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Die Analyse der Fettsäuregehalt und Zusammensetzung in Mikroalgen

Published: October 1, 2013 doi: 10.3791/50628
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1Bioprocess Engineering, Wageningen University and Research Center, 2AlgaePARC, Wageningen University and Research Center, 3Food and Biobased Research, Wageningen University and Research Center

Summary

Ein Verfahren zur Bestimmung der Fettsäuregehalt und der Zusammensetzung in Mikroalgen anhand von mechanischen Zellaufschluss, Lösungsmittelbasis Lipidextraktion, Umesterung und die Quantifizierung und Identifizierung der Fettsäuren mittels Gaschromatographie beschrieben. Ein tripentadecanoin interner Standard verwendet wird, um für die möglichen Verluste bei der Extraktion und unvollständiger Umesterung kompensieren.

Abstract

Ein Verfahren, um den Inhalt und die Zusammensetzung der Gesamtfettsäuren in Mikroalgen enthaltenen Säuren bestimmen beschrieben. Fettsäuren sind ein Hauptbestandteil der Mikroalgenbiomasse. Diese Fettsäuren können in verschiedenen Acyl-Lipidklassen vorhanden sein. Vor allem die in Triacylglycerol (TAG) enthaltenen Fettsäuren sind von wirtschaftlichem Interesse, da sie für die Produktion von Kraftstoffen, Massenchemikalien, Nutraceuticals (ω-3-Fettsäuren) und Nahrungsmitteln verwendet werden. Um kommerzielle Anwendungen zu entwickeln, sind verlässliche Analysemethoden zur Quantifizierung der Fettsäuregehalt und Zusammensetzung benötigt. Mikroalgen sind einzelne Zellen durch eine starre Zellwand umgeben. Eine Fettsäure Analysemethode sollte ausreichend Zellaufschluss bieten alle Acyl-Lipide und das verwendete Extraktionsverfahren sollte in der Lage, alle Acyl Lipidklassen extrahieren befreien.

Mit dem hier vorgestellten Verfahren alle in Mikroalgen enthaltenen Fettsäuren können genau und reproduzierbar sein idenSCHICHT und quantifiziert mit kleinen Probenmengen (5 mg), unabhängig von ihrer Kettenlänge, Unsättigungsgrad oder der Lipidklasse sie gehören.

Diese Methode liefert keine Informationen über die relative Häufigkeit der verschiedenen Lipidklassen, kann aber verlängert, um Lipidklassen voneinander zu trennen.

Das Verfahren beruht auf einer Folge von mechanischen Zellaufschluss, Lösungsmittelbasis Lipidextraktion Umesterung von Fettsäuren zu Fettsäuremethylester (FAME) sowie die Quantifizierung und Identifizierung von FAME mit Hilfe der Gaschromatographie (GC-FID) basiert. Ein TAG internen Standard (tripentadecanoin) vor dem Analyseverfahren hinzugefügt, um Verluste während der Extraktion und unvollständige Umesterung korrigieren.

Introduction

Fettsäuren sind einer der wichtigsten Bestandteile der Mikroalgen-Biomasse und machen in der Regel zwischen 5-50% der Zelltrockengewicht 1-3. Sie sind vor allem in Form von Glycerolipide vorhanden. Diese Glycerolipiden wiederum hauptsächlich aus Phospholipiden, Glycolipiden und Triacylglycerin (TAG). Vor allem die in der TAG vorliegenden Fettsäuren von kommerziellem Interesse, weil sie als Ressource für die Produktion von Kraftstoffen, Massenchemikalien, Nutraceuticals (ω-3-Fettsäuren) und Nahrungsmittelrohstoffen 6.3 verwendet werden. Mikroalgen in Meerwasserbasis Kultivierungsmedien wachsen, kann eine viel höhere Flächenproduktivität als Landpflanzen haben und kann in Photobioreaktoren an Standorten, die für die Landwirtschaft ungeeignet sind kultiviert werden, gegebenenfalls auch offshore. Aus diesen Gründen sind Mikroalgen oft als eine vielversprechende Alternative zu terrestrischen Pflanzen für die Herstellung von Biodiesel und anderen Schüttgütern 3-6. Potenziell keine landwirtschaftliche lund oder Frischwasser (in geschlossenen Photobioreaktoren, wenn oder wenn kultiviert marine Mikroalgen verwendet werden) wird für ihre Herstellung benötigt wird. Daher werden Biokraftstoffen aus Mikroalgen als 3. Generation von Biokraftstoffen.

Die gesamte zelluläre Gehalt an Fettsäuren (% Trockengewicht) der Lipidklassenzusammensetzung sowie der Fettsäure Länge und der Grad der Sättigung sehr variabel zwischen Arten von Mikroalgen. Darüber hinaus sind diese Eigenschaften variieren mit Kultivierungsbedingungen wie Nährstoffverfügbarkeit, Temperatur, pH-Wert, und die Lichtintensität 1,2. Zum Beispiel, wenn an Stickstoffmangel ausgesetzt, Mikroalgen können große Mengen von TAG ansammeln. Unter optimalen Wachstumsbedingungen TAG stellt in der Regel weniger als 2% des Trockengewichts, aber wenn auf Stickstoffmangel TAG-Gehalt ausgesetzt sind, können bis zu 40% der Mikroalgentrockengewicht 1 zu erhöhen.

Mikroalgen produzieren hauptsächlich Fettsäuren mit Kettenlängen von 16 und 18Kohlenstoffatomen, aber einige Arten können Fettsäuren mit bis zu 24 Kohlenstoffatomen in der Länge zu machen. Sowohl gesättigte als auch hoch ungesättigte Fettsäuren werden durch Mikroalgen. Letztere sind Fettsäuren mit ernährungsphysiologischen Vorteile (ω-3-Fettsäuren), wie C20: 5 (Eicosapentaensäure, EPA) und C22: 6 (Docosahexaensäure, DHA), für die keine pflanzlichen Alternativen gibt 1,2,4,7. Die (Verteilung der)-Fettsäurekettenlänge und Sättigungsgrad bestimmt auch die Eigenschaften und die Qualität der Algen stamm Biokraftstoffe und Speiseöle 4,8.

Um kommerziellen Anwendungen der Mikroalgen abgeleitet Fettsäuren zu entwickeln, sind verlässliche Analysemethoden zur Quantifizierung der Fettsäuregehalt und Zusammensetzung benötigt.

Wie auch von Ryckebosch et al. 9 erwähnt, zeichnet sich Analyse von Fettsäuren in Mikroalgen aus anderen Substraten (zB Pflanzenöl, Nahrungsmittel, Tiergeweben etc.)Ursache 1) Mikroalgen sind einzelne Zellen durch starre Zellwand umgeben ist, verkompliziert Lipidextraktion, 2) Mikroalgen enthalten eine Vielzahl von Lipidklassen und die Lipidklassenverteilung sehr variabel 7 ist. Diese verschiedenen Lipidklassen eine Vielzahl der chemischen Struktur und Eigenschaften wie Polarität. Auch sind andere als Acyllipiden Lipidklassen hergestellt, 3) Mikroalgen enthalten eine Vielzahl von Fettsäuren, zwischen 12-24 Kohlenstoffatome in der Länge und die sowohl gesättigte als auch hoch ungesättigte Fettsäuren. Daher entwickelt, um Fettsäuren in anderen als Mikroalgen Substrate zu analysieren Methoden, vielleicht nicht geeignet, um Fettsäuren in Mikroalgen zu analysieren.

Wie durch Ryckebosch et al. 9 Bewertung ist der Hauptunterschied zwischen gängigen Lipidextraktionsverfahren in der Lösungsmittelsysteme, die verwendet werden. Aufgrund der großen Vielfalt von Mikroalgen in Gegenwart Lipidklassen, die jeweils unterschiedlicher Polarität, die extrahiertenLipid-Menge wird mit Lösungsmitteln verwendet 10-12 variieren. Dies führt zu Inkonsistenzen in der Lipidgehalt und in der Literatur vorgestellt Zusammensetzung 9,10. Abhängig von der verwendeten Lösungsmittelsystem, Verfahren auf der Basis der Lösungsmittelextraktion ohne Aufbrechen der Zellen durch beispielsweise Wulst Schlagen oder Ultraschallbehandlung, nicht wegen der starren Struktur einiger Arten von Mikroalgen 9,13 extrahieren können alle Lipide. Im Falle von unvollständigen Lipidextraktion kann die Extraktionseffizienz der verschiedenen Lipidklassen 14 variieren. Dies kann auch einen Einfluss auf das Mess Fettsäure-Zusammensetzung, da die Fettsäurezusammensetzung ist variabel zwischen Lipidklassen 7.

Unser Verfahren basiert auf einer Sequenz von mechanischen Zellaufschluss, Lösungsmittelbasis Lipidextraktion Umesterung von Fettsäuren zu Fettsäuremethylester (FAME) sowie die Quantifizierung und Identifizierung von FAME mittels Gaschromatographie in Kombination mit einem Flamm Ionisation basierendtion Detektor (GC-FID). Ein interner Standard in der Form einer Triacylglycerol (tripentadecanoin) vor dem Analyseverfahren aufgenommen. Mögliche Verluste bei der Extraktion und unvollständiger Umesterung kann dann korrigiert werden. Die Methode kann verwendet werden, um den Inhalt zu bestimmen sowie die Zusammensetzung der Mikroalgenbiomasse in vorhandenen Fettsäuren werden. Alle in den verschiedenen Acyl-Lipidklassen, einschließlich Speicher (TAG) als auch Membranlipide (Glykolipide, Phospholipide), erkannt werden, identifiziert und unter Verwendung von nur geringen Mengen an Probe (5 mg) durch dieses Verfahren genau und reproduzierbar zu quantifizieren vorliegenden Fettsäuren . Diese Methode liefert keine Informationen über die relative Häufigkeit der verschiedenen Lipidklassen. Jedoch kann das Verfahren erweitert werden, um Lipidklassen voneinander 1 zu trennen. Die Konzentration und die Fettsäurezusammensetzung der verschiedenen Lipidklassen können dann individuell bestimmt werden.

In der Literatur sind mehrere andere Methodenbeschrieben, um Lipide in Mikroalgen zu analysieren. Einige Methoden konzentrieren sich auf insgesamt 15 lipophilen Bestandteile, während andere Methoden konzentrieren sich auf Gesamtfettsäuren 9,16. Zu diesen Optionen gehören gravimetrischen Bestimmung des extrahierten Lipide, direkte Umesterung von Fettsäuren, kombiniert mit Quantifizierung mittels Chromatographie und Färben von Zellen mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoffen.

Eine häufig verwendete Alternative zur Quantifizierung von Fettsäuren mittels Chromatographie ist die Quantifizierung von Lipiden mit Hilfe eines gravimetrischen Bestimmung 17,18. Vorteile einer gravimetrischen Bestimmung sind das Fehlen von Anforderungen für fortgeschrittene und teure Ausrüstung wie ein Gaschromatograph, einfach zu, weil die Verfügbarkeit von standardisierten Analysegeräte (zB Soxhlet) einzurichten, das Verfahren, und eine gravimetrische Bestimmung ist weniger zeitaufwendig als Chromatographie basierten Verfahren. Der Hauptvorteil der Verwendung von Chromatographie basierten Verfahren auf der andeer Hand, daß bei einem solchen Verfahren nur die Fettsäuren gemessen. In einer gravimetrischen Bestimmung der Nicht-Fettsäure, Lipiden, wie Pigmente oder Steroide, werden auch in der Bestimmung enthalten. Diese nicht-Fettsäure, die Lipide bilden einen großen Anteil (> 50%) der Gesamtlipide. Wenn man nur an der Fettsäuregehalt (zB für die Biodiesel-Anwendungen) ist, wird es überbewertet, wenn eine gravimetrische Bestimmung verwendet werden. Darüber hinaus in einer gravimetrischen Bestimmung der Genauigkeit der Analysenwaage verwendet, um die extrahierten Lipide wiegen bestimmt, die Stichprobengröße, die verwendet werden muss. Diese Menge ist in der Regel weit mehr als benötigt wird, wenn die Chromatographie verwendeten Menge. Schließlich ist ein weiterer Vorteil der Verwendung von Chromatographie über gravimetrische Bestimmung, dass Chromatographie liefert Informationen über die Fettsäurezusammensetzung.

Eine weitere Alternative zu unseren vorgestellten Verfahren ist die direkte Umesterung 16,19,20.Bei diesem Verfahren wird der Lipidextraktion und Umesterung von Fettsäuren zu FAME werden in einem Schritt zusammengefasst. Dieses Verfahren ist schneller als eine separate Extraktion und Umesterung, sondern die Kombination dieser Maßnahmen begrenzt die Lösungsmittel, die zur Extraktion verwendet werden können. Dies könnte negativ beeinflussen Extraktionseffizienz. Ein weiterer Vorteil eines separaten Lipidextraktion und Umesterung ist, dass es eine zusätzliche Lipidklassentrennung zwischen diesen Schritten 1. Dies ist nicht möglich, wenn eine direkte Umesterung verwendet wird.

Andere häufig verwendete Methoden, um den Lipidgehalt in Mikroalgen gehören zu bestimmen Färbung der Biomasse mit lipophilen fluoreszierenden Flecken wie Nil rot oder BODIPY und die Messung der Fluoreszenzsignal 21,22. Ein Vorteil dieser Verfahren ist, dass sie weniger aufwendig als bei anderen Methoden. Ein Nachteil dieser Verfahren ist, daß die Fluoreszenzantwort ist, die aus verschiedenen Gründen variabel zwischen Spezies, Anbaubedingungen, Lipidklassen und analytischen Verfahren. Als ein Beispiel sind einige dieser Variationen werden durch Unterschiede in der Aufnahme des Farbstoffs durch die Mikroalgen verursacht. Kalibrierung unter Verwendung einer anderen quantitativen Verfahren ist daher erforderlich, vorzugsweise für alle unterschiedlichen Anzuchtbedingungen und Wachstumsstadien durchgeführt wird. Schließlich hat dieses Verfahren keine Information über die Fettsäurezusammensetzung und ist weniger genau und reproduzierbar als Chromatographie-basierte Verfahren.

Das vorgestellte Verfahren beruht auf der von Lamers et al. 23 und Santos et al. 24 beschriebenen Methode und wurde auch von anderen Autoren 1,25-27 angewendet. Auch andere Methoden zur Verfügung, die auf den gleichen Prinzipien basieren und könnte ähnliche Ergebnisse liefern 9,28.

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Protocol

1. Probenvorbereitung

Es gibt zwei alternative Protokolle für die Probenvorbereitung enthalten wie die Schritte 1.1 und 1.2. Beide Verfahren sind gleichermaßen geeignet und ergeben ähnliche Ergebnisse, aber, wenn eine begrenzte Menge von Algen Kulturvolumen zur Verfügung steht, ist 1,1-Methode empfohlen.

HINWEIS: Für beide Protokolle, bereiten zwei zusätzliche Kugelmühle Rohre nach die gesamte Protokoll, jedoch ohne Zugabe von Algen, um sie als eine leere verwendet werden. Auf diese Weise können Peaks im GC-Chromatogramm von der Extraktion von Komponenten aus den verwendeten Materialien identifiziert und quantifiziert werden.

1.1. Probenvorbereitung Protokoll Option 1: Empfohlen, wenn eine begrenzte Anzahl von Algenkulturen ist verfügbar

  1. Bestimmen Sie die Algentrockenmasse-Konzentration (g / L) in der Kulturbrühe, zum Beispiel wie von Breuer et al. Ein.
  2. Wird ein Volumen von Kulturbrühe, die 5-10 mg Algentrockenmasse enthält, umein Glaszentrifugenröhrchen. Berechnen Sie die genaue Menge an Biomasse überführt mit der Biomassekonzentration in Schritt 1.1.1 bestimmt.
  3. Zentrifuge 5 min bei 1.200 x g.
  4. Entsorgen Sie Teil der Überstand, lassen etwa 0,25 ml in die Röhre.
  5. Re-suspend die Algen in dem verbleibenden Überstand durch vorsichtiges Pipettieren der Pellet auf und ab und übertragen die komplette Zellpellet zu einer Kugelmühle Rohr mit einer 200 ul Pipette.
  6. Mit ± 0,15 ml Milli-Q-Wasser spülen die Zentrifugenröhrchen und Glaspipette und dann die Flüssigkeit auf die gleiche Kugelmühle Röhre.
  7. Zentrifugenröhrchen Kugelmühle für eine Minute bei Höchstdrehzahl, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Unterseite der Rohre bleiben. Es ist möglich, geschlossene Kugelmühle Röhrchen bei -80 ° C lagern
  8. Lyophilisieren die Kugelmühle Rohre mit der Probe. Es ist möglich, die geschlossene Kugelmühle Röhrchen bei -80 ° C aufbewahren

1.2. Probenvorbereitung Protokoll Option 2

  1. Zentrifugieren Sie eine unbestimmte Volumen von Algen Kulturbrühe und Überstand verwerfen. Es ist nicht notwendig, die Konzentration der Biomasse zu bestimmen oder die verwendete Volumen zu messen.
  2. Messung oder Berechnung der Osmolarität des Kulturmediums mit der Konzentration der in dem Kulturmedium vorhanden Haupt Salze.
  3. Waschen des Zellpellets durch Resuspendieren des Zellpellets in dem gleichen Volumen, wie es in Schritt 1.2.1, einer Ammoniumformiat-Lösung, die die Osmolarität des Kulturmediums annähert. Ein equiosmolar Ammoniumformiat-Lösung verhindert Zelllyse beim Waschen der Zellen.

HINWEIS: Waschen der Zellen notwendig ist, um in dem Kulturmedium enthaltenen Salze zu entfernen. Dies ist wegen der hohen Salzkonzentrationen in ihrem Kulturmedium besonders wichtig für die Fettsäureanalyse in Meeresmikroalgen. Wenn Salze immer noch vorhanden sein, würde diese Überschätzung der Höhe der Zelltrockengewicht, die später in t festgelegt wird dazu führen,seinem Protokoll. Ammoniumformiat wird verwendet, um Zellen zu waschen, weil diese Lösung vollständig während der Gefriertrocknung zu verdampfen und keine Rückstände hinterlassen.

  1. Centrifuge Algensuspension und Ablagestand.
  2. Lyophilisieren das Zellpellet.
  3. Wiegen 5-10 mg gefriergetrocknete Mikroalgen Pulver in eine Kugelmühle Röhre. Nehmen Sie das genaue Gewicht.

2. Zellaufschluss und Lipidextraktion

HINWEIS: Dieser Abschnitt wird eine ausgedehnte Zellaufschluss Verfahren. Möglicherweise sind einige der Zellaufschluss Schritte redundante und weniger umfangreiche Zellaufschluss vielleicht die gleichen Ergebnisse für einige Arten von Mikroalgen oder für Biomasse aus bestimmten Anbaubedingungen abgeleitet ergeben. Dies würde Validierung für die jeweilige Situation müssen jedoch. Deshalb ist die vorgeschlagene umfangreiche Störung Protokoll als universelle Methode eignet sich für alle Mikroalgenmaterial empfohlen.

  1. Wiegen eine exakte Menge an tripentadecanoin (triacylglycerol mit drei C15: 0-Fettsäuren) und es auf einen genau bekannten Menge 4:5 (v / v) Chloroform hinzu: Methanol. Auf diese Weise wird die Konzentration der tripentadecanoin genau bekannt ist. Ziel für eine Konzentration von 50 mg / L. Tripentadecanoin dient als interner Standard für die Quantifizierung Fettsäure.
  2. 1 ml Chloroform: Methanol 04.05 (v / v) enthält tripentadecanoin jedem Schlagen Rohr (in den Reagenzien und Ausrüstung Tabelle). Überprüfen Sie, dass es keine Perlen im Inneren der Kappe des BeadBeater Rohr bleibt, wird dies in der undichten Rohre führen. Verwenden Sie eine positive Verschiebung Pipette für genaue Zusatz von Lösemitteln.
  3. Bead schlugen die Kugelmühle Röhrchen bei 2500 min-8x für 60 Sekunden, jedes Mal mit einem internen 120 Sekunden zwischen jeder schlagen.
  4. Die Lösung wird von den Kugelmühle Rohre zu einer sauberen hitzebeständig 15 ml Glaszentrifugenröhrchen mit Teflon-Einsatz Schraubverschlüsse. Seien Sie sicher, alle Perlen aus der Kugelmühle Rohr übertragen als gut.
  5. Um warh der Kugelmühle Rohr, 1 ml Chloroform: Methanol 4.05 (v / v) mit tripentadecanoin in die Kugelmühle Rohr, in der Nähe Kappe und mischen, und übertragen Sie diese Lösung auf die gleiche Glasrohr von Schritt 2.4. Dreimaliges Waschen der Röhre (insgesamt 4 ml Chloroform: Methanol 04.05 (v / v) enthält tripentadecanoin pro Probe verwendet - 1 ml in Schritt 2.2 zugegeben und 3 ml für 3 Waschschritte).
  6. Vortex die Glasröhren für 5 Sekunden und beschallen in einem Ultraschallbad für 10 min.
  7. In 2,5 ml MilliQ-Wasser, das 50 mM 2-Amino-2-hydroxymethyl-propan-1 ,3-diol (Tris) und 1 M NaCl, pH 7, die mit einem HCl-Lösung eingestellt. Dies führt zu einer Phasentrennung zwischen Chloroform und Methanol: Wasser. 1 M NaCl verwendet wird, um das Gleichgewicht von Lipiden zu der Chloroform-Phase zu verbessern.
  8. Vortex für 5 Sekunden und dann für 10 Minuten beschallen.
  9. Zentrifuge für 5 min bei 1.200 x g.
  10. Übertragen Sie das gesamte Chloroform-Phase (untere Phase) auf eine saubere Glasrohr mit einem Glas-Pasteur pipettE. Stellen Sie sicher, keine Interphase oder oberen Phase zu übertragen.
  11. Re-wird die Probe durch Zugabe von 1 ml Chloroform alte Röhre (die das Methanol: Wasser-Lösung).
  12. Vortex für 5 Sekunden und dann für 10 Minuten beschallen.
  13. Zentrifuge für 5 min bei 1.200 x g.
  14. Sammeln Sie die Chloroform-Phase (untere Phase) mit einer Glaspasteurpipette und Pool mit der ersten Chloroform-Fraktion aus Schritt 2.10.
  15. Wenn Schwierigkeiten bei der Erhebung der gesamten Chloroform-Fraktion in der vorherigen Schritt erfahren, wiederholen Sie die Schritte von 2,11 bis 2,14. Ansonsten mit Schritt 2.16 fortfahren.
  16. Verdampfe das Chloroform aus dem Rohr in einem Stickstoffgasstrom. Nach diesem Schritt können die Proben bei -20 ° C unter einer Stickstoffatmosphäre gelagert werden.

3. Umesterung zu Fettsäuremethylester

  1. 3 ml Methanol, das 5% (v / v) Schwefelsäure zu der Entnahme des getrockneten extrahierten Lipide (Rohr ursprünglich die Chloroformfraktion enthält) undschließen Sie das Rohr fest.
  2. Rührers 5 Sekunden.
  3. Proben für 3 h Inkubation bei 70 ° C in einem Heizblock oder Wasserbad. In regelmäßigen Abständen (jeden ± 30 min) sicherzustellen, dass die Proben nicht Sieden (durch ein nicht ordnungsgemäß geschlossenen Deckel verursacht) und Wirbelrohren. Während dieser Reaktion Fettsäuren, ihre Fettsäuremethylester (FAME) methyliert.
  4. Coole Proben auf Raumtemperatur und 3 ml MilliQ Wasser und 3 ml n-Hexan.
  5. Vortex für 5 Sekunden und mischen Sie für 15 Minuten mit einem Reagenzglas-Rotator.
  6. Zentrifuge für 5 min bei 1.200 x g.
  7. Sammeln Sie 2 ml Hexan (oben) Phase und in frischem Glasrohr setzen mit einer Glaspasteurpipette.
  8. 2 ml MilliQ Wasser auf die gesammelten Hexan-Phase, es zu waschen.
  9. Rührers 5 Sekunden und Zentrifuge für 5 min bei 1.200 x g. Nach diesem Schritt ist es möglich, die Proben bei -20 ° C unter Stickstoffgasatmosphäre (Phasentrennung nicht erforderlich) speichern.

4. Quantifizierung der FAME Usingen Gaschromatographie

  1. Füllen GC-Vials mit dem Hexan-Phase (obere Phase) mit einer Glaspasteurpipette.
  2. Setzen Sie die Kappen auf den GC-Vials. Stellen Sie sicher, dass die Kappen sind vollständig versiegelt und kann nicht eingeschaltet werden, um die Verdampfung aus dem Fläschchen zu verhindern.
  3. Füllen Sie die GC Wasch Lösungsmittel (Hexan), leeren die Abfall Fläschchen, und legte Probenfläschchen in Autosampler. Bevor Sie die eigentlichen Proben auf der GC, ersten Lauf zwei Rohlinge, die nur auf der GC-Hexan.
  4. Führen Sie die Proben auf einem GC-FID mit einer Nukol Säule (30 mx 0,53 mm x 1,0 um). Verwenden Eintrittstemperatur von 250 ° C und mit Helium als Trägergas, Druck von 81,7 kPa und Split-Verhältnis von 0,1:1, Gesamtdurchflussrate: 20 ml / min. FID Detektortemperatur von 270 ° C mit H 2-Flussrate von 40 ml / min Luftdurchsatz von 400 ml / min und He Flussrate von 9,3 ml / min. Eingestellt Injektionsvolumen 1 &mgr; l / Probe. Vor und nach der Wasch Injektor mit n-Hexan. Initial Ofentemperatur für 0,5 min auf 90 ° C eingestellt und hob dann with 20 ° C / min bis zu einer Ofentemperatur von 200 ° C erreicht ist. Ofentemperatur wird dann bei 200 ° C für 39 min gehalten. Die gesamte Laufzeit beträgt 45 min.

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Representative Results

Ein typisches Chromatogramm, das durch dieses Verfahren erhalten wird, ist in Fig. 1 gezeigt. FAME werden durch Größe und Grad der Sättigung durch die GC-Säule und des verwendeten Protokolls getrennt. Kürzerer Kettenlänge Fettsäuren und gesättigte Fettsäuren (weniger Doppelbindungen) kürzere Verweilzeiten. Das verwendete GC-Säule und das Protokoll nicht beabsichtigen, Fettsäure-Isomeren (gleicher Kettenlänge und Sättigungsgrad, aber unterschiedlichen Positionen der Doppelbindungen) zu trennen, aber dies könnte durch Verwendung eines anderen GC-Säule und Protokoll erreicht werden.

Die Fettsäurekonzentration und-zusammensetzung kann mit dem Bereich der GC-Peaks, interne Standardkonzentration (mg / L) (Schritt 2.1), und die Menge der Biomasse in der Probe (mg) (Schritt 1.1.2 oder 1.2 berechnet werden. 6, je nachdem, welche Probenvorbereitungsprotokoll ausgewählt wurde).

Der Inhalt der einzelnen Fettsäuren in der Biomasse (mg Fettsäure / g Trockengewicht) ermittelt werden b y

Gleichung 1
Mit Bereich der einzelnen FAME als durch Integration der GC-Chromatogramm (Abbildung 1) bestimmt; Bereich C15: 0 FAME als durch Integration der GC-Chromatogramm (Abbildung 1) bestimmt;

Gleichung 2
Mit [IS] die Konzentration tripentadecanoin in Chloroform: Methanol-Lösung, wie in Schritt 2.1 bestimmt, MW C15: 0 FA das Molekulargewicht der C15 :0-Fettsäure (242,4 g / mol), MW C15: 0 TAG das Molekulargewicht der tripentadecanoin (765,24 g / mol);

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0 FAME und FAME aller einzelner Fettsäuren in der Probe erwartet, [C15: 0 in FAME Kalibrierlösung] die Konzentration der C15: 0 Ruf in der durch laufende Eichlösungen auf der GC, bildet aus Gemischen von C15 bestimmt Kalibrierungslösung (mg / L); [FAME in einzelnen Kalibrierungslösung] die Konzentration der einzelnen FAME in der Kalibrierungslösung (mg / L), und die Bereiche, wie durch die Integration der GC-Chromatogramm der Kalibrierungslösung bestimmt.

Der Gesamtfettsäuregehalt als die Summe aller einzelnen Fettsäuren berechnet werden. Die relative Menge jeder Fettsäure kann durch Dividieren der Konzentration jeder einzelnen Fettsäure mit der Gesamtgehalt an Fettsäuren berechnet werden.

Die Fettsäurezusammensetzung und die Inhalte der Scenedesmus obliquus UTEX393 (Chlorophyceae) sowohl unter Stickstoff voll und Abbau Bedingungenin Fig. 2 gezeigt. Die Fettsäurezusammensetzung und Inhalt sind sehr von Stickstoffmangel betroffen. In S. obliquus, C16: 0 (Palmitinsäure) und C18: 1 (Ölsäure) sind die beiden am häufigsten vorkommenden Fettsäuren.

Die Fettsäurezusammensetzung und der Inhalt der Phaeodactylum tricornutum UTEX640 (Diatomeen) sowohl unter Stickstoff angefüllt und führen Bedingungen sind in Fig. 3 gezeigt. Ähnlich wie S. obliquus, der Fettsäuregehalt und Zusammensetzung sind sehr von Stickstoffmangel betroffen. P. tricornutum erzeugt auch erhebliche Mengen an mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie C20: 5 (Eicosapentaensäure, EPA) als auch sehr langkettigen Fettsäuren (Lignocerinsäure, C24: 0), die durch dieses Verfahren detektiert werden können.

Figur 1 < br /> Abbildung 1. Vertreter GC-FID-Chromatogramm. Eine Probe von Scenedesmus obliquus abgeleitet, um Stickstoffmangel ausgesetzt wurde. Nur die ersten 20 min des Chromatogramms gezeigt. Nach 20 min wurden keine Peaks in dieser Probe festgestellt.

Figur 2
2. Die Fettsäurezusammensetzung (relative Häufigkeit von Fettsäuren) von Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae) unter beiden Stickstoff ausreichend (schwarze Balken) und Stickstoff entzogen Anbaubedingungen (weiße Balken). Die Gesamtfettsäure Inhalte waren 8,6 ± 0,5% und 44,7 ± 1,7% ( % der Trockenmasse) unter Stickstoff ausreichend und Stickstoff entzogen Anbaubedingungen auf. Fehlerbalken zeigen die höchste und niedrigste Wert von zwei analytischen Wiederholungen.

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Abbildung 3. Fettsäurezusammensetzung (relative Häufigkeit von Fettsäuren) von Phaeodactylum tricornutum (Diatomeen) sowohl unter Stickstoff ausreichend (schwarze Balken) und Stickstoff entzogen Anbaubedingungen (weiße Balken). Die Gesamtfettsäure Inhalte waren 11,7 ± 0,9% und 30,5 ± 1,1% (% Trockengewicht) unter Stickstoff ausreichend und Stickstoff entzogen Anbaubedingungen auf. Fehlerbalken zeigen die höchste und niedrigste Wert von zwei analytischen Wiederholungen.

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Discussion

Das beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um den Inhalt zu bestimmen sowie die Zusammensetzung der Gesamtfettsäuren in Mikroalgen-Biomasse vorhandenen Säuren werden. Fettsäuren von allen Lipidklassen, einschließlich Speicher (TAG) als auch Membranlipide (Phospholipide und Glycolipide) abgeleitet werden erkannt. Alle Fettsäurekettenlängen und Sättigungsgrade, die in der Mikroalgen vorhanden sind, können erkannt und unterschieden werden. Das Verfahren beruht auf mechanischen Zellaufschluss, Lösungsmittelbasis Lipidextraktion Umesterung von Fettsäuren auf FAME und Quantifizierung von FAME mittels Gaschromatographie in Kombination mit einem Flammen-Ionisations-Detektor (GC-FID) basiert. Dieses Verfahren erfordert geringe Probenmengen (5 mg), genau und reproduzierbar und kann unter einer Vielzahl von Arten von Mikroalgen verwendet werden. Dieses Verfahren soll für analytische Zwecke eingesetzt werden und ist speziell für kleine Probengrößen abgestimmt. Das Verfahren ist nicht für die vergrösserte und verwendet werden zum Extrahieren von großenMengen von Mikroalgen-Fettsäuren. Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass es umständlich ist und es kann ein paar Tage nach dem Start des Verfahrens zur Gewinnung von Ergebnissen zu nehmen. Besonders im Fall der Prozessüberwachung für die industrielle Produktion von Mikroalgen Fettsäure könnte dies als Einschränkung werden. Wenn schnellere Ergebnisse erforderlich sind, können auch andere Optionen wie Färbung mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen besser geeignet. Die folgenden Empfehlungen werden im Hinblick auf die Durchführung der analytischen Verfahren hergestellt:

  1. Extraktion und Umesterungsverfahren unter Verwendung eines Triacylglycerol (tripentadecanoin) als internen Standard standardisiert. Die Verwendung eines internen Standards wird üblicherweise für die Quantifizierung von FAME in Proben mittels Gaschromatographie verwendet, aber meistens ein FAME interner Standard verwendet. Es wird empfohlen, einen internen Standard TAG statt einer FAME internen Standard zu verwenden und es vor dem Zellaufschluss und Extraktion mit Lösungsmitteln hinzufügen. Mögliche Verluste bei der Lipid extrAktion oder unvollständige Umesterung kann dann korrigiert werden, da erwartet wird, daß ähnliche Verluste würde auf den internen Standard auf. Ein interner Standard verwendet werden soll, der nicht tut koeluieren mit durch Mikroalgen produziert Fettsäuren. Da Mikroalgen Fettsäuren produzieren nur noch mit Kohlenstoffzahlen, ist ein TAG, das eine Fettsäure mit einer ungeraden Anzahl von Kohlenstoffatomen ein guter Kandidat. Da die GC-Säule und das Protokoll nicht nur auf Kettenlänge zu trennen, sondern auch vom Grad der Ungesättigtheit kann ein gesättigter ungeradzahligen Fettsäuren hypothetisch koeluieren mit einer ungesättigten geradzahligen Fettsäuren. Es sollte bestätigt werden, dass das verwendete interne Standard nicht koeluieren mit Fettsäuren natürlich in der Probe vorhanden ist. Nach unseren Erfahrungen mit verschiedenen Mikroalgen, tripentadecanoin (TAG mit drei C15: 0 Fettsäuren) nicht koeluieren mit Fettsäuren natürlich in Mikroalgen vor.
  2. Gesättigten und mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu unterschiedlichen GC-FID-Antworten (Peakflächen) bei gleichen Konzentrationen. Daher sollten Standards der FAME für die Kalibrierung und Bestimmung der relativen Responsefaktoren der einzelnen Fettsäuren, wie in der repräsentativen Ergebnissen Abschnitt beschrieben verwendet werden. Standards von FAME kann auch zur Retentionszeiten der einzelnen Fettsäuren zu bestimmen. Alternativ kann GC-MS für Fettsäure Identifizierung verwendet werden.
  3. Sowohl die Retentionszeit und relativen Responsefaktor der einzelnen Fettsäuren mit GC Ausrüstung Alter ändern. Häufige Kalibrierung von Retentionszeit und relativen Responsefaktor wird daher empfohlen.
  4. Mechanische Zellaufschluss ist ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren. Es wird durch eine Kombination von Lyophilisierung Wulst Schlagen und Beschallung realisiert. Ohne Zellaufschluss ist es möglich, dass nicht alle Lipide extrahiert 9,13. Möglicherweise sind einige der Zellaufschluss Schritte redundante und weniger umfangreiche Zellaufschluss (zB kürzere Wulst Prügel mal) könnte das gleiche wieder ergebennisse für einige Arten von Mikroalgen oder für Biomasse aus bestimmten Anbaubedingungen abgeleitet. Dies würde Validierung für die jeweilige Situation jedoch müssen daher die vorgeschlagene umfangreiche Störung Protokoll wird empfohlen.
  5. Während der Analyseverfahren, könnten die verwendeten Lösungsmittel Komponenten aus den Kunststoffgefäße und Pipettenspitzen verwendet extrahieren. Diese extrahierten Komponenten können mit Nachweis der FAME mit GC-FID stören. Insbesondere wird noch lange Wulst-Beat Zeiten und hohe Temperatur während der Wulst-Schlagen in verunreinigenden Komponenten führen. Unsere Erfahrung ist, dass Komponenten aus den Wulst-Beat-Rohre extrahiert wird in wenigen zusätzlichen Peaks in der GC-FID-Chromatogramm, wodurch Überlagerung mit Algen FAME (vor allem die gesättigten Fettsäuren) einige. Wenn das Verfahren ausgeführt wird, wie vorgeschlagen wurde, ist diese nicht mehr als 1-2% der Gesamtpeakfläche. Kühlen der Kügelchen-beater Rohre während perlen Schlagen und mit größeren Mengen an Biomasse pro Probe werden die relativen Peak reduzierenBereich dieser Kunststoffspitzen abgeleitet. Es wird empfohlen, Glaspipetten und Glasrohre so weit wie möglich während des gesamten Protokolls. Weiterhin ist die Verwendung von Leerzeichen, um zu prüfen und zu korrigieren, die aus Kunststoffen extrahierten Komponenten, aber auch um zu prüfen und zu korrigieren Kontaminationen in beispielsweise den verwendeten Lösungsmitteln, wird empfohlen.
  6. Während der Wulst-Mahlprozess werden sowohl die Wulst-Strohleittrommel und die Wulst-beater Rohre erwärmen. Wenn Kügelchen Schlagen für eine viel längere Zeit oder viel höheren Drehzahl als in diesem Verfahren vorgeschlagen, und wenn keine Kühlung dazwischen angelegt wird, kann diese in der siedenden Lösungsmittel und schließlich Bruch der Rohre führen. Dies wird zu einem Verlust der Probe führen. Nach unserer Erfahrung tritt diese Situation, wenn Wulst-schlagen für mehr als 6 Minuten bei 6000 Umdrehungen pro Minute.
  7. Mikroalgen können hoch ungesättigten Fettsäuren produzieren, die oxidationsanfällig sein kann. Ryckebosch et al. 9 beobachtete keine Veränderung in der Fettsäurezusammensetzung durch Oxidation von ungesättigten f verursachtatty Säuren während der verschiedenen Extraktionsverfahren. Es wurde vorgeschlagen, dass Antioxidantien in natürlich vorkommenden Mikroalgen schützen diese ungesättigten Fettsäuren vor Oxidation. Wenn der Verdacht besteht, daß die Oxidation auftreten, wäre eine Möglichkeit, um ein synthetisches Antioxidans, wie Butylhydroxytoluol (BHT), solange das Antioxidationsmittel nicht koeluieren mit FAME hinzuzufügen, und solange die Menge des Antioxidans nicht stört die Chromatographie 9. Um die Oxidation während der Langzeitlagerung zu verhindern, um Proben bei -80 ° C unter einer Stickstoffgasatmosphäre zu empfehlen ist.
  8. In Mikroalgen vorhanden Lipasen hydrolysieren kann potenziell Lipide während des Analyseverfahrens und damit die Ergebnisse beeinflussen. Ryckebosch et al. 9 festgestellt, dass der Gefriertrocknung inaktiviert Lipasen. Hinzu kommt, dass nicht Lipasen Fettsäuren abbauen, sondern nur lösen sie aus der Gruppe von Glycerin Glycerolipide. Daher sollten Lipase-Aktivität nicht mit der Fett präsentiert aci störend-Protokoll. Enzyme der Fettsäureabbau wirken auf Coenzym A beteiligt aktivierten Fettsäuren und das Auftreten einer solchen Verschlechterung während der Extraktion daher nicht wahrscheinlich. Dennoch, falls es wird vermutet, dass die enzymatische Abbau von Fettsäuren von Glycerolipiden Ergebnisse beeinflussen könnten, eine Möglichkeit wäre, ein Lipase-Inhibitor, wie Isopropanol hinzugefügt, solange der Inhibitor nicht mit der analytischen Verfahren selbst 9 stören.

Dieses Verfahren kann erweitert durch Verwendung einer Festphasenextraktion (SPE) Trennschritt zwischen Schritt 2 (Lipidextraktion) und Schritt 3 (Umesterung Quantifizierung und Bestimmung der Fettsäurezusammensetzung von neutralen Lipiden (TAG) und polare Lipide (Phospholipide, Glycolipide) werden ), wie beispielsweise beschrieben Breuer et al. 1. Alternativ kann eine Dünnschicht-Chromatographie (TLC)-Schritt verwendet, um verschiedene polare Lipidklassen zu trennen, beispielsweise wie von Wang und Benning 28 beschrieben.

Dieses Verfahren kann erweitert werden, um in, beispielsweise Pflanzen, tierische Gewebe und Mikroorganismen. Aufgrund der Betonung der Zellaufschluss, ist dieses Verfahren insbesondere geeignet für die Analyse von Fettsäuren in Materialien, die sehr schwierig zu extrahieren sind.

Die Extraktion Teil des Verfahrens (Schritte 1 und 2) kann für die Extraktion von Pigmenten und anderen lipophilen Komponenten 23,25 verwendet werden. Der Zellaufschluss Verfahren könnte für die Extraktion von anderen Bestandteilen, wie Stärke oder Kohlenhydraten unter Verwendung anderer Lösungsmittelsysteme (einschließlich Wasser) verwendet werden.

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Disclosures

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Ein Teil dieser Arbeit wurde durch das Institut zur Förderung der Innovation durch Wissenschaft und Technologie-strategische Grundlagenforschung (IWT-SBO) Projekt Sonnenlicht und Biosolar Zellen unterstützt. Erik Bolder und BackKim Nguyen sind für ihren Beitrag zur Optimierung der Wulst Schlagen Verfahren anerkannt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tripentadecanoin (C15:0 TAG) Sigma Aldrich T4257 CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Larodan
Beadbeater Bertin Technologies Precellys 24
beadbeater tubes MP Biomedicals Lysing matrix E
116914500
GC-FID Hewlett-Packer HP6871
GC column Supelco Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl Mettler Toledo MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000 Mettler Toledo C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml VWR 612-1925
glass tubes VWR SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 VWR SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps VWR SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator VWR 445-2101
Heated Evaporator/Concentrator Cole-Parmer YO-28690-25

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References

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Umweltwissenschaften Chemie-Analysetechniken Mikroalgen Fettsäure Triacylglycerins- Lipid- Gas-Chromatographie Zellaufschluss
Die Analyse der Fettsäuregehalt und Zusammensetzung in Mikroalgen
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