Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Analys av fettsyrasammansättning och sammansättning i Mikroalger

Published: October 1, 2013 doi: 10.3791/50628
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1Bioprocess Engineering, Wageningen University and Research Center, 2AlgaePARC, Wageningen University and Research Center, 3Food and Biobased Research, Wageningen University and Research Center

Summary

Ett förfarande för bestämning av fettsyrainnehållet och komposition i mikroalger baserat på mekanisk cellstörning, lösningsmedelsbaserade lipidextraktion, transförestring, och kvantifiering och identifiering av fettsyror med användning av gaskromatografi beskrivs. En tripentadecanoin intern standard används för att kompensera för eventuella förluster under extraktion och ofullständig omförestring.

Abstract

En metod för att fastställa innehållet och sammansättningen av de totala fettsyrorna i mikroalger beskrivs. Fettsyror är en viktig beståndsdel i mikroalger biomassa. Dessa fettsyror kan vara närvarande i olika acyl-lipid-klasserna. Speciellt fettsyrorna i triacylglycerol (TAG) är av kommersiellt intresse, eftersom de kan användas för framställning av drivmedel, kemikalier i bulk, nutraceuticals (ω-3-fettsyror), och livsmedelsråvaror. Att utveckla kommersiella tillämpningar, behövs tillförlitliga analysmetoder för kvantifiering av fettinnehållet syra och sammansättning. Mikroalger är enskilda celler omgivna av en styv cellvägg. En fettsyra analysmetod bör ge tillräcklig cellstörningar att befria alla acyl lipider och utvinning förfarande som används ska kunna extrahera alla acyl lipid klasser.

Med den metod som presenteras här alla fettsyror som föreligger i mikroalger kan vara exakt och reproducerbart identifieras och kvantifieras med hjälp av små mängder av prov (5 mg) som är oberoende av deras kedjelängd, graden av omättnad, eller lipid klass de är en del av.

Denna metod ger inte information om den relativa förekomsten av olika fettklasser, men kan förlängas för att separera lipidklasser från varandra.

Metoden bygger på en sekvens av mekanisk cellstörningar, lösningsmedelsbaserad lipidextraktion, transförestring av fettsyror till fettsyrametylestrar (Fames), samt kvantifiering och identifiering av FAMEs hjälp av gaskromatografi (GC-FID). En TAG intern standard (tripentadecanoin) tillsättes före den analytiska procedur för att korrigera för förluster under utvinning och ofullständig omestring.

Introduction

Fettsyror är en av de viktigaste beståndsdelarna i mikroalger biomassa och utgör typiskt mellan 5-50% av den celltorrvikt 1-3. De är i huvudsak närvarande i form av glycerolipider. Dessa glycerolipider i sin tur består huvudsakligen av fosfolipider, glykolipider, och triacylglycerol (TAG). Speciellt fettsyrorna i TAG är av kommersiellt intresse, eftersom de kan användas som en resurs för produktion av drivmedel, bulkkemikalier, nutraceuticals (ω-3 fettsyror) och livsmedelsråvaror 3-6. Mikroalger kan växa i havsvatten baserad odlingsmedier, kan ha en mycket större areal produktivitet än landlevande växter, och kan odlas i photobioreactors på platser som är olämpliga för jordbruk, kanske till havs. Av dessa skäl är mikroalger ofta som ett lovande alternativ till landväxter för produktion av biodiesel och andra bulkprodukter 3-6. Potentiellt ingen jordbruks loch eller sötvatten (när odlas i slutna photobioreactors eller när marina mikroalger används) är nödvändigt för deras produktion. Därför är biobränslen från mikroalger anses 3: e generationens biobränslen.

Den totala cellulära halten av fettsyror (i% av torrvikt), lipid klass sammansättning, liksom fettsyra längd och mättnadsgrad är mycket variabla mellan mikroalger. Dessutom är dessa egenskaper varierar med odlingsbetingelser, såsom tillgången på näringsämnen, temperatur, pH, och ljusintensitet 1,2. Till exempel, när den utsätts för kväve svält, kan mikroalger ackumulera stora mängder av TAG. Under optimala tillväxtbetingelser utgör TAG typiskt mindre än 2% av torrvikt, men när de utsätts för kväve svält TAG innehåll kan öka upp till 40% av mikroalger torrvikt 1.

Mikroalger producerar främst fettsyror med kedjelängd av 16 och 18kolatomer, men vissa arter kan göra fettsyror med upp till 24 kolatomer i längd. Både mättade, samt höggradigt omättade fettsyror produceras av mikroalger. De senare inkluderar fettsyror med näringsmässiga fördelar (ω-3 fettsyror) som C20: 5 (eikosapentaensyra, EPA) och C22: 6 (dokosahexaensyra, DHA) för vilka inga vegetabiliska alternativ finns 1,2,4,7. Den (fördelning) fettsyra kedjelängd och mättnadsgrad avgör också de egenskaper och kvalitet av alger-derived biobränsle, matolja 4,8.

Att utveckla kommersiella tillämpningar av mikroalgsamhällen härledda fettsyror, behövs tillförlitliga analysmetoder för kvantifiering av fettinnehållet syra och sammansättning.

Som också påpekats av Ryckebosch et al. 9, analys av fettsyror i mikroalger skiljer sig från andra substrat (t.ex. vegetabilisk olja, livsmedel, djurvävnader etc.) varaorsaka en) mikroalger är enskilda celler omgivna av styva cellväggar, vilket komplicerar lipidextraktion; 2) mikroalger innehålla ett stort antal olika lipidklasser och fördelningen lipid klass är mycket variabel 7. Dessa olika lipid klasser har ett brett utbud i kemisk struktur och egenskaper såsom polaritet. Dessutom är andra än acyl lipider lipidklasser produceras, 3) mikroalger innehåller en mängd olika fettsyror, som sträcker sig från 12 till 24 kolatomer i längd och innehåller både mättade, samt mycket omättade fettsyror. Därför metoder som utvecklats för att analysera fettsyror i andra än mikroalger substrat, kanske inte lämpar sig för att analysera fettsyror i mikroalger.

Som granskas av Ryckebosch m fl. 9, är den största skillnaden mellan vanligen används extraktion lipid i lösningsmedelssystem som används. På grund av den stora variationen av lipid klasser som finns i mikroalger, vart och ett varierar i polaritet, den extraheradelipid kvantitet varierar med lösningsmedel som används 10-12. Detta leder till inkonsekvenser i fettinnehållet och sammansättning som presenteras i litteraturen 9,10. Beroende på lösningsmedelssystemet som används, metoder baserade på lösningsmedelsextraktion utan avbrott cell genom exempelvis, bead stryk eller ultraljudsbehandling, kanske inte extrahera alla lipider på grund av den stela vissa mikroalger arter 9,13. I fallet med ofullständig lipidextraktion kan extraktionseffektivitet av de olika lipidklasser variera 14. Detta kan också ha en effekt på den uppmätta fettsyrakompositionen, eftersom fettsyrakompositionen är variabel bland lipidklasser 7.

Vår metod bygger på en sekvens av mekanisk cellstörningar, lösningsmedelsbaserad lipidextraktion, transförestring av fettsyror till fettsyrametylestrar (Fames), samt kvantifiering och identifiering av FAMEs hjälp av gaskromatografi i kombination med en flamma ionization detektor (GC-FID). En inre standard i form av en triacylglycerol (tripentadecanoin) läggs innan analysmetoden. Möjliga förluster under extraktion och ofullständig omförestring kan sedan korrigeras för. Metoden kan användas för att bestämma innehållet och sammansättningen av fettsyrorna i mikroalger biomassa. Alla fettsyror som finns närvarande i de olika acyl-lipid-klasser, inklusive lagring (TAG) liksom membranlipider (glykolipider, fosfolipider), detekteras, identifieras och kvantifieras på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt genom denna metod med användning av endast små mängder av prov (5 mg) . Denna metod ger inte information om den relativa förekomsten av olika fettklasser. Emellertid kan förfarandet utvidgas till att separera lipidklasser från varandra 1. Koncentrationen och fettsyrakompositionen av de olika lipidklasser kan därefter bestämmas individuellt.

I litteraturen flera andra metoder ärbeskrives för att analysera lipider i mikroalger. Vissa metoder fokuserar på totala lipofila komponenter 15, medan andra metoder fokuserar på totala fettsyror 9,16. Dessa alternativ inkluderar gravimetrisk bestämning av det totala extraherade lipider, direkt transförestring av fettsyror i kombination med kvantifiering med hjälp av kromatografi, och färgade celler med lipofila fluorescerande färger.

Ett alternativ som ofta används till kvantifiering av fettsyror med hjälp av kromatografi är kvantifiering av lipider med en gravimetrisk bestämning 17,18. Fördelar med en gravimetrisk bestämning är att det saknas krav på avancerad och dyr utrustning som en gaskromatograf, lätt att ställa in förfarandet, på grund av tillgången på standardiserade analysutrustning (t.ex. Soxhlet) och en gravimetrisk bestämning är mindre tidskrävande än kromatografi baserade metoder. Den stora fördelen med användning av kromatografi baserad metoder på OTHer hand är att endast de fettsyror i en sådan metod mäts. I en gravimetrisk bestämning av icke-fettsyra som innehåller lipider, såsom pigment eller steroider, ingår också i bestämningen. Dessa icke-fettsyra-innehållande lipider kan göra upp en stor andel (> 50%) av totala lipider. Om man endast är intresserad av att halten av fettsyror (t.ex. för biodiesel applikationer), kommer det att överskattas när en gravimetrisk bestämning används. Dessutom, i en gravimetrisk bestämning noggrannhet analysvåg som skall användas för att väga de extraherade lipider avgör provstorleken som måste användas. Denna mängd är oftast mycket mer än den mängd som behövs vid kromatografi används. Slutligen är en annan fördel med användning av kromatografi över gravimetrisk bestämning att kromatografi ger information om fettsyrasammansättningen.

Ett annat alternativ till vår presenterade metoden direkt transesterifiering 16,19,20.I denna metod lipidextraktion och transförestring av fettsyror till FAMEs kombineras i ett steg. Denna metod är snabbare än en separat extraktion och transesterifiering steg, men att kombinera dessa steg begränsar lösningsmedlen som kan användas för extraktion. Detta kan negativt påverka extraktionseffektivitet. En annan fördel med en separat lipidextraktion och transesterifiering steg är att det möjliggör för en extra lipidklass separationen mellan dessa steg 1. Detta är inte möjligt när direkt omförestring används.

Andra vanligen använda metoder för att bestämma innehållet lipid i mikroalger inkluderar färgning biomassan med lipofila fluorescerande fläckar såsom Nilen röd eller BODIPY och mätning av fluorescenssignalen 21,22. En fördel med dessa metoder är att de är mindre arbetskrävande än alternativa metoder. En nackdel med dessa metoder är att den fluorescerande svar är av olika skäl, rörlig mellan species, odlingsförhållanden, lipid klasser och analysmetoder. Som ett exempel, är flera av dessa variationer som orsakas av skillnader i upptag av färgämne genom den mikroalger. Därför behövs Kalibrering med en annan kvantitativ metod, företrädesvis för alla de olika odlingsförhållanden och tillväxtstadier. Slutligen, denna metod inte ger information om fettsyresammansättning och är mindre exakt och reproducerbar än kromatografi baserade metoder.

Denna metod är baserad på den metod som beskrivs av Lamers et al. 23 och Santos et al. 24 och har även tillämpats av flera andra författare 1,25-27. Även andra metoder finns tillgängliga som bygger på samma principer och kan ge liknande resultat 9,28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Provberedning

Det finns två alternativa protokoll för provberedning ingår i stegen 1,1 och 1,2. Båda metoderna är lika lämpliga och ger liknande resultat, men om en begränsad mängd alger odlingsvolym är tillgänglig, är metoden 1.1 rekommenderas.

OBS: För båda protokoll, förbereda två extra pärla visp rör enligt hela protokollet, men utan att lägga alger till dem för att användas som en tomt. På detta sätt kan toppar i GC-kromatogrammet till följd av utvinning av komponenter från material identifieras och kvantifieras.

1,1. Provberedning Protocol Alternativ 1: Rekommenderat När en begränsad mängd alger kultur är tillgänglig

  1. Bestäm alger torrsubstanskoncentration (g / L) i odlingsbuljongen, till exempel såsom beskrivits av Breuer et al. 1.
  2. För över en volym av odlingsbuljong som innehåller 5-10 mg alger torrvikt tillett glas centrifugrör. Beräkna den exakta mängden biomassa överförs med hjälp av biomassakoncentrationen bestämdes i steg 1.1.1.
  3. Centrifugera 5 minuter vid 1200 x g..
  4. Kasta bort en del av den överstående lösningen, lämna approximativt 0,25 ml i röret.
  5. Återuppslamma algerna i den återstående supernatanten genom försiktig pipettering pelleten upp och ner och överföra hela cellpelleten till en pärla visp rör med hjälp av en 200 l pipett.
  6. Skölj centrifugeringsrör glaspipett med ± 0,15 ml MilliQ vatten och överför vätskan till samma kula beater röret.
  7. Centrifugera pärla visp rör för en minut vid maximalt varvtal för att se till att inga luftbubblor finns kvar i botten på rören. Det är möjligt att lagra slutna pärla visp rör vid -80 ° C.
  8. Lyofilisera pärlan visp rör som innehåller provet. Det är möjligt att lagra de stängda pärla visp rör vid -80 ° C.

1,2. Provberedning protokoll Alternativ 2

  1. Centrifugera en obestämd volym av alger odlingsbuljongen och kassera supernatanten. Det är inte nödvändigt att bestämma koncentrationen av biomassa eller för att mäta den volym som används.
  2. Mäta eller beräkna osmolariteten av odlingsmediet med användning av koncentrationen av huvudsalterna som är närvarande i odlingsmediet.
  3. Tvätta cellpelleten genom att återsuspendera cellpelleten i samma volym, som används i steg 1.2.1, med en ammoniumformiat-lösning, som approximerar osmolariteten av odlingsmediet. En equiosmolar ammoniumformiat lösning förhindrar cell lyses under tvättning av cellerna.

OBS: tvättning av cellerna som är nödvändigt för att avlägsna salter som är närvarande i odlingsmediet. Detta är särskilt viktigt för fettsyraanalys i marina mikroalger på grund av de höga salthalter i deras odlingsmedium. Om salter ändå skulle finnas, skulle detta leda till en överskattning av den mängd celltorrvikt som kommer att fastställas senare i thans protokoll. Ammoniumformiat används för att tvätta cellerna, eftersom denna kommer att fullständigt avdunsta under lyofilisering och inte lämna några rester.

  1. Centrifugera alger fjädring och kassera supernatanten.
  2. Lyofilisera cellpelleten.
  3. Väg 5-10 mg frystorkade mikroalger pulver i en pärla visp rör. Notera den exakta vikten.

2. Cell Störningar och Lipid Extraction

OBS: Detta avsnitt beskriver en omfattande störning cell förfarande. Möjligen några av de störningscell steg är överflödiga och mindre omfattande cellstörningar kan ge samma resultat för vissa mikroalger arter eller för biomassa som härrör från vissa odlingsförhållanden. Detta skulle behöva validering för varje specifik situation dock. Därför föreslås omfattande störningar protokoll rekommenderas som en universell metod som lämpar sig för alla mikroalger material.

  1. Väg en exakt mängd tripentadecanoin (triacylglycerol innehåller tre C15: 0 fettsyror) och lägga till en exakt känd mängd av 04:05 (v / v) kloroform: metanol. På detta sätt kan koncentrationen av tripentadecanoin är exakt kända. Sikta på en koncentration av 50 mg / L. Tripentadecanoin tjänar som intern standard för fettsyra kvantifiering.
  2. Tillsätt 1 ml kloroform: metanol 04:05 (volym / volym) innehållande tripentadecanoin till varje malningsröret (anges i de reagens och utrustning tabell). Kontrollera att det inte finns några kulor kvar inne i locket på beadbeater röret, kommer detta att leda till läckage i rören. Använd en positiv förskjutning pipett för exakt tillsats av lösningsmedel.
  3. Bead slå pärla visp rören 8x vid 2500 rpm i 60 sek, varje gång med en 120 sek internt mellan varje stryk.
  4. Överför lösningen från pärla visp rören till en ren värmebeständigt 15 ml glas centrifugrör med teflonlägg skruvlock. Se till att överföra alla pärlorna från pärlan beater röret också.
  5. För att varh vulsten beater röret, tillsätt 1 ml kloroform: metanol 04:05 (volym / volym) innehållande tripentadecanoin in vulsten beater röret, nära locket och blanda, och överför denna lösning till samma glasröret från steg 2,4. Tvätta röret tre gånger (totalt 4 ml kloroform: metanol 04:05 (volym / volym) innehållande tripentadecanoin används per prov - 1 ml tillsätts i steg 2,2 och 3 ml för tre tvättsteg).
  6. Vortex glasrören för 5 sek och låt ligga i en ultraljudsbadet i 10 min.
  7. Tillsätt 2,5 ml MilliQ vatten, innehållande 50 mM 2-amino-2-hydroximetyl-propan-1 ,3-diol (Tris) och 1 M NaCl, som är inställd på pH 7 med användning av en HCl-lösning. Detta kommer att orsaka en fasseparering mellan kloroform och metanol: vatten. 1 M NaCI används för att förbättra jämvikten av lipider mot kloroformfasen.
  8. Vortex i 5 sekunder och sedan låt ligga i 10 min.
  9. Centrifugera i 5 minuter vid 1200 x g..
  10. Överför hela kloroformfasen (undre fas) till en ren glasrör med hjälp av ett glas Pasteur pipette. Se till att inte överföra någon interfas eller toppfasen.
  11. Extrahera provet genom tillsats av 1 ml kloroform till gamla röret (innehållande metanol: vattenlösning).
  12. Vortex i 5 sekunder och sedan låt ligga i 10 min.
  13. Centrifugera i 5 minuter vid 1200 x g..
  14. Samla kloroformfasen (undre fas) med hjälp av ett glas Pasteur pipett och pool med den första kloroform fraktionen från steg 2,10.
  15. Om svårigheterna har erfarenhet av att samla hela kloroform fraktionen i föregående steg, upprepa steg från 2,11 till 2,14. Annars fortsätt med steg 2.16.
  16. Indunsta kloroformen från röret i en kvävgasström. Efter detta steg prover kan lagras vid -20 ° C under en kvävgasatmosfär.

3. Transesterifiering till Fettsyrametylestrar

  1. Lägg 3 ml metanol innehållande 5% (volym / volym) svavelsyra till röret innehållande de torkade extraherade lipider (röret ursprungligen innehållande kloroform fraktion) ochförslut röret tätt.
  2. Vortex i 5 sek.
  3. Inkubera proverna för 3 h vid 70 ° C i en blockvärmare eller vattenbad. Periodvis (var ± 30 min) se till att proven inte kokande (orsakad av en felaktigt stängt lock) och vortexrör. Under denna reaktion fettsyror metyleras till sina fettsyrametylestrar (fames).
  4. Cool prover till rumstemperatur och tillsätt 3 ml MilliQ vatten och 3 ml n-hexan.
  5. Vortex i 5 sek och blanda i 15 minuter med ett provrör rotator.
  6. Centrifugera i 5 minuter vid 1200 x g..
  7. Samla 2 ml av hexan (övre) fasen och sätta i färskt glasrör med hjälp av ett glas Pasteur pipett.
  8. Tillsätt 2 ml MilliQ vatten till den insamlade hexanfasen att tvätta den.
  9. Vortex i 5 sekunder och centrifugera i 5 minuter vid 1200 x g.. Efter detta steg är det möjligt att lagra proverna vid -20 ° C under kvävgasatmosfär (fasseparation inte nödvändigt).

4. Kvantifiering av FAMEs Usjunga gaskromatografi

  1. Fyll GC ampuller med hexan fasen (övre fas) med hjälp av ett glas Pasteur pipett.
  2. Placera locken på GC-flaskor. Se till att locken är helt tät, och kan inte stängas, för att förhindra avdunstning från flaskan.
  3. Fylla på GC tvätt lösningsmedel (hexan), tömma avfallsflaskor, och satte provflaskor i auto-sampler. Innan du kör den verkliga prover på GC, första körningen 2 ämnen som endast innehåller hexan på GC.
  4. Kör proverna på en GC-FID med en Nukol kolonn (30 mx 0,53 mm x 1,0 ^ m). Använd inloppstemperatur av 250 ° C och använda helium som bärargas, tryck av 81,7 kPa och delningsförhållande av 0,1:1, total flödeshastighet: 20 ml / min. FID-detektortemperatur av 270 ° C med H 2 flödeshastighet av 40 ml / min, luftflödeshastighet av 400 ml / min och Han flödeshastighet av 9,3 ml / min. Ställ injektionsvolym på 1 pl / prov. Före och efter tvätt injektor med n-hexan. Initial ugnstemperatur är inställd på 90 ° C under 0,5 minuter och därefter höjas with 20 ° C / min tills en ugnstemperatur av 200 ° C uppnås. Ugnstemperaturen hölls sedan vid 200 ° C under 39 min. Total körtid är 45 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett typiskt kromatogram som erhålls genom denna process visas i Figur 1. FAMEs separeras efter storlek och graden av mättnad av GC-kolonnen och protokoll som används. Kortare kedjelängd fettsyror och mer mättade fettsyror (färre dubbelbindningar) har kortare uppehållstider. Den använda GC-kolonn och protokoll har inte för avsikt att separera fettsyraisomerer (samma kedjelängd och mättnadsgrad, men olika positioner av dubbelbindningar), men detta skulle kunna uppnås genom att använda en annan GC-kolonn och protokoll.

Fettsyra koncentrationen och kompositionen kan beräknas med användning av arean av GC-toppar, intern standard koncentration (mg / l) (steg 2,1), och mängden biomassa som sätts till provet (mg) (steg 1.1.2 eller 1,2. 6, beroende på vilken provberedning protokoll valdes).

Innehållet i varje enskild fettsyra i biomassa (mg fettsyra / g torrvikt) kan bestämmas b y

Ekvation 1
Med område med individuell FAME som bestäms genom integrering av GC-kromatogrammet (Figur 1), Område av C15: 0 FAME som bestäms genom integrering av GC-kromatogrammet (figur 1);

Ekvation 2
Med [IS] koncentrationen av tripentadecanoin i kloroform: metanol-lösning såsom bestämts i steg 2,1; MW C15: 0 FA molekylvikten för C15: 0 fettsyra (242,4 g / mol); MW C15: 0 TAG molekylvikten av tripentadecanoin (765,24 g / mol);

ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50628/50628eq3.jpg "/>
Som bestäms genom att köra kalibreringslösningar på GC, utgör av blandningar av C15: 0 FAME och FAMEs av alla enskilda fettsyror som förväntas i provet, med [C15: 0 FAME i kalibreringslösning] koncentrationen av C15: 0 FAME i kalibreringslösning (mg / L), [individuell FAME i kalibreringslösning] koncentrationen av den individuella FAME i kalibreringslösningen (mg / L), och de områden som bestäms genom integrering av GC-kromatogrammet för kalibreringslösningen.

Totala fettsyrahalten kan beräknas som summan av alla enskilda fettsyror. Den relativa förekomsten av varje fettsyra kan beräknas genom att dividera koncentrationen av varje individuell fettsyra med det totala fettsyrainnehållet.

Den fettsyresammansättning och innehåll Scenedesmus obliquus UTEX393 (Chlorophyceae) under både kväve fylld och tömmer villkor ärsom visas i figur 2. Fettsyrasammansättning och innehåll påverkas i hög grad av kväve svält. I S. obliquus, C16: 0 (palmitinsyra) och C18: 1 (oljesyra) är de två mest förekommande fettsyror.

Fettsyrakompositionen och innehåll Phaeodactylum tricornutum UTEX640 (kiselalger) under både kväve fylld och utarma betingelser visas i figur 3. Liknar S. obliquus, innehållet fettsyror och sammansättning påverkas i hög grad av kväve svält. P. tricornutum producerar dessutom avsevärda mängder av höggradigt omättade fettsyror, såsom C20: 5 (eikosapentaensyra, EPA) samt mycket långkedjiga fettsyror (lignocerinsyra, C24: 0) som kan detekteras genom denna metod.

Figur 1 < br /> Figur 1. Representative GC-FID kromatogrammet. Ett prov härlett från Scenedesmus obliquus exponeras för kväve svält användes. Endast den första 20 min av kromatogrammet visas. Efter 20 minuter inga toppar upptäcktes i detta prov.

Figur 2
Figur 2. Fettsyrasammansättning (relativa förekomsten av fettsyror) i Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae) under båda kväve tillräckliga (svarta staplar) och kväve berövade odlingsförhållanden (vita staplar). De totala fettsyrainnehållet var 8,6 ± 0,5% och 44,7 ± 1,7% ( % av torrvikt) under kväve tillräcklig och kväve berövas odlingsbetingelser, respektive. Felstaplar anger det högsta och lägsta värde på två analytiska replikat.

tält "fo: keep-together.within-page =" alltid "> Figur 3
Figur 3. Fettsyrasammansättning (relativa förekomsten av fettsyror) i Phaeodactylum tricornutum (kiselalger) under båda kväve tillräckliga (svarta staplar) och kväve berövade odlingsförhållanden (vita staplar). Den totala fettsyrainnehållet var 11,7 ± 0,9% och 30,5 ± 1,1% (% av torrvikt) under kväve tillräckliga och kväve berövade odlingsförhållanden, respektive. Felstaplar anger det högsta och lägsta värde på två analytiska replikat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrivna metoden kan användas för att bestämma halten liksom sammansättningen av de totala fettsyrorna i alger biomassa. Fettsyror som härrör från alla lipidklasser, inklusive lagring (TAG) liksom membran lipider (fosfolipider och glykolipider), upptäcks. Alla fettsyra kedjelängder och mättnadsgrader som är närvarande i mikroalger kan detekteras och särskiljas. Metoden är baserad på mekanisk cellstörningar, lösningsmedelsbaserad lipidextraktion, transförestring av fettsyror till FAMEs, och kvantifiering av FAMEs använder gaskromatografi i kombination med en flamjonisationsdetektor (GC-FID). Denna metod kräver små mängder av provet (5 mg), är noggrann och reproducerbar och kan användas bland en mängd olika mikroalger arter. Denna metod är avsedd att användas för analysändamål och är skräddarsydda för att använda små provvolymer. Metoden är inte avsedd att skalas upp och användas för att extrahera storakvantiteter mikroalgsamhällen fettsyror. En begränsning med denna metod är att den är arbetskrävande och det kan ta några dagar från att starta förfarandet för att erhålla resultat. Särskilt i fråga om processövervakning för industriell mikroalger fettsyraproduktion detta kan anses vara en begränsning. Om snabbare resultat krävs, kan andra alternativ, som färgning med lipofila fluorescerande färger vara mer passande. Följande rekommendationer görs för att utföra analysen:

  1. Extraktion och transesterifiering förfarande är standardiserade med hjälp av en triacylglycerol (tripentadecanoin) som en intern standard. Användning av en intern standard används vanligtvis för kvantifiering av FAME i prover med gaskromatografi, men oftast en FAME intern standard används. Det rekommenderas att använda en TAG intern standard snarare än en FAME intern standard och att lägga till den före avbrott cell och vätskeextraktion. Möjliga förluster under lipid Extrhandling eller ofullständig omestring kan sedan korrigeras för, eftersom det förväntas att liknande skador skulle uppstå till den interna standarden. En intern standard skall användas som inte samar elueras med fettsyror som produceras av mikroalger. Eftersom mikroalger endast producera fettsyror med jämna antal kolatomer, är en TAG innehållande en fettsyra med ett udda antal kolatomer en bra kandidat. Eftersom GC-kolonnen och protokoll inte bara skilja på kedjelängd, utan även på graden av omättnad, en mättad udda numrerade fettsyra kan hypotetiskt sam-eluera med en omättad jämnt antal fettsyra. Det bör godkännas att den använda intern standard inte sam-eluera med fettsyror som förekommer naturligt i provet. Enligt vår erfarenhet med olika mikroalger, tripentadecanoin (TAG innehållande tre C15: 0 fettsyror) inte samtidigt elueras med fettsyror som förekommer naturligt i mikroalger.
  2. Mättade och höggradigt omättade fettsyror ger olika GC-FID svar (toppytor) vid samma koncentrationer. Därför standarder FAMEs bör användas för kalibrering och bestämning av relativa responsfaktorer för enskilda fettsyror som beskrivs i resultat avsnittet företrädaren. Standards of FAMEs kan också användas för att bestämma retentionstiden för individuella fettsyror. Alternativt kan GC-MS att användas för fettsyra identifiering.
  3. Både uppehållstid och relativa responsfaktorn för enskilda fettsyror kommer att förändras med GC utrustning ålder. Frekvent kalibrering av uppehållstid och relativa responsfaktorn rekommenderas därför.
  4. Mekanisk cell störningar är ett viktigt steg i denna metod. Den förverkligas genom en kombination av frystorkning, pärla stryk och ultraljudsbehandling. Utan avbrott cell är det möjligt att inte alla lipider utvinns 9,13. Möjligen några av de störningscell steg är överflödiga och mindre omfattande cellstörningar (t.ex. kortare pärla beating gånger) skulle kunna ge samma resultat för vissa mikroalger arter eller för biomassa som härrör från vissa odlingsförhållanden. Detta skulle behöva validering för varje specifik situation dock, alltså den föreslagna omfattande störningar protokoll rekommenderas.
  5. Under analysförfarandet, kan de använda lösningsmedlen extrahera komponenter från plaströren och pipettspetsar användes. Dessa extraherade komponenter kan störa detekteringen av FAMEs använder GC-FID. Speciellt kommer långa pärla-takttider och hög temperatur under bead-stryk leda till kontaminerande komponenter. Vår erfarenhet är att komponenter som extraherats från bead-beat-rör kommer att resultera i ytterligare några toppar i GC-FID kromatogram, av vilka en överlagring med alger härledda FAMEs (främst de mättade fettsyror). När förfarandet genomförs som föreslås, är detta aldrig mer än 1-2% av den totala topparean. Kylning av pärla-visp rör under bead-stryk och använda större mängder biomassa per prov kommer att minska den relativa toppområde av dessa plast härledda toppar. Det rekommenderas att använda glaspipetter och glasrör så mycket som möjligt genom hela protokollet. Dessutom, för att användningen av ämnena kontrollera och korrigera för de komponenter som extraherats från plaster, men också för att kontrollera och korrigera för föroreningar i exempelvis de använda lösningsmedlen, rekommenderas.
  6. Under pärlan misshandel processen kommer både pärlan-beater och pärla-visp rör värma upp. När vulsten misshandel under en mycket längre tid, eller mycket högre varvtal än vad som föreslagits i denna metod, och när ingen kylning appliceras däremellan, kan detta resultera i kokning av lösningsmedlen och slutligen brott på rören. Detta kommer att resultera i en förlust av prov. Enligt vår erfarenhet är denna situation inträffar när vulsten ledande i mer än 6 min vid 6000 rpm.
  7. Mikroalger kan producera höggradigt omättade fettsyror, som kan vara benägna till oxidation. Ryckebosch et al. 9 observerade ingen förändring i fettsyrasammansättning som orsakas av oxidation av omättade fAtty syror under olika extraktionsmetoder. Det föreslogs att antioxidanter som förekommer naturligt i mikroalger skydda dessa omättade fettsyror från oxidation. Om man misstänker att oxidation kan inträffa, skulle en möjlighet vara att lägga till en syntetisk antioxidant såsom butylhydroxitoluen (BHT) så länge som antioxidant inte samar elueras med FAME, och så länge som mängden antioxidant används inte stör kromatografin 9. För att förhindra oxidation under långtidslagring, är det rekommenderat att lagra proverna vid -80 ° C under kvävgasatmosfär.
  8. Lipaser som finns i mikroalger kan potentiellt hydrolysera lipider under en analys och därmed påverka resultaten. Ryckebosch et al. 9 fann att frystorkning inaktiverar lipaser. Dessutom behöver lipaser inte degradera fettsyror, men bara lossa dem från glycerolgrupp glycerolipider. Därför bör lipasaktivitet inte störa den presenterade fet ACId-protokollet. Enzymer som är involverade i fettsyra akt syranedbrytning på koenzym A aktiverade fettsyror och förekomsten av sådan nedbrytning under extraktionen således inte verkar troligt. Ändå ifall man misstänker, att enzymatisk nedbrytning av fettsyror från glycerolipider kan påverka resultatet, en möjlighet skulle vara att lägga en lipashämmare, såsom isopropanol, så länge hämmare inte stör analysförfarandet i sig 9.

Denna metod skulle kunna utvidgas för att kvantifiera och bestämma fettsyrasammansättningen av neutrala lipider (TAG) och polära lipider (fosfolipider, glykolipider) genom användning av en fastfasextraktion (SPE) separationssteg mellan steg 2 (lipidextraktion) och steg 3 (transförestring ) såsom beskrivits av t.ex. Breuer et al. 1. Alternativt kan en tunnskiktskromatografi (TLC) steget användas för att separera olika polära lipidklasser, t ex såsom beskrivits av Wang och Benning 28.

Denna metod skulle kunna utvidgas till att användas i, till exempel, växter, djurvävnader och andra mikroorganismer. På grund av betoningen på störningar cell, är denna metod som främst lämpar sig för analys av fettsyror i material som är mycket svåra att utvinna.

Extraktionen del av metoden (steg 1 och 2) kan användas för extraktion av pigment och andra lipofila komponenter 23,25. Den cellsprängning förfarande skulle kunna användas för utvinning av andra komponenter, såsom stärkelse eller kolhydrater genom användning av andra lösningsmedelssystem (inklusive vatten).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

En del av detta arbete har genomförts med finansiellt stöd från Institutet för främjande av innovation genom vetenskap och teknik-strategisk grundforskning (IWT-SBO) projekt Solljus och Biosolar celler. Erik Bolder och BackKim Nguyen är erkända för deras bidrag till optimering av pärlan misshandeln förfarandet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tripentadecanoin (C15:0 TAG) Sigma Aldrich T4257 CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Larodan
Beadbeater Bertin Technologies Precellys 24
beadbeater tubes MP Biomedicals Lysing matrix E
116914500
GC-FID Hewlett-Packer HP6871
GC column Supelco Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl Mettler Toledo MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000 Mettler Toledo C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml VWR 612-1925
glass tubes VWR SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 VWR SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps VWR SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator VWR 445-2101
Heated Evaporator/Concentrator Cole-Parmer YO-28690-25

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
  2. Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54 (4), 621-639 (2008).
  3. Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25 (3), 294-306 (2007).
  4. Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (2), 169-177 (2012).
  5. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329 (5993), 796-799 (2010).
  6. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4 (3), 287-295 (2010).
  7. Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45 (2), 160-186 (2006).
  8. Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1 (1), 20-43 (2008).
  9. Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists' Society. 89 (2), 189-198 (2011).
  10. Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84 (4), 1879-1887 (2012).
  11. Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36 (11), 1283-1287 (2001).
  12. Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71 (9), 955-959 (1994).
  13. Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, Suppl 1 ement. 75-77 (2010).
  14. Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
  15. Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100 (23), 5988-5995 (2009).
  16. Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45 (11), 1053-1060 (2010).
  17. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
  18. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  19. Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
  20. Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28 (7), 635-638 (1002).
  21. Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77 (1), 41-47 (2009).
  22. Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing "green oil" in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109 (2), 198-201 (2010).
  23. Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106 (4), 638-648 (2010).
  24. Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
  25. Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. , (2012).
  26. Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24 (2), 253-266 (2012).
  27. Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162 (1), 21-27 (2012).
  28. Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).

Tags

Miljövetenskap kemisk analysteknik Mikroalger fettsyra triacylglycerol lipid gaskromatografi avbrott cell
Analys av fettsyrasammansättning och sammansättning i Mikroalger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Breuer, G., Evers, W. A. C., de… More

Breuer, G., Evers, W. A. C., de Vree, J. H., Kleinegris, D. M. M., Martens, D. E., Wijffels, R. H., Lamers, P. P. Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae. J. Vis. Exp. (80), e50628, doi:10.3791/50628 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter