Summary
기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출, 에스테르 교환 반응 및 정량 가스 크로마토 그래피를 사용하여 지방산의 식별에 기초하여 미세 조류의 지방산 함량 및 조성의 결정을위한 방법을 설명한다. tripentadecanoin 내부 표준 물질은 추출과 불완전 에스테르 교환시 가능한 손실을 보상하기 위해 사용된다.
Abstract
미세 조류에 존재하는 전체 지방산의 함량 및 조성을 결정하는 방법을 설명한다. 지방산은 미세 조류 바이오 매스의 주성분이다. 이러한 지방산은 다른 아실 지질 클래스에 존재할 수있다. 그들은 연료 수송, 벌크 화학 물질, 기능 식품 (ω-3 지방산), 식품 상품의 제조에 이용 될 수 있기 때문에 특히 트리 아실 글리세롤 (TAG)에 존재하는 지방산, 상업적인 관심사이다. 상용 응용 프로그램을 개발하려면, 지방산 함량과 성분의 정량화를위한 신뢰할 수있는 분석 방법이 필요합니다. 미세 조류는 단단한 세포벽에 둘러싸여 하나의 세포입니다. 지방산 분석 방법은 모두 아실 지질 및 사용한 추출 조작은 모두 아실 지질 클래스를 추출 할 수 있어야 해방 충분한 세포 분열을 제공한다.
방법은 여기에 제시된으로 미세 조류에있는 모든 지방산은 척수 문제 또는 신경관 정확하고 재현성이 될 수 있습니다tified 그들의 사슬 길이, 불포화도 또는 지질 클래스가 속하는 무관 샘플 소량 (5 mg)을 사용하여 정량.
이 방법은 다른 지질 클래스의 상대적인 풍부함에 대한 정보를 제공하지 않지만, 서로 지질 클래스를 구분하기 위해 확장 될 수있다.
방법은 기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출, 지방산 메틸 에스테르 (장의 이미지)으로 지방산의 에스테르 교환 반응 및 정량 가스 크로마토 그래피 (GC-FID)를 사용하여 장의 이미지의 식별 시퀀스에 기초한다. TAG 내부 표준 (tripentadecanoin)는 추출과 불완전 에스테르 교환시 손실을 수정하기 전에 분석 절차에 추가됩니다.
Introduction
지방산은 미세 조류 바이오 매스의 주요 성분 중 하나이며, 일반적으로 세포 건조 중량 1-3 5~50% 사이에 만들 수 있습니다. 그들은 glycerolipids의 형태로 주로 존재한다. 차례로 이러한 glycerolipids는 주로 인지질, 당지질, 및 트리 아실 글리세롤 (TAG)로 구성되어 있습니다. 그들은 연료 수송, 벌크 화학 물질, 기능 식품 (ω-3 지방산), 및 음식 재화 3-6의 제조 자원으로 이용 될 수 있기 때문에 특히 TAG 존재 지방산은 상업적 관심이다. 미세 조류는 바다 수중 재배 미디어에서 성장할 수있는 육상 식물보다 훨씬 높은 면적 생산성을 가질 수 있으며, 어쩌면 해양, 농업에 적합하지 위치에 광 바이오 반응기에서 재배 할 수있다. 이러한 이유로, 미세 조류는 종종 바이오 디젤 및 기타 벌크 제품 3-6의 생산을위한 육상 식물에 유망한 대안으로 간주됩니다. 잠재적으로 더 농업 L 없습니다및 또는 신선한 물 (폐쇄 광 바이오 반응기하거나 재배 할 때 해양 미세 조류를 사용하는)가 자신의 생산을 위해 필요합니다. 따라서, 미세 조류 유래 바이오 연료는 제 3 세대 바이오 연료로 간주됩니다.
지방산 (건조 중량 %), 지질 수준의 조성물뿐만 아니라 지방산 길이와 포화도의 전체 셀룰러 함량은 미세 조류 종 사이에서 매우 가변적이다. 또한, 이러한 속성은 영양 가용성, 온도, pH, 그리고 빛의 세기 1, 2 등의 재배 조건에 따라 달라집니다. 질소 기아에 노출 될 때, 예를 들면, 미세 조류는 TAG 대량 축적 할 수있다. 최적의 성장 조건 하에서 TAG 전형적 건조 중량의 2 % 미만을 구성하지만, 질소 기아 TAG 컨텐츠에 노출 될 경우 미세 조류 건조 중량 1의 최대 40 %까지 증가 할 수있다.
미세 조류는 주로 16 및 18의 사슬 길이를 갖는 지방산을 생산탄소수 있지만, 일부 종은 최대 24 개의 탄소 원자의 지방산을 만들 수있다. 고도 불포화 지방산은 미세 조류에 의해 생성 된 바와 둘뿐만 아니라 포화. 6 (도코 사 헥사 엔 산, DHA)에는 야채의 대안이 1,2,4,7가 존재하지 않은 : 그리고 C22 5 (EPA 에이코 사 펜타 엔 산) : 후자는 C20과 같은 영양 혜택 (ω-3 지방산)과 지방산을 포함한다. 지방산의 사슬 길이와 포화도 (배포)도 조류 유래 바이오 연료 및 식용유 4.8의 특성과 품질을 결정합니다.
미세 조류 유래 지방산의 상용 응용 프로그램을 개발하려면, 지방산 함량과 성분의 정량화를위한 신뢰할 수있는 분석 방법이 필요합니다.
로서도 Ryckebosch 외. 9 지적한, 미세 조류의 지방산의 분석 (예를 들어 식물유, 식품, 기타 동물 조직)이 될 다른 기판으로부터 자신을 구별원인 1) 미세 조류는 지질 추출 복잡해 강성 세포벽에 의해 둘러싸여 단셀 있으며 2) 미세 조류는 지질 클래스의 다양한 포함하고 지질 수준의 분포는 7 매우 가변적이다. 이러한 다양한 지질 클래스는 화학 구조와 같은 극성 등의 속성에 다양한 있습니다. 또한, 아실 지질 이외의 지질 클래스가 생성된다, 3) 미세 조류의 길이는 12-24 탄소 원자에 이르기까지 모두 포화 등의 고도의 불포화 지방산을 포함하는 지방산의 다양한 포함. 따라서, 미세 조류 이외의 기판에 지방산을 분석하기 위해 개발 된 방법은 미세 조류의 지방산을 분석하기에 적합하지 않을 수 있습니다.
Ryckebosch 외. 구함으로써 평가에 일반적으로 사용되는 지질 추출 절차 사이의 주요 차이는 사용되는 용매 시스템에있다. 때문에 미세 조류에 존재하는 지질 클래스의 많은 종류의, 각각의 극성이 다른, 추출지질의 양이 10 ~ 12 사용하는 용매에 따라 달라질 것입니다. 이것은 지질 함량 및 조성 문학 9,10 제시의 불일치로 연결됩니다. 사용 된 용매 시스템에 따라 전지를 통해 중단없이 용매 추출에 따라 방법은, 예를 들어, 구슬 박동이나 초음파, 때문에 일부 미세 조류 종 9,13의 견고한 구조의 모든 지질을 추출 할 수 있습니다. 불완전 지질 추출의 경우, 다른 지질 클래스의 추출 효율은 14 변할 수있다. 지방산 조성은 지질 클래스 7 구비 변수 때문에이 또한 측정 된 지방산 조성에 영향을 미칠 수있다.
우리의 방법은 기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출, 지방산 메틸 에스테르 (장의 이미지)으로 지방산의 에스테르 교환 및 정량화 및 불꽃 ioniza와 함께 가스 크로마토 그래피를 사용하여 장의 이미지의 식별 시퀀스에 기초기의 검출기 (GC-FID). 트리 아실 글리세롤 (tripentadecanoin)의 형태로 내부 표준이 종래의 분석 과정에 추가된다. 추출 및 불완전 에스테르 교환 반응 중에 발생 가능한 손실은 보정 할 수 있습니다. 상기 방법은 콘텐츠를 결정할뿐만 아니라, 미세 조류 바이오 매스에 존재 지방산 조성하는데 사용될 수있다. 저장 (TAG)를 포함뿐만 아니라 세포막 지질 (당지질, 인지질), 감지, 샘플 만 소량 (5 mg)을 사용하여 식별이 방법으로 정확하고 재현성있게 정량 다른 아실 지질 클래스에있는 모든 지방산 . 이 방법은 다른 지질 클래스의 상대적인 풍부함에 대한 정보를 제공하지 않는다. 그러나,이 방법은 서로 다른 (1)로부터 지질 클래스를 구분하기 위해 확장 될 수있다. 다른 지질 클래스의 농도 및 지방산 조성은 개별적으로 결정될 수있다.
문헌에 여러 가지 다른 방법이 있습니다미세 조류의 지질을 분석하는 기술. 다른 방법은 전체 지방산 9,16에 초점 반면 일부 방법은, 총 친 유성 성분 15에 초점을 맞 춥니 다. 이러한 대안은 총 추출 된 지질의 중량 측정 결정, 크로마토 그래피를 사용하여 정량과 함께 지방산의 직접 에스테르 교환 반응 및 친 유성 형광 염료로 염색 세포를 포함한다.
크로마토 그래피를 사용하여 지방산의 정량화에 일반적으로 사용되는 다른 방법은 중력 판정 17,18을 이용하여 지질의 정량화이다. 때문에 표준화 된 분석 장비 (예 슬렛)의 가용성, 프로 시저를 설정하는 용이함;; 중력 판정의 이점은 가스 크로마토 그래프와 같은 고급 및 고가의 장비에 대한 요구의 부재이며 중력 판정은 덜 시간 소모적보다는 크로마토 그래피 방법을 기반으로. OTH 크로마토 기반 방법을 사용하는 주요 장점ER 손 같은 방법 만 지방산가 측정된다는 것이다. 중력 판정 안료 또는 스테로이드와 같은 지질을 포함하는 비 - 지방산은 또한 판정에 포함된다. 이러한 비 지방산 함유 지질 총 지질의 큰 비율 (> 50 %)을 만들 수 있습니다. 하나 (바이오 디젤 애플리케이션을위한 예를 들어) 지방산 콘텐츠에만 관심이 있다면 중력 판정을 사용할 때, 과대 평가 될 것이다. 또, 중력 판정에서 추출한 지질 무게 데 분석 저울의 정확도가 사용될 필요 샘플 크기를 결정한다. 이 양은 일반적으로 크로마토 그래피를 사용할 때 필요한 양보다 훨씬 더. 마지막으로, 중력 판정상의 크로마토 그래피를 사용하는 또 다른 장점은 크로마토 그래피 지방산 조성에 대한 정보를 제공한다는 것이다.
우리의 제시 방법에 대한 또 다른 대안은 직접 에스테르 교환 16,19,20입니다.이 방법에서는 장의 이미지로 지질 추출 및 지방산의 에스테르 교환은 하나의 단계에서 결합된다. 이 방법은 별도의 추출 및 에스테르 교환 반응 단계보다 빠르지 만, 이들 단계를 조합하여 추출을 위해 사용될 수있는 용매를 제한한다. 이는 부정적인 추출 효율에 영향을 미칠 수있다. 별도의 지질 추출 및 에스테르 교환 반응 단계의 또 다른 장점은이 단계 (1) 사이 추가적인 지질 클래스 분리를 허용한다는 것이다. 직접 에스테르 교환 반응을 사용하는 경우에는 취소가 불가능합니다.
미세 조류의 지질 함량을 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 나일과 같은 친 유성 형광 얼룩 바이오 매스 염색 포함 빨간색 또는 BODIPY 및 형광 신호 (21, 22)를 측정. 이 방법의 장점은 다른 방법보다 힘든 점이다. 이러한 방법의 단점은 형광 반응은 여러 가지 이유이며, 변수 시험편 사이이다ES, 재배 조건, 지질 클래스 및 분석 절차. 예로서, 이러한 변형은 여러 미세 조류에 의해 색소의 흡수 차이에 기인한다. 다른 방법을 사용하여 정량 보정 따라서 바람직 모든 다른 배양 조건 및 성장 단계 동안 수행 필요하다. 마지막으로,이 방법은 지방산 조성에 대한 정보를 제공하고 크로마토 그래피 기반의 방법보다 정확하고 재현 할 수 없습니다.
제시된 방법은 LAMERS 외. 23 산토스 등. (24)에 의해 설명 된 방법에 근거하고 또한 다양한 다른 저자 1,25-27 의해 적용되었다. 또 다른 방법은 동일한 원리를 기반으로하는 사용할 수 있으며, 유사한 결과 9,28를 제공 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 샘플 준비
1.1 및 1.2 단계로 준비가 포함 된 샘플에 대한 두 개의 다른 프로토콜이 있습니다. 두 가지 방법 모두 동일하게 적합하고 유사한 결과를 얻을 수 있지만, 조류 배양 볼륨을 제한 금액을 사용할 수있는 경우, 방법 1.1을 권장합니다.
참고 : 프로토콜 중 하나를 들어, 전체 프로토콜에 따라 두 개의 추가 비드 비터 튜브를 준비하지만 빈으로 사용할 수 있도록 그들에게 조류를 추가하지 않고. 이러한 방식으로, 사용되는 재료의 성분의 추출시에 얻어지는 GC 크로마토 그램의 피크가 식별되고 정량화 될 수있다.
1.1. 샘플 준비 프로토콜 옵션 1 : 추천하면 조류 문화의 제한된 양의 예약이 가능
- 브루어 등으로 설명 예를 들어, 배양액의 조류 건조 중량 농도 (g / L)를 확인합니다. 1.
- 5-10 mg의 조류 건조 중량이 포함되어 배양액의 볼륨을 전송유리 원심 관. 단계 1.1.1에서 결정된 바이오 매스 농도를 사용하여 전송 바이오 매스의 정확한 금액을 계산합니다.
- 1,200 X g에서 원심 분리기 5 분.
- 상층 액의 일부를 버리고, 관 약 0.25 ㎖를 둡니다.
- 하여 나머지 상층의 조류를 일시 중지 다시 부드럽게 위아래로 펠렛을 피펫 팅과 200 μL 피펫을 사용하여 비드 비터 튜브에 완전한 세포 펠렛을 전송합니다.
- ± 0.15 ML을 MilliQ 물을 원심 분리 관 및 유리 피펫을 씻어 같은 구슬 치는 튜브에 액체를 전송합니다.
- 확인 기포가 튜브의 바닥에 남아 있도록 최대 rpm에서 일 분간 원심 분리기 비드 비터 관. 그것은 -80 ° C에서 폐쇄 비드 비터 튜브를 저장하는 것이 가능하다
- 샘플을 포함하는 비드 비터 튜브를 냉동 건조. 그것은 -80 ° C에서 폐쇄 비드 비터 튜브를 저장하는 것이 가능하다
1.2. 샘플 준비 프로토콜 옵션 2
- 조류 배양액의 확인되지 않은 볼륨을 원심 분리기 및 뜨는 폐기. 이는 미생물 농도를 결정하기 위하여 사용하거나 볼륨을 측정 할 필요가 없다.
- 측정하거나 배지에 존재하는 대부분의 염 농도를 사용하여 배양액의 삼투압을 계산한다.
- 단계 1.2.1에서 사용 된 배양 배지의 삼투압에 근사 포름산 암모늄 용액으로, 동일 체적에서 세포 펠렛을 재현 탁하여 세포 펠렛을 씻는다. equiosmolar 포름산 암모늄 용액을 세포의 세정 중에 셀 lyses 방지한다.
참고 : 세포를 세척하는 문화 매체에 존재하는 염을 제거 할 필요가있다. 이는 그들의 배지에서 높은 염농도의 해양 미세 조류의 지방산 분석을 위해 특히 중요하다. 염이 여전히 존재한다면, 이것은 나중에 t에 결정됩니다 세포 건조 중량의 양을 과대 평가를 야기자신의 프로토콜입니다. 포름산 암모늄이 솔루션은 완전히 동결 건조 중에 증발하고 잔류 물을 떠나지 않을 것이기 때문에 세포를 세척하는 데 사용됩니다.
- 원심 분리기 조류 서스펜션 및 폐기 뜨는.
- 세포 펠릿을 냉동 건조.
- 비드 비터 관에 5 ~ 10 mg의 동결 건조 된 미세 조류 분말의 무게. 정확한 무게를 기록한다.
2. 휴대 중단 및 지질 추출
참고 :이 섹션은 광범위한 세포 분열 과정을 설명합니다. 아마도, 세포 분열 단계 중 일부는 중복 덜 광범위한 세포 분열 일부 미세 조류 종 또는 특정 배양 조건 유래의 바이오 매스에 대해 동일한 결과를 얻을 수있다. 그러나 이것은 각각의 특정 상황에 대한 유효성 검사를해야합니다. 따라서 제안 된 광범위한 중단 프로토콜은 모든 미세 조류 재료에 적합한 보편적 인 방법으로 권장합니다.
- tripentadecanoin의 정확한 양 (TR 무게세 C15 포함 iacylglycerol : 0 지방산)과 4:5 (V / V) 클로로포름 정확하게 알려진 금액에 추가 : 메탄올. 이러한 방식 tripentadecanoin의 농도는 정확하게 알려져있다. 50 ㎎ / L의 농도를 목표로 Tripentadecanoin 지방산 정량 내부 표준 물질로서 기능한다.
- 추가 1 ㎖의 클로로포름 : 메탄올 4시 5분 (V / V) (시약 및 장비 표에 지정된) 각 박동 튜브에 tripentadecanoin를 포함. beadbeater 튜브의 캡 내부에 남아있는 구슬이 없음을 확인,이 관의 누수가 발생합니다. 용매의 정확한 추가를 위해 긍정적 인 변위 피펫을 사용합니다.
- 비드는 비드 비터 튜브 각 매질 간의 내부 120 초와 60 초 동안 2,500 rpm으로 각각의 시간을 8 배 이겼다.
- 테플론 삽입 스크류 캡 깨끗한 내열 15 ㎖의 유리 원심 분리기 튜브에 비드 비터 튜브에서 솔루션을 전송합니다. 뿐만 아니라 비드 비터 관에서 모든 구슬을 전송해야합니다.
- 하였다H 비드 비터 관, 추가 1 ㎖의 클로로포름 : 메탄올 4시 5분 (V / V) 비드 비터 관, 가까운 모자와 혼합하고, 2.4 단계에서 같은 유리관에이 솔루션을 전송로 tripentadecanoin 포함. (클로로포름 총 4 ㎖에 : 메탄올 4시 5분 (V / V)를 포함 tripentadecanoin은 샘플 당 사용 - 단계 2.2에 추가 1 ㎖ 3 세척 단계 3 ㎖) 관을 세 번 씻으십시오.
- 소용돌이 유리 10 분 동안 초음파 욕조에서 5 초와 초음파 처리를위한 관.
- 함유하는 50 mM, 2.5을 MilliQ 물 mL를 넣고 2 - 아미노 -2 - 히드 록시 프로판 -1,3 - 디올 (트리스) 및 HCl 용액을 사용하여 pH를 7로 설정 한 M의 NaCl,. 물이 클로로포름, 메탄올 사이의 상 분리의 원인이됩니다. 1 M의 NaCl을 클로로포름 위상쪽으로 지질의 균형을 향상시키기 위해 사용된다.
- 다음 5 초 동안 소용돌이와는 10 분 동안 초음파 처리.
- 1,200 X g에서 5 분 원심 분리기.
- 유리 파스퇴르 pipett를 사용하여 깨끗한 유리 튜브로 전체를 클로로포름 상 (하부 상)을 전송전자. 어떤 계면 또는 최고 단계를 전송하지 않도록합니다.
- (: 수용액, 메탄올을 포함) 된 튜브에 1 ㎖의 클로로포름을 추가하여 샘플을 추출하는 재.
- 다음 5 초 동안 소용돌이와는 10 분 동안 초음파 처리.
- 1,200 X g에서 5 분 원심 분리기.
- 단계 2.10에서 첫 번째 클로로포름 분획 유리 파스퇴르 피펫과 풀을 사용하여 클로로포름 단계 (아래 단계)를 수집합니다.
- 문제는 이전 단계에서 전체 클로로포름 분획을 수집 한 경험이있는 경우, 반복 2.11-2.14 단계를 반복합니다. 그렇지 않으면 단계 2.16를 진행합니다.
- 질소 기류에서 튜브에서 클로로포름을 증발. 이 단계에서 샘플은 질소 가스 분위기하에 -20 ° C에서 저장 될 수 후.
3. 지방산 메틸 에스테르로 에스테르 교환 반응
- 건조 추출 된 지질 (튜브 원래 클로로포름 분획물을 포함)를 포함하는 튜브에 5 %를 포함하는 3 ㎖의 메탄올 (V / V) 황산을 추가하고단단히 튜브를 닫습니다.
- 5 초 동안 소용돌이.
- 블록 히터 나 물을 욕조에 70 ° C에서 3 시간 동안 샘플을 품어. 주기적으로 (매 ± 30 분) 확인이 샘플은 비등 (잘못 닫힌 뚜껑에 의한)와 소용돌이 튜브되지 않습니다. 이 반응 중에 지방산들은 지방산 메틸 에스테르 (장의 이미지)로 메틸화된다.
- 차가운 실내 온도에 샘플 및 3 ㎖를 MilliQ 물 3 ㎖ n-헥산을 추가합니다.
- 5 초 동안 소용돌이와 시험관 회전기로 15 분 동안 혼합한다.
- 1,200 X g에서 5 분 원심 분리기.
- 2 헥산 (위) 상 ㎖의 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 신선한 유리관에 넣어를 수집합니다.
- 씻어 수집 헥산 상에 2 ㎖를 MilliQ 물을 추가합니다.
- 1,200 X g에서 5 분 5 초 원심 분리를위한 소용돌이. 이 단계 후에는 질소 가스 분위기 (불필요 상분리) 하에서 -20 ° C에서 샘플들을 저장하는 것이 가능하다.
4. 장의 이미지 U의 정량화노래 가스 크로마토 그래피
- 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 헥산 단계 (위 상)과 GC 작은 유리 병을 채우십시오.
- GC 작은 유리 병에 뚜껑을 놓습니다. 유리 병에서 증발을 방지하기 위해 캡이 완전히 밀봉하고, 설정 할 수 있는지 확인합니다.
- GC 세척 용제 (헥산) 리필, 폐 유리 병을 비우고, 자동 샘플러의 샘플 튜브를 넣어. GC, 첫 번째 실행 GC에서만 헥산 포함 2 공백의 실제 샘플을 실행하기 전에.
- Nukol 칼럼 (0.53 mm의 x 1.0 μm의 30 MX)와 GC-FID에 샘플을 실행합니다. 250 ° C의 입구 온도를 사용하여 캐리어 가스, 81.7 kPa의 압력과 0.1:1의 분할 비율, 총 유량으로 헬륨을 사용 : 20 ml / 분. 40 ㎖ / 분의 H 2 유량 400 ㎖ / 분의 공기 유량 및 그는 9.3 ㎖ / 분의 유속으로 270 °의 C의 FID 검출기 온도. 1 μL / 샘플로 설정 주입량. n-헥산과 사전 및 사후 세척 주입기. 초기 오븐 온도는 0.5 분 동안 90 ° C로 설정하고 재치 발생H 20 °는 C / 분 200 ° C의 오븐 온도에 도달 할 때까지. 오븐 온도는 다음 39 분 동안 200 ° C에 유지된다. 전체 실행 시간은 45 분입니다.
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Representative Results
이 과정을 통해 얻어지는 전형적인 크로마토 그램은도 1에 도시된다. 장의 이미지가 사용 된 GC 컬럼 및 프로토콜에 의해 크기와 채도의 정도에 따라 구분됩니다. 짧은 사슬 길이의 지방산 등의 포화 지방산 (닫기 이중 결합)은 짧은 체류 시간이있다. 사용 GC 컬럼 및 프로토콜 지방산 이성질체 (동일 사슬 길이 및 포화도 있지만 이중 결합의 다른 위치)를 분리하고자하지 않지만, 이것은 다른 GC 컬럼 및 프로토콜을 사용하여 달성 될 수있다.
지방산 농도와 조성은 GC 피크 면적을 내부 표준 농도 (㎎ / L) (단계 2.1) 및 샘플 (MG)에 첨가 바이오 매스의 양 (단계 1.1.2 또는 1.2를 사용하여 계산 될 수있다. 6, 샘플 준비 프로토콜)가 선택되었다 따라하는.
바이오 매스의 각각의 지방산 (MG 지방산 / g 건조 중량)의 함량은 B를 구할 수있다 와이
C15의 지역, GC 크로마토 그램의 통합 (그림 1)에 의해 결정되는 개인의 명예의 면적 : 0 FAME GC 크로마토 그램 (그림 1)의 통합에 의해 결정;
와 클로로포름 tripentadecanoin의 농도 [A] : 메탄올 용액 2.1 단계에서 결정된 바와 같이, MW C15 : 0 FA C15의 분자량 : 0 지방산 (242.4 g / 몰); MW C15 : 0 TAG는 분자량 tripentadecanoin의 (765.24 g / 몰)
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C15의 농도 : [보정 용액에 0 FAME C15] :와, 샘플에서 예상되는 모든 개별 지방산의 0 명성과 장의 이미지 : 0 명성을, GC에 교정 솔루션을 실행 C15의 혼합물 중 구성에 의해 결정 보정 용액 (㎎ / L)] [개별 교정 액 중의 FAME] 보정 용액 (㎎ / L)에서 개별 FAME의 농도와, 교정 액의 GC 크로마토 그램의 적분에 의해 결정되는 영역.
총 지방산 함량은 모든 개별 지방산의 합으로서 계산 될 수있다. 각 지방산의 상대적인 풍부함 총 지방산 함량에 의해 각 지방산의 농도를 나눔으로써 계산 될 수있다.
지방산 조성 및 모두 질소 (가) 구비에서 Scenedesmus obliquus UTEX393 (Chlorophyceae)의 내용과 조건을 고갈입니다그림 2. 지방산 조성 및 함량은 높은 질소 기아에 의해 영향을 받는다. S.에서 obliquus, C16 : 0 (팔 미트 산) 및 C18 : 0 (올레산)이 가장 풍부한 지방산이다.
지방산 조성 및 양 질소원 구비 하에서 Phaeodactylum의 tricornutum UTEX640 (규조)의 내용 및 조건을 고갈은도 3에 나타낸다. S. 유사 obliquus, 지방산 함량 및 조성은 높게 질소 기아에 의해 영향을 받는다. P. 5 (에이코 사 펜타 엔 산, EPA)뿐만 아니라 매우 긴 사슬 지방산 (리그 노 세르 산, C24 : 0)이 방법에 의해 검출 될 수의 tricornutum 또한 C20 등의 고도의 불포화 지방산의 상당한 양을 생성한다.
< BR /> 그림 1. 주제 GC-FID 크로마토. Scenedesmus obliquus 유래 질소 기아에 노출 된 시료를 사용 하였다. 만 크로마토 그램의 첫 번째 20 분이 표시됩니다. 20 분 후 더 피크는이 샘플에서 검출되지 않았다.
그림 2. 모두 질소 충분한 (검은 막대)와 질소 박탈 재배 조건 (흰색 막대)에서 Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae)의 지방산 조성 (지방산의 상대 풍부). 총 지방산의 내용은 (8.6 ± 0.5 %와 44.7 ± 1.7 %였다 질소 하에서 건조 중량의 %) 충분한 질소를 각각 재배 조건을 박탈. 오차 막대는 두 개의 분석 복제물의 최고 및 최저 값을 나타냅니다.
그림 3. 모두 질소 충분한 (검은 막대)와 질소 박탈 재배 조건 (흰색 막대)에서 Phaeodactylum의의 tricornutum (규조류)의 지방산 조성 (지방산의 상대 풍부). 총 지방산 함량은 각각 11.7 ± 0.9 %와 질소에 충분한 질소 박탈 재배 조건에서 30.5 ± 1.1 % (건조 중량 %)이었다. 오차 막대는 두 개의 분석 복제물의 최고 및 최저 값을 나타냅니다.
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Discussion
한 방법은 콘텐츠를 결정할뿐만 아니라, 미세 조류 바이오 매스에서 본 전체 지방산의 조성하는데 사용될 수있다. 저장 (TAG)를 포함뿐만 아니라 세포막 지질 (인지질 및 당지질) 모든 지질 클래스에서 파생 된 지방산, 검출된다. 미세 조류에 존재하는 모든 포화 지방산 사슬 길이와 각도를 검출하고 구별 될 수있다. 방법은 기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출 장의 이미지에 지방산의 에스테르 교환 및 불꽃 이온화 검출기 (GC-FID)와 함께 가스 크로마토 그래피를 사용하여 장의 이미지의 정량화에 기초한다. 이 방법은, 시료 (5 mg)를 적은 양을 필요로 정확하고 재현성 및 미세 조류 종의 다양한 구비 사용될 수있다. 이 방법은 분석 목적을 위해 사용되는 것으로 의도되며 구체적으로 작은 샘플 크기를 사용 맞게 조정된다. 방법은 대규모의 추출에 업 스케일링 및 사용할 수 없습니다미세 조류 지방산의 양. 이 방법의 한계는 힘든이며이 결과를 획득하는 절차를 시작 몇 일이 걸릴 수 있다는 것입니다. 특히 산업용 미세 조류 지방산 생산을위한 프로세스 모니터링의 경우 이것은 제한으로 간주 될 수있다. 빠른 결과가 필요한 경우, 같은 친 유성 형광 염료로 염색 등의 옵션이 더 적합 할 수 있습니다. 다음 권장 사항은 분석 절차를 수행과 관련하여 만들어집니다 :
- 추출 및 에스테르 교환 절차는 내부 표준 물질로서 트리 아실 글리세롤 (tripentadecanoin)를 이용하여 규격화되어있다. 내부 표준 물질의 사용은 일반적으로 가스 크로마토 그래피를 사용하여 샘플에서 장의 이미지의 정량화에 사용되지만 자주 FAME 내부 표준이 사용된다. 그것은 TAG 내부 표준보다는 FAME 내부 표준을 사용하는 세포의 분열 및 용매 추출하기 전에 추가하는 것이 좋습니다. 지질 EXTR 중에 발생 가능한 손실그것은 유사 손실 내부 표준에 발생할 것으로 기대되기 때문에, 동작 또는 불완전 에스테르 교환 반응은, 보정 될 수있다. 내부 표준 물질은 미세 조류에 의해 생성 된 지방산의 공동 용출되지 않는 것을 사용해야합니다. 미세 조류는 짝수 탄소수와 지방산을 생산하기 때문에, 탄소수 홀수 지방산을 함유 TAG는 좋은 후보이다. GC 컬럼 및 프로토콜 체인의 길이에 분리뿐만 아니라 불포화 정도에뿐만 아니라 때문에, 포화 홀수 지방산 할 수 가설 불포화 짝수 지방산과 공동 용출. 그것은 사용 된 내부 표준 샘플에 자연적으로 존재 지방산 공동 용출되지 않도록 확인해야한다. 다양한 미세 조류와 우리의 경험, tripentadecanoin (세 C15 포함 TAG : 0 지방산)는 미세 조류에 자연적으로 존재 지방산 공동 용출하지 않습니다.
- 포화 및 고도 불포화 지방산 (다른 GC-FID 응답을 제공피크 지역) 동일 농도에서. 따라서 장의 이미지의 기준은 대표적인 결과 섹션에서 설명한 바와 같이 각각의 지방산의 상대적 반응 인자의 교정 및 측정에 사용되어야한다. 장의 이미지의 기준은 또한 개별 지방산의 체류 시간을 결정하기 위하여 사용될 수있다. 다르게는, GC-MS는 지방산 식별에 이용 될 수있다.
- 머무름 시간과 각각의 지방산의 상대적 반응 인자 모두 GC 장비 연령에 따라 변화 할 것이다. 유지 시간 및 상대 반응 계수를 자주 교정 따라서 권장합니다.
- 기계 세포 분열이 방법에서 중요한 단계입니다. 그것은 동결 건조, 구슬 구타와 초음파의 조합에 의해 실현된다. 세포 파괴하지 않고는 모든 지질는 9,13를 추출하는 것이 가능하다. 아마도, 세포 분열 단계 중 일부는 (예를 들어 짧은 비드 고해 번) 동일한 재를 얻을 수있는 중복 덜 광범위한 세포 분열 아르일부 미세 조류 종 또는 특정 재배 조건에서 유래의 바이오 매스에 대한 sults. 이 그러나 각각의 특정 상황에 대한 유효성 검사를해야합니다, 따라서 제안 된 광범위한 중단 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다.
- 분석 절차를 수행하는 동안, 사용 된 용매는 사용되는 플라스틱 튜브 및 피펫 팁의 구성 요소를 추출 할 수 있습니다. 이들 추출 된 성분은 GC-FID를 이용하여 장의 이미지의 검출을 방해 할 수있다. 특히, 비드 치는 동안 긴 비드 비트 시간과 높은 온도는 부품을 오염 발생합니다. 우리의 경험은 비드 - 비트 튜브에서 추출 된 성분이 GC-FID 크로마토 그램에서 몇 가지 추가 봉우리 될 것입니다 몇 가지 조류 유래 장의 이미지 (주로 포화 지방산)과 함께하는 오버레이. 제안 된 방법을 실행하면,이 총 피크 면적의 1 ~ 2 % 이상이 결코 아니다. 비드 치는 동안 비드 비터 튜브의 냉각 및 샘플 당 바이오 매스의 더 많은 양을 사용하면 상대적으로 피크를 줄일 수이러한 플라스틱 파생 피크의 영역입니다. 그것은 프로토콜에 걸쳐 가능한 한 유리 피펫 및 유리 튜브를 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 공백의 사용을 확인하고 플라스틱에서 추출 된 구성 요소에 대한 올바른뿐만 아니라, 확인 및 예를 들어, 사용 된 용매의 오염 물질에 대한 올바른가 좋습니다.
- 비드 치는 과정에서 비드 비터와 비드 비터 관 모두가 가열됩니다. 때 더 이상 시간이나이 방법으로 제안 된 것보다 훨씬 더 높은 RPM에 대한 비드 박동, 더 냉각이 사이에 적용되지 않은 경우,이 용매의 끓는점과 튜브 결국 파열 될 수 있습니다. 이 샘플의 손실이 발생할 것입니다. 6,000 rpm에서 6 개 이상 분 비드를 제패 할 때 우리의 경험에 비추어 볼 때, 이러한 상황이 발생합니다.
- 미세 조류는 산화하는 경향이 될 수있는 고도의 불포화 지방산을 생성 할 수 있습니다. Ryckebosch 외. 9 불포화 F의 산화에 의한 지방산 조성에 변화가 관찰되지다양한 추출 과정에서 애띠 산. 이것은 자연적으로 미세 조류에서 발생하는 산화 방지제는 산화로부터 이러한 불포화 지방산을 보호하는 것이 제안되었다. 이 산화 반응이 발생할 수 있다고 추측되면, 가능성 한 항산화 장의 이미지와 공동 용출하지 않으므로 그러한 부틸 히드 록시 톨루엔 (BHT) 등의 합성 산화 방지제를 추가 할 수 있으며, 마찬가지로 긴 항산화 중고의 양을 방해하지 않는 크로마토 그래피 9. 장기간 저장시 산화를 방지하기 위해서는, 질소 가스 분위기하에 -80 ° C에 보관 샘플 추천.
- 미세 조류의 존재는 잠재적 리파제 분석 절차 동안 지질을 가수 분해하고, 따라서 결과에 영향을 줄 수있다. Ryckebosch 등. 9 동결 건조 리파제를 비활성화 것으로 나타났습니다. 또한, 리파제는 지방산을 분해하지 않지만, 그냥 glycerolipids의 글리세롤 그룹에서 그들을 분리. 따라서, 리파제 활성을 제시 지방산 ACI를 방해하지 않아야D 프로토콜입니다. 효소에 지방산 분해 행위에 관련된 효소가 추출 중에 지방산과 같은 열화의 발생을 활성화 따라서 가능성 보이지 않는다. 그럼에도 불구하고, 경우에 그것은 glycerolipids로부터 지방산의 효소 고장 가능성만큼 억제제 분석 절차 자체 (9)와 간섭하지 않는 한, 이소프로판올 등의 리파제 억제제를 추가하는 것, 결과에 영향을 줄 수 있는지 의심한다.
이 방법은 고체상 추출 단계 2 (지질 추출) 간의 (SPE) 분리 단계 및 3 단계 (에스테르 교환 반응을 이용하여 지방산 중성 지질 조성물 (TAG) 및 극성 지질 (인지질, 당지질)을 정량화하고 결정하기 위하여 확장 될 수있다 ) 예를 들어 설명한대로 브루어 등. 1. 왕 및 베닝 (28)에 의해 설명 된 대안 적으로, 박막 크로마토 그래피 (TLC) 단계는 예를 들어, 다양한 극성 지질 클래스를 분리하는데 사용될 수있다.
이 방법은 예를 들면, 사용되도록 확장 될 수있는, 식물, 동물 조직 및 기타 미생물. 때문에 세포 분열을 강조,이 방법은 추출하는 것은 매우 어려운 재료 지방산의 분석을 위해 주로 적당하다.
방법의 추출 부 (1 단계와 2 단계) 안료 및 다른 친 유성 성분 (23, 25)의 추출을 위해 사용될 수있다. 세포 분열 과정 (물을 포함한) 다른 용매 시스템을 사용하여 전분 또는 탄수화물 같은 다른 구성 요소의 추출을 위해 사용될 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품의 일부는 재정적으로 과학 기술 - 전략적 기초 연구 (IWT-SBO) 프로젝트 햇빛과 생체 태양 전지에 의한 혁신의 추진 연구소에 의해 지원되었다. 에릭 과감하고 BackKim 구엔은 비드 박동 절차의 최적화에 기여에 대한 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tripentadecanoin (C15:0 TAG) | Sigma Aldrich | T4257 | CAS Number 7370-46-9 |
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Sigma Aldrich | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Lipidox | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Larodan | ||
| Beadbeater | Bertin Technologies | Precellys 24 | |
| beadbeater tubes | MP Biomedicals | Lysing matrix E 116914500 |
|
| GC-FID | Hewlett-Packer | HP6871 | |
| GC column | Supelco | Nukol 25357 | |
| Positive displacement pipette 100-1000μl | Mettler Toledo | MR-1000 | |
| Positive displacement pipet tips C-1000 | Mettler Toledo | C-1000 | |
| Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml | VWR | 612-1925 | |
| glass tubes | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| Teflon coated screw-caps | VWR | SCERKSSR15415BY10 | |
| STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator | VWR | 445-2101 | |
| Heated Evaporator/Concentrator | Cole-Parmer | YO-28690-25 |
References
- Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
- Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54 (4), 621-639 (2008).
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25 (3), 294-306 (2007).
- Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (2), 169-177 (2012).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329 (5993), 796-799 (2010).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4 (3), 287-295 (2010).
- Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45 (2), 160-186 (2006).
- Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1 (1), 20-43 (2008).
- Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists' Society. 89 (2), 189-198 (2011).
- Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84 (4), 1879-1887 (2012).
- Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36 (11), 1283-1287 (2001).
- Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71 (9), 955-959 (1994).
- Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, Suppl 1 ement. 75-77 (2010).
- Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
- Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100 (23), 5988-5995 (2009).
- Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45 (11), 1053-1060 (2010).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
- Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28 (7), 635-638 (1002).
- Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77 (1), 41-47 (2009).
- Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing "green oil" in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109 (2), 198-201 (2010).
- Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106 (4), 638-648 (2010).
- Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
- Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. , (2012).
- Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24 (2), 253-266 (2012).
- Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162 (1), 21-27 (2012).
- Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).
