Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Analyse van vetzuurgehalte en Compositie in Microalgen

Published: October 1, 2013 doi: 10.3791/50628
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1Bioprocess Engineering, Wageningen University and Research Center, 2AlgaePARC, Wageningen University and Research Center, 3Food and Biobased Research, Wageningen University and Research Center

Summary

Werkwijze voor de bepaling van vetzuren en samenstelling microalgen gebaseerd op mechanische celdisruptie, oplosmiddelhoudende vetextractie, verestering en kwantificatie en identificatie van vetzuren met gaschromatografie wordt beschreven. Een tripentadecanoin interne standaard wordt gebruikt ter compensatie van eventuele verliezen bij de winning en onvolledige omestering.

Abstract

Werkwijze om het gehalte en de samenstelling van de totale vetzuren in microalgen bepalen wordt beschreven. Vetzuren zijn een hoofdbestanddeel van microalgen biomassa. Deze vetzuren kunnen aanwezig zijn in verschillende acyl-lipiden klassen. Vooral de vetzuren in triacylglycerol (TAG) zijn commercieel belang, omdat ze kunnen worden gebruikt voor de productie van transportbrandstoffen, bulkchemicaliën, nutraceuticals (ω-3 vetzuren) en levensmiddelen. Naar commerciële toepassingen ontwikkelen, zijn betrouwbare analytische methoden voor het kwantificeren van vetzuurgehalte en samenstelling nodig. Microalgen enkele cellen omgeven door een starre celwand. Een vetzuuranalyse principe voldoende celdisruptie aan alle acyl lipiden en extractieprocedure gebruikt moeten kunnen alle acyl lipideklassen extraheren bevrijden.

Met de hier gepresenteerde methode alle vetzuren in microalgen kan nauwkeurig en reproduceerbaar zijn idenficeerd en gekwantificeerd met behulp van kleine hoeveelheden monster (5 mg) onafhankelijk van de ketenlengte, graad van onverzadigdheid of de lipide klasse ze deel uitmaken.

Deze werkwijze geeft geen informatie over de relatieve abundantie van de verschillende lipide klassen, maar kan worden uitgebreid tot lipide klassen van elkaar te scheiden.

De methode is gebaseerd op een reeks van mechanische celdisruptie, op basis van oplosmiddelen vetextractie, verestering van vetzuren aan vetzuurmethylesters (Bekendheid), en kwantificering en identificatie van Fames gebruik van gaschromatografie (GC-FID). Een TAG interne standaard (tripentadecanoin) wordt voorafgaand aan de analytische procedure toegevoegd om te corrigeren voor verliezen bij de winning en onvolledige transveresteringsreactie.

Introduction

Vetzuren zijn een van de belangrijkste bestanddelen van microalgen biomassa en maken doorgaans tussen 5-50% van de cel drooggewicht 1-3. Ze zijn voornamelijk aanwezig in de vorm van glycerolipids. Deze glycerolipids op hun beurt bestaan ​​voornamelijk uit fosfolipiden, glycolipiden en triacylglycerol (TAG). Vooral de vetzuren aanwezig in TAG zijn commercieel belang, omdat ze kunnen worden gebruikt als een bron voor de productie van transportbrandstoffen, bulkchemicaliën, nutraceuticals (ω-3 vetzuren), en voedselproducten 3-6. Microalgen kunnen groeien in zeewater gebaseerd teelt media, kan een veel hogere productie realiseren dan landplanten hebben, en kan in fotobioreactoren worden geteeld op locaties die niet geschikt zijn voor de landbouw zijn, mogelijk zelfs uit de kust. Daarom worden microalgen vaak beschouwd als een veelbelovend alternatief voor terrestrische gewassen voor de productie van biodiesel en andere bulkproducten 3-6. Potentieel geen agrarische len of zoet water (wanneer gekweekt in gesloten fotobioreactoren of wanneer mariene microalgen worden gebruikt) is nodig voor de productie ervan. Daarom worden biobrandstoffen afkomstig van microalgen als 3 e generatie biobrandstoffen.

De totale cellulaire gehalte aan vetzuren (% droog gewicht), de lipide klasse samenstelling, alsmede het vetzuur duur en mate van verzadiging zijn zeer variabel tussen algen soorten. Bovendien, deze eigenschappen variëren kweekomstandigheden zoals nutriëntbeschikbaarheid, temperatuur, pH en lichtintensiteit 1,2. Bijvoorbeeld, wanneer blootgesteld aan stikstof honger, kan microalgen accumuleren grote hoeveelheden TAG. Onder optimale groeiomstandigheden TAG vormt typisch minder dan 2% drooggewicht, maar bij blootstelling aan stikstoftekort TAG inhoud kan oplopen tot 40% van de microalgen droog gewicht 1.

Microalgen produceren voornamelijk vetzuren met een ketenlengte van 16 en 18koolstofatomen, maar sommige soorten kunnen vetzuren tot 24 koolstofatomen lang maken. Zowel verzadigde als sterk onverzadigde vetzuren worden geproduceerd door microalgen. De laatste omvatten vetzuren met voedingswaarde (ω-3 vetzuren) als C20: 5 (eicosapentaeenzuur, EPA) en C22: 6 (docosahexaeenzuur, DHA) waarvoor geen plantaardige alternatieven bestaan ​​1,2,4,7. De (verdeling van) vetzuur ketenlengte en mate van verzadiging bepaalt ook de eigenschappen en kwaliteit van algen afgeleide biobrandstoffen en eetbare oliën 4,8.

Naar commerciële toepassingen van microalgen afgeleide vetzuren ontwikkelen, zijn betrouwbare analytische methoden voor het kwantificeren van vetzuurgehalte en samenstelling nodig.

Zoals ook opgemerkt door Ryckebosch et al.. 9, analyse van vetzuren in microalgen onderscheidt zich van andere substraten (bv. plantaardige olie, voedsel, dierlijk weefsel enz.) zijnveroorzaken 1) microalgen afzonderlijke cellen omgeven door rigide celwand, bemoeilijkt vetextractie, 2) algen bevatten een grote verscheidenheid van lipide klassen en het lipide klasseverdeling is zeer variabel 7. Deze verschillende lipide klassen sterk uiteenlopende chemische structuur en eigenschappen zoals polariteit. Ook andere dan acyl lipiden lipide klassen worden vervaardigd; 3) algen bevatten een grote verscheidenheid aan vetzuren, variërend 12-24 koolstofatomen lang en met zowel verzadigde als sterk onverzadigde vetzuren. Daarom ontwikkelde methoden vetzuren analyseren dan microalgen substraten, misschien geschikt vetzuren analyseren microalgen.

Zoals beoordeeld door Ryckebosch et al.. 9, het belangrijkste verschil tussen gebruikte lipide extractie procedures in het oplosmiddel-systemen worden gebruikt. Vanwege de grote variëteit aan lipide klassen die in microalgen, elk verschillend in polariteit, de geëxtraheerdelipide hoeveelheid zal variëren met de gebruikte oplosmiddelen 10-12. Dit leidt tot de inconsistenties in het vetgehalte en de samenstelling die in de literatuur 9,10. Afhankelijk van het oplosmiddelsysteem gebruikte methoden op basis oplosmiddelextractie zonder celdisruptie door bijvoorbeeld kralen kloppen of sonicatie, misschien niet extract alle lipiden door de stijve constructie van bepaalde soorten microalgen 9,13. Bij onvolledige lipide extractie, kan de extractie-efficiëntie van de verschillende lipide klassen variëren 14. Dit kan ook een effect hebben op de gemeten vetzuursamenstelling, omdat de vetzuursamenstelling varieerde tussen lipideklassen 7.

De methode is gebaseerd op een reeks mechanische celdisruptie, oplosmiddelhoudende vetextractie, verestering van vetzuren naar vetzuurmethylesters (Fames) en kwantificering en identificatie van Fames middels gaschromatografie in combinatie met een vlam ionisatietie detector (GC-FID). Een interne standaard in de vorm van een triacylglycerol (tripentadecanoin) wordt voorafgaand aan de analyseprocedure toegevoegd. Eventuele verliezen bij de winning en onvolledige transveresteringsreactie kan vervolgens worden gecorrigeerd voor. De methode kan worden gebruikt om de inhoud te bepalen alsmede de samenstelling van de vetzuren aanwezig in microalgen biomassa. Alle vetzuren in verschillende acyl-lipiden klassen, waaronder opslag (TAG) en membraan lipiden (glycolipiden, fosfolipiden), worden aangetoond, geïdentificeerd en nauwkeurig en reproduceerbaar gekwantificeerd volgens deze methode met slechts kleine hoeveelheden monster (5 mg) . Deze methode geeft geen informatie over de relatieve overvloed van verschillende lipide klassen. Echter kan de werkwijze worden uitgebreid tot lipide klassen van elkaar te scheiden 1. De concentratie en vetzuursamenstelling van de verschillende lipide klassen kunnen vervolgens individueel bepaald.

In de literatuur zijn verschillende andere methodenbeschreven lipiden analyseren microalgen. Sommige methoden richten zich op de totale lipofiele componenten 15, terwijl andere methodes richten zich op de totale vetzuren 9,16. Tot deze alternatieven behoren gravimetrische bepaling van het totaal geëxtraheerde lipiden, rechtstreekse trans-verestering van vetzuren in combinatie met kwantificering met behulp van chromatografie, en kleuren van cellen met lipofiele fluorescerende kleurstoffen.

Een veelgebruikt alternatief voor kwantificatie van vetzuren middels chromatografie kwantificering van lipiden met behulp van een gravimetrische bepaling 17,18. Voordelen van een gravimetrische bepaling zijn het gebrek aan eisen voor geavanceerde en dure apparatuur zoals een gaschromatograaf, gemakkelijk om het opzetten van de procedure, vanwege de beschikbaarheid van gestandaardiseerde analytische apparatuur (bijv. Soxhlet), en een gravimetrische bepaling is minder tijdrovend dan chromatografie gebaseerde methoden. Het grote voordeel van het gebruik van chromatografie gebaseerde werkwijzen de OTHER hand dat een dergelijke methode alleen de vetzuren gemeten. Bij een gravimetrische bepaling de niet-vetzuur bevat lipiden, zoals pigmenten of steroïden, zijn ook opgenomen in de bepaling. Deze niet-vetzuur bevat lipiden kan maken een groot deel (> 50%) van de totale lipiden. Als men in het vetzuurgehalte (bijvoorbeeld voor biodiesel toepassingen) alleen geïnteresseerd, zal worden overschat als een gravimetrische bepaling wordt gebruikt. Bovendien, in een gravimetrische bepaling van de nauwkeurigheid van de analyse wordt gebruikt om het geëxtraheerde lipiden wegen bepaalt de steekproefomvang die moet worden gebruikt. Deze hoeveelheid is meestal veel meer dan hetgeen nodig bij chromatografie gebruikt. Een laatste voordeel van het gebruik van kolomchromatografie over gravimetrisch bepaald dat chromatografie geeft informaties vetzuursamenstelling.

Een ander alternatief voor onze onderhavige methode is directe omestering 16,19,20.Bij deze werkwijze lipide extractie en transesterificatie van vetzuren Bekendheid worden gecombineerd in een stap. Deze werkwijze is sneller dan een aparte extractie en verestering stap, maar deze stappen gecombineerd beperkt de oplosmiddelen die kunnen worden gebruikt voor de extractie. Dit kan een negatieve invloed extractie-efficiëntie. Een ander voordeel van een afzonderlijke lipide extractie en omestering stap is dat het zorgt voor een extra lipideklasse scheiding tussen deze stappen 1. Dit is niet mogelijk wanneer directe transesterificatie wordt gebruikt.

Andere veel gebruikte methoden om het vetgehalte van microalgen bepalen omvatten het kleuren van de biomassa lipofiele fluorescente vlekken zoals Nile rood of BODIPY en meten van de fluorescentie signaal 21,22. Een voordeel van deze werkwijzen is dat ze minder arbeidsintensief dan alternatieve methoden. Een nadeel van deze werkwijzen is dat de fluorescente respons, om verschillende redenen, variabel tussen species, teeltomstandigheden, lipideklassen en analytische procedures. Als voorbeeld, enkele van deze variaties worden veroorzaakt door verschillen in opname van de kleurstof door de microalgen. Kalibratie met een andere kwantitatieve methode is daarom noodzakelijk, bij voorkeur uitgevoerd voor alle verschillende teeltomstandigheden en groeistadia. Tenslotte is deze methode niet informaties vetzuursamenstelling leveren en minder nauwkeurig en reproduceerbaar dan chromatografie gebaseerde methoden.

De onderhavige methode is gebaseerd op de door Lamers et al.. 23 en Santos et al.. 24 werkwijze en is ook door verschillende andere auteurs 1,25-27 toegepast. Ook andere methoden zijn beschikbaar die gebaseerd zijn op dezelfde principes en kon vergelijkbare resultaten 9,28 verschaffen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

Er zijn twee alternatieve protocollen voor monstervoorbereiding opgenomen als de stappen 1.1 en 1.2. Beide methoden zijn even geschikt en geven vergelijkbare resultaten, maar als een beperkte hoeveelheid algencultuur volume beschikbaar is, wordt aanbevolen methode 1.1.

OPMERKING: Voor beide protocol bereiden twee extra bead beater buisjes volgens het gehele protocol, maar zonder toevoeging van algen hun gebruik als blanco. Zo kan pieken in de GC chromatogram verkregen door extractie van bestanddelen uit materialen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd.

1.1. Monstervoorbereiding Protocol Optie 1: Aanbevolen wanneer er een beperkte hoeveelheid algen Cultuur is beschikbaar

  1. Bepaal de algen drooggewicht concentratie (g / L) in de kweekbouillon, bijvoorbeeld zoals beschreven door Breuer et al.. 1.
  2. Breng een hoeveelheid van cultuur bouillon die 5-10 mg algen droog gewicht bevateen glazen centrifugebuis. Bereken het exacte bedrag van biomassa overgebracht met behulp van de biomassa-concentratie bepaald in stap 1.1.1.
  3. Centrifugeer 5 minuten bij 1200 x g.
  4. Gooi een deel van de bovenstaande vloeistof, laat ongeveer 0,25 ml in de buis.
  5. Resuspendeer de algen in het resterende supernatant door voorzichtig pipetteren de pellet en neer en doe de volledige celpellet een bead beater buis met behulp van een 200 ul pipet.
  6. Spoel de centrifugebuis en glazen pipet met ± 0,15 ml milliQ water en breng de oplossing aan dezelfde kraal klopper buis.
  7. Centrifuge bead beater buisjes gedurende een minuut bij het maximale toerental zodat er geen luchtbellen in de bodem van de buizen. Het is mogelijk gesloten bead beater buisjes bewaren bij -80 ° C.
  8. Lyofiliseren de bead beater buisjes met het monster. Het is mogelijk om de gesloten bead beater buisjes bewaren bij -80 ° C.

1.2. Monstervoorbereiding Protocol Optie 2

  1. Centrifugeer een onbepaalde hoeveelheid algen cultuur bouillon en gooi supernatant. Het is niet nodig om de concentratie biomassa bepalen of het gebruikte volume te meten.
  2. Meet berekent de osmolariteit van het kweekmedium met de concentratie van de belangrijkste zouten aanwezig in het kweekmedium.
  3. Was de celpellet door resuspenderen de celpellet in hetzelfde volume, zoals gebruikt in stap 1.2.1, een ammoniumformiaatoplossing die de osmolariteit van het kweekmedium benadert. Een equiosmolar ammoniumformiaatoplossing voorkomt cel lyses tijdens het wassen van de cellen.

OPMERKING: wassen van de cellen moet zouten aanwezig in het kweekmedium. Dit is vooral belangrijk voor vetzuuranalyse mariene microalgen vanwege de hoge zoutconcentraties in hun kweekmedium. Als zouten nog aanwezig zou zijn, zou dit overschatting van de hoeveelheid cel drooggewicht die later in t wordt bepaald veroorzakenzijn protocol. Ammoniumformaat wordt gebruikt om cellen te wassen omdat deze oplossing zal volledig verdampen tijdens het vriesdrogen en geen residu achter.

  1. Centrifuge algensuspensie en gooi supernatant.
  2. Lyofiliseren de celpellet.
  3. Weeg 5-10 mg gevriesdroogd microalgen poeder in een kraal klopper buis. Noteer het exacte gewicht.

2. Cel Verstoring en vetextractie

OPMERKING: Dit hoofdstuk beschrijft een uitgebreide celdisruptie procedure. Eventueel enkele cel verstoring stappen overbodig en minder uitgebreid celdisruptie kan dezelfde resultaten voor een aantal soorten microalgen of biomassa afkomstig uit bepaalde kweekomstandigheden opleveren. Dit zou de validatie voor elke specifieke situatie echter nodig. De voorgestelde sterke ontwrichting protocol wordt aangeraden als een universele methode voor alle microalgen materiaal.

  1. Weeg een exacte hoeveelheid tripentadecanoin (triacylglycerol met drie C15: 0 vetzuren) toevoegen aan een nauwkeurig bekende hoeveelheid 04:05 (v / v) chloroform: methanol. Zo de concentratie tripentadecanoin precies bekend. Streven naar een concentratie van 50 mg / L. Tripentadecanoin dient als interne standaard voor vetzuur kwantificering.
  2. Voeg 1 ml chloroform: methanol 04:05 (v / v) met tripentadecanoin elke kloppende buis (in de reagentia en apparatuur tabel). Controleer of er geen kralen die nog in de dop van de BeadBeater buis, zal dit resulteren in het lekken van de buizen. Gebruik een positieve verplaatsing pipet voor nauwkeurige toevoeging van oplosmiddelen.
  3. Kraal sloeg de bead beater buisjes 8x bij 2500 rpm gedurende 60 seconden, elke keer met een 120 sec intern tussen elk pak slaag.
  4. Breng de oplossing uit de bead beater buisjes om een ​​schone hittebestendig 15 ml glazen centrifugebuis met Teflon insert schroefdoppen. Zorg ervoor dat alle kralen overdracht van de kraal klopper buis ook.
  5. Aan wash de kraal klopper buis, voeg 1 ml chloroform: methanol 04:05 (v / v) met tripentadecanoin in de kraal klopper buis, dicht cap en meng en breng deze oplossing aan dezelfde glazen buis vanaf stap 2.4. Was het buisje driemaal (in totaal 4 ml chloroform: methanol 04:05 (v / v) bevattende tripentadecanoin wordt gebruikt per monster - 1 ml toegevoegd in stap 2.2 en 3 ml 3 wasstappen).
  6. Vortex de glazen buizen gedurende 5 seconden en ultrasone trillingen in een ultrasoonapparaat bad gedurende 10 minuten.
  7. Voeg 2,5 ml MilliQ water, bevattende 50 mM 2-amino-2-hydroxymethyl-propaan-1 ,3-diol (Tris) en 1 M NaCl, die is ingesteld op pH 7 met een HCl-oplossing. Water: dit zal een fase scheiding tussen chloroform en methanol veroorzaken. 1 M NaCl gebruikt om het evenwicht van lipiden naar de chloroformfase verbeteren.
  8. Vortex gedurende 5 sec en dan ultrasone trillingen gedurende 10 minuten.
  9. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1200 x g.
  10. Breng de gehele chloroform fase (onderste fase) om een ​​schone glazen buis met een glazen Pasteur pipette. Zorg ervoor dat alle interfase of bovenkant fase niet over te dragen.
  11. Re-extract van het monster door 1 ml chloroform om oude buis (met de methanol: water oplossing).
  12. Vortex gedurende 5 sec en dan ultrasone trillingen gedurende 10 minuten.
  13. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1200 x g.
  14. Verzamel de chloroform fase (onderste fase) met een glas Pasteur pipet en zwembad met de eerste chloroform fractie uit stap 2.10.
  15. Als de problemen zijn ervaren in het verzamelen van de hele chloroformfractie in de vorige stap, herhaal dan de stappen 2,11-2,14. Anders verder met stap 2.16.
  16. Damp het chloroform uit de buis in een stroom stikstofgas. Na deze stap monsters bij -20 ° C worden bewaard onder een atmosfeer van stikstof.

3. Transveresteringsreactie naar Fatty Acid Methyl Esters

  1. Voeg 3 ml methanol die 5% (v / v) zwavelzuur aan de buis met de gedroogde geëxtraheerde lipiden (buis aanvankelijk bevattende chloroform fractie) ensluit de buis stevig vast.
  2. Vortex gedurende 5 sec.
  3. Incubeer monsters gedurende 3 uur bij 70 ° C in een blok verwarming of waterbad. Periodiek (elke ± 30 min) zorgen ervoor dat de monsters niet kokend (veroorzaakt door een niet goed gesloten deksel) en vortex buizen. Tijdens deze reactie vetzuren worden gemethyleerd hun vetzuurmethylesters (Fames).
  4. Koel monsters tot kamertemperatuur en voeg 3 ml MilliQ water en 3 ml n-hexaan.
  5. Vortex gedurende 5 sec en meng gedurende 15 minuten met een reageerbuis rotator.
  6. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1200 x g.
  7. Verzamel 2 ml van het hexaan (bovenste) fase en zet in verse glazen buis met behulp van een glas Pasteur pipet.
  8. Voeg 2 ml MilliQ water om de verzamelde hexaanfase om het te wassen.
  9. Vortex gedurende 5 seconden en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1200 x g. Na deze stap is het mogelijk om de monsters bewaren bij -20 ° C onder stikstof gasatmosfeer (fasenscheiding niet nodig).

4. Kwantificering van Fames USing gaschromatografie

  1. Vul GC flacons met de hexaanfase (bovenste fase) met een glas Pasteur pipet.
  2. Plaats de doppen op de GC flacons. Zorg ervoor dat de doppen zijn volledig afgesloten, en kan niet worden ingeschakeld, om verdamping te voorkomen uit de flacon.
  3. Vul het GC wasoplosmiddelen (hexaan), leeg het afval flesjes, en zet monsterflesjes in auto-sampler. Voordat u de werkelijke monsters op de GC, eerste run 2 blanks met alleen hexaan op de GC.
  4. Voer de monsters op een GC-FID met een Nukol kolom (30 mx 0,53 mm x 1,0 pm). Gebruik inlaattemperatuur van 250 ° C en gebruik van helium als dragergas, druk van 81,7 kPa en split verhouding van 0,1:1, totale stroomsnelheid: 20 ml / min. FID detector temperatuur van 270 ° C met H2 stroomsnelheid van 40 ml / min, lucht stroomsnelheid van 400 ml / min en hij stroomsnelheid van 9,3 ml / min. Stel injectie volume tot 1 ul / monster. Pre-en post wassen injector met n-hexaan. Initiële oventemperatuur ingesteld op 90 ° C gedurende 0,5 minuten en daarna verhoogd with 20 ° C / min totdat een oventemperatuur van 200 ° C wordt bereikt. De oventemperatuur wordt dan gehandhaafd op 200 ° C gedurende 39 minuten. Totale looptijd is 45 minuten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een chromatogram dat is verkregen via deze werkwijze wordt getoond in figuur 1. Bekendheid worden gescheiden door de grootte en de mate van verzadiging van de kolom en protocol GC gebruikt. Kortere ketenlengte vetzuren en verzadigde vetzuren (minder dubbele bindingen) kortere retentietijden. De gebruikte GC-kolom en het protocol niet van plan om vetzuurisomeren (dezelfde ketenlengte en verzadigingsgraad, maar verschillende posities van de dubbele bindingen) te scheiden, maar dit kan worden bereikt door het gebruik van een andere GC-kolom en protocol.

De vetzuur concentratie en samenstelling kan worden berekend met de oppervlakte van de pieken GC, interne standaard concentratie (mg / L) (stap 2.1) en de hoeveelheid biomassa toegevoegd aan het monster (mg) (stap 1.1.2 en 1.2. 6, afhankelijk van monstervoorbereiding protocol werd gekozen).

De inhoud van elk vetzuur in de biomassa (mg vetzuur / g droog gewicht) bepaald b y

Vergelijking 1
Met Soort individuele FAME zoals bepaald door integratie van de GC chromatogram (figuur 1) Soort C15: 0 FAME zoals bepaald door integratie van de GC chromatogram (figuur 1);

Vergelijking 2
Met [IS] de concentratie van tripentadecanoin in chloroform: methanol, zoals bepaald in stap 2.1, MW C15: 0 FA het molecuulgewicht van de C15: 0 vetzuren (242,4 g / mol), MW C15: 0 TAG het molecuulgewicht van tripentadecanoin (765,24 g / mol);

ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50628/50628eq3.jpg "/>
Zoals bepaald door het uitvoeren van kalibratie-oplossingen op de GC, die samen uit mengsels van C15: 0 FAME en Bekendheid van alle individuele vetzuren verwacht in de steekproef, met [C15: 0 FAME in kalibratie-oplossing] de concentratie van C15: 0 FAME in de kalibratie-oplossing (mg / L); [individuele FAME in kalibratie-oplossing] de concentratie van de individuele FAME in de ijkoplossing (mg / L), en de als bepaald door integratie van de GC chromatogram van de ijkoplossing gebieden.

Het totale vetzuurgehalte kan worden berekend als de som van alle afzonderlijke vetzuren. De relatieve overvloed van elk vetzuur kan worden berekend door de concentratie van elke individuele vetzuur delen door het totale vetzuurgehalte.

De vetzuursamenstelling en de inhoud van Scenedesmus obliquus UTEX393 (Chlorophyceae) onder zowel stikstof vol en afbrekende voorwaarden isFiguur 2. Vetzuursamenstelling en inhoud worden sterk beïnvloed door stikstof honger. In S. obliquus, C16: 0 (palmitinezuur) en C18: 1 (oliezuur) zijn de twee meest voorkomende vetzuren.

De vetzuursamenstelling en de inhoud van Phaeodactylum tricornutum UTEX640 (diatomeeën) zowel onder stikstof vol en afbrekende omstandigheden worden getoond in Figuur 3. Vergelijkbaar met S. obliquus, de vetzuren en de samenstelling zijn sterk beïnvloed door stikstof honger. P. tricornutum produceert ook aanzienlijke hoeveelheden meervoudig onverzadigde vetzuren zoals C20: 5 (eicosapentaeenzuur, EPA) en lange keten vetzuren (lignocerinezuur, C24: 0) die kan worden gemeten door deze methode.

Figuur 1 < br /> Figuur 1. Vertegenwoordiger GC-FID chromatogram. Een monster afgeleid van Scenedesmus obliquus blootgesteld aan stikstof honger werd gebruikt. Alleen de eerste 20 min van het chromatogram getoond. Na 20 min werden geen pieken waargenomen in dit voorbeeld.

Figuur 2
Figuur 2. Vetzuursamenstelling (relatieve overvloed van vetzuren) van Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae) onder zowel stikstof voldoende (zwarte balken) en stikstof beroofd teeltomstandigheden (witte balken). De totale inhoud vetzuur waren 8,6 ± 0,5% en 44,7 ± 1,7% ( % van het drooggewicht) onder stikstof voldoende en stikstof beroofd teeltomstandigheden, respectievelijk. Fout balken geven de hoogste en de laagste waarde van de twee analytische herhalingen.

tent "fo: keep-together.within-page =" altijd "> Figuur 3
Figuur 3. Vetzuurcompositie (relatieve overvloed van vetzuren) van Phaeodactylum tricornutum (diatomeeën) onder zowel stikstof voldoende (zwarte balken) en stikstof beroofd teeltomstandigheden (witte balken). De totale inhoud vetzuur waren 11,7 ± 0,9% en 30,5 ± 1,1% (% van het drooggewicht) onder stikstof voldoende en stikstof beroofd teeltomstandigheden, respectievelijk. Fout balken geven de hoogste en de laagste waarde van de twee analytische herhalingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beschreven werkwijze kan worden gebruikt om de inhoud te bepalen alsmede de samenstelling van de totale vetzuren in microalgen biomassa. Vetzuren van alle lipide klassen, waaronder opslag (TAG) en membraanlipiden (fosfolipiden en glycolipiden), gedetecteerd. Alle vetzuur ketenlengtes en mate van verzadiging die in de microalgen kan worden gedetecteerd en onderscheiden. De methode is gebaseerd op mechanische celdisruptie, oplosmiddelhoudende vetextractie, verestering van vetzuren Bekendheid en kwantificering van Fames middels gaschromatografie in combinatie met een vlamionisatiedetector (GC-FID). Deze methode vereist kleine hoeveelheden monster (5 mg), nauwkeurig en reproduceerbaar kunnen worden gebruikt bij allerlei soorten microalgen. Deze methode is bedoeld voor analytische doeleinden en is speciaal ontworpen voor gebruikmaking van kleine monsterhoeveelheden. De methode is niet bedoeld opgeschaald en bij de extractie grotehoeveelheden microalgen vetzuren. Een beperking van deze methode is dat ze omslachtig en kan een paar dagen starten de procedure verkrijgen resultaten. Vooral bij procesbewaking voor industriële microalgen vetzuurproductie kan dit worden beschouwd als een beperking. Als snellere resultaten nodig zijn, kunnen ook andere opties, zoals kleuring met lipofiele fluorescente kleurstoffen zijn meer geschikt. De volgende aanbevelingen worden gedaan met betrekking tot het uitvoeren van de analytische procedure:

  1. Extractie en transverestering procedure gestandaardiseerd door een triacylglycerol (tripentadecanoin) als interne standaard. Het gebruik van een interne standaard gebruikt voor de kwantificering van Fames in monsters met gaschromatografie, maar meestal intern FAME standaard wordt gebruikt. Het wordt aanbevolen om een ​​TAG interne standaard in plaats van een FAME interne standaard te gebruiken en om deze toe te voegen voordat cel verstoring en solventextractie. Eventuele verliezen tijdens lipide extractie of onvolledige omestering kan vervolgens worden gecorrigeerd, omdat verwacht dat dergelijke schade zou ontstaan ​​aan de interne standaard. Een interne standaard worden gebruikt dat niet co-elueren met vetzuren geproduceerd door microalgen. Omdat microalgen produceren slechts vetzuren met nog koolstofgetallen, een TAG met een vetzuur met een oneven aantal koolstofatomen is een goede kandidaat. Omdat de GC-kolom en het protocol niet alleen los op ketting lengte, maar ook op het aantal dubbele bindingen, kan een verzadigde oneven genummerde vetzuur hypothetisch co-elueren met een onverzadigde zelfs genummerde vetzuur. Er wordt bevestigd dat de gebruikte interne standaard niet co-elueren met vetzuren van nature in het monster. In onze ervaring met diverse microalgen, tripentadecanoin (TAG met drie C15: 0 vetzuren) niet co-elueren met vetzuren van nature aanwezig in microalgen.
  2. Verzadigde en sterk onverzadigde vetzuren geven verschillende GC-FID respons (piekgebieden) aan ongewijzigde concentraties. Daarom normen Fames worden gebruikt voor kalibratie en bepaling van relatieve responsfactoren individuele vetzuren zoals beschreven in de representatieve resultaten sectie. Normen Fames kan ook worden gebruikt om retentietijden individuele vetzuren bepalen. Alternatief kan GC-MS worden gebruikt vetzuur identificatie.
  3. Zowel de retentietijd en de relatieve respons factor van individuele vetzuren zal veranderen met GC apparatuur leeftijd. Veelvuldig kalibreren van retentietijd en relatieve respons factor wordt daarom aanbevolen.
  4. Mechanische celdisruptie is een belangrijke stap in deze methode. Het wordt gerealiseerd door een combinatie van vriesdrogen, kralen slaan en sonicatie. Zonder cel verstoring is het mogelijk dat niet alle lipiden geëxtraheerd 9,13. Eventueel enkele cel verstoring stappen overbodig en minder uitgebreid celdisruptie (bijvoorbeeld kortere kralen slaan maal) kunnen dezelfde re opbrengstsultaten voor sommige soorten microalgen of voor biomassa afkomstig uit bepaalde teeltomstandigheden. Dit zou de validatie voor elke specifieke situatie echter nodig, dus de voorgestelde uitgebreide verstoring protocol wordt aangeraden.
  5. In de analyse wordt, zou de gebruikte oplosmiddelen componenten uit de plastic buizen en pipetpunten gebruikt halen. Deze gewonnen onderdelen kunnen interfereren met de detectie van de Bekendheid met behulp van GC-FID. Vooral, zal lange kralen-beat en hoge temperatuur tijdens kraal-beating leiden tot verontreinigende componenten. Onze ervaring is dat componenten geëxtraheerd uit de korrel-maat buizen leidt tot een aantal extra pieken in de GC-FID chromatogram, waarvan sommige overlay met algen afgeleide Bekendheid (voornamelijk verzadigde vetzuren). Wanneer de werkwijze wordt uitgevoerd zoals voorgesteld, is niet meer dan 1-2% van het totale piekoppervlak. Koeling van de kraal-beater buizen tijdens kraal-beating en het gebruik van grotere hoeveelheden biomassa per monster zal de relatieve piek verminderengebied van deze plastic afgeleide pieken. Het wordt aanbevolen om glazen pipetten en glazen buizen zoveel mogelijk door het protocol. Bovendien is het gebruik van plano's te controleren en te corrigeren voor de componenten geëxtraheerd uit kunststof, maar ook controleren en corrigeren voor verontreinigingen in bijvoorbeeld het gebruikte oplosmiddel wordt aanbevolen.
  6. Tijdens de kraal-beating proces zal zowel de kraal-klopper en de kraal-beater buizen opwarmen. Wanneer bead-slaan voor een veel langere tijd of veel hoger toerental dan in deze methode voorgesteld, wanneer geen koeling toegepast tussen, kan dit tot kookpunt van het oplosmiddel en uiteindelijk breuk van de buizen. Dit zal resulteren in een verlies van monster. In onze ervaring, deze situatie doet zich voor wanneer kraal-slaan voor meer dan 6 min bij 6000 rpm.
  7. Microalgen kan sterk onverzadigde vetzuren produceren, die gevoelig voor oxidatie zijn. Ryckebosch et al.. 9 namen geen verandering in de vetzuursamenstelling door oxidatie van onverzadigde fatty zuren tijdens de verschillende extractie procedures. Voorgesteld werd antioxidanten nature in microalgen bevei onverzadigde vetzuren tegen oxidatie. Als vermoed wordt dat oxidatie optreden, zou een mogelijkheid zijn om een ​​synthetische antioxidanten zoals butylhydroxytolueen (BHT) voeg zolang de antioxidant niet co-elueren met Bekendheid, en zolang de hoeveelheid antioxidans niet interfereert met de chromatografie 9. Om oxidatie tijdens langdurige opslag te voorkomen, wordt aanbevolen om opslag monsters bij -80 ° C onder een atmosfeer van stikstof.
  8. Lipasen aanwezig in microalgen kan mogelijk lipiden hydrolyseren in de analyse wordt en dus van invloed op de resultaten. Ryckebosch et al.. 9 vonden dat vriesdrogen inactiveert lipasen. Bovendien hoeft lipasen niet degraderen vetzuren, maar ze gewoon los te maken van de glycerol groep glycerolipids. Vandaar dat lipase-activiteit niet verstoren de gepresenteerde vetzuren acid protocol. Enzymen die deze vetzuren afbraak daad Coenzyme A geactiveerde vetzuren en het optreden van dergelijke afbraak tijdens de extractie komt dus niet waarschijnlijk. Niettemin, wanneer vermoed wordt dat enzymatische afbraak van vetzuren uit glycerolipids kunnen resultaten beïnvloeden, mogelijk zou zijn om een lipase inhibitor, zoals isopropanol voegen, mits de remmer niet interfereert met de analysemethode zelf 9.

Deze werkwijze kan worden uitgebreid naar kwantificeren en bepalen de vetzuursamenstelling van neutrale lipiden (TAG) en polaire lipiden (fosfolipiden, glycolipiden) door een vastefase-extractie (SPE) scheidingsstap van stap 2 (vetextractie) en stap 3 (transesterificatie ) zoals beschreven door bijvoorbeeld Breuer et al.. 1. Als alternatief kan een dunne laag chromatografie (TLC) stap worden gebruikt om verschillende polaire lipide klassen te scheiden, bijvoorbeeld zoals beschreven door Wang en Benning 28.

Deze werkwijze kan worden uitgebreid voor gebruik in, bijvoorbeeld, planten, dierlijk weefsel en andere micro-organismen. Vanwege de nadruk op celdisruptie Deze methode is vooral geschikt voor de analyse van vetzuren in materialen die zeer moeilijk te extraheren.

De extractie deel van de werkwijze (stap 1 en 2) kan worden gebruikt voor extractie van pigmenten en andere lipofiele componenten 23,25. De cel verstoring procedure kan worden gebruikt voor de extractie van andere bestanddelen zoals zetmeel of koolhydraten door andere oplosmiddelen (waaronder water).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Een deel van dit werk werd financieel ondersteund door het Instituut voor de Aanmoediging van Innovatie door Wetenschap en Technologie-Strategisch Basisonderzoek (IWT-SBO) project Zonlicht en BioSolar Cells. Erik Bolder en BackKim Nguyen worden bedankt voor hun bijdrage aan de optimalisering van de kraal kloppend procedure.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tripentadecanoin (C15:0 TAG) Sigma Aldrich T4257 CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Larodan
Beadbeater Bertin Technologies Precellys 24
beadbeater tubes MP Biomedicals Lysing matrix E
116914500
GC-FID Hewlett-Packer HP6871
GC column Supelco Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl Mettler Toledo MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000 Mettler Toledo C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml VWR 612-1925
glass tubes VWR SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 VWR SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps VWR SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator VWR 445-2101
Heated Evaporator/Concentrator Cole-Parmer YO-28690-25

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
  2. Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54 (4), 621-639 (2008).
  3. Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25 (3), 294-306 (2007).
  4. Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (2), 169-177 (2012).
  5. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329 (5993), 796-799 (2010).
  6. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4 (3), 287-295 (2010).
  7. Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45 (2), 160-186 (2006).
  8. Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1 (1), 20-43 (2008).
  9. Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists' Society. 89 (2), 189-198 (2011).
  10. Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84 (4), 1879-1887 (2012).
  11. Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36 (11), 1283-1287 (2001).
  12. Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71 (9), 955-959 (1994).
  13. Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, Suppl 1 ement. 75-77 (2010).
  14. Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
  15. Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100 (23), 5988-5995 (2009).
  16. Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45 (11), 1053-1060 (2010).
  17. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
  18. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  19. Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
  20. Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28 (7), 635-638 (1002).
  21. Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77 (1), 41-47 (2009).
  22. Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing "green oil" in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109 (2), 198-201 (2010).
  23. Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106 (4), 638-648 (2010).
  24. Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
  25. Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. , (2012).
  26. Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24 (2), 253-266 (2012).
  27. Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162 (1), 21-27 (2012).
  28. Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).

Tags

Environmental Sciences chemische analysetechnieken microalgen vetzuren triglyceriden lipide gaschromatografie celdisruptie
Analyse van vetzuurgehalte en Compositie in Microalgen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Breuer, G., Evers, W. A. C., de… More

Breuer, G., Evers, W. A. C., de Vree, J. H., Kleinegris, D. M. M., Martens, D. E., Wijffels, R. H., Lamers, P. P. Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae. J. Vis. Exp. (80), e50628, doi:10.3791/50628 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter