En computer-assisteret Multi-elektrode Patch-clamp System

Summary

Multi-elektrode patch-clamp optagelser udgør en kompleks opgave. Her viser vi, hvordan, ved at automatisere mange af de eksperimentelle trin, er det muligt at fremskynde processen, der fører til kvalitativ forbedring af ydeevne og antallet af optagelser.

Abstract

Plasteret-clamp teknik er i dag den mest veletablerede metode til optagelse af elektrisk aktivitet fra de enkelte neuroner eller deres subcellulære afsnit. Ikke desto mindre opnå stabile optagelser, selv fra enkelte celler, er fortsat en tidskrævende procedure betydelig kompleksitet. Automatisering af mange skridt i forbindelse med en effektiv information display i høj grad kan hjælpe eksperimentalister i at udføre et større antal optagelser med større pålidelighed og på kortere tid. For at opnå store optagelser konkluderede vi den mest effektive fremgangsmåde er ikke fuldt ud automatisere processen, men at forenkle de eksperimentelle trin og reducere chancerne for menneskelige fejl, mens effektivt indarbejde eksperimentatorens erfaring og visuel feedback. Med disse mål for øje har vi udviklet en computer-assisteret system, som centraliserer alle de nødvendige foranstaltninger for en multi-elektrode patch-clamp eksperiment i et enkelt interface, en commercially tilgængelige trådløse gamepad, mens der vises eksperiment relateret information og vejledning tidskoder på computerskærmen. Her beskriver vi de forskellige dele af systemet, der tillod os at reducere den tid, der kræves for at opnå optagelse konfiguration og øge chancerne for en vellykket optagelse stort antal neuroner samtidigt.

Introduction

Evnen til at optage og stimulere flere steder med mikrometer præcision er særdeles nyttig for eksperimentelt at opnå en bedre forståelse af neuronale systemer. Mange teknikker er blevet udviklet til dette formål, men ingen mulighed for submillivolt opløsning opnås ved patch-clamp teknik, der er afgørende for at studere subthreshold aktivitet og individuelle postsynaptiske potentialer. Her dækker vi udviklingen af ​​en tolv-elektrode computer-assisteret patch-clamp system til samtidig optagelse og stimulere et stort antal individuelle celler med tilstrækkelig præcision til studiet af neuronal tilslutningsmuligheder. Mens mange andre applikationer kan tænkes for et sådant system, det egner sig særligt godt til studiet af synaptisk forbindelse givet, at antallet af mulige forbindelser inden for en gruppe af neuroner vokser proportionalt med kvadratet på antallet af neuroner pågældende. Derfor, mens et system med tre elektroder tillader afprøvning afforekomsten af op til seks forbindelser og oftest optage en enkelt, optagelse tolv neuroner tillader afprøvning af forekomsten af op til 132 forbindelser og ofte observere over et dusin (figur 1). Observationen af snesevis af tilslutninger samtidigt gør det muligt at analysere organiseringen af små netværk og udlede statistiske egenskaber nettets struktur, som ikke kan probede ellers ^1.. Desuden præcis stimulering af talrige celler giver også mulighed for kvantificering af rekruttering af postsynaptiske celler ^2.

Protocol

1.. Klargøring af udstyr

1. Kontrolsystemer manipulatorer fra en computer
   1. Forbind hver mikromanipulator controller box til en computer via serielle porte (RS-232).
   2. Gennemføre kommandoerne til positionering, forespørge og justering af indstillinger, der skal sendes via den serielle port. Given hastighed og hardware kompatibilitetsproblemer C / C + + anbefales som programmeringssprog.
   3. Standardisere referencesystem af manipulatorer, således at nul er den tættest mulige position med hensyn til de motorer og positiv bevægelse er rettet væk fra motorerne.
   4. Placer mikroskopet på sin centrale position 2 mm over prøven brændplanet (koordinater [0, 0, 2000]).
   5. Store for hver manipulator de lokale koordinater, der tillader spidsen af ​​en pipette til at blive observeret i midten af ​​synsfeltet for mikroskopet. Dette er det første referencepunkt for hver elektrode.
2. VisuaLize elektrode stillinger. Det er meget nyttigt at være i stand til at spore positionen af hver elektrode under et eksperiment. En grafisk repræsentation er den mest intuitive måde at opnå dette. Med henblik herpå referencesystemerne i hver elektrode, og at af mikroskopet skal matches. En enkel måde at opnå dette er:
   1. Bring spidsen af ​​en elektrode til midten af ​​synsfeltet.
   2. Gemme positionen på hver akse manipulator og hver akse af mikroskopet.
   3. Udfør med x-aksen i manipulatoren en relativt stor bevægelse (1 mm).
   4. Find spidsen atter bevæger sig kun mikroskopet.
   5. Beregn forskellen i mikroskopet position, siden den sidst blev målt. Det er de fremskrivninger af elektroden akse bevægelse onto mikroskop akser.
   6. Gentag trin 2,3-2,5 for Y-og Z-akserne af elektroden manipulatoren. Dette giver en matrix af projektioner på mikroskopet akser, der skal bestemmes (<strong> figur 2) også kaldet cosinus matrix:
      
   7. Vend denne matrix til at gøre det muligt at beregne de bevægelser, i tre dimensioner, der kræves af elektroden manipulator til at nå en given position i mikroskopet koordinatsystemet:
      
   8. Ved hjælp af indledende referencepunkt og cosinus matrix bestemme placeringen af ​​hver elektrode i mikroskop-koordinater.
   9. Vist grafisk baseret på mikroskopet koordinater, positionen af ​​hver elektrode med regelmæssige mellemrum. Vi valgte at bruge C / C + + tegning biblioteker (GDI +) til at trække elektrode positioner hver 40 msek.
   10. Gentag trin 1.2.1 - 1.2.7, hver gang manipulator vinkler ændres, eller hvis der er behov for ændringer af placeringen af ​​adskillige millimeter, for eksempel, når den type elektrode ændres.
3. Aktiver lagring af positions relevante funktioner i væv, såsom celler eller anatomiske referencepunkter, i mikroskop-koordinater.
4. Anskaf video og overlay relevante oplysninger.
   1. Mekanisk tilpasse x-aksen af ​​bevægelse af mikroskopet med den vandrette akse af mikroskopet kamera.
   2. Installer på computeren en framegrabber med live video og overlay kapacitet og et software development kit (SDK).
   3. Gennemføre live video display betjening med SDK.
   4. Konverter mikroskop koordinatsystem til kameraet referencesystem ved passende oversættelse og skalering.
   5. Tegn de relevante funktioner i kameraets koordinater og overlay på live video det resulterende billede med regelmæssige intervaller på omkring 40 msek (Figur 3).
5. Kontrol forstærkere.
   1. Brug forstærkeren software til styring af forstærkerens indstillinger fra grænsefladen.
6. Control oscilloskoper.
   1. Tilslut oscilloskoper til pc'en ved hjælp serielle porte.
   2. Bestem oscilloskop skala, kobling og tidsmæssig opløsning for de forskellige trin i patch-clamp procedure i spænding-clamp (f.eks elektrode i bad, sæl dannelse, hel-celle-konfiguration) og strøm-clamp.
   3. Send passende oscilloskop indstilling kommandoer når forstærker kommandoer udstedt fra grænsefladen.
7. Kontrol pipette tryk.
   1. Saml et tryk styresystem ifølge figur 4.
      1. Brug en 12 V / 5 V strømforsyning til at forsyne hver elektronisk komponent korrekt.
      2. Slut outputtet af en membranpumpe til positivt tryk-buffer (100 ml beholder).
      3. Forbinde input af en membranpumpe til undertryk-buffer (100 ml beholder).
      4. Slut pipetteholder slangen til en tryksensor i trykkategore styresystem og en pneumatisk ventil, der forbinder til de vigtigste pres rummet.
      5. Forbinde hver af tryk buffere til en ventil forbundet til de vigtigste tryk rum.
      6. Tilslut en ventil mellem de vigtigste pres rummet og atmosfæren.
      7. Tilslut en tryksensor til de vigtigste pres rummet.
      8. Tilslut en tryksensor til hver buffer.
      9. Slut trykkontrolsystem til et dataopsamlingssystem bord.
      10. Forbind hver tryksensor til en analog indgang.
      11. Slut hver ventil til en digital udgang.
   2. Fjern atmosfæretryk forskudt fra alle sensorer ved at åbne alle ventiler undtagen dem tilslutning til membranpumper og fratrække det målte tryk.
   3. Gennemføre trykstyring
      1. Definer i grænsefladen en kontrol for at aktivere eller de-aktivere positivt tryk kontrol til hver pipette.
      2. Definer et minimalt positiv pres for pipettens af omkring 70 mbar.
      3. Periodisk (hver 0,5 sek) opdage, når trykket i pipetter under aktiv trykstyring falder under den indstillede tærskel.
      4. Ved tærskelkrydsningshøjde åbne positivt pres buffer til de vigtigste pres rummet og dette rum mod pipetten pågældende under korte perioder (20 ms), indtil trykket i pipetterne er over tærsklen. Luk alle andre ventiler.
      5. De-aktivere yderligere pres kontrol, som indledes den endelige strategi for en celle af interesse.
   4. Ansøg undertryk for sæl dannelse
      1. Luk alle ventiler og åbn undertryk buffer ventil mod de vigtigste pres rummet og dette rum mod pipetten pågældende for varigheden forsøgslederen kræver ved at holde en knap nede.
8. Centraliser kommandoer på en menneskelig brugerflade enhed.
   1. Tilslut en kommercielt tilgængelig wireless gamepad til PC'en.
   2. Gennemføre udlæsning af joysticket status. For eksempel bruger DirectX biblioteker for C / C + + til at udføre udlæsninger hver 5 ms.
   3. Sammenlign aktuelle status med tidligere status til at opdage, hvilke knapper er blevet presset, frigivet eller holdes nede siden sidste gang trin.
   4. Tildele funktioner til hver knap på gamepad. Et eksempel på denne kortlægning er vist i figur 5.

2. Patch-clamp Procedure

1. Forbered hjerneskiver i regionen af interesse.
2. Placer en hjerne udsnit af interesse med området af interesse i midten af mikroskopet deplacement rækkevidde.
3. Cell Selection
   1. Identificer celler af interesse ved at gennemse med mikroskopet. Gemme positionen af ​​cellerne baseret på mikroskopet koordinatsystem med en højre muse-klik på live video display på toppen af ​​cellen af ​​interesse. Den grafiske brugerflade vil vise de markerede celler samt mikropipetter for et samlet overblik og software vil tilføje en markør på cellen position, der vil blive lagt oven på billederne. Derudover et billede af cellen er fanget for fremtidig reference i filen 'Cell #. Jpg ".
4. Fordeling af celler til pipetter
   1. Efter valg cellerne af interesse, tildele hvilken pipette vil registrere hver celle. Den grafiske brugerflade giver overdragelse kontroller, der skal indstilles. Visualiser et preview af den endelige udformning ved at markere afkrydsningsfeltet 'Vis endelige holdninger.
   2. Vælg hver pipette der ønskes eller tjek 'Vælg alle' afkrydsningsfeltet den endelige position preview. Deaktiver den aktuelle position display for bedre visualisering, hvis nødvendigt.
5. Forbered pipetter
   1. Fyld pipetter (6 - 8 MOhm er som regel bedst, hvis der bruges mange pipetter) With intracellulære løsning og indlæse dem i deres holdere. Placer headstages i deres optagelser, men ikke glide dem frem til at undgå at berøre bad med pipettespidsen.
   2. Aktiver positivt tryk, og vælg alle pipetter til at sikre, at de tips vil forblive ren. Skub forsigtigt hver hovedtrin på plads.
6. Lokalisering pipettespidserne
   1. Placer mikroskopet til en central position med fokus 3 mm over skive ved at trykke på R2-tasten, mens du holder knappen 'A'. Brug den tilsvarende position for hver manipulator som gemt fra den tidligere eksperiment ved at trykke på knappen, L2, mens du holder knappen A.
      Bemærk: På dette punkt bør der være enten en karakteristisk skygge af en pipette i betragtning eller en lille bevægelse langs pipetten akse bør være nok til at observere det i de fleste tilfælde. Kompensation for små forskelle i pipette form skal udføres manuelt.
   2. Bring pipettespidsen i fokus. Placér spidsen på den røde central prik af video display uden at flytte mikroskop (det skal stadig være i position [0, 0, 2000]).
   3. Informer den software, pipetten er i centrum af skærmen ved at trykke på knappen Z, mens du holder knappen C. Efter hver pipettespids ligger, sende, at pipetten bagud, så den følgende kan findes ved at trykke på L1-knappen, mens du holder knappen A.
7. Nærmer cellerne
   1. Når alle pipettespidser er præcist placeret og hver pipette tilskrives en celle automatisk placere pipetterne tæt på deres respektive celler. Blot højreklikke i midten af ​​gruppen af ​​celler og vælge "Cluster" på pop op-menuen. På klyngens muligheder vindue, der vises, skal du vælge alle de pipetter, som du ønsker at placere på dette tidspunkt, og klik på "Gå med alle kontrolleret pipetter. Gentag denne handling for hver klynge af celler af interesse.
   2. Perform den endelige tilgang manuelt. Positionen af ​​pipetter i forhold til cellerne kan angives forskelligt, men som regel er simpelthen 200 um fra cellen i aksen af ​​pipetten og 200 um over den i lodret retning, hvilket er nok til at holde pipetten spids uden vævet . Vent til positionering af pipetter er færdig og flytte mikroskopet mod en pipette ved at trykke på knappen, R1, mens du holder knappen C.
   3. Rekalibrér hver pipette position ved at fokusere mikroskopet på sin spids overalt i video display og tryk på knappen B, mens du holder knappen C. En kvadratisk gitter bør kortvarigt angiver identificerede position pipette. Hvis positionen ikke er korrekt, skal du placere spidsen på den centrale prik af videoen displayet, og tryk på knappen Z, mens du holder knappen C.
8. Etablere den celle-attached konfiguration
   1. Bekræft, at cellen af ​​interesse for den aktuelle pipetten er korrektmarkeret. Ellers flytter mikroskop til at matche celle af interesse med den centrale røde prik. Markér cellen ved at trykke på Y-knappen, mens du holder knappen C. Tryk på knappen L2, mens du holder knappen C for at positionere pipetten 200 um væk fra sin tildelte celle, vil mikroskopet automatisk flytte til den tilsvarende position.
   2. Juster pipette position, så den passer til den røde prik. Juster pipetten opvejes ved at trykke på knappen, R1, mens du holder knappen X.
   3. Aktiver test pulsen ved at trykke på L1-knappen, mens du holder knappen X. langsomt nærmer pipetten til sin tilskrives celle.
   4. Ved at observere dannelsen af ​​en fordybning på overfladen af ​​cellens membran anvende en kort puls af undertryk ved at trykke på Y, mens du holder knappen Z for at give det påførte tryk for at nå cellen. En bedrift potentiale på ca-65mV bør etableres på dette tidspunkt ved at trykke på knappen L2, mens du holder knappen X.
9. Helcelle-konfiguration
   1. Når en Giga-tætning er dannet for hver celle, start brud membranerne ved anvendelse af undertryk.
10. Udfør optagelser
    1. Brug stimulation / erhvervelse til at udføre dine optagelser. Anvend impulser eller tog af impulser på en individuel celle ad gangen og observere reaktioner på de resterende celler til kort tilslutning blandt de optagede celler.
11. Vige pipetter
    1. Når optagelserne er færdige, aftage pipetter langsomt fra vævet ved at højreklikke på den tabel radio-knappen. Vælg 'aftage-> Pipetter 500 um' at have pipetter aftage en kort afstand langs deres akser. Overhold drift i potentialet af cellerne (rydde tips ved at anvende nogle positive tryk kan hjælpe).
    2. At trække sig tilbage pipetter hele vejen tilbage, sæt positionering hastighed til 'Fast' og gentage den samme operation, men vælge 'Alle' valgmulighed. Fjern den brugtepipetter ved forsigtigt at skyde ud headstages og skrue pipetter fra indehaverne. Det er nyttigt at undgå at vride indehaverne i deres stikkontakter, da dette i høj grad kan forstyrre pipettespidsen position.

Representative Results

Efter de ovenfor beskrevne metoder vi lykkedes i at udføre hel-celle optagelse på op til tolv neuroner samtidigt, næsten en fordobling det største antal af neuroner samtidig patch-fastspændt hidtil. Eksempler på netværk af direkte synaptiske forbindelser mellem pyramideneuroner optaget i Layer V somatosensoriske cortex hos rotter er vist i fig. 6.

Bestemmelsen af forbindelsen sandsynlighed profiler som en funktion af inter-somatisk afstand for en given celle-type er en typisk måling af interesse, der kan udføres effektivt med en multi-elektrode patch-clamp-system ^1. For nylig fotostimulation begyndte at fremstå som en endnu mere effektiv middel til at opnå sådanne oplysninger ^3,4. Vigtigere er dog de data, der er erhvervet med multi-elektrode patch-clamp-systemer giver eksperimentatorer at opnå en mere fuldstændig kortlægning af netværket under studiet samt høj opløsning farvning med intracellulære diffust farvestoffer. I multi-elektrode patch-clamp eksperimenter hver celle kan optages og stimuleres, hvilket ofte ikke er tilfældet med andre teknikker, såsom foto-stimulation eller calcium billeddannelse. Denne funktion giver eksperimentatorer at holde styr på bias i tilslutningsmuligheder, såsom den høje forekomst af gensidige forbindelser, som ikke kan måles på anden måde. Ved at stimulere og optage alle studerede neuron viste vi, at neuroner er ikke kun forudindtaget mod at blive gensidigt forbundet, men også danner klynger. Omfanget af vores indspilninger også tilladt os at konstatere, at der fandtes en højere sandsynlighed forbindelse blandt par af neuroner, der delte fælles naboer, de var nemlig begge samtidigt tilsluttet andre individuelle neuroner i stikprøven netværk (figur 7a). Denne observation var signifikant på hver intersomatisk afstand bin på 50 mm (50-250 mm). Vi observerede også par af neuroner deler mange fælles naboer forekom signifikant mereti end forventet ved en tilfældighed (figur 7b). Desuden har vi opdaget en effekt på tilslutning sandsynlighed i forhold til antallet af fælles naboer deles af en given par neuroner. De mere almindelige naboer det deler jo mere sandsynligt er et par af neuroner er skal forbindes (figur 7c).

Denne tendens fører til dannelsen af ​​grupper af neuroner, der er mere tæt forbundet med hinanden end gennemsnittet. Interessant, meget sammenkoblede grupper af neuroner ikke kun udstillet mere mange forbindelser, men også i de gennemsnitlige, stærkere ^1. Disse fund førte os til den konklusion, at neocorticale kredsløb ikke kun er organiseret i lag og kolonner, men også i celle forsamlinger, dvs grupper af neuroner deler tæt og stærk synaptisk sammenkobling som postuleret af Donald Hebb flere årtier siden.

Andre resultater af interesse, der kan opnås med flere samtidigt patch-fastspændt neurons omfatter kvantificering af rekruttering af hæmning af supra-tærskel aktivitet i forskellige antal excitatoriske celler ^2. En allestedsnærværende form for hæmning i neocortex ⁵ medieres af Martinotti celler (figur 8a og B, tilpasset fra Berger et al.), Som modtager input fra pyramideceller og integrere det i igen påvirker, med nogle latenstid, andre pyramideformede celler. Vi viste, at efter korte byger af spiking aktivitet i så få som fire pyramideformede celler hver pyramidecellelaget i en lokal mikrokredsløb modtager denne form for inhibering (figur 8c, c og f). Vi viste også, at disse inhibitoriske postsynaptiske potentialer tendens til at mætte, når otte eller flere pyramideformede celler stimuleres samtidigt (8E).

En oversigt over systemets komponenter kan ses i figur 9. Den software interface og hardware are vist i figur 9a og b samt grænseflade til i figur 9c vejlede elektroderne hen imod celler til optagelse under mikroskop mål (fig. 9d).

Figur 1. Beregning af antallet af forbindelser observeret i et eksperiment som en funktion af antallet af neuroner, samtidig konstateret viser en kvadratisk vækst. Numeriske beregninger (top). Illustrativt diagram, hvor yderligere neuroner i det samme netværk tilsættes successivt (nederst).

Figur 2. Koordinatsystemer af hver elektrode manipulator (gul) og mikroskop (rød).

Figur 3. Skærmbillede af en pipette i tilgang til tildelte celle med overlejret tilgang vektor celle positioner og omfanget bar.

Figur 4.. Diagram, som illustrerer det pneumatiske system for pipette trykregulering.

Figur 5. Kommandoer på den menneskelige Kortlæseren der centraliserer kontrollen anvendes under patch-clamp eksperimenter.

Figur 6. Eksempel på tre netværk afdirekte synaptiske forbindelser kortlagt i de enkelte eksperimenter

Figur 7. Fælles nabo effekt. (A) Par af neuroner, der samtidig forbindelse til mindst én anden neuron i stikprøven netværk (blå) udviser en signifikant forøget sandsynlighed for at blive forbundet med hinanden. (B) Par af neuroner deler flere fælles naboer forekommer oftere end forventet tilfældigt i de netværk i stikprøven. (c) Connected sandsynlighed inden for par af neuroner stiger som en funktion af antallet af fælles naboer deles af parret.

Figur 8. Kvantificering af rekrutteringen af Martinotti Cells. (a) Grafisk repræsentation af en pyramidecellelaget (rød), som danner synapser på en Martinotti Cell (blå), som igen former synapser på en anden Pyramidal Cell (sort). (b) Over-tærskel stimulering af Pyramidal celle ( rød) fører til rekruttering af Martinotti Cell (blå) gennem integration af lette excitatoriske postsynaptiske potentialer. De rekrutterede Martinotti Cell så hæmmer det andet pyramidecellelaget (sort). (C) Diagram der repræsenterer stimulering af et stigende antal patch-fastspændt pyramideceller og virkningerne på en anden pyramidecellelaget. (D) Gennemsnitlige Inhibitory postsynaptiske potentialer optaget fra en pyramidecellelaget som en funktion af antallet af andre nærliggende pyramidale celler, der er stimuleret. Tilpasset fra Berger et al. ² (e) amplitude disynaptic inhibering i et lokalt kredsløb tendens til at mætte, når 9 eller flere pyramideceller er stimulated indikerer maksimal rekruttering af Martinotti Celler i formentlig nået på dette tidspunkt. (f) Den fraktion af celler, der modtager disynaptic hæmning hurtigt stiger til 1 som et stigende antal pyramideformede celler stimuleres.

Figur 9. Illustration af ensemble af systemet. (A) Grafisk brugerflade med hovedvinduet, live video display, log vindue og grafisk repræsentation. (B) mikroskop og manipulatorer. (C) Human Interface-enhed med kontroller for eksperimentel procedure. (D) Glas mikropipetter i position til optagelse af flere neuroner.

Figur 10. Binomial probability fordelingsfunktioner, der beskriver den fraktion af eksperimenter, der med held optage et bestemt antal celler givne anvendelse tolv elektroder. Sammenligning mellem udbyttet af forsøg udført under anvendelse af visuel feedback af erfarne brugere er vist i blå og af mindre erfarne brugere i ikke-ideelle betingelser i rødt.

Discussion

En umiddelbar spørgsmål opstår normalt, om graden af ​​succes af den procedure, vi beskrevet. Ved høje succesrater forberedelse er vigtig. Pipetter skal have tip åbninger, der er passende til de celler væsener optaget. Filtrering af intracellulære løsning for at undgå tilstoppede pipetter er også vigtig. Ekstremt rene, frisktappet pipetter er et andet krav. En binomialfordeling er den simpleste model, der kan bruges til at forstå, hvordan disse problemer påvirker det endelige udbytte. Det er rimeligt at forvente en experimenter med erfaring og rette udstyr til at opnå en succesrate på 80% eller mere i optagelse individuelle neuroner med visuel feedback. Begyndere kan forventes at opnå meget lavere succesrate, især hvis vigtig forberedelse trin er overset. Hvordan disse satser oversætte i antallet af celler, der er optaget for hvert forsøg kan ses i fig. 10. Yderligere stigninger i antallet af samtidigt patch-muslingped neuroner vil sandsynligvis kræve miniaturisering af manipulatorer og øget pålideligheden af ​​proceduren, hvilket igen kræver betydelig opmærksomhed for detaljer, men er helt realistisk.

Alsidigheden af systemet præsenteres her, er stadig ved at blive undersøgt, og nye applikationer er ofte blevet fundet, især i udforskningen af forholdet mellem ekstracellulære signaler og individuel neuron aktivitet ^7. Anatomiske overvejelser bliver mere vigtig som afstanden mellem optagne celler stiger. Ikke desto mindre er dette system absolut tillader undersøgelse af langtrækkende og inter-lags-tilslutning, hvor tilslutninger forbliver intakte efter udskæring procedure.

Mikromanipulator kontrol

Aktivering automatisk positionering med mikromanipulatorer høj grad fremskynder processen med multi-elektrode patch-clamp og øger dens pålidelighed reducere forekomsten afmenneskelige fejl. Forskellige producenter giver forskellige løsninger med henblik på at etablere en forbindelse fra pc'en til manipulatorer. En fælles løsning er en seriel eller USB-port. For at sikre hurtig kommunikation dedikeret vi en seriel port til hver manipulator controller. Den mest nyttige træk automatisk positionering er sandsynligvis fjernelse af mest laterale og vertikale bevægelse af elektroder inde i vævet og begrænser dens forvrængning. Da bevægelsen af ​​elektroderne inde i væv foregår næsten udelukkende langs den aksiale retning, er mekanisk interferens minimeres. Sidebevægelser er kun nødvendigt at lejlighedsvis undgå blodkar og celler.

Visualiser elektrode positioner

Det er meget nyttigt at være i stand til at spore placeringen af ​​hver elektrode i et eksperiment. I en traditionel opsætning tabende synet af en elektrode kan hurtigt blive problematisk. Ved anvendelse af et stort antal elektroder er det ikkemuligt at holde alle elektroder inden for visning på alle tidspunkter. Afhængige af en grafisk repræsentation er den mest intuitive alternative og også hjælper med at holde styr på forløbet af eksperimentet, straks viser hvilke elektroder allerede er blevet placeret i deres endelige udformning, og hvilke der ikke har.

Video erhvervelse og overlay

Evnen til at vise live video fra mikroskop synsfelt på et programvindue er meget nyttig. Displayet var programmeret til at reagere på museklik muliggør lagring af positioner af interesse (celle somata) samt hurtig opdatering af de relative positioner mellem mikroskop og elektroder fjerne akkumulerede fejl, når de vises. Vi implementerede også overlejring af praktiske oplysninger om live video såsom tilgang forløb for hver elektrode i retning af udvalgte celler eller mærkning af disse celler (figur 3). Registrering of funktioner og superposition hjælpekontakter billeder såsom tal fra anatomiske atlas blev også gennemført for at hjælpe, hvor regioner af interesse er ikke umiddelbart klart.

Forstærkere

Computer mikroskop forstærkere kan give kontrol til at finde sted fra andre ansøgninger. Dette drastisk øger den hastighed og pålidelighed, hvormed flere celler kan optages samtidigt, og eliminerer den største kilde til menneskelige fejl. Efter computer-assisteret positionering og pipette trykstyring er dette skridt, der producerer de mest bemærkelsesværdige gevinster i tid, men de gevinster i pålidelighed er endnu vigtigere.

Oscilloskoper

Sikre, at testsignaler kan visualiseres i realtid på en passende skala og tidslig opløsning i høj grad forbedrer effektiviteten, hvormed en forsøgslederen kan udføre eksperimentelle trin. Ved at koble oscilloskopet sætsom hver især er til forstærker tilstande (såsom strøm eller spænding klemme) vi sikret, at tidskritiske skridt blev henrettet og visualiseret med lidt indsats som holder cellerne på passende membranpotentialer umiddelbart efter opnåelse af cellen vedlagte konfiguration. Korrekt visualisering blev sikret ved at sende de relevante skalering og koblings-kommandoer via den serielle port på oscilloskopet egen protokol til at passe amplitude og offset af test signaler inden oscilloskopet skærm.

Pipette trykstyring

Da antallet af elektroder, der anvendes i et eksperiment stiger sikre, at et positivt tryk permanent anvendes til at holde spidsen af ​​glaselektroderne ren bliver mere krævende at det punkt, der udgør en vigtig hindring. Tilstrækkelige positive og negative tryk (få hundrede mbar) kan dannes ved simple membranpumper. For at stabilisere trykket blev disse pumper koblet til reservoirs på ca 100 ml, hvis åbning og lukning blev kontrolleret af pneumatiske ventiler. Ventilerne gengæld var computerstyret ved hjælp af en datafangst kortet. Diagrammet af pneumatiske kredsløb kan ses i fig. 4. Trykregulatoren udfører en vigtig rolle, ikke kun sikrer pipettespidser forbliver rene, men også tillader dannelsen af ​​gigaohm sæler hurtigt efter observation af smilehuller på cellemembranen som pipetter røre cellerne yderligere fremskynde proceduren.

Den menneskelige Kortlæseren

De fleste forsøgsopstillinger har kontrollen af ​​eksperimentelle udstyr udbredt over et stort område. Vi koncentrerede de mest almindeligt anvendte kontrol af en enkelt trådløs gamepad (Figur 5) i høj grad reducere den tid og indsats, der kræves for at optage hver celle, men vigtigst, fjerne kilder til menneskelige fejl, som ofte kan bringe store eksperimenter til en tidlig end.

Programmeringssprog

Vi havde meget lidt valg i form af programmeringssprog for denne ansøgning, da det eneste sprog, der understøttes integration af alle de nødvendige udstyr var C / C + +. En stor fordel ved C / C + + er mulighed for at gennemføre flere forarbejdning tråde og fuldt udbytte af performance forbedringer tillades af multiple-core processorer.

Erhvervelse elektrofysiologiske data

Det system vi beskrev overlader valget af elektrofysiologiske optagelse software og datafangst system op til forsøgslederen. Udveksling af meddelelser mellem dataindsamling software og vores ansøgning kan finde sted over serielle porte eller via socket kommunikation over netværket.

Fremtidige perspektiver

Mere end 30 år siden, Sakmann og Neher skelsættende eksperimenter, patch-clamp teknik er still alene at levere data med en særlig kombination af signal opløsning og samplingfrekvensen, der kræves for en bred vifte af eksperimenter, især dem, der involverer påvisningen af ​​individuelle postsynaptiske strømme eller potentialer. Ved at udvikle et computer-assisteret system, der giver registrering af mange neuroner samtidig vi sigter mod at udvide de eksperimentelle muligheder for patch-clamp teknik. Kombination af disse nye muligheder med den seneste udvikling i eksperimentel neurovidenskab ^8-13 kan åbne vejen for en dybere forståelse af neuronale kredsløb med hidtil uset hastighed og detaljer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus	BX51WI	40X Immersion Objective
Manipulators	Luigs Neumann	SM-5	Serial protocol used
Amplifiers	Axon Instruments	MultiClamp 700B	SDK used
Camera	Till Photonics	VS 55	BNC analog output
Framegrabber	Data Translation	DT3120	SDK used
Oscilloscopes	Tektronix	TDS 2014	Serial communication
Data acquisition	InstruTECH	ITC 1600
Data acquisition	National Instruments	PCI-6221	Library used (.dll)
Pressure valve	SMC	SMC070C-6BG-32
Pressure sensor	Honeywell	24PCDFA6G
Membrane pump	Schego	Optimal