Summary
Multi-elettrodo patch-clamp costituiscono un compito complesso. Qui vi mostriamo come, per l'automazione di molti dei passaggi sperimentali, è possibile accelerare il processo che porta al miglioramento qualitativo delle prestazioni e il numero di registrazioni.
Abstract
La tecnica del patch-clamp è oggi il metodo più consolidata per la registrazione dell'attività elettrica di singoli neuroni o dai loro compartimenti subcellulari. Tuttavia, ottenere registrazioni stabili anche da cellule singole, rimane un tempo procedura di notevole complessità. Automazione di molti passi in congiunzione con display informativo efficiente potranno agevolare sperimentali in esecuzione di un numero maggiore di registrazioni con una maggiore affidabilità e in meno tempo. Per conseguire registrazioni su larga scala abbiamo concluso l'approccio più efficiente non è di automatizzare completamente il processo ma per semplificare le fasi sperimentali e ridurre le possibilità di errore umano mentre efficientemente incorporando esperienza dello sperimentatore e feedback visivo. Con questi obiettivi in mente, abbiamo sviluppato un sistema computerizzato che centralizza tutti i controlli necessari per un esperimento di patch-clamp multi-elettrodo in una singola interfaccia, un commercbuona resa disponibile gamepad wireless, mentre la visualizzazione esperimento correlate di informazione e orientamento spunti sullo schermo del computer. Qui si descrivono le diverse componenti del sistema che ci ha permesso di ridurre il tempo necessario per raggiungere la configurazione di registrazione e sostanzialmente aumentare le possibilità di successo registrando un gran numero di neuroni contemporaneamente.
Introduction
La capacità di registrare e stimolare diversi siti con precisione micrometrica è estremamente utile per sperimentalmente conseguire una migliore comprensione dei sistemi neuronali. Molte tecniche sono stati sviluppati per questo scopo ma nessuno consentire la risoluzione submillivolt realizzato con la tecnica patch-clamp, essenziale per lo studio dell'attività sottosoglia e singoli potenziali postsinaptici. Qui copriamo lo sviluppo di un sistema di patch-clamp dodici elettrodi assistita da computer volto a registrare simultaneamente e stimolare un gran numero di singole cellule con precisione sufficiente per lo studio della connettività neuronale. Mentre molte altre applicazioni possono essere concepite per un tale sistema, si presta particolarmente bene allo studio della connettività sinaptica dato che il numero di possibili connessioni all'interno di un gruppo di neuroni cresce proporzionalmente al quadrato del numero di neuroni in questione. Pertanto, mentre un sistema a tre elettrodi consente di testare l'verificarsi di fino a sei connessioni e più spesso registrando una sola, registrazione dodici neuroni consente di testare la presenza di fino a 132 connessioni e frequentemente osservando oltre un dozzina (Figura 1). L'osservazione di decine di connessioni contemporaneamente rende possibile analizzare l'organizzazione delle piccole reti e dedurre le proprietà statistiche della struttura di rete che non può essere sondato altrimenti 1. Inoltre, la stimolazione precisa di numerose cellule permette anche la quantificazione del reclutamento di cellule postsinaptici 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione del materiale
- Manipolatori di comando da un computer
- Collegare ogni casella di controllo micromanipolatore ad un computer tramite porte seriali (RS-232).
- Implementare i comandi per il posizionamento, l'interrogazione e la regolazione delle impostazioni da inviare tramite la porta seriale. Problemi di velocità e compatibilità hardware fornite C / C + + è raccomandato come linguaggio di programmazione.
- Standardizzare il sistema di riferimento dei manipolatori modo che lo zero è la posizione più vicina possibile rispetto ai motori e movimento positivo è diretto lontano dai motori.
- Posizionare il microscopio nella posizione centrale di 2 mm dal piano focale campione (coordinate [0, 0, 2000]).
- Memorizzare, per ciascun manipolatore, le coordinate locali che consentono alla punta di una pipetta da osservare al centro del campo visivo del microscopio. Questo è il punto di riferimento iniziale per ciascun elettrodo.
- Visuaposizioni degli elettrodi. Lize è molto utile essere in grado di monitorare la posizione di ciascun elettrodo durante un esperimento. Una rappresentazione grafica è il modo più intuitivo di realizzare questo. A tal fine i sistemi di riferimento di ciascun elettrodo e quella del microscopio devono corrispondere. Un modo semplice per farlo è:
- Portare la punta di un elettrodo al centro del campo visivo.
- Memorizzare la posizione su ciascun asse del manipolatore e ciascun asse del microscopio.
- Eseguire con l'asse x del manipolatore relativamente grande movimento (1 mm).
- Individuare la punta ancora una volta muovendo solo il microscopio.
- Calcolare la differenza nella posizione microscopio sin dall'ultimo misurata. Queste sono le proiezioni del movimento dell'asse elettrodo sugli assi microscopio.
- Ripetere i passaggi 2,3-2,5 per gli assi Y e Z del manipolatore elettrodo. Ciò consente una matrice di proiezioni sul microscopio assi da determinare (<strong> Figura 2), detta anche matrice coseno:
- Invertire questa matrice per permettere di calcolare i movimenti, in tre dimensioni, richieste dal manipolatore elettrodo per raggiungere una determinata posizione nel microscopio sistema di coordinate:
- Utilizzo del punto di riferimento iniziale e la matrice coseno determinare la posizione di ciascun elettrodo di microscopio coordinate.
- Visualizzare graficamente, basato sul microscopio coordinate, la posizione di ciascun elettrodo a intervalli regolari. Abbiamo scelto di utilizzare / C + + librerie di disegno C (GDI +) per disegnare le posizioni degli elettrodi ogni 40 msec.
- Ripetere i punti 1.2.1 - 1.2.7 ogni volta angoli manipolatori vengono modificate o se sono necessari cambiamenti di posizione di alcuni millimetri, ad esempio, quando il tipo di elettrodo viene modificato.
- Abilitare la memorizzazione del positions di caratteristiche rilevanti nel tessuto, come le cellule oi punti di riferimento anatomici, in microscopio coordinate.
- Acquisire video e sovrapporre le informazioni pertinenti.
- Meccanicamente allineare l'asse x del moto del microscopio con l'asse orizzontale della fotocamera microscopio.
- Installare sul computer di un framegrabber con video dal vivo e la capacità di sovrapposizione e di un kit di sviluppo software (SDK).
- Implementare funzionamento display video in tempo reale con l'SDK.
- Convertire il sistema di coordinate microscopio al sistema di riferimento telecamera la traduzione scala appropriato.
- Disegnare le caratteristiche rilevanti in coordinate fotocamera e overlay sul video dal vivo l'immagine risultante a intervalli regolari di circa 40 msec (Figura 3).
- Amplificatori di controllo.
- Utilizzare il software amplificatore per controllare le impostazioni dell'amplificatore dall'interfaccia.
- Control oscilloscopi.
- Collegare gli oscilloscopi al PC tramite porte seriali.
- Determinare la scala dell'oscilloscopio, accoppiamento e risoluzione temporale per le varie fasi della procedura di patch-clamp in voltage-clamp (es elettrodo in bagno, formazione sigillo, configurazione whole-cell) e corrente-clamp.
- Inviare i comandi di impostazione dell'oscilloscopio appropriati ogni volta i comandi di amplificazione vengono emessi dall'interfaccia.
- Controllo della pressione pipetta.
- Assemblare un sistema di controllo pressione secondo la figura 4.
- Utilizzare un alimentatore 12 V / 5 V per fornire ogni componente elettronico in modo appropriato.
- Collegare l'uscita di una pompa a membrana per il tampone di pressione positiva (un contenitore 100 ml).
- Collegare l'ingresso di una pompa a membrana per il tampone di pressione negativa (un contenitore 100 ml).
- Collegare il tubo titolare pipetta di un sensore di pressione nella pressiori sistema di controllo e una valvola pneumatica che collega al vano pressione principale.
- Collegare ciascuno dei buffer di pressione per una valvola collegata al vano pressione principale.
- Collegare una valvola tra il vano di pressione principale e l'atmosfera.
- Collegare un sensore di pressione al compartimento pressione principale.
- Collegare un sensore di pressione per ogni buffer.
- Collegare il sistema di controllo della pressione per una scheda di acquisizione dati.
- Collegare ogni sensore di pressione ad un ingresso analogico.
- Collegare ogni valvola a un'uscita digitale.
- Rimuovere offset da tutti i sensori attraverso le valvole tranne quelli che collegano le pompe a membrana e sottraendo la pressione misurata pressione atmosferica.
- Implementare il controllo della pressione
- Definire nell'interfaccia un controllo per attivare o disattivare il controllo pressione positiva per ogni pipetta.
- Definire una pressione positiva minima per la pipettas di circa 70 mbar.
- Periodicamente (ogni 0,5 sec) rileva ogni volta la pressione in pipette sotto controllo la pressione attiva scende sotto la soglia impostata.
- Al superamento della soglia aprire il tampone di pressione positiva al vano pressione principale e il vano verso la pipetta in questione durante brevi periodi (20 msec) finché la pressione nelle pipette è sopra la soglia. Chiudere tutte le altre valvole.
- De-attivare un ulteriore controllo pressione viene avviato l'approccio finale verso una cella di interesse.
- Applicare una pressione negativa per la formazione di tenuta
- Chiudere tutte le valvole e aprire la valvola tampone di pressione negativa verso il vano di pressione principale e questo comparto verso la pipetta in questione per tutta la durata dello sperimentatore richiede mantenendo un pulsante premuto.
- Assemblare un sistema di controllo pressione secondo la figura 4.
- Centralizzare i comandi su un dispositivo di interfaccia umana.
- Collegare un wirele disponibile in commercioss gamepad al PC.
- Implementare lettura dello stato joystick. Ad esempio, utilizzare le librerie DirectX per C / C + + per eseguire letture ogni 5 msec.
- Confronta stato attuale con lo stato precedente di rilevare che sono stati premuti pulsanti, rilasciato o tenuto premuto dal passo ultima volta.
- Assegnare le funzioni a ciascun pulsante del gamepad. Un esempio di questa mappatura è mostrata in Figura 5.
2. Patch-clamp procedura
- Preparare le fette di cervello della regione di interesse.
- Mettere una fetta cervello di interesse, con la regione di interesse nel centro del range di spostamento del microscopio.
- Selezione delle cellule
- Identificare le cellule di interesse navigando con il microscopio. Memorizzare la posizione delle celle in base al sistema di coordinate microscopio con un destro del mouse sul display video dal vivo in cima alla cella di interesse. L'interfaccia grafica visualizza le celle selezionate nonché le micropipette per una visione globale e il software aggiungerà un indicatore sulla posizione della cella che verrà sovrapposta alle immagini. Inoltre, l'immagine della cella viene catturata per riferimento futuro nel file 'Cella #. Jpg'.
- Attribuzione delle cellule di pipette
- Dopo aver selezionato le cellule di interesse, assegnare pipetta che registrerà ogni cella. L'interfaccia grafica fornisce i controlli di assegnazione che devono essere impostati. Visualizza un'anteprima della configurazione finale selezionando la casella "Visualizza posizioni finali '.
- Selezionare ogni pipetta per i quali l'anteprima posizione finale è desiderato o selezionare la casella di controllo 'Seleziona tutto'. Disattivare la visualizzazione della posizione corrente per una migliore visualizzazione, se necessario.
- Preparare le Pipettes
- Riempire le pipette (6-8 mW di solito sono migliori se si utilizzano molte pipette) with soluzione intracellulare e caricarli nelle loro proprietari. Mettere le headstages nelle loro fissazioni, ma non farle scorrere in avanti per evitare di toccare la vasca da bagno con la punta della pipetta.
- Abilitare il controllo della pressione positiva e selezionare tutte le pipette per assicurare che le punte rimarranno puliti. Far scorrere delicatamente ogni headstage a posto.
- Individuazione dei puntali delle pipette
- Posizionare il microscopio in una posizione centrale, con messa a fuoco 3 mm sopra la fetta premendo il tasto R2 mentre si tiene il tasto 'A'. Utilizzare la posizione corrispondente per ogni manipolatore come memorizzato dal precedente esperimento premendo il tasto L2 tenendo premuto il pulsante A.
Nota: A questo punto non ci dovrebbero essere né ombra distintivo di una pipetta in vista o un piccolo movimento lungo l'asse della pipetta dovrebbe essere sufficiente osservare che nella maggioranza dei casi. Compensazione per le lievi differenze di forma pipetta deve essere effettuata manualmente. - Portare la punta della pipetta a fuoco. Posizionare la punta sul punto centrale rosso del display video senza spostare il microscopio (dovrebbe essere ancora in posizione [0, 0 2000]).
- Informare il software che la pipetta è al centro del display premendo il tasto Z tenendo premuto il tasto C. Dopo ogni punta della pipetta si trova, inviare tale pipetta all'indietro in modo che il successivo può essere posizionato premendo il tasto L1 tenendo premuto il pulsante A.
- Posizionare il microscopio in una posizione centrale, con messa a fuoco 3 mm sopra la fetta premendo il tasto R2 mentre si tiene il tasto 'A'. Utilizzare la posizione corrispondente per ogni manipolatore come memorizzato dal precedente esperimento premendo il tasto L2 tenendo premuto il pulsante A.
- Avvicinandosi le cellule
- Una volta che tutti i puntali delle pipette sono stati localizzati con precisione e ogni pipetta viene attribuito a una cella, posizionare automaticamente le pipette vicino alle loro rispettive celle. Basta fare clic destro nel centro del gruppo di celle e selezionare l'opzione 'Cluster' nel menu a comparsa. Nella finestra delle opzioni del cluster che apparirà, selezionare tutte le pipette che si desidera posizionare in questo periodo e clicca su 'Vai con tutte le pipette controllati'. Ripetere questa operazione per ogni cluster di cellule di interesse.
- Perform l'approccio finale manualmente. La posizione delle pipette relativi alle cellule può essere specificato in modo diverso, ma di solito è semplicemente 200 micron dalla cella nell'asse della pipetta e 200 micron superiore nella direzione verticale, che è sufficiente a mantenere la punta della pipetta fuori del tessuto . Attendere che il posizionamento delle pipette è finito e spostare il microscopio verso una pipetta premendo il tasto R1 tenendo premuto il tasto C.
- Ricalibrare ogni posizione pipetta puntando il microscopio sulla punta in qualsiasi parte del display video e premendo il tasto B mentre si tiene il pulsante C. Una griglia quadrata dovrebbe brevemente indica la posizione individuata della pipetta. Se la posizione non è corretta, posizionare la punta sul punto centrale del display video e premere il pulsante Z tenendo premuto il tasto C.
- Stabilire la configurazione cell-attached
- Verificare che la cella di interesse per la pipetta corrente è correttomarcata. In caso contrario, spostare il microscopio per abbinare la cella di interesse con il puntino rosso centrale. Segna la cella premendo il tasto Y mentre si tiene il pulsante C. Premere il tasto L2 tenendo premuto il tasto C per posizionare la pipetta 200 micron di distanza dal suo cellulare assegnata, il microscopio si sposterà automaticamente nella posizione corrispondente.
- Regolare la posizione della pipetta in modo che corrisponda il punto rosso. Regolare l'offset premendo il tasto R1 tenendo premuto il tasto X. pipetta
- Attivare l'impulso di test premendo il tasto L1 tenendo premuto il tasto X. lentamente avvicinare la pipetta alla sua cellula attribuito.
- Osservando la formazione di una fossetta sulla superficie della membrana della cellula applicare un breve impulso di pressione negativa premendo il tasto Y tenendo premuto il pulsante Z per consentire la pressione applicata per raggiungere la cella. Un potenziale di circa-65mV possesso dovrebbe istituito a questo punto premendo il tasto L2 tenendo premuto il tasto X.
- Configurazione whole-cell
- Una volta che un Giga-sigillo è formato per ogni cella, iniziare la rottura delle membrane applicando pressione negativa.
- Eseguire le registrazioni
- Utilizzare il sistema di stimolazione / acquisizione di effettuare le registrazioni. Applicare impulsi o treni di impulsi in un'unica singola cella alla volta e osservare risposte delle cellule rimanenti per mappare connettività tra le cellule registrati.
- Recedere pipette
- Una volta che le registrazioni sono finite, recedere pipette lentamente dal tessuto facendo clic destro sulla radio-pulsante Tabella. Selezionare 'recedere-> Pipettes 500 micron' di avere le pipette retrocedono a breve distanza lungo i loro assi. Osservare la deriva del potenziale delle cellule (compensazione i consigli applicando una certa pressione positiva può aiutare).
- Per recedere pipette per tutto il tragitto, impostare la velocità di posizionamento di 'Fast' e ripetere la stessa operazione, ma scegliere l'opzione 'All'. Rimuovere l'usatopipette scorrendo le headstages e svitando le pipette da parte dei titolari. E 'utile per evitare torsioni titolari nelle loro prese poiché questo potrebbe notevolmente interferire con la posizione della punta della pipetta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seguendo i metodi descritti sopra siamo riusciti a eseguire la registrazione a cellula intera fino a dodici neuroni simultaneamente, quasi raddoppiando il maggior numero di neuroni simultaneamente patch-bloccato finora. Esempi di reti di connessioni sinaptiche diretti tra piramidale neuroni registrati in strato V della corteccia somatosensoriale di ratti sono mostrati in Figura 6.
La determinazione dei profili di probabilità connessione in funzione della distanza inter-somatica per un dato tipo cellulare è una misura tipica di interesse che può essere eseguita in modo efficiente con un multi-elettrodo sistema patch-clamp 1. Recentemente foto-stimolazione cominciò ad apparire come un ancora più efficiente mezzo per ottenere tale 3,4 dati. Importante, tuttavia, i dati acquisiti con sistemi patch-clamp multi-elettrodo sperimentatori permette di ottenere una mappatura più completa della rete in fase di studio e ad alta risoluzione con colorazione intracellulare diffuso coloranti. In multi-elettrodo esperimenti di patch-clamp ogni cellula può essere registrato e stimolata, che non è spesso il caso con altre tecniche come foto-stimolazione o calcium imaging. Questa caratteristica permette sperimentatori di tenere traccia delle distorsioni nella connettività, quali l'elevata incidenza di connessioni reciproche, che non può essere misurato diversamente. Stimolando e registrando ogni neurone studiato abbiamo dimostrato che i neuroni non sono solo prevenuto verso l'essere reciprocamente connessi, ma anche formano ammassi. La scala delle nostre registrazioni anche permesso di osservare che una più alta probabilità di connessione esisteva tra coppie di neuroni che condividevano i vicini comuni, vale a dire sono stati entrambi contemporaneamente collegati ad altri neuroni individuali nella rete campione (Figura 7a). Questa osservazione è stata significativa ad ogni distanza bin intersomatica di 50 mm (da 50 a 250 mm). Abbiamo anche osservato coppie di neuroni che condividono molti comuni vicini si sono verificati significativamente piùdieci del previsto per caso (figura 7b). Inoltre, abbiamo rilevato un effetto sulla probabilità di collegamento secondo il numero di vicini comuni condivisi da una determinata coppia di neuroni. I vicini più comuni condivide la più probabile un paio di neuroni è quello di essere interconnessi (Figura 7c).
Questa tendenza porta alla formazione di gruppi di neuroni che sono più densamente interconnessi della media. È interessante notare, gruppi altamente interconnessi di neuroni esposti non solo più numerose connessioni, ma anche, in media, più forti 1. Questi risultati ci hanno portato alla conclusione che il circuito neocorticale è organizzata non solo in strati e colonne, ma anche in gruppi di cellule, cioè gruppi di neuroni che condividono denso e forte l'interconnessione sinaptica come postulato da Donald Hebb diversi decenni fa.
Altri risultati di interesse che possono essere raggiunti con più contemporaneamente patch-serrata neurons comprendono la quantificazione del reclutamento di inibizione per attività soprallimitare in un diverso numero di cellule eccitatorie 2. Una forma onnipresente di inibizione nella neocorteccia 5 è mediata dalle cellule Martinotti (figure 8a e B, adattato da Berger et al.), Che ricevono input da cellule piramidali e si integrano a sua volta colpisce, con una certa latenza, altre cellule piramidali. Abbiamo dimostrato che, dopo brevi raffiche di chiodare attività in soli quattro cellule piramidali, ogni cellula piramidale in un microcircuito locale riceve questa forma di inibizione (figure 8c, c, f). Abbiamo anche dimostrato che questi potenziali postsinaptici inibitori tendono a saturare quando otto o più cellule piramidali sono stimolati contemporaneamente (Figura 8E).
Una panoramica dei componenti del sistema può essere visto in Figura 9. L'interfaccia hardware e software are mostrato in Figura 9a e b così come l'interfaccia controllore in Figura 9c guidare gli elettrodi verso cellule registrazione sotto obiettivo microscopio (Figura 9d).
Figura 1. Calcolo del numero di connessioni osservati in un esperimento in funzione del numero di neuroni registrate simultaneamente mostra una crescita quadratica. Calcoli numerici (top). Schema illustrativo dove vengono successivamente aggiunti ulteriori neuroni della stessa rete (in basso).
Figura 2. Sistemi di coordinate di ogni manipolatore elettrodo (giallo) e microscopio (rosso).
Figura 3. Screen capture di una pipetta di approccio verso la cella assegnata con sovrapposto vettore approccio, le posizioni delle celle e barra di scala.
Figura 4. Diagramma illustrante sistema pneumatico di controllo della pressione pipetta.
Figura 5. Comandi sul dispositivo di interfaccia umana che centralizza i comandi utilizzati durante esperimenti di patch-clamp.
Figura 6. Esempio di tre reti diconnessioni sinaptiche diretti mappati in singoli esperimenti
Figura 7. Effetto comune prossimo. (A) coppie di neuroni che collegano contemporaneamente ad almeno un altro neurone nella rete campionata (blu) presentano un significativo aumento della probabilità di essere interconnessi. (B) Coppie di neuroni condividono più vicini comuni si verificano più spesso di quanto previsto per caso nelle reti campione. (c) probabilità di connessione tra coppie di neuroni aumenta in funzione del numero di vicini comuni condivisi dalla coppia.
Figura 8. Quantificazione del reclutamento di cellule Martinotti. (a) Rappresentazione grafica di una cellula piramidale (rosso) che forma sinapsi su un cellulare Martinotti (blu), che a sua volta forme sinapsi su una seconda cellula piramidale (nero). (b) la stimolazione Supra-soglia della cella piramidale ( rosso) porta al reclutamento della Cellula Martinotti (blu) attraverso l'integrazione di facilitare potenziali postsinaptici eccitatori. La cellula Martinotti reclutati quindi inibisce la seconda Cellula piramidale (nero). (C) Schema che rappresenta la stimolazione di un numero crescente di di patch-bloccato cellule piramidali e gli effetti su un altro cellulare piramidale. (D) Nella media i potenziali post-sinaptici inibitori registrate da una cellula piramidale in funzione del numero di altri vicini cellule piramidali che vengono stimolati. Adattato da Berger et al. 2 (e) L'ampiezza di inibizione disynaptic in un circuito locale tende a saturare quando 9 o più cellule piramidali sono STIMulated indicando assunzione massima di Celle Martinotti in verosimilmente raggiunto a questo punto. (f) La frazione di cellule che ricevono l'inibizione disynaptic rapidamente sale a 1 come un numero crescente di cellule piramidali sono stimolati.
Figura 9. Illustrazione del complesso del sistema. (A) Interfaccia utente grafica con la finestra principale di visualizzazione video live, finestra e rappresentazione grafica di log. (B) Microscopio e manipolatori. (C) dispositivo di interfaccia umana con controlli per procedura sperimentale. (D) Vetro micropipette in posizione per la registrazione di diversi neuroni.
Figura 10. PROBABILIT binomialefunzioni di distribuzione y che descrivono la frazione di esperimenti che registrano con successo un certo numero di cellule dato l'uso di dodici elettrodi. Confronto tra il rendimento di esperimenti eseguiti utilizzando un feedback visivo da utenti esperti sono mostrati in blu e dagli utenti meno esperti in condizioni non ideali in rosso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Una domanda immediata di solito si pone per quanto riguarda il tasso di successo della procedura che abbiamo descritto. Per le alte percentuali di successo preparazione è essenziale. Le pipette devono avere aperture di punta che sono adeguati per le cellule degli esseri registrati. Filtrare la soluzione intracellulare per evitare pipette ostruiti è anche importante. Estremamente pulite, pipette appena tirato sono un altro requisito. Una distribuzione binomiale è il modello più semplice che può essere utilizzato per capire come questi problemi influenzano la resa finale. E 'ragionevole attendersi uno sperimentatore con l'esperienza e attrezzatura adeguata per raggiungere un tasso di successo del 80% o più nella registrazione neuroni individuali con feedback visivo. I principianti possono essere tenuti a raggiungere percentuali di successo molto più bassi, soprattutto se sono trascurati importanti fasi di preparazione. Come questi tassi traducono in numero di cellule registrati per esperimento può essere visto in Figura 10. Ulteriori aumenti del numero di contemporaneamente patch-clamneuroni ped probabilmente richiedono miniaturizzazione dei manipolatori e una maggiore affidabilità della procedura, che a sua volta richiede notevole attenzione ai dettagli, ma sono del tutto fattibile.
La versatilità del sistema qui presentato è ancora in fase di studio e nuove applicazioni sono spesso individuato, in particolare nell'esplorazione del rapporto tra segnali extracellulari e l'attività singolo neurone 7. Considerazioni anatomiche diventano più importanti come la distanza fra registrate cellule aumenta. Tuttavia, questo sistema permette sicuramente indagine a lungo raggio e la connettività tra strati ovunque connessioni rimangono intatti seguendo la procedura di taglio.
Controllo micromanipolatore
Attivazione posizionamento automatico con micromanipolatori accelera notevolmente il processo di multi-elettrodo patch-clamp e aumenta la sua affidabilità ridurre il verificarsi dierrori umani. Diversi produttori offrono diverse soluzioni per stabilire una connessione dal PC ai manipolatori. Un'opzione comune è un seriale o USB. Al fine di garantire una comunicazione rapida abbiamo dedicato una porta seriale a ciascun controller manipolatore. La caratteristica più utile di posizionamento automatico è probabilmente l'eliminazione della maggior movimento laterale e verticale degli elettrodi all'interno del tessuto e ne limitano le distorsioni. Mentre il movimento degli elettrodi all'interno del tessuto avviene quasi esclusivamente lungo la direzione assiale, interferenza meccanica è minimizzato. Movimenti laterali sono necessari solo per evitare di tanto in tanto vasi sanguigni e cellule.
Visualizza le posizioni degli elettrodi
È molto utile essere in grado di monitorare la posizione di ciascun elettrodo durante un esperimento. In una tradizionale configurazione perdente vista di un elettrodo può diventare rapidamente problematico. Quando si usa un gran numero di elettrodi non èpossibile mantenere tutti gli elettrodi all'interno del campo di vista in ogni momento. Basandosi su una rappresentazione grafica è l'alternativa più intuitiva e inoltre aiuta a tenere traccia dello stato di avanzamento dell'esperimento, immediatamente mostrando che gli elettrodi sono già stati posizionati nella loro configurazione finale e quelli che non hanno.
Acquisizione video e overlay
La possibilità di visualizzare video in diretta dal campo microscopio di vista su una finestra di applicazione è molto utile. La finestra di visualizzazione è stato programmato per rispondere ai clic del mouse che consente lo stoccaggio di posizioni di interesse (somata cella) e rapido aggiornamento delle posizioni relative tra microscopio e elettrodi eliminazione di errori accumulati quando compaiono. Abbiamo anche implementato la sovrapposizione di informazioni pratiche sul video dal vivo come la traiettoria di avvicinamento per ogni elettrodo verso le cellule selezionate o la marcatura di queste cellule (Figura 3). Registrazione oF Caratteristiche e sovrapposizione di immagini ausiliari quali figure da atlanti anatomici è stata implementata anche per assistere in cui le regioni di interesse non sono immediatamente chiare.
Amplificatori
Controllati dal computer amplificatori microscopio possono consentire il controllo avvenga da altre applicazioni. Questo aumenta drasticamente la velocità e l'affidabilità con cui più celle possono essere registrati simultaneamente ed elimina la principale fonte di errori umani. Dopo il posizionamento e la pressione pipetta controllo del computer-assistita questo è il passo che produce i guadagni più evidenti in tempo, ma i guadagni in termini di affidabilità sono ancora più importanti.
Oscilloscopi
Garantire che i segnali di test possono essere visualizzati in tempo reale su scala appropriata e risoluzione temporale migliora notevolmente l'efficienza con cui uno sperimentatore può eseguire operazioni sperimentali. Accoppiando il set oscilloscopioTings all'amplificatore modalità (come clamp di corrente o tensione) ci ha assicurato che passi time-critical sono stati eseguiti e visualizzati con poco sforzo, come in possesso di cellule a opportuni potenziali di membrana subito dopo aver raggiunto la configurazione allegata cella. Visualizzazione corretta è stata assicurata mediante l'invio di appositi scala e di accoppiamento comandi tramite la porta seriale nel proprio protocollo dell'oscilloscopio per adattare l'ampiezza e l'offset dei segnali di test all'interno dello schermo dell'oscilloscopio.
Controllo della pressione Pipetta
Poiché il numero di elettrodi impiegati in un esperimento aumenta, assicurando che la pressione positiva viene applicata a tenere permanentemente la punta degli elettrodi di vetro pulito diventa più esigente al punto da costituire un ostacolo importante. Pressione positiva e negativa sufficiente (poche centinaia di mbar) può essere generato da semplici pompe a membrana. Al fine di stabilizzare la pressione, queste pompe sono accoppiate a riservoirs di circa 100 ml la cui apertura e chiusura è stato controllato da valvole pneumatiche. Le valvole a loro volta controllati dal computer utilizzando una scheda di acquisizione dati. Lo schema del circuito pneumatico può essere visto in Figura 4. Il regolatore di pressione svolge un ruolo importante non solo assicurando che le punte delle pipette rimangono puliti ma anche consentendo la formazione di guarnizioni gigaohm rapidamente, sull'osservazione di fossette sulla membrana cellulare come pipette toccano le cellule, accelerando ulteriormente la procedura.
Il dispositivo di interfaccia umana
La maggior parte delle configurazioni sperimentali hanno i controlli delle attrezzature sperimentali ampiamente dispersi su una vasta area. Ci siamo concentrati i controlli più comunemente utilizzati su un singolo gamepad wireless (Figura 5) riducendo notevolmente il tempo e gli sforzi necessari per registrare ogni cella, ma, soprattutto, eliminando le fonti di errore umano che spesso possono portare grandi esperimenti per una e prematurand.
Linguaggio di programmazione
Abbiamo avuto poca scelta in termini di linguaggio di programmazione per questa applicazione poiché l'unico linguaggio che ha sostenuto l'integrazione di tutta l'attrezzatura necessaria è C / C + +. Un grande vantaggio di C / C + + è la possibilità di implementare più thread di elaborazione e pienamente profitto dal miglioramento delle prestazioni consentita dai processori multi-core.
Acquisizione dati elettrofisiologici
Il sistema abbiamo descritto lascia la scelta del software di registrazione elettrofisiologica e sistema di acquisizione dati fino al sperimentatore. Scambio di comunicazioni tra il software di acquisizione dei dati e la nostra applicazione può avvenire attraverso le porte seriali o tramite comunicazione socket tramite la rete.
Prospettive future
Più di 30 anni da quando Sakmann e Neher di esperimenti seminali, la tecnica del patch-clamp è stilsolo nel fornire dati con una particolare combinazione di risoluzione del segnale e la frequenza di campionamento che sono necessari per una grande varietà di esperimenti, in particolare l quelle riguardanti la rilevazione di singole correnti post-sinaptiche o potenziali. Con lo sviluppo di un sistema computerizzato che consente la registrazione di molti neuroni contemporaneamente abbiamo puntato ad ampliare le possibilità sperimentali della tecnica del patch-clamp. Combinazione di tali nuove possibilità con i recenti sviluppi delle neuroscienze sperimentali 8-13 può aprire la strada verso una comprensione più profonda dei circuiti neuronali con velocità e dettaglio senza precedenti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, e Sonia Garcia per preziosi consigli sul miglioramento della procedura di automazione patch-clamp. Ringraziamo Rajnish Ranjan per la consulenza e l'assistenza con l'implementazione software di valore. Questo lavoro è stato finanziato in parte dal progetto Synapse UE e in parte dal Programma di Scienza Human Frontiers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
References
- Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).
- Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
- Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
- Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
- Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
- Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).
- Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).
