Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Analyse av Fatty Acid innhold og sammensetning i Mikroalger

Published: October 1, 2013 doi: 10.3791/50628
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1Bioprocess Engineering, Wageningen University and Research Center, 2AlgaePARC, Wageningen University and Research Center, 3Food and Biobased Research, Wageningen University and Research Center

Summary

Fremgangsmåte for bestemmelse av fettsyreinnhold og sammensetning i mikroalger basert på mekanisk celleoppbrytning, oppløsningsmiddel basert lipid ekstraksjon, transforestring, og mengdebestemmelse og identifikasjon av fettsyrer ved hjelp av gass-kromatografi, er beskrevet. En tripentadecanoin intern standard brukes til å kompensere for de mulige tap under ekstraksjon og ufullstendig transesterifiseringen.

Abstract

En fremgangsmåte for å bestemme innholdet og sammensetningen av de totale fettsyrene som er tilstede i mikroalger er beskrevet. Fettsyrer er en viktig bestanddel av microalgal biomasse. Disse fettsyrer kan være tilstede i forskjellige acyl-lipid-klasser. Spesielt de fettsyrer som er tilstede i triacylglycerol (TAG) er av kommersiell interesse, fordi de kan brukes til fremstilling av transportbrennstoffer, bulkkjemikalier, kosttilskudd (ω-3-fettsyrer) og matvarer. For å utvikle kommersielle anvendelser, er pålitelige analysemetoder for måling av fett-syreinnhold og sammensetning nødvendig. Mikroalger er enkeltceller som er omgitt av et stivt cellevegg. En fettsyre analysemetode bør gi tilstrekkelig celleoppbrytning å frigjøre alle acyl lipider og utvinning prosedyren som brukes skal være i stand til å trekke ut alle acyl lipid klasser.

Med den fremgangsmåten som presenteres her alle fettsyrene som er tilstede i mikroalger kan være nøyaktig og reproduserbart idenserte og kvantifiseres ved hjelp av små mengder av prøven (5 mg) uavhengig av deres kjedelengde, grad av umettethet, eller lipid-klasse de er en del av.

Denne metoden gir ikke informasjon om den relative overflod av forskjellige lipidklasser, men kan bli utvidet til å skille lipidklasser fra hverandre.

Fremgangsmåten er basert på en sekvens av mekanisk celleoppbrytning, oppløsningsmiddel basert lipid ekstraksjon, transforestring av fettsyrer til fettsyremetylestere (fames), og mengdebestemmelse og identifikasjon av Slike fettsyremetylestere ved hjelp av gasskromatografi (GC-FID). En TAG intern standard (tripentadecanoin) tilsettes før prosedyren analytisk å korrigere for tap under ekstraksjon og ufullstendig transesterifiseringen.

Introduction

Fettsyrer er en av de viktigste bestanddeler av microalgal biomasse og vanligvis utgjør mellom 5 til 50% av celletørrvekt 1-3. De er hovedsakelig tilstede i form av glycerolipids. Disse glycerolipids i sin tur består hovedsakelig av fosfolipider, glykolipider og triacylglycerol (TAG). Spesielt de fettsyrer som er tilstede i TAG er av kommersiell interesse, fordi de kan brukes som en kilde for fremstilling av transportbrennstoffer, bulkkjemikalier, kosttilskudd (ω-3-fettsyrer), samt matvarer 3-6. Mikroalger kan vokse i sjøvann basert dyrkingsmedier, kan ha en mye høyere arealproduktivitet enn landplanter, og kan dyrkes i fotobioreaktorer på steder som ikke er egnet for jordbruk, muligens også offshore. Av disse grunner, er mikroalger ofte betraktet som et lovende alternativ til landplanter for produksjon av biodiesel og andre bulkprodukter 3-6. Potensielt ingen landbruks log eller ferskvann (når dyrket i lukkede fotobioreaktorer og ved marine mikroalger blir brukt) som er nødvendig for deres fremstilling. Derfor er biodrivstoff avledet fra mikroalger regnet 3 rd-generasjons biodrivstoff.

Den totale cellulære innholdet av fettsyrer (% av tørrvekten), lipid-klasse sammensetning, så vel som fettsyre lengden og graden av metning er meget variabel mellom mikroalgearter. Videre har disse egenskaper varierer med dyrkningsforhold som næringsstoffer, temperatur, pH, og lysintensiteten 1,2. For eksempel, når de utsettes for nitrogen sult, kan mikroalger akkumulerer store mengder av TAG. Under optimale vekstforhold TAG utgjør vanligvis mindre enn 2% av tørrvekt, men når de utsettes for nitrogen-utsulting TAG-innhold kan øke opp til 40% av tørrvekten microalgal 1..

Mikroalger produserer hovedsakelig fettsyrer med kjedelengder på 16, og 18karbonatomer, men noen arter kan gjøre fettsyrer med opptil 24 karbonatomer i lengde. Både mettede så vel som høyt umettede fettsyrer blir produsert av mikroalger. Sistnevnte inkluderer fettsyrer med ernæringsmessige fordeler (ω-3 fettsyrer) som C20: 5 (eikosapentaensyre, EPA) og C22: 6 (dokosaheksaensyre, DHA) som det ikke vegetabilske alternativer eksistere 1,2,4,7. Den (fordeling av) fettsyre kjedelengde og grad av metning bestemmer også de egenskaper og kvalitet av alger-avledet biodrivstoff og matoljer 4,8.

For å utvikle kommersielle anvendelser av microalgal avledet fettsyrer, er pålitelige analysemetoder for kvantifisering av fettsyreinnhold og sammensetning nødvendig.

Som også påpekt av Ryckebosch et al. 9, analyse av fettsyrer i mikroalger skiller seg fra andre underlag (f.eks vegetabilsk olje, matvarer, dyr vev ol) væreforårsake 1) mikroalger er enkeltceller omgitt av stive cellevegger, som kompliserer lipid ekstraksjon, 2) mikroalger inneholde en rekke forskjellige lipidklasser, og lipid-klasse fordelingen er svært variabel 7.. Disse forskjellige lipidklasser har en bred variasjon i kjemisk struktur og egenskaper som polaritet. Dessuten er lipid annet enn acyl lipider klasser produsert, 3) mikroalger inneholde et bredt spekter av fettsyrer, som strekker seg 12 til 24 karbonatomer i lengde og inneholdende både mettede og umettede fettsyrer. Derfor er fremgangsmåter som er utviklet for å analysere fettsyrer andre enn mikroalger substrater, kanskje ikke er egnet til å analysere fettsyrer i mikroalger.

Som gjennomgått av Ryckebosch et al. 9, er den viktigste forskjellen mellom vanlig brukte lipidekstraksjonen prosedyrer i løsemiddel-systemer som benyttes. På grunn av det store utvalg av lipidklasser som er tilstede i mikroalger, som hver varierer i polaritet, den ekstrahertelipid mengden vil variere med løsemidler som brukes 10-12. Dette fører til uoverensstemmelser i lipid-innhold og sammensetning presentert i litteraturen 9,10. Avhengig av hvilket løsningsmiddelsystem som brukes, fremgangsmåter basert på løsningsmiddelekstraksjon uten celleoppbrytning ved, for eksempel, bead vibrerende eller sonikering, ikke kan trekke ut alle lipidene på grunn av den stive konstruksjon av enkelte mikroalgearter 9,13. I tilfelle av ufullstendig lipid ekstraksjon, kan ekstraksjonen effektiviteten av de forskjellige lipidklasser variere 14.. Dette kan også ha en effekt på den målte fettsyresammensetning, fordi fettsyresammensetningen er variabel mellom lipidklasser 7.

Vår fremgangsmåte er basert på en sekvens av mekanisk celleoppbrytning, oppløsningsmiddel basert lipid ekstraksjon, omestring av fettsyrer til fettsyremetylestere (fames), og kvantifisering og identifisering av Slike fettsyremetylestere ved hjelp av gasskromatografi i kombinasjon med en flamme ionizadetektor sjon (GC-FID). En intern standard i form av en triacylglycerol (tripentadecanoin) tilsettes før prosedyren analytisk. Mulige tap under ekstraksjon og ufullstendig transesterifiseringen kan da bli korrigert for. Fremgangsmåten kan brukes til å bestemme innholdet, så vel som sammensetningen av fettsyrene som er tilstede i microalgal biomasse. Alle fettsyrene som er tilstede i de forskjellige acyl-lipid klasser, herunder lagring (TAG) samt membranlipider (glykolider, fosfolipider), detekteres, identifisert og kvantifisert nøyaktig og reproduserbart ved denne metode, ved bruk av kun små mengder av prøven (5 mg) . Denne metoden gir ikke informasjon om den relative overflod av ulike lipid klasser. Imidlertid kan fremgangsmåten bli utvidet for å separere lipid-klasser av hverandre en. Konsentrasjonen og fettsyresammensetningen av de forskjellige lipidklasser kan deretter bestemmes individuelt.

I litteraturen flere andre metoder erbeskrevet for å analysere fett i mikroalger. Noen metoder fokuserer på totale lipofile komponenter 15, mens andre metoder fokuserer på totale fettsyrer 9,16. Disse alternativene omfatter gravimetrisk bestemmelse av totalt utpakkede lipider, direkte trans-forestring av fettsyrer kombinert med kvantifisering ved hjelp av kromatografi, og flekker celler med lipofile fluorescerende fargestoffer.

Et vanlig alternativ til kvantifisering av fettsyrer ved hjelp av kromatografi er kvantifisering av lipider ved hjelp av en gravimetrisk bestemmelse 17,18. Fordeler med en gravimetrisk bestemmelse er mangel på krav til avansert og kostbart utstyr som en gasskromatograf, lette å sette opp fremgangsmåte, på grunn av tilgjengeligheten av standardiserte analyseutstyr (f.eks Soxhlet), og en gravimetrisk bestemmelse er mindre tidkrevende enn kromatografi baserte metoder. Den store fordelen med å bruke kromatografi baserte metoder på otheh hånd er at ved en slik fremgangsmåte bare fettsyrene er målt. I en gravimetrisk bestemmelse av ikke-fettsyre inneholdende lipider, som pigmenter eller steroider, er også inkludert i bestemmelsen. Disse ikke-fett-syreinneholdende lipider kan utgjøre en stor andel (> 50%) av totale lipider. Hvis man bare er interessert i fettsyreinnhold (for eksempel for biodiesel anvendelser), vil den bli overestimert når en gravimetrisk bestemmelse anvendes. I tillegg, i en gravimetrisk bestemmelse av riktigheten av analysevekt anvendes for å veie de ekstraherte lipider bestemmer prøvestørrelsen som skal benyttes. Denne mengden er vanligvis mye mer enn den mengde som trengs når kromatografi anvendes. Endelig er en annen fordel med bruk av kromatografi over gravimetrisk bestemmelse er at kromatografi gir informasjon om fettsyresammensetning.

Et annet alternativ til vår presenterte metode er direkte omestring 16,19,20.I denne metoden lipid ekstraksjon og omestring av fettsyrer for å Slike fettsyremetylestere kombineres i ett trinn. Denne metode er raskere enn en separat ekstraksjon og omestring trinn, men ved å kombinere fremgangsmåten begrenser oppløsningsmidler som kan brukes for ekstraksjon. Dette kan negativt påvirke utvinning effektivitet. En annen fordel med et separat lipid ekstraksjon, og transforest trinn er at det gir mulighet for et ekstra lipid-klasse avstanden mellom disse trinnene 1. Dette er ikke mulig ved direkte omestring anvendes.

Andre vanlige metoder for å bestemme fettinnholdet i mikroalger inkluderer farging biomassen med lipofile fluorescerende flekker som Nilen rød eller BODIPY og måle fluorescens signal 21,22. En fordel ved disse metodene er at de er mindre arbeidskrevende enn alternative metoder. En ulempe med disse metodene er at den fluorescerende responsen er, av ulike grunner, variabel mellom spesies, dyrkingsforhold, lipid klasser og analytiske prosedyrer. Som et eksempel, er flere av disse variasjoner forårsaket av forskjeller i opptak av fargestoff av mikroalger. Kalibrering ved bruk av en annen kvantitativ metode er derfor nødvendig, utføres fortrinnsvis for alle de forskjellige dyrkingsbetingelser og vekststadier. Endelig, denne fremgangsmåten ikke gi informasjon om fettsyresammensetning og er mindre nøyaktig og reproduserbar enn kromatografi baserte metoder.

Den fremlagte metoden er basert på fremgangsmåten beskrevet av Lamers et al. 23 og Santos et al. 24 og har også blitt anvendt av forskjellige andre forfattere 1,25-27. Også andre metoder er tilgjengelig som er basert på de samme prinsipper og kunne gi lignende resultater 9,28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Prøvepreparering

Det er to alternative protokoller for prøveopparbeidelse inngår som steg 1,1 og 1,2. Begge metodene er like godt egnet og gir lignende resultater, men hvis en begrenset mengde alger kulturvolum er tilgjengelig, er metoden 1.1 anbefalt.

NB: For hver protokoll, forberede to ytterligere vulsten beater rør i henhold til hele protokoll, men uten tilsetning av alger for dem å bli brukt som blindprøve. På denne måten, kan toppene i kromatogrammet GC følge av ekstraksjon av komponenter fra materialer bli identifisert og kvantifisert.

1.1. Prøvepreparering Protocol Alternativ 1: Anbefalt Når en begrenset mengde av alger Kultur er Tilgjengelig

  1. Bestem alger tørrstoff-konsentrasjon (g / L) i kulturmediet, for eksempel som beskrevet av Breuer et al. 1.
  2. Overfør et volum på kultur buljong som inneholder 5-10 mg alger tørrvekt tilen glass sentrifugerør. Beregne den nøyaktige mengden av biomasse overføres med biomasse konsentrasjonen fastsatt i trinn 1.1.1.
  3. Sentrifuger i 5 min ved 1200 x g.
  4. Kast en del av den overliggende, la ca 0,25 ml i røret.
  5. Re-suspen algene i den gjenværende supernatant ved forsiktig pipettering pelleten opp og ned, og overføre den komp cellepelleten i en vulst beater røret ved hjelp av en 200 ul pipette.
  6. Skyll sentrifugerør og glass-pipette med ± 0,15 ml MilliQ vann og overføre væsken til den samme perle beater røret.
  7. Sentrifuger perle beater rør for ett minutt på maksimalt turtall for å sørge for at ingen luftbobler i bunnen av rørene. Det er mulig å lagre lukkede kule beater rør ved -80 ° C.
  8. Lyofiliser de perle beater rør som inneholder prøven. Det er mulig å lagre de lukkede kule beater rør ved -80 ° C.

1.2. Prøvepreparering Protocol Alternativ 2

  1. Sentrifuger ubestemt volum av alger kultur buljong og kast supernatanten. Det er ikke nødvendig å bestemme konsentrasjonen av biomasse, eller for å måle volumet som brukes.
  2. Måle eller beregne osmolariteten til kulturmediet ved hjelp av konsentrasjonen av de viktigste salter som er tilstede i kulturmediet.
  3. Vask cellepelleten ved å oppslemme cellepelleten i samme volum, som anvendt i trinn 1.2.1, av et ammonium-formiat-oppløsning, som tilnærmet tilsvarer osmolariteten til kulturmediet. En equiosmolar ammoniumformiat løsning hindrer celle lyserer under vasking av cellene.

MERK: Vasking av cellene som er nødvendig for å fjerne saltene som er tilstede i kulturmediet. Dette er spesielt viktig for fettsyreanalyse i marine mikroalger på grunn av den høye saltkonsentrasjoner i deres kulturmedium. Hvis salter fremdeles vil være til stede, ville dette føre til overvurdering av mengden av celletørrvekt, som vil bli bestemt senere i thans protokollen. Ammonium-formiat anvendes for å vaske cellene, fordi denne løsningen vil fullstendig fordampe under lyofiliseringen og ikke etterlate noen rester.

  1. Sentrifuger alger fjæring og kast supernatanten.
  2. Lyofiliser cellepelleten.
  3. Vei 5-10 mg lyofiliserte mikroalger pulver i en kule beater rør. Spill nøyaktig vekt.

2. Celleoppbrytning og Lipid Extraction

MERK: Denne delen beskriver en omfattende celle avbrudd prosedyre. Muligens noen av celleoppbrytning trinn er overflødig og mindre omfattende celleoppbrytning kan gi de samme resultater for enkelte mikroalgearter, eller for biomasse avledet fra visse dyrkingsforhold. Dette trenger validering for hver enkelt situasjon likevel. Derfor foreslås omfattende avbrudd protokollen er anbefalt som en universell metode som passer for alle microalgal materiale.

  1. Veie en eksakt mengde tripentadecanoin (triacylglycerol inneholdende tre C15: 0-fettsyrer) og legge den til en nøyaktig kjent mengde av 04:05 (v / v) kloroform: metanol. På denne måte kan konsentrasjonen av tripentadecanoin er nøyaktig kjent. Målet for en konsentrasjon på 50 mg / L. Tripentadecanoin fungerer som intern standard for fettsyre kvantifisering.
  2. Tilsett 1 ml kloroform: metanol 04:05 (v / v) inneholdende tripentadecanoin til hver vibrerende rør (som er angitt i de anvendte reagenser og utstyr tabell). Sjekk at det ikke er noen perler rester inne i hetten på beadbeater tube, vil dette resultere i lekker av rørene. Bruk en positiv forskyvning pipette for nøyaktig tillegg av løsemidler.
  3. Perle slå perle beater rør 8x på 2500 rpm i 60 sek, hver gang med en 120 sek internt mellom hver juling.
  4. Overfør løsningen fra vulsten beater rør til et rent varmebestandig 15 ml glass sentrifugerør med Teflon insert skruefester. Pass på å overføre alle perlene fra perle beater tube også.
  5. Å varh vulsten beater røret, tilsett 1 ml kloroform: metanol 04:05 (v / v) inneholdende tripentadecanoin inn i vulsten beater røret, i nærheten av hetten og bland, og overføre denne løsning til det samme glassrøret fra trinn 2.4. Vask røret tre ganger (totalt 4 ml kloroform: metanol 04:05 (v / v) inneholdende tripentadecanoin benyttes per prøve - 1 ml tilsatt i trinn 2.2 og 3 ml for tre vasketrinn).
  6. Vortex glassrørene for 5 sek og sonicate i en ultralyd bath for 10 min.
  7. Til 2,5 ml MilliQ vann, inneholdende 50 mM 2-amino-2-hydroksymetyl-propan-1 ,3-diol (Tris) og 1 M NaCl, som er innstilt til pH 7 ved hjelp av en HCl-løsning. Dette vil føre til en faseseparasjon mellom kloroform og metanol: vann. 1 M NaCl blir brukt til å forsterke likevekt av lipider inn i kloroformfasen.
  8. Vortex for 5 sek og deretter sonicate for 10 min.
  9. Sentrifuger i 5 min ved 1200 x g.
  10. Overfør hele kloroformfasen (bunnfase) til en ren glassrøret ved hjelp av en glass Pasteur pipette. Sørg for ikke å overføre noen inter eller topp fase.
  11. Re-trekke ut prøven ved tilsetning av 1 ml kloroform til gamle rør (inneholdende metanol: vann-oppløsning).
  12. Vortex for 5 sek og deretter sonicate for 10 min.
  13. Sentrifuger i 5 min ved 1200 x g.
  14. Samle kloroformfasen (bunnfasen) ved hjelp av en glass Pasteur-pipette og bassenget med den første kloroform fraksjonen fra trinn 2.10.
  15. Dersom problemene er erfarne i å samle hele kloroform brøkdel i forrige trinn, gjenta trinn 02.11 til 02.14. Ellers fortsetter med trinn 2.16.
  16. Fordamp kloroformen fra røret i en nitrogen-gasstrøm. Etter dette trinnet kan prøvene lagres ved -20 ° C under en nitrogengassatmosfære.

Tre. Omestring til fettsyremetylestere

  1. Tilsett 3 ml metanol inneholdende 5% (v / v) svovelsyre til røret som inneholder den tørkede ekstraherte lipider (rør opprinnelig inneholdende kloroform fraksjon) oglukke røret tett.
  2. Vortex i 5 sek.
  3. Inkuber prøvene i 3 timer ved 70 ° C i en blokk ovn eller vannbad. Med jevne mellomrom (hver ± 30 min) sikre at prøvene er ikke kokende (forårsaket av en feil lukket lokk) og vortex-rør. I løpet av denne reaksjons fettsyrer er metylert til sine fettsyre-metylestere (fames).
  4. Kule prøvene til romtemperatur og tilsett 3 ml MilliQ-vann og 3 ml n-heksan.
  5. Vortex i 5 sek og bland i 15 minutter med et reagensrør rotator.
  6. Sentrifuger i 5 min ved 1200 x g.
  7. Samle 2 ml av heksan (topp) fase og satt i friskt glassrør ved hjelp av et glass Pasteur-pipette.
  8. Tilsett 2 ml MilliQ vann til de innsamlede heksan fasen for å vaske den.
  9. Vortex for 5 sek og sentrifuger i 5 min ved 1200 x g. Etter dette trinnet er det mulig å lagre prøvene ved -20 ° C under nitrogengassatmosfære (faseseparasjon ikke er nødvendig).

4. Kvantifisering av Slike fettsyremetylestere USing gasskromatografi

  1. Fyll GC ampuller med heksan fase (øvre fase) ved hjelp av en glass Pasteur-pipette.
  2. Sett lokkene på GC ampuller. Pass på at caps er helt forseglet, og kan ikke bli slått, for å hindre fordamping fra hetteglasset.
  3. Fylle på GC vaskeløsemidler (heksan), tømme avfalls ampuller, og sette prøve ampuller i auto-sampler. Før du kjører den faktiske prøver på GC, først kjøre to blanks inneholder kun heksan på GC.
  4. Kjør prøvene på en GC-FID med en Nukol kolonne (30 mx 0,53 mm x 1,0 mm). Bruk innløpstemperatur på 250 ° C og bruk helium som bæregass, trykk på 81,7 kPa og deleforhold på 0,1:1, total strømningshastighet: 20 ml / min. FID-detektortemperatur på 270 ° C med H 2 strømningshastighet på 40 ml / min, luftstrømningshastighet på 400 ml / min, og han strømningshastighet på 9,3 ml / min. Sett injeksjonsvolum til en mL / prøven. Før og etter vask injektor med n-heksan. Initial ovnstemperaturen er satt til 90 ° C i 0,5 minutter og deretter hevet with, 20 ° C / min inntil en ovnstemperatur på 200 ° C er nådd. Ovnstemperaturen holdes deretter ved 200 ° C i 39 min. Total kjøretid er 45 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et typisk kromatogram som oppnås via denne prosessen er vist i figur 1. Slike fettsyremetylestere separeres etter størrelse og graden av metning av GC-kolonnen, og protokollen som brukes. Kortere kjedelengde fettsyrer og mer mettede fettsyrer (færre doble obligasjoner) har kortere oppholdstid. Den brukte GC kolonne og protokoll ikke har tenkt å skille fettsyre isomerer (samme kjedelengde og grad av metning, men forskjellige posisjoner av dobbeltbindinger), men dette kan oppnås ved å bruke en annen GC kolonne og protokoll.

Den fettsyre-konsentrasjon og sammensetning kan beregnes ved hjelp av det området av GC-toppene, intern standard konsentrasjon (mg / l) (trinn 2.1), og mengden av biomasse tilsatt til prøven (mg) (trinn 1.1.2 eller 1.2. 6, avhengig av hvilken prøvepreparering protokoll ble valgt).

Innholdet av hver enkelt fettsyre i biomasse (mg fettsyre / g tørrvekt) kan bestemmes b y

Ligning 1
Med Areal av individuelle FAME som bestemmes av integrering av GC kromatogrammet (figur 1), Areal av C15: 0 FAME som bestemmes av integrering av GC kromatogrammet (figur 1);

Ligning 2
Med [IS] er konsentrasjonen av tripentadecanoin i kloroform: metanol-løsning som bestemt i trinn 2.1, MW C15: 0 FA molekylvekten av C15: 0 fettsyre (242,4 g / mol); MW C15: 0 TAG molekylvekten av tripentadecanoin (765,24 g / mol);

ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50628/50628eq3.jpg "/>
Som bestemmes ved å kjøre kalibreringsløsninger på GC, utgjør av blandinger av C15: 0 FAME og Slike fettsyremetylestere av alle individuelle fettsyrer som forventes på prøven, med [C15: 0 FAME i kalibreringsløsning] konsentrasjonen av C15: 0 FAME i kalibreringsløsning (mg / L), [individuelle FAME i kalibreringsløsning] er konsentrasjonen av den individuelle FAME i kalibreringsløsning (mg / L), og de områdene som bestemmes ved integrasjon av GC kromatogram av kalibreringsløsningen.

Det totale fettsyre-innhold kan beregnes som summen av alle de individuelle fettsyrer. Den relative mengde av hver fettsyre kan beregnes ved å dividere konsentrasjonen av hver enkelt fettsyre med det totale fettsyreinnhold.

Fettsyresammensetning og innhold av Scenedesmus obliquus UTEX393 (Chlorophyceae) under både nitrogen fylt og utarme forholdene ervist i figur 2. Fettsyresammensetning og innhold er sterkt påvirket av nitrogen sult. I S. Obliquus, C16: 0 (palmitinsyre), og C18: 1 (oljesyre) er de to mest forekommende fettsyrer.

Fettsyresammensetning og innhold av Phaeodactylum tricornutum UTEX640 (diatomeen) under både nitrogen fylt og utarme forholdene er vist i figur 3. I likhet med S. Obliquus, er fettsyreinnhold og sammensetning sterkt påvirket av nitrogen sult. P. tricornutum produserer også vesentlige mengder av sterkt umettede fettsyrer som for eksempel C20: 5 (eikosapentaensyre, EPA) samt meget langkjedete fettsyrer (lignocersyre syre, C24: 0), som kan detekteres ved denne fremgangsmåten.

Figur 1 < br /> Figur 1. Representant GC-FID kromatogram. Et eksempel hentet fra Scenedesmus obliquus utsatt for nitrogen sult ble brukt. Bare den første 20 min av kromatogrammet blir vist. Etter 20 min ingen topper ble påvist i denne prøve.

Fig. 2
Figur 2. Fettsyresammensetning (relative overflod av fettsyrer) av Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae) under begge nitrogen tilstrekkelige (svarte striper) og nitrogen fratatt dyrkingsforhold (hvite søyler). Den totale fettsyreinnholdet var 8,6 ± 0,5% og 44,7 ± 1,7% ( % av tørrvekt) under nitrogen tilstrekkelig og nitrogen fratatt dyrkningsforhold, henholdsvis. Feilfelt angir den høyeste og laveste verdi av to analytiske replikater.

telt "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 3
Figur 3. Fettsyresammensetning (relative overflod av fettsyrer) av Phaeodactylum tricornutum (diatomeen) under begge nitrogen tilstrekkelige (svarte striper) og nitrogen fratatt dyrkingsforhold (hvite søyler). Det totale fettsyre-innholdet var 11,7 ± 0,9% og 30,5 ± 1,1% (% av tørrvekt) under nitrogen tilstrekkelige og nitrogen fratatt dyrkningsbetingelser, respektivt. Feilfelt angir den høyeste og laveste verdi av to analytiske replikater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne fremgangsmåte kan brukes til å bestemme innholdet, så vel som sammensetningen av de totale fettsyrene som er tilstede i microalgal biomasse. Fettsyrer avledet fra alle lipidklasser, herunder lagring (TAG) samt membranlipider (fosfolipider og glykolider), blir detektert. Alle fettsyre-kjedelengder og grader av metning som er tilstede i mikroalger kan påvises og skilles. Fremgangsmåten er basert på mekanisk celleoppbrytning, oppløsningsmiddel basert lipid ekstraksjon, omestring av fettsyrer til Slike fettsyremetylestere, og kvantifisering av Slike fettsyremetylestere ved hjelp av gasskromatografi i kombinasjon med en flammeioniseringsdetektor (GC-FID). Denne metoden krever små mengder av prøven (5 mg), er nøyaktig og reproduserbar, og kan brukes blant et bredt utvalg av mikroalgearter. Denne fremgangsmåte er ment å bli brukt til analyseformål, og er spesielt tilpasset for bruk av små prøvestørrelser. Metoden er ikke ment å bli skalert opp og brukes for å trekke ut storemengder microalgal fettsyrer. En begrensning ved denne metoden er at den er arbeidskrevende og det kan ta et par dager fra start av fremgangsmåten for å oppnå resultatene. Spesielt i tilfelle av prosessovervåking for industriell microalgal fettsyreproduksjon dette kan anses som en begrensning. Hvis raskere resultater er nødvendig, kan andre alternativer som for eksempel farging med lipofile fluorescerende fargestoffer være mer egnet. Følgende anbefalinger er gjort med hensyn til å utføre prosedyren analytisk:

  1. Utvinning og omestring fremgangsmåte er standardisert ved hjelp av en triacylglycerol (tripentadecanoin) som en indre standard. Bruken av en intern standard er ofte brukt for kvantifisering av Slike fettsyremetylestere i prøver ved hjelp av gass-kromatografi, men oftest en FAME intern standard er brukt. Det anbefales å bruke en TAG intern standard snarere enn en FAME intern standard og å legge den før celle avbrudd og løsemiddelekstraksjon. Mulige tap i lipid ekstrhandling eller ufullstendig omestring kan da korrigeres for, siden det er forventet at tilsvarende tap ville oppstå på den interne standard. En intern standard bør brukes som ikke ko-eluere med fettsyrer produsert av mikroalger. Fordi mikroalger bare produsere fettsyrer med til og med karbontall, er en TAG inneholdende en fettsyre med et ulike antall karbonatomer en god kandidat. På grunn av at GC-kolonnen, og protokollen ikke bare separere på kjedelengden, men også av graden av umettethet, en mettet odde nummererte fettsyre kunne hypotetisk co eluere med en umettet partalls fettsyre. Det skal valideres som benyttes intern standard ikke samtidig eluere med fettsyrer naturlig til stede i prøven. I vår erfaring med ulike mikroalger, tripentadecanoin (TAG inneholder tre C15: 0 fettsyrer) ikke coelueres med fettsyrer naturlig tilstede i mikroalger.
  2. Mettede og umettede fettsyrer gir forskjellige GC-FID responser (peak områder) på identiske konsentrasjoner. Derfor standarder av Slike fettsyremetylestere bør brukes for kalibrering og bestemmelse av relative responsfaktorer for de enkelte fettsyrer, som beskrevet i det representative resultater delen. Standarder av Slike fettsyremetylestere kan også brukes for å bestemme oppholdstider av individuelle fettsyrer. Alternativt kan GC-MS benyttes til fettsyre identifikasjon.
  3. Både retensjonstiden og relative responsfaktor av individuelle fettsyrer vil endres med GC utstyr alder. Hyppig kalibrering av oppholdstid og relative responsfaktor er derfor anbefalt.
  4. Mekanisk celle avbrudd er et viktig skritt i denne metoden. Det er realisert ved en kombinasjon av lyofilisering, perle vibrerende og sonikering. Uten celle avbrudd er det mulig at ikke alle lipider er hentet 9,13. Muligens noen av celleoppbrytning trinn er overflødig og mindre omfattende celleoppbrytning (for eksempel kortere vulsten vibrerende ganger) kan gi samme retater for enkelte mikroalgearter eller for biomasse utledet fra visse dyrkningsforhold. Dette trenger validering for hver enkelt situasjon imidlertid derfor den foreslåtte omfattende avbrudd protokollen er anbefalt.
  5. Under prosedyren analytisk, kan løsemidler brukes hente komponenter fra plastrør og pipette tips som brukes. Disse ekstraherte komponentene kan forstyrre deteksjon av fames bruker GC-FID. Spesielt vil lange perle-beat tider og høy temperatur under perle-juling medføre forurensende komponenter. Erfaringen er at komponentene ekstrahert fra de perle-beat-rør vil resultere i noen få ytterligere topper i GC-FID kromatogram, hvorav noen overlapping med alger avledet Slike fettsyremetylestere (hovedsakelig mettede fettsyrer). Når fremgangsmåten blir utført som foreslått, er det aldri mer enn 1-2% av det totale topparealet. Kjøling av perle-beater rør under perle-juling og bruke større mengder biomasse per prøve vil redusere den relative toppområde av disse plast avledet toppene. Det anbefales å bruke glass pipetter og glassrør så mye som mulig gjennom hele protokollen. I tillegg til bruk av blanks kontrollere og korrigere for komponentene ekstrahert fra plast, men også for å kontrollere og korrigere for forurensninger i for eksempel de som brukes løsningsmidler, anbefales.
  6. I løpet av perle-juling prosessen, vil både perle-beater og perle-beater rørene varmes opp. Når kule-juling i en mye lengre tid eller mye høyere turtall enn foreslått i denne metoden, og når ingen kjøling er anvendt i mellom, kan dette føre til koking av oppløsningsmidlene og eventuelt brudd på rørene. Dette vil resultere i et tap av prøven. I vår erfaring, oppstår denne situasjonen når perle-juling for mer enn seks minutter ved 6000 rpm.
  7. Mikroalger kan produsere sterkt umettede fettsyrer, som kan være utsatt for oksidasjon. Ryckebosch et al. 9. observerte ingen endring i fettsyresammensetning som skyldes oksidasjon av umettede fAtty Øvrige syrer under ulike ekstraksjonsmetoder. Det ble foreslått at antioksidanter naturlig forekommende i mikroalger beskytte disse umettede fettsyrer mot oksydasjon. Hvis det er mistanke om at oksidasjon kan oppstå, vil en mulighet være å legge en syntetisk antioksidant som butylhydroksytoluen (BHT) så lenge antioksidant ikke coelueres med Slike fettsyremetylestere, og så lenge mengden av antioksidanter brukte ikke forstyrrer kromatografien ni. For å hindre oksydasjon ved lang tids lagring, er det anbefalt å lagre prøver ved -80 ° C under en nitrogengassatmosfære.
  8. Lipaser som er tilstede i mikroalger kan potensielt hydrolysere lipidene i løpet av prosedyren analytisk og således påvirke resultatene. Ryckebosch et al. Ni funnet at lyofilisering inaktiverer lipaser. Videre trenger lipaser ikke nedbrytes fettsyrer, men bare løsne dem fra glycerol gruppe glycerolipids. Derfor bør lipase-aktivitet ikke forstyrrer den presenterte fettstoffer acid protokollen. Enzymer som er involvert i fettsyre degradering act on koenzym A aktivert fettsyrer og forekomsten av en slik nedbrytning ved utvinning således ikke synes sannsynlig. Likevel, i tilfelle det er mistanke om at enzymatisk nedbrytning av fettsyrer fra glycerolipids kan påvirke resultatene, en mulighet ville være å legge en lipase-hemmer, slik som isopropanol, så lenge det hemmer ikke forstyrrer selve inngrepet 9 analytisk.

Denne metoden kan utvides til å kvantifisere og bestemme fettsyresammensetningen av nøytrale lipider (TAG), og polare lipider (fosfolipider, glykolider) ved hjelp av en fastfase-ekstraksjon (SPE) separasjonstrinn mellom trinn 2 (lipid extraction) og trinn 3 (omestring ) som beskrevet av for eksempel Breuer et al. 1. Alternativt kan en Tynnsjiktkromatografi (TLC) trinn anvendes for å separere forskjellige polare lipidklasser, for eksempel som beskrevet av Wang og Benning 28.

Denne metoden kan utvides til å brukes i, for eksempel, planter, animalske vev og andre mikroorganismer. På grunn av vekt på celle-nedbrytning, er denne fremgangsmåte hovedsakelig egnet for analyse av fettsyrer i materialer som er meget vanskelig å trekke ut.

Utvinningen del av fremgangsmåten (trinn 1 og 2) kan brukes til ekstraksjon av pigmenter og andre lipofile komponentene 23,25. Den celleoppbrytning fremgangsmåte kan brukes for ekstraksjon av andre komponenter som for eksempel stivelse eller karbohydrater ved hjelp av andre løsningsmiddelsystemer (inkludert vann).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

En del av dette arbeidet ble finansielt støttet av Institutt for fremme av innovasjon ved Science and Technology-strategisk grunnforskning (IWT-SBO) prosjekt Sollys og Biosolar celler. Erik Bolder og BackKim Nguyen er anerkjent for sitt bidrag til optimalisering av perlen juling prosedyren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tripentadecanoin (C15:0 TAG) Sigma Aldrich T4257 CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Larodan
Beadbeater Bertin Technologies Precellys 24
beadbeater tubes MP Biomedicals Lysing matrix E
116914500
GC-FID Hewlett-Packer HP6871
GC column Supelco Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl Mettler Toledo MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000 Mettler Toledo C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml VWR 612-1925
glass tubes VWR SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 VWR SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps VWR SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator VWR 445-2101
Heated Evaporator/Concentrator Cole-Parmer YO-28690-25

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
  2. Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54 (4), 621-639 (2008).
  3. Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25 (3), 294-306 (2007).
  4. Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (2), 169-177 (2012).
  5. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329 (5993), 796-799 (2010).
  6. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4 (3), 287-295 (2010).
  7. Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45 (2), 160-186 (2006).
  8. Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1 (1), 20-43 (2008).
  9. Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists' Society. 89 (2), 189-198 (2011).
  10. Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84 (4), 1879-1887 (2012).
  11. Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36 (11), 1283-1287 (2001).
  12. Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71 (9), 955-959 (1994).
  13. Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, Suppl 1 ement. 75-77 (2010).
  14. Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
  15. Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100 (23), 5988-5995 (2009).
  16. Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45 (11), 1053-1060 (2010).
  17. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
  18. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  19. Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
  20. Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28 (7), 635-638 (1002).
  21. Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77 (1), 41-47 (2009).
  22. Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing "green oil" in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109 (2), 198-201 (2010).
  23. Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106 (4), 638-648 (2010).
  24. Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
  25. Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. , (2012).
  26. Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24 (2), 253-266 (2012).
  27. Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162 (1), 21-27 (2012).
  28. Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).

Tags

Environmental Sciences kjemisk analyse teknikker fra mikroalger fettsyre triacylglycerol lipid gasskromatografi celle avbrudd
Analyse av Fatty Acid innhold og sammensetning i Mikroalger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Breuer, G., Evers, W. A. C., de… More

Breuer, G., Evers, W. A. C., de Vree, J. H., Kleinegris, D. M. M., Martens, D. E., Wijffels, R. H., Lamers, P. P. Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae. J. Vis. Exp. (80), e50628, doi:10.3791/50628 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter