hæld forsigtigt af supernatant, der indeholder phospholipider og isoprenyltransferaser lipider.
  7. Resuspender LPS pellet i 1,8 ml 50 mM natriumacetat, pH 4,5, 1% SDS-puffer ved hvirvelbehandling. Sonikeres prøve ved hjælp badsonikator indtil pellet er jævnt fordelt (~ 30 sek.)
  8. Inkuber prøven i 30 minutter i kogende vandbad. Sørg for, at hætter er stram, men ikke forseglet.
  9. Fjern fra vandbadet, så prøven til afkøling ved stuetemperatur i 5-10 min.
  10. Konverter opløsningen i en tofaset Bligh-Dyer-blanding ved tilsætning af 2 ml chloroform og 2 mlmethanol, hvilket gav et chloroform: methanol: vandig (2:2:1.8 v / v) blanding. Vortex at blande, og centrifugeres i 10 minutter i klinisk centrifuge ved 1.500 xg til separate faser.
  11. Uddrag den nederste fase i et rent glas centrifugerør under anvendelse af en glaspipette (første ekstraktion).
  12. Udføre en anden ekstraktion af prøven ved tilsætning af 2 ml af præ-ækvilibreret tofaset Bligh-Dyer nedre fase (fremstillet som i trin 1.2) til den resterende øverste fase fra trin 11. Vortex og centrifuger 10 min. Fjern nedre fase og kombinere med den nedre fase fra den første ekstraktion.
  13. Den poolede nedre fase (~ 4 ml totalvolumen), tilsættes 7,6 ml af præ-ækvilibreret øvre fase (trin 1.2), hvilket gav en tofaset Bligh-Dyer-opløsning (chloroform: methanol: vand; 2:2:1.8 v / v). Vortex og centrifuger i 10 min.
  14. Fjern den nederste fase til et rent reagensglas og tør ved hjælp af en nitrogen tørretumbler. Tørrede prøver kan opbevares ved -20 ° C indtil yderligere anvendelse.

7.. Visualiseringning af 32 P-mærket lipid A Art via Tyndtlagskromatografi

  1. Forbered 32P-mærket sphingosin En prøve TLC tanken og TLC-plader som beskrevet i trin fra 2,1 til 2,8.
  2. 32P-mærkede prøve opløses i 500 pi 4:1 chloroform-methanol (vol / vol). Vortex og bad sonikat at opløse lipid materiale. Der tilsættes 5 ul prøve til scintillationshætteglas med 5 ml scintillationsvæske. Tæl i scintillationstæller og beregne den samlede tællinger / min prøve.
  3. Ved at visualisere radioaktivt mærkede lipidtyper, kan anvendes 10 x 20 cm eller 20 x 20 cm TLC-plader. For 10x20 cm plader, skal prøver spottet langs oprindelse markeret i trin 2.5, således at pladens længste dimension er lodret (dvs. prøver spottet på oprindelsesstedet mærket 2 cm over 10 cm kant).
  4. Ved hjælp af en mikrokapillære pipette, spot 10.000-20.000 cpm / prøve på plade og lad pletter tørre (> 15 min). Prøverne skal muligvis koncentreres ved tørring undernitrogen og resuspenderet i et passende volumen, for at opnå 10.000-20.000 tællinger / min / stedet (2 pi eller 2 pi ad gangen <10 pi i alt).
  5. Anbring TLC-plade indeholdende radiomærkede prøver til præ-ækvilibreret tank. Når væskefronten når toppen af ​​TLC-pladen (~ 3 hr), fjernes pladen og lufttørre (> 60 min). Forsigtig: TLC-plader kører i nærværelse af pyridin skal tørres grundigt i stinkskab, som spormængder af pyridin kan beskadige phosphorimaging skærme. En kold luft pistol kan bruges til at sikre fuldstændig tørhed.
  6. Pak pladen i plastfolie og udsættes for phosphorbilleddanner skærm i et autoradiografi kassette O / N. Den næste morgen scanne skærmen for at opnå billedet (figur 6). Brug billede densitometrianalyse software, denne metode giver mulighed for præcise, relativ kvantificering af lipid A-arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Canonical lipid A fra E. coli og Salmonella enterica serovar typhimurium er en hexa-acyleret disaccharid af glucosamin med fosfatgrupper på 1 - og 4 '-positioner. Under vækst i rigt medie (fx Luria Broth) en del af lipid A indeholder en pyrophosphat-gruppe i 1-stillingen til opnåelse af en Tris-phosphorylerede arter 36 (fig. 1). Kdo (3-deoxy-D-manno-octulosonsyre), er fastgjort ved 6'-hydroxylgruppen og fungerer som en bro til at forbinde lipid A til de resterende kulhydrat domæner (dvs. kerne oligosaccharid og O-antigen domæner) af LPS. Selv om gram-negative bakterier deler en konserveret vej for lipid A-biosyntese, der svarer til E. coli K-12, er der en stor mængde af mangfoldighed i Lipid A strukturer. Denne mangfoldighed opstår fra handlingen af ​​latente enzymer, der modificerer lipid En struktur, som aktiveres som reaktion på miljømæssige stimuli. For example, i S. enterica phosphatgrupperne lipid A kan være modificeret med det kationiske sukker L-4-aminoarabinose (figur 1, blå) eller med en phosphoethanolamin rest (figur 1; magenta). I Salmonella disse ændringer er reguleret af to-komponent respons regulator systemer, tilføjede som svar på lav [Mg 2 +], mild-sur pH og tilstedeværelsen af kationiske antimikrobielle peptider. Derudover i Salmonella, kan tilsættes palmitat til dannelse af en hepta-acyleret lipid A, der fremmer resistens over for kationiske antimikrobielle peptider (figur 1; grøn) 8. Andre modifikationer indbefatter, men er ikke begrænset til, fjernelse af phosphatgrupper og acylkæder eller dioxygenase katalyseret tilsætning af en hydroxylgruppe til 3'-bundne sekundære acylkæde observeret i et antal organismer 1,3.

Isolering af intakte lipid A fra hele celler af vores modifikation af metoden af ​​CaroFF og Raetz er beskrevet i protokol 1 (figur 2). Denne isolation metode er blevet anvendt til at estimere, at 10 6 molekyler af lipid A findes pr bakteriecellen E. coli 37.. Følgende protokoller 1 og 3, den negative ion MALDI-TOF massespektrum af lipid A fra E. coli K-12 (W3110) giver enkeltvis deprotoneret ion ([MH] -) ved m / z 1,796.20 som majorly observerede arter (figur 3). MALDI-TOF MS blev udført i negativ reflectron tilstand for at forbedre spektral opløsning. Alternativt kan den samme lipid prøve underkastes negativ modus nano-ESI (protokol nr. 4) giver overvejende dobbelt deprotonerede lipid A ioner ved m / z 898,1 betegnet [M-2H] 2 - (Figur 4). Enkeltvis deprotonerede lipid A-ioner [MH] - ved m / z 1,796.20 er observerbare, men er af lavere relativ overflod til [M-2H] 2 - ioner (figur 4). Multiply ladede arter overvejendeNate ved brug af ESI. Fragmentering af CID (figur 5A) eller 193 nm UVPD (figur 5B) blev udført på den [MH] - lipid A ion m / z 1,796.20. Disse teknikker kan anvendes til bedre at tildele kemiske strukturer, især af lipid A-arter indeholder komplekse kombinationer af ændringer eller tidligere karakteriserede kemiske modifikationer. Fragmentering profiler er vist med punkterede linier repræsenterer spaltningssteder og matches med m / z-værdier under hvert billede struktur (Figur 5). M / z-værdier og kløvningssteder fremhævet med rødt skrift udgør unikke produkt ioner forbundet med UVPD.

Som beskrevet i protokollerne 6 og 7, 32P-mærket lipid A isoleret fra to forskellige E. coli K-12-stammer blev analyseret ved TLC (figur 6). W3110 meste indeholder bis-og tris-phosphoryleret lipid A (figur 6;venstre vognbane), mens et mere komplekst TLC mønster er observeret med 32 P-lipid A isoleret fra E. coli stamme WD101 (figur 6, højre bane) 38. WD101 producerer lipid A stærkt modificeret med aminoarabinose (L-Ara4N) og phosphoethanolamin (PETN). Da både 1 - og 4 '- fosfater er tilgængelige for ændring, kan lipid A fra WD101 beskrives som enkeltvis ændres, der kun indeholder ét L-Ara4N eller PETN enten fosfat, eller dobbelt modificeret hvor begge fosfater ændres på en kombinatorisk måde. Ud over modifikation i 1 - og 4 '- fosfater palmitat Desuden er også observeret (se figur 1) og øger Rrværdi af lipid A-arter i dette opløsningsmiddel (figur 6). Hvis det ønskes, densitometri analyse under anvendelse af en phosphorbilleddanner, kan anvendes til at kvantificerbart skøn relative mængder af lipid A-arter inden for den samme prøve.


Figur 1. Repræsentant lipid Et domæne strukturer fra E. coli K-12 og S. enterica serovar typhimurium. Ændringer af den bevarede lipid En struktur er vist (til højre), som beskrevet i Repræsentative resultater. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Skematisk af lipid A isolation procedure. Outline skildrer kemisk lysis af bakteriel cellepellet anvendes enkelt fase Bligh-Dyer-blanding, centrifugering af lysatet til pelletering LPS, mild-a cid hydrolyse at befri lipid A fra tilknyttet polysaccharid, og den endelige oprensning af lipid A ved hjælp af to fase Bligh-Dyer ekstraktion. Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. MALDI-MS-analyse af lipid A isoleret fra E. coli K-12 (W3110). Spectra opnået fra gennemsnittet af> 300 skud. Enkeltvis pålagt [MH] - lipid A er observeret som den molekylære ion ved m / z 1,796.2, hvilket svarer til en deprotoneret arter af strukturen vist til højre.

0623/50623fig4.jpg "/>
Figur 4.. ESI-MS-analyse af lipid A isoleret fra E. coli K-12 (W3110) Isoleret [MH] og dobbelt ladet [M-2H] 2 -. lipid A-arter observeres som molekylære ioner med m / z 1,796.2 og m / z 898,1, hhv.

Figur 5
Figur 5. MS / MS-analyse af lipid A isoleret fra E. coli K-12 (W3110). Kollision dissociation (A) eller ultraviolet photodissociation (B) blev anvendt til at fragmentere prækursor-ion m / z 1,796.2. UVPD specifikke produkt ioner er angivet med rødt. En fragmentering kort er forudsat (C), hvor sort stiplede linjer angiver fragmentering forbundet med både CID og UVPD og rød stiplede linjer angiver UVPD specifikke fragmentering. Værdier, der er opført under fragmenteringen kortet svarer til nøjagtige masser af [MH] -. Produkt ioner Klik her for at se større figur .

Figur 6
Figur 6. TLC-baseret separation af lipid A-arter isoleret fra E. coli K-12-32P-mærket lipid A blev isoleret fra W3110 (venstre bane) eller WD101 (højre bane) og adskilt i et TLC beholder opløsningsmiddelsystem indeholdende chloroform. pyridin: 88% myresyre: vand (50:50:16 : 5 v / v).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol har vi beskrevet isolering af lipid A arter fra hele celler af bakterier, og beskrevet TLC eller MS baserede analysemetoder til kemisk karakterisere denne isolerede materiale. Tandem massespektrometri er en stærk strategi for de novo strukturel karakterisering af biologiske forbindelser, og er uvurderlig for den kemiske karakterisering af opbud af lipid A molekyler observeret i naturen. CID og UVPD er to komplementære aktiverings metoder, der skaber forskellige typer af produkt ioner, der giver vigtige fingeraftryk til lipid A molekyler. MS / MS fragmentering ved hjælp af både CID og UVPD tillader belysning af subtile forskelle i lipid A-strukturer, der giver finere detaljer for kemisk struktur opgaver. Oplysninger af denne type er nødvendigt at etablere præcise korrelat struktur / funktion forhold i biologi lipid A molekylære arter. Vi har også beskrevet proceduren for 32P-radioaktiv mærkning af lipid A-arter i small-skala bakteriekulturer, hvor det kemiske mønster af 32P-lipid-A-arter kan visualiseres ved hjælp af TLC og autoradiografi.

Der er en række funktioner til denne protokol, at enhver bruger skal være opmærksom på. For store præparater lipid A (protokol 1), kan andelen af ​​start opløsningsmiddel til mængden af ​​bakteriel pellet være optimeret til at forbedre den samlede udbytte. Men denne andel kan kun bestemmes empirisk. De i denne protokol beskrevne beløb udgør et godt udgangspunkt for de fleste bakteriestammer. Kultur mængder for lipid A udvinding og isolation kan også justeres afhængigt af den bakteriestamme, du arbejder med. For eksempel V. cholerae kræver mindst 200 ml kultur med henblik på at opnå en høj kvalitet massespektre, men lydstyrken for E. kultur coli kan skaleres ned til 5 ml. Mere udgangsmateriale (større mængder kultur) er påkrævet for nogle bakteriearter fordi hydrolyser trin, der frigiver lipid A fra hele LPS er mindre effektiv. For eksempel organismer, der indeholder en funktionel Kdo dioxygenase eller Kdo kinase udviser nedsat lipid A udbytter efter mild syrehydrolyse 39.. Ofte mutanter med ændrede LPS / lipid A-strukturer eller en særlig bakteriearter er ofte vanskelige at pelletere under cellehøst. For disse stammer kan længden af ​​centrifugering udvides til at forøge udbyttet. Også at bemærke, efter cellelyse i en enfaset Bligh-Dyer blandingen og LPS bundfældes (se trin 1.9), kan der kræves yderligere vaske skridt til at reducere phospholipid forurening. Ved isolering af lipid A fra E. coli eller Salmonella, kun én vask påkrævet. Men hvis isolere lipid A fra andre organismer (fx V. cholerae eller Helicobacter pylori), der er behov for yderligere vasketrin.

Efter mild syre hydrolyse i SDS, udbyttet af lipid en art med reduceret hydrofobicitet (dvs. mere phosphate grupper> 2 eller færre acylkæder <5) kan forbedres ved anvendelse af en sur Bligh-Dyer-ekstraktion. For de anvendte mængder i protokol punkt 1, tilsættes 225 pi koncentreret HCI til SDS-opløsning indeholdende hydrolyseret lipid A efterfulgt af 30 ml chloroform og 30 ml methanol i en tofaset Bligh-Dyer blanding af chloroform: methanol: 0,1 M HCI (2:2:1.8, v / v). For de anvendte mængder i protokol afsnit 6 tilsættes 15 ul koncentreret HCI til SDS-opløsning indeholdende hydrolyseret lipid A efterfulgt af 2 ml chloroform og 2 ml methanol, hvilket gav et chloroform: methanol: 0,1 M HCI (2:2:1.8 v / v) blanding. Efter en sur Bligh-Dyer udvinding, kan pyridin hvormed puljede lavere faser at neutralisere syren (1 dråbe pyridin / 2 ml endelige prøve volumen). Dette yderligere trin skal udføres inden tørring af prøven, i stinkskab. Vær forsigtig med ikke at bruge overskydende pyridin, hvilket kan føre til fjernelse af esterbundne fedtsyrer. Desuden, hvis lipid Sample er vanskelige at tørre under nitrogen tilsættes nogle ml chloroform: methanol (4:1, v / v) til kolben og fortsætter med at tørre prøven afsluttet.

Den komplekse kemiske heterogenitet af lipid A-arter observeret i nogle organismer (f.eks V. cholerae, Yersinia pseudotuberculosis) kan nogle gange gøre TLC-eller MS-baseret analyse vanskelig. Kolonnechromatografi kan anvendes opstrøms af disse analytiske teknikker til at pre-fractionate isolerede lipid A arter i mere simple blandinger. Anionbytter med diethylaminoethyl (DEAE)-cellulose er mest almindeligt anvendte 40. Som en generel retningslinje lipid En modificeret enten fosfat position, med ikke-sure grupper såsom aminoarabinose eller phosphoethanolamine, eluerer før umodificerede lipid A-arter 40. Tilsvarende tris-phosphoryleret lipid A eluerer godt efter umodificerede bisphosphorylated arter 36,40. Omvendt fase-kromatografi kan anvendes til at fraktionere lipid A species af varierende grader af hydrofobicitet 41. Søjlekromatografi er også nyttig til fjernelse af resterende SDS efter mild syrehydrolyse og efterfølgende Bligh-Dyer lipid A ekstraktionstrin. Høje niveauer af resterende SDS kan bidrage til at signalere undertrykkelse i spektre opnået ved vores følsomme ESI-MS-protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud AI064184 og AI76322 fra National Institutes of Health (NIH) og Grant 61789-MA-MUR fra hæren Research Office til MST Research blev også støttet af Welch Foundation Grant F1155 og NIH tilskud R01GM103655 til JSB

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
  2. Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
  3. Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
  4. Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
  5. Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
  7. Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
  8. Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
  9. Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
  10. Westphal, O. aJ., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
  11. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
  12. Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
  13. Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
  14. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
  15. Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
  16. Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).
  17. Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
  18. Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
  19. Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
  20. Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
  21. Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
  22. Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
  23. Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
  24. Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
  25. El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
  26. Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
  27. Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
  28. Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
  29. Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
  30. Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
  31. Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
  32. Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
  33. Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
  34. Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
  35. Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
  36. Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
  37. Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
  38. Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
  39. Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
  40. Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
  41. Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).

Tags

Kemi membranlipider Toll-lignende receptorer endotoxiner glycolipider lipopolysaccharider Lipid A Microbiology lipider lipid A Bligh-Dyer tyndtlagskromatografi (TLC) lipopolysaccharid massespektrometri Collision dissociation (CID ) Photodissociation (PD)
Isolering og kemisk karakterisering af lipid A fra gramnegative bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Henderson, J. C., O'Brien, J. P.,… More

Henderson, J. C., O'Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter