Summary
Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Aufnahmen bilden eine komplexe Aufgabe. Hier zeigen wir, wie durch die Automatisierung vieler Versuchsschritten ist es möglich, den Prozess zur qualitativen Verbesserung der Leistung und der Anzahl der Aufnahmen zu beschleunigen.
Abstract
Die Patch-Clamp-Technik ist heute die etablierten Verfahren zur Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von einzelnen Neuronen, Zellen oder Zell Fächern. Dennoch Erreichen eines stabilen Aufnahmen, auch aus einzelnen Zellen, bleibt ein zeitaufwendiges Verfahren von beträchtlicher Komplexität. Automatisierung von vielen Schritten in Verbindung mit effizienter Informationsanzeige kann sehr helfen Experimentatoren bei der Durchführung einer größeren Anzahl von Aufnahmen mit größerer Zuverlässigkeit und in weniger Zeit. Um großflächige Aufnahmen zu erreichen schlossen wir der effizienteste Ansatz ist nicht vollständig zu automatisieren den Prozess, sondern um die experimentellen Schritte zu vereinfachen und reduzieren die Chancen auf menschliche Fehler während effizient Erfahrung des Experimentators und visuelles Feedback Einbeziehung. Mit diesen Zielen vor Augen haben wir ein computergestütztes System, das alle notwendigen Kontrollen für eine Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Experiment in einer einzigen Schnittstelle, einem commerc zentralisiert entwickeltmathematisch verfügbaren Wireless-Gamepad, während der Anzeige Experiment bezogene Informationen und Führungssignale auf dem Computer-Bildschirm. Hier beschreiben wir die verschiedenen Komponenten des Systems, die uns die Zeit zum Erreichen der Aufnahmekonfiguration zu reduzieren und die Chancen für die erfolgreiche Aufnahme einer großen Anzahl von Nervenzellen gleichzeitig zu erhöhen erlaubt.
Introduction
Die Fähigkeit, mehrere Seiten mit Mikrometer-Präzision aufnehmen und zu stimulieren ist sehr nützlich für experimentell ein besseres Verständnis der neuronalen Systemen. Viele Techniken haben zu diesem Zweck entwickelt worden, aber die submillivolt Beschluss der Patch-Clamp-Technik, die für das Studium unterschwellige Aktivität und einzelnen postsynaptischen Potentiale erreicht keiner erlauben. Hier behandeln wir die Entwicklung eines Zwölf-Elektrode computergestützten Patch-Clamp-System bei gleichzeitiger Aufnahme und Förderung einer großen Anzahl von Einzelzellen mit ausreichender Genauigkeit für die Untersuchung der neuronalen Konnektivität gerichtet. Während viele andere Anwendungen für ein solches System konzipiert werden, eignet es sich besonders gut für die Untersuchung von synaptischer Verbindungen gegeben, dass die Anzahl der möglichen Verbindungen innerhalb einer Gruppe von Neuronen wächst proportional zu dem Quadrat der Anzahl von Neuronen in Frage. Während also ein System mit drei Elektroden ermöglicht die Prüfung derAuftreten von bis zu sechs Verbindungen und meist Aufnahme eines einzigen, Aufzeichnungs zwölf Neuronen ermöglicht das Testen des Auftretens von bis zu 132 Anschlüsse, und oft mehr als ein Dutzend beobachtet (Abbildung 1). Die Beobachtung von Dutzenden von Verbindungen gleichzeitig ist es möglich, die Organisation von kleinen Netzwerken zu analysieren und zu schließen statistische Eigenschaften der Netzwerkstruktur, die nicht anderweitig 1 untersucht werden können. Darüber hinaus ermöglicht eine präzise Stimulation von zahlreichen Zellen auch die Quantifizierung der Rekrutierung von postsynaptischen Zellen 2.
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Protocol
1. Vorbereitung der Ausrüstung
- Steuer Manipulatoren von einem Computer
- Schließen Sie jedes Mikromanipulator Controller-Box an einen Computer über serielle Schnittstellen (RS-232).
- Implementieren Sie die Befehle für die Positionierung, Abfrage und die Einstellungen vornehmen, um über die serielle Schnittstelle gesendet werden. Angesichts Geschwindigkeit und Hardware-Kompatibilitätsprobleme C / C + + als Programmiersprache empfohlen.
- Standardisieren Sie das Bezugssystem der Manipulatoren, so dass Null ist der nächstmögliche Position in Bezug auf die Motoren und positive Bewegung weg von den Motoren gerichtet.
- Positionieren des Mikroskops an seiner zentralen Position 2 mm oberhalb der Probe Brennebene (Koordinaten [0, 0, 2000]).
- Speicher für jeden Manipulator, der lokalen Koordinaten, die die Spitze einer Pipette, in der Mitte des Sichtfeldes des Mikroskops beobachtet werden können. Dies ist der erste Bezugspunkt für jede Elektrode.
- VisuaLize Elektrodenpositionen. Es ist sehr nützlich, um die Position einer jeden Elektrode während eines Experiments zu verfolgen. Eine grafische Darstellung ist die intuitive Weise, dies zu erreichen. Zu diesem Zweck werden die Referenzsysteme jeder Elektrode und der des Mikroskops abgeglichen werden müssen. Ein einfacher Weg, dies zu erreichen ist:
- Bringt die Spitze einer Elektrode zu der Mitte des Sichtfeldes.
- Speichern die Position auf jeder Achse des Manipulators und jede Achse des Mikroskops.
- Ausführen mit der x-Achse des Manipulators eine relativ große Bewegung (1 mm).
- Suchen Sie die Spitze noch einmal bewegen nur das Mikroskop.
- Berechnen Sie die Differenz im Mikroskop Position, seit es zuletzt gemessen. Dies sind die Vorsprünge des Elektrodenachsenbewegung auf das Mikroskop Achsen.
- Die Schritte von 2,3 bis 2,5 für die Y-und Z-Achsen der Elektrodenmanipulator. Dies ermöglicht eine Matrix von Vorsprüngen auf dem Mikroskop-Achsen bestimmt werden (<strong> Abbildung 2) auch als Kosinus-Matrix:
- Invertieren dieser Matrix, die es ermöglichen, die Bewegungen in drei Dimensionen, die durch die Elektrode Manipulator erforderlich, um eine bestimmte Position im Mikroskop Koordinatensystem zu erreichen berechnen:
- Mit dem ersten Referenzpunkt und der Kosinus-Matrix bestimmen die Position jeder Elektrode in Mikroskop koordiniert.
- Grafisch dargestellt, basierend auf dem Objektkoordinaten, die Position jeder Elektrode in regelmäßigen Abständen. Wir entschieden uns für C / C + +-Bibliotheken Zeichnung (GDI +) zu verwenden, um Elektrodenpositionen alle 40 ms zu ziehen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 - 1.2.7 jedem Manipulator Winkel verändert oder Positionsänderungen von mehreren Millimetern erforderlich sind, zum Beispiel wenn die Art der Elektrode verändert wird.
- Aktivieren Sie das Speichern der Positionierungns der relevanten Merkmale in das Gewebe, wie z. B. Zellen oder anatomischen Referenzpunkten, die im Mikroskop koordiniert.
- Erwerben Sie Video-und relevanten Informationen zu überlagern.
- Mechanisch die x-Achse der Bewegung des Mikroskops ausgerichtet mit der horizontalen Achse des Mikroskop-Kamera.
- Installieren Sie auf dem Computer einen Framegrabber mit Live-Video-und Overlay-Fähigkeit und ein Software Development Kit (SDK).
- Implementieren Sie Live-Video-Display-Betrieb mit dem SDK.
- Konvertieren das Mikroskop Koordinatensystem der Kamera-Referenzsystem durch die geeignete Übersetzung und Skalierung.
- Daraus die relevanten Merkmale in Kamerakoordinaten und die Überlagerung auf dem Live-Video das resultierende Bild in regelmäßigen Abständen von etwa 40 ms (Fig. 3).
- Regelverstärker.
- Verwenden Sie die Software, um die Verstärker Verstärkereinstellungen von der Schnittstelle zu steuern.
- CoNTROL Oszilloskope.
- Schließen Sie die Oszilloskope mit seriellen Schnittstellen mit dem PC.
- Bestimmen Sie die Oszilloskop-Skala, Kupplung und zeitliche Auflösung für die verschiedenen Schritte der Patch-Clamp-Verfahren in Voltage-Clamp (zB Elektrode im Bad, Dichtung Bildung, Ganzzell-Konfiguration) und Strom-Klemme.
- Senden der geeigneten Oszilloskop Einstellbefehle wenn Verstärker Befehle von der Schnittstelle ausgegeben.
- Steuer Pipette Druck.
- Zusammenstellung eines Drucksteuersystems gemäß 4.
- Verwenden Sie eine 12 V / 5 V-Stromversorgung, jede elektronische Komponente entsprechend zu versorgen.
- Den Ausgang der Membranpumpe nach einem der Überdruckpuffer (100 ml Behälter).
- Den Eingang einer Membranpumpe mit der Unterdruckpuffer (100 ml Behälter).
- Verbinden den Pipettenhalter Schlauch mit einem Drucksensor in der pressuWiedersteuersystem und ein pneumatisches Ventil, das an dem Hauptdruckraum verbindet.
- Verbinden jeder der Druckpuffer auf ein Ventil mit der Hauptdruckkammer verbunden ist.
- Verbinden eines Ventils zwischen der Hauptdruckkammer und der Atmosphäre.
- Schließen Sie einen Drucksensor an der Hauptdruckraum.
- Schließen Sie einen Drucksensor, der jeden Puffer.
- Schließen Sie den Druckkontrollsystem mit einer Datenerfassungskarte.
- Verbinden Sie jeden Drucksensor mit einem Analogeingang.
- Verbinden jedes Ventil mit einem digitalen Ausgang.
- Entfernen Atmosphärendruck durch Öffnen aller Ventile mit Ausnahme der Verbindung zu den Membranpumpen und Subtraktion der gemessene Druck von allen Sensoren kompensiert.
- Implementieren Druckkontrolle
- Definieren Sie in der Schnittstelle ein Steuerelement zu aktivieren oder zu de-aktivieren positive Druckregelung für jede Pipette.
- Definieren Sie eine minimale Überdruck für die Pipettes von etwa 70 mbar.
- In regelmäßigen Abständen (alle 0,5 sec) erkennen, wenn Druck in Pipetten unter aktiver Druckregelung unter den eingestellten Schwellenwert.
- Nach der Schwellenwertüberschreitung öffnen Sie die Überdruckpuffer in den Hauptdruckraum und dieses Fach in Richtung der Pipette in Frage während der kurzen Perioden (20 ms), bis der Druck in den Pipetten oberhalb der Schwelle ist. Schließen Sie alle anderen Ventile.
- De-aktivieren weitere Druckkontrolle als der letzte Ansatz für eine Zelle von Interesse ausgelöst.
- Bewerben Unterdruck zur Bildung Dichtung
- Schließen Sie alle Ventile und öffnen Sie die Unterdruckpuffer Ventil in Richtung der Hauptdruckraum und dieses Fach in Richtung der Pipette in Frage für die Dauer der Experimentator erfordert, indem sie eine Taste gedrückt wird.
- Zusammenstellung eines Drucksteuersystems gemäß 4.
- Zentralisieren Sie Befehle auf eine Human Interface Device.
- Schließen Sie einen handelsüblichen wireless-Gamepad an den PC.
- Implementieren Auslesen der Joystick-Status. So verwenden Sie die DirectX-Bibliotheken für C / C + +, um alle 5 ms Anzeigen durchzuführen.
- Vergleichen Sie den aktuellen Status mit früheren Status zu erkennen, welche Tasten betätigt wurden, freigegeben oder gedrückt gehalten seit dem letzten Zeitschritt.
- Zuweisen von Funktionen zu jeder Taste in dem Gamepad. Ein Beispiel dieser Abbildung ist in Fig. 5 gezeigt.
2. Patch-Clamp-Verfahren
- Vorbereitung der Hirnschnitten der Region von Interesse.
- Legen Sie einen Hirnschnitt von Interesse, mit dem interessierenden Bereich in der Mitte des Verschiebebereich des Mikroskops.
- Zellselektion
- Identifizieren Zellen von Interesse, indem Sie mit dem Mikroskop. Bewahren Sie die Position der Zellen auf der Basis des Mikroskops ein Koordinatensystem mit der rechten Maustaste auf das Live-Video-Anzeige auf der Oberseite der Zelle von Interesse. Die grafische Oberfläche werden die ausgewählten Zellen sowie die Mikropipetten für einen globalen Überblick und Software anzuzeigen, eine Markierung auf der Zellposition, die auf den Bildern überlagert werden hinzuzufügen. Darüber ein Bild von der Zelle wird für die Zukunft in der Datei 'Zelle #. Jpg' eingefangen.
- Namensnennung von Zellen, Pipetten
- Nach der Auswahl der Zellen von Interesse, weisen Sie die Pipette jede Zelle aufnehmen wird. Die grafische Oberfläche bietet Zuordnung Steuerelemente, die eingestellt werden soll. Visualisieren Sie eine Vorschau auf die endgültige Konfiguration indem Sie die Kontrollkästchen 'Final Positionen Show'.
- Wählen Sie jede Pipette, für die die endgültige Position Vorschau gewünscht oder überprüfen Sie die "Select All" Kontrollkästchen. Deaktivieren Sie die Anzeige der aktuellen Position zur besseren Visualisierung, wenn nötig.
- Bereiten Sie die Pipetten
- Füllen Sie die Pipetten (6-8 MOhm sind in der Regel am besten, wenn viele Pipetten verwendet werden) with intrazellulären Lösung und laden sie in ihre Inhaber. Legen Sie die headstages in ihren Aufzeichnungen aber nicht schieben Sie sie nach vorne zu vermeiden, berühren Sie das Bad mit der Pipettenspitze.
- Aktivieren Sie die positive Drucksteuerung und wählen Sie alle Pipetten, um sicherzustellen, dass die Spitzen bleibt sauber. Schieben Sie jede heads an Ort und Stelle.
- Auffinden der Pipettenspitzen
- Positionieren Sie das Mikroskop in eine zentrale Position mit Fokus 3 mm über der Scheibe durch Drücken der Taste bei gedrückter R2-Taste 'A'. Verwenden Sie die entsprechende Position für jeden Manipulator aus dem vorherigen Experiment durch Drücken der Taste L2-Taste gespeichert werden, während A. Halten
Hinweis: An dieser Stelle sollte es entweder ein unverwechselbares Schatten einer Pipette in Aussicht oder eine kleine Bewegung entlang der Pipette Achse sein sollte, genug, um es in den meisten Fällen zu beobachten. Vergütung für die leichte Unterschiede in Form Pipette muss manuell durchgeführt werden. - Bringen Sie die Pipettenspitze in den Fokus. Die Spitze auf dem roten Punkt in der Mitte des Videoanzeige ohne Bewegung des Mikroskops (es sollte noch in Position [0, 0 2000] sein).
- Informieren Sie die Software, die die Pipette ist in der Mitte der Anzeige durch Drücken der Taste Z, während die Taste C gehalten Nach jeder Pipettenspitze befindet, senden diese Pipette nach hinten, so dass die folgende kann man durch Drücken der Taste L1-Taste, während A. hält befinden
- Positionieren Sie das Mikroskop in eine zentrale Position mit Fokus 3 mm über der Scheibe durch Drücken der Taste bei gedrückter R2-Taste 'A'. Verwenden Sie die entsprechende Position für jeden Manipulator aus dem vorherigen Experiment durch Drücken der Taste L2-Taste gespeichert werden, während A. Halten
- Annäherung an die Zellen
- Sobald alle Pipettenspitzen haben genau lokalisiert worden und jede Pipette wird mit einer Zelle zugeschrieben, die Pipetten in der Nähe ihrer jeweiligen Zellen automatisch zu positionieren. Einfach mit der rechten Maustaste in der Mitte der Gruppe von Zellen, und wählen Sie die Option 'Cluster' im Popup-Menü. Auf dem Cluster-Optionen-Fenster, die angezeigt wird, wählen Sie alle Pipetten, die Sie in dieser Zeit positionieren möchten, und klicken Sie auf 'Go mit allen Pipetten überprüft. Wiederholen dieses Vorgangs für jedes Cluster von Zellen von Interesse.
- Perform den Endanflug manuell. Die Position der Pipette in Bezug auf die Zellen unterschiedlich festgelegt werden, aber gewöhnlich ist einfach 200 &mgr; m entfernt von der Zelle in der Achse der Pipette und 200 um darüber in der vertikalen Richtung, die ausreichen, um die Pipettenspitze außerhalb des Gewebes zu halten, ist . Warten Sie, bis die Positionierung der Pipetten ist fertig und das Mikroskop zu bewegen in Richtung einer Pipette durch Drücken der Taste bei gedrückter R1-Taste C.
- Kalibrieren Sie jede Pipette Position durch die Fokussierung des Mikroskops auf der Spitze überall in der Videoanzeige und Drücken der Taste B bei gedrückter Taste C ein quadratisches Gitter sollte kurz erscheinen, die die identifizierten Position der Pipette. Wenn die Position nicht korrekt ist, positionieren Sie die Spitze auf dem zentralen Punkt der Videoanzeige und drücken Sie die Taste Z gedrückt gehaltener Taste C.
- Stellen Sie die Cell-Attached-Konfiguration
- Bestätigen Sie, dass die Zelle von Interesse für die aktuelle Pipette richtig istmarkiert. Ansonsten bewegen das Mikroskop, um die Zelle von Interesse mit dem zentralen roten Punkt übereinstimmen. Markieren Sie die Zelle mit der Taste Y-Taste bei gedrückter C-Taste drücken, während L2 Taste C halten, um die Pipette 200 um weg von dem ihm zugewiesenen Zelle positionieren, wird das Mikroskop automatisch in die entsprechende Position zu bewegen.
- Stellen Sie die Pipette Position, damit es den roten Punkt übereinstimmt. Stellen Sie die Pipette durch Drücken der Taste R1-Taste, während X. hält Offset
- Aktivieren Sie den Testimpuls durch Drücken der Taste bei gedrückter L1-Taste X. Langsam nähern sich der Pipette auf seine Zelle zurückgeführt.
- Nach Beobachtung der Bildung einer Vertiefung auf der Oberfläche der Membran der Zelle gelten eine kurze Puls der Unterdruck durch Drücken der Taste Y, während die Taste Z halten, damit der aufgebrachte Druck, um die Zelle zu erreichen. Ein Haltepotential von etwa-65mV sei an dieser Stelle durch Drücken der Taste L2, während die Taste X. Holding gegründet
- Whole-Cell-Konfiguration
- Sobald eine Giga-Dichtung für jede Zelle gebildet, beginnen Aufbrechen der Membranen durch Aufbringen von Unterdruck.
- Führen Aufnahmen
- Verwenden Sie die Stimulation / Erfassungssystem, um Ihre Aufnahmen durchzuführen. Gelten Impulse oder Impulsfolgen auf einer Einzelzelle zu einer Zeit und Reaktionen beobachten, auf den übrigen Zellen, um die Verbindung zwischen den aufgenommenen Zellen abzubilden.
- Zurücktreten Pipetten
- Sobald Aufnahmen fertig sind, zurücktreten Pipetten langsam aus dem Gewebe mit der rechten Maustaste auf die Tabelle Radio-Button. Wählen Sie "zurücktreten-> Pipetten 500 um" zu haben, die Pipetten rücken eine kurze Strecke entlang ihrer Achsen. Beachten Sie die Drift in Potential der Zellen (Clearing die Tipps durch die Anwendung einiger positiver Druck kann helfen).
- Um Pipetten ganzen Weg zurück zurückgehen, stellen Sie die Positionierungsgeschwindigkeit auf 'Fast' und wiederholen Sie den gleichen Vorgang, aber wählen Sie das "Alle"-Option. Entfernen Sie die verbrauchtePipetten durch vorsichtiges Schieben Sie die headstages und Lösen der Pipetten aus den Halterungen. Es ist nützlich, um zu vermeiden, drehen die Inhaber in ihren Höhlen da dies stark mit der Pipettenspitze Position stören.
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Representative Results
Nach den oben beschriebenen Verfahren ist es gelungen, gleichzeitig ausführen Ganzzell-Aufzeichnung von bis zu zwölf Neuronen nahezu verdoppelt die größte Anzahl von Neuronen gleichzeitig patch-geklemmt so weit. Beispiele für Netzwerke der direkten synaptischen Verbindungen zwischen den pyramidalen Neuronen in Schicht V im somatosensorischen Cortex von Ratten sind in Abbildung 6 gezeigt.
Die Bestimmung der Verbindungswahrscheinlichkeit Profile als eine Funktion der Zwischenkörperabstand für einen gegebenen Zelltyp ist eine typische Messung des Interesses, die effizient mit einem Multielektroden Patch-Clamp-System 1 ausgeführt werden können. Kürzlich begann Foto-Stimulation als eine noch effizientere Mittel, um solche Daten 3,4 angezeigt. Wichtig ist jedoch, die mit Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Systemen erfassten Daten ermöglicht Experimentatoren, um eine vollständige Abbildung des Netzwerks unter-Studie sowie hochauflösende Färbung mit inner erhaltenzellulären diffuses Farbstoffen. In Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Experimente kann jede Zelle aufgenommen und gefördert werden, was oft nicht der Fall ist mit anderen Techniken, wie Photostimulation oder Calcium-Imaging. Diese Funktion ermöglicht es, den Überblick über Experimentatoren Verzerrungen in Anbindung zu halten, wie die hohe Inzidenz von wechselseitigen Verbindungen, die sonst nicht gemessen werden kann. Durch die Stimulation und Aufzeichnung jedes studierte Neuron haben wir gezeigt, dass Neuronen sind nicht nur in Richtung wechselseitig verbunden vorgespannt, sondern bilden auch Clustern. Die Skala unserer Aufnahmen erlaubt uns auch, zu beobachten, dass eine höhere Verbindungswahrscheinlichkeit zwischen Paaren von Neuronen, die gemeinsamen Nachbarn, also wurden beide gleichzeitig zu anderen einzelnen Neuronen in der Stichprobe Netzwerk (7a) verbunden gemeinsamen existierte. Diese Beobachtung war signifikant bei allen Zwischenwirbelabstand Behälter von 50 mm (von 50 bis 250 mm). Wir beobachteten auch Paare von Nervenzellen teilen viele gemeinsame Nachbarn traten signifikant vonals zehn zufällig (7b) erwartet. Darüber hinaus wirkt sich auf Verbindungswahrscheinlichkeit wiesen wir nach der Anzahl der gemeinsamen Nachbarn von einem gegebenen Paar von Neuronen gemeinsam genutzt. Je mehr gemeinsame Nachbarn teilt, desto wahrscheinlicher ein Paar von Neuronen miteinander verbunden (Abbildung 7c) werden.
Diese Tendenz zur Bildung von Gruppen von Neuronen, die dichter miteinander verbunden sind als der Durchschnitt. Interessant ist, stark vernetzten Gruppen von Neuronen zeigten nicht nur mehr, sondern auch zahlreiche Verbindungen, in Durchschnitt stärkeren ein. Diese Ergebnisse führten uns zu dem Schluss, dass neocortical Schaltung ist nicht nur in Schichten und Spalten organisiert sind, sondern auch in Zellverbänden, dh Gruppen von Neuronen teilen dichte und starke synaptische Vernetzung von Donald Hebb als postulierte vor einigen Jahrzehnten.
Weitere Ergebnisse von Interesse, die mit mehreren gleichzeitig Patch eingespannten n erreicht werden kanneurons gehören die Quantifizierung der Rekrutierung von Hemmung durch über Schwelle Aktivität in unterschiedlicher Anzahl von erregenden Zellen 2. Eine allgegenwärtige Form der Hemmung in der Großhirnrinde 5 wird durch Martinotti Zellen (8a und b, von Berger et al. Angepasst), die Eingabe von Pyramidenzellen erhalten und integrieren sie wiederum beeinflussen, mit etwas Wartezeit, andere Pyramidenzellen vermittelt. Wir haben gezeigt, dass nach kurzen Ausbrüchen von Spike-Aktivität in nur vier Pyramidenzellen, jede Pyramidenzelle in einer lokalen Mikroschaltung erhält diese Form der Hemmung (8c, c, und f). Wir zeigten auch, dass diese inhibitorischen postsynaptischen Potentiale neigen dazu, zu sättigen, wenn acht oder mehr Pyramidenzellen werden gleichzeitig stimuliert (8E).
Ein Überblick über die Systemkomponenten in Fig. 9 gesehen werden. Die Software-Schnittstelle und Hardware-arE in Fig. 9a und b sowie die Controller-Schnittstelle in 9c Führen der Elektroden gegen Zellen zum Aufzeichnen unter Mikroskopobjektiv (9d) gezeigt.
Fig. 1 ist. Berechnung der Anzahl der in einem Experiment als eine Funktion der Anzahl von Neuronen gleichzeitig aufgezeichnet beobachtet Verbindungen zeigt ein quadratisches Wachstum. Numerische Berechnungen (oben). Illustratives Diagramm, wo weitere Neuronen der gleichen Netzwerk nacheinander zugegeben (unten).
2. Koordinatensysteme der einzelnen Elektrodenmanipulator (gelb) und Mikroskop (rot).
3. Bildschirmerfassung einer Pipette in Ansatz zugeordnet Zelle mit überlagerten Ansatz Vektor, Zellpositionen und Maßstab.
4. Schematische Darstellung Pneumatiksystem für Pipettendruckregelung.
5. Befehle auf dem Human Interface Device, die Kontrollen während der Patch-Clamp-Experimente verwendet zentralisiert.
6. Beispiel von drei NetzenDirekt synaptischen Verbindungen in einzelnen Experimenten abgebildet
Abbildung 7. Gemeinsames Nachbareffekt. (A) Paare von Neuronen, die gleichzeitig eine Verbindung zu mindestens einem anderen Neuron in der abgetasteten Netz (blau) zeigen eine deutlich erhöhte Wahrscheinlichkeit aufweisen, miteinander verbunden. (B) Paare von Neuronen teilen mehreren gemeinsamen Nachbarn häufiger auftreten als erwartet zufällig in den abgetasteten Netzwerken. (c) Verbindungs Wahrscheinlichkeit Paare von Neuronen als eine Funktion der Anzahl der gemeinsamen Nachbarn durch das Paar geteilt.
Abbildung 8. Die Quantifizierung der Rekrutierung von Martinotti Cells. (a) Grafische Darstellung einer Pyramidenzelle (rot), die Synapsen auf eine Martinotti Zelle (blau), die wiederum bildet Synapsen auf eine zweite Pyramidenzelle (schwarz) bildet. (b) Supra-Schwelle Stimulation der Pyramidenzelle ( rot) führt zur Rekrutierung der Martinotti Zelle (blau) durch die Integration zu erleichtern exzitatorischen postsynaptischen Potentiale. Die rekrutiert Martinotti Handy hemmt dann die zweite Pyramidenzelle (schwarz). (C) Diagramm, das die Stimulation einer wachsenden Zahl von Patch-Pyramidenzellen eingespannt und die Auswirkungen auf die anderen Pyramidenzelle. (D) Durchschnittliche Hemmende postsynaptischen Potentiale aus einer Pyramidenzelle aufgezeichnet als Funktion der Anzahl von anderen nahe gelegenen Pyramidenzellen, die stimuliert werden. Von Berger et al. 2 (e) Angepasst Die Amplitude disynaptic Hemmung in einem lokalen Schaltung dazu neigt, zu sättigen, wenn 9 oder mehr Pyramidenzellen sind stimulated Angabe maximale Rekrutierung von Zellen in Martinotti wahrscheinlich an diesem Punkt erreicht. (f) Der Anteil der Zellen, die Hemmung disynaptic schnell auf 1 steigt, da immer mehr Pyramidenzellen stimuliert werden.
Abbildung 9. Illustration von Ensemble des Systems. (A) Grafische Benutzeroberfläche mit Hauptfenster, Live-Video-Display, melden Sie Fenster und grafische Darstellung. (B) Mikroskop und Manipulatoren. (C)-Schnittstellengerät mit Reglern für experimentelle Verfahren. (D) Glas Mikropipetten in Position für die Aufnahme mehrerer Neuronen.
Abbildung 10. Binomial probability Verteilungsfunktionen, die den Bruchteil der Experimente, die eine bestimmte Anzahl von Zellen Bei der Verwendung zwölf Elektroden erfolgreich aufnehmen zu beschreiben. Vergleich zwischen der Rendite von Experimenten durchgeführt, mit visuellen Rückmeldungen von erfahrenen Benutzern sind in Blau und von weniger erfahrenen Benutzern in nicht idealen Bedingungen gezeigt in rot.
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Discussion
Eine unmittelbare Frage stellt sich in der Regel über die Erfolgsquote des Verfahrens, die wir beschrieben. Für hohe Erfolgsraten Vorbereitung ist unerlässlich. Pipetten müssen Spitzenöffnungen, die ausreichend für den aufgenommenen Zellen Wesen sind. Filtern des intrazellulären Lösung verstopfte Pipette zu vermeiden, ist ebenfalls wichtig. Extrem sauber, frisch gezapftes Pipetten sind eine weitere Voraussetzung. Eine Binomialverteilung ist das einfachste Modell, die verwendet werden können, um zu verstehen, wie diese Probleme betreffen die endgültige Ausbeute. Es ist sinnvoll, um ein Experimentator mit Erfahrung und richtige Ausrüstung, um eine Erfolgsquote von 80% oder mehr in der Aufnahme einzelner Neuronen mit visuellem Feedback zu erreichen erwarten. Anfänger können erwartet werden, viel geringere Erfolgsraten zu erreichen, vor allem, wenn wichtige Vorbereitungsschritte übersehen werden. Wie diese Sätze zu übersetzen in der Anzahl der Zellen pro Experiment aufgenommen wurden, können in Abbildung 10 zu sehen. Weitere Erhöhungen in der Anzahl der gleichzeitig Patch-Muschelped Neuronen erfordert wahrscheinlich Miniaturisierung von Manipulatoren und erhöhte Zuverlässigkeit des Verfahrens, das wiederum erfordert erhebliche Aufmerksamkeit zum Detail, sind aber durchaus möglich.
Die Vielseitigkeit der hier vorgestellte System ist noch erforscht und neuartige Anwendungen häufig in der Erforschung der Beziehung zwischen extrazelluläre Signale und einzelne Neuronen-Aktivität 7 gefunden, insbesondere. Anatomische Überlegungen wichtiger geworden als der Abstand zwischen den aufgezeichneten Zellen steigt. Trotzdem ermöglicht dieses System definitiv Untersuchung von Langstrecken-und Inter-Layer-Konnektivität, wo Verbindungen nach dem Slicing Verfahren bleiben erhalten.
Mikromanipulator Steuer
Eine automatische Positionierung der Mikromanipulatoren stark beschleunigt den Prozess der Multielektroden Patch-Clamp und erhöht seine Zuverlässigkeit Verringerung des Auftretens vonmenschliche Fehler. Verschiedene Hersteller bieten verschiedene Lösungen, um eine Verbindung vom PC an den Manipulatoren herzustellen. Eine verbreitete Möglichkeit ist eine serielle oder USB-Schnittstelle. Um eine schnelle Kommunikation zu gewährleisten widmeten wir einer seriellen Schnittstelle an jedem Manipulatorsteuerung. Die nützliche Funktion der automatischen Positionierung ist wahrscheinlich die Eliminierung der meisten seitliche und vertikale Bewegung der Elektroden in das Gewebe und zur Begrenzung seiner Verzerrung. Da die Bewegung der Elektroden in das Gewebe erfolgt fast ausschließlich in axialer Richtung wird die mechanische Störung minimiert. Seitliche Bewegungen sind nur notwendig, um Blutgefäße und Zellen gelegentlich zu vermeiden.
Visualisieren Elektrodenpositionen
Es ist sehr nützlich, um die Position einer jeden Elektrode während eines Experiments zu verfolgen. In einer traditionellen Einrichtung Verlierer Anblick einer Elektrode kann schnell problematisch werden. Wenn eine große Anzahl von Elektroden ist es nichtmöglich, alle Elektroden innerhalb des Sichtfeldes zu allen Zeiten zu halten. Unter Berufung auf eine grafische Darstellung ist die intuitive Alternative und hilft bei der Verfolgung der Fortschritte des Experiments zeigt sofort, welche Elektroden haben bereits in ihrer endgültigen Konfiguration positioniert wurde und welche auch nicht haben.
Erwerb und Video-Overlay
Die Möglichkeit, Live-Video von dem Mikroskop Feld auf einem Anwendungsfenster anzuzeigen ist sehr nützlich. Das Anzeigefenster wurde so programmiert, auf Mausklicks ermöglicht Speicherung von Positionen von Interesse (Zell Somata) sowie schnelles Update der relativen Positionen zwischen Mikroskop und Elektroden entfernt aufgelaufenen Fehler, wenn sie erscheinen, zu reagieren. Wir haben auch die Überlagerung von praktischen Informationen über Live-Video, wie die Anflugbahn für jede Elektrode in Richtung gewählt Zellen oder die Markierung dieser Zellen (Abbildung 3) durchgeführt. O Registrierungf Funktionen und Überlagerung von Hilfs Bilder, wie Zahlen aus anatomischen Atlanten wurde ebenfalls implementiert, um zu helfen, wo Regionen von Interesse sind, nicht sofort klar.
Verstärker
Computergesteuerte Mikroskop Verstärker können ermöglichen die Kontrolle statt aus anderen Anwendungen zu berücksichtigen. Dies erhöht drastisch die Geschwindigkeit und die Zuverlässigkeit, mit der mehrere Zellen gleichzeitig aufgenommen werden und eliminiert die Hauptquelle der menschlichen Fehler. Nach computergestützte Positionierung und Pipette Druckregelung ist der Schritt, der die meisten Gewinne in der Zeit bemerkbar produziert aber die Gewinne in Zuverlässigkeit sind noch wichtiger.
Oszilloskope
Sicherstellung, dass Testsignale in Echtzeit an der entsprechenden Skala visualisiert werden und zeitlicher Auflösung die Effizienz, mit der ein Experimentator experimentellen Schritte ausführen stark erhöht. Durch die Kopplung des Oszilloskop-Settings Modi (wie Strom-oder Spannungsklemme) Verstärker haben wir sichergestellt, dass zeitkritische Schritte wurden ausgeführt und mit wenig Aufwand wie Halte Zellen in geeigneten Membranpotentiale unmittelbar nach Erreichen der Zelle verbundene Konfiguration visualisiert. Die richtige Visualisierung wurde, indem die entsprechenden Skalierung und Kopplung Befehle über die serielle Schnittstelle in des Oszilloskops eigenes Protokoll, um die Amplitude und Offset passt der Testsignale innerhalb der Oszilloskop-Bildschirm gewährleistet.
Pipette Druckkontrolle
Da die Anzahl der in einem Experiment eingesetzt Elektroden erhöht, so dass Überdruck dauerhaft angewendet, um die Spitze der Glaselektroden sauber zu halten wird immer anspruchsvoller auf den Punkt eine wichtige Hindernis darstellt. Ausreichend positiven und negativen Druck (einige hundert mbar) durch einfache Membranpumpen erzeugt werden. Um den Druck zu stabilisieren, wurden diese Pumpen gekoppelt erneutservoirs von etwa 100 ml, dessen Öffnen und Schließen durch pneumatische Ventile gesteuert. Die Ventile waren wiederum computergesteuert unter Verwendung einer Datenerfassungskarte. Das Diagramm der pneumatischen Schaltung in Fig. 4 zu sehen ist. Der Druckregler hat eine wichtige Rolle, nicht nur sicherzustellen, Pipettenspitzen bleiben sauber, sondern auch schnell, die die Bildung von Gigaohm Dichtungen, auf der Beobachtung von Grübchen auf der Zellmembran als Pipetten berühren die Zellen weitere Beschleunigung des Verfahrens.
Das Human Interface Device
Die meisten Versuchsanordnungen haben die Kontrollen der experimentelle Ausstattung weit über eine große Fläche verteilt. Wir konzentrierten uns auf die am häufigsten verwendeten Steuerelemente auf einer einzelnen Wireless Gamepad (Abbildung 5) stark reduziert Zeit und Aufwand erforderlich, um jede Zelle aufzunehmen, aber am wichtigsten ist, wodurch menschliche Fehlerquellen, die oft bringen können große Experimente zu einem vorzeitigen end.
Programmiersprache
Wir hatten sehr wenig Auswahl in Bezug auf die Programmiersprache für diese Anwendung, da die einzige Sprache, die Integration aller erforderlichen Geräte unterstützt wurde, war C / C + +. Ein großer Vorteil von C / C + + ist die Möglichkeit, aus der Performance-Verbesserung von Mehrkern-Prozessoren implementieren erlaubt mehrere Verarbeitungsthreads und voll profitieren.
Elektrophysiologische Datenerfassung
Das System, das wir beschrieben, überlässt die Wahl der elektrophysiologischen Aufnahme-Software-und Datenerfassungssystem bis zu den Experimentator. Austausch von Kommunikation zwischen Datenerfassungssoftware und unsere Anwendung kann über serielle Schnittstellen oder über Socket-Kommunikation über das Netzwerk erfolgen.
Zukunftsperspektiven
Mehr als 30 Jahre seit Sakmann und Neher brech Experimente, ist der Patch-Clamp-Technik still allein die Bereitstellung von Daten mit einer bestimmten Kombination von Signalauflösung und Abtastrate, die für eine Vielzahl von Experimenten erforderlich sind, insbesondere diejenigen, die die Detektion von einzelnen postsynaptischen Potentiale oder Ströme. Durch die Entwicklung einer computergestützten System, das die Aufnahme von vielen Neuronen ermöglicht gleichzeitig wir zielt auf die Erweiterung der experimentellen Möglichkeiten der Patch-Clamp-Technik. Kombination dieser neuen Möglichkeiten mit den jüngsten Entwicklungen in der experimentellen Neurowissenschaften 8-13 kann den Weg zu einem tieferen Verständnis der neuronalen Schaltungen mit beispielloser Geschwindigkeit und Detail öffnen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Wir möchten Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi und Sonia Garcia für wertvolle Erfahrungsberichte zu Verbesserungen für die Patch-Clamp-Verfahren Automatisierung danken. Wir danken Rajnish Ranjan für wertvolle Ratschläge und Unterstützung bei der Software-Implementierung. Diese Arbeit wurde zum Teil von der EU-Synapse-Projekt und teilweise von der Human Frontiers Science Program gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
References
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