Summary
다중 전극 패치 클램프 녹음은 복잡한 작업을 구성한다. 여기에서 우리는 실험 단계의 많은 자동화함으로써, 성능과 녹음 수의 질적 향상으로 이어지는 프로세스를 가속화 할 수 방법을 보여줍니다.
Abstract
패치 클램프 기술은 개별 신경 세포 또는 세포 내 구획에서 전기 활동을 기록하기위한 가장 잘 확립 된 방법 오늘입니다. 그럼에도 불구하고, 안정된 기록을 실현에도 개별 세포에서 상당한 복잡도의 시간 소모적 인 절차 남아있다. 효율적인 정보 표시와 함께 여러 단계의 자동화가 크게 더 큰 신뢰성과 녹음의 큰 숫자를 수행하는 적은 시간 experimentalists 에의을 지원할 수 있습니다. 대규모 기록을 달성하기 위하여, 우리는 가장 효과적인 접근법은 완전히 공정을 자동화하기 위하여 만 실험 단계를 단순화하고 효율적 실험자의 경험 및 비주얼 피드백을 도입하면서 인간의 오류의 가능성을 줄일 수없는 결론 지었다. 이러한 목표를 마음에 담아두고, 우리는 하나의 인터페이스에서 다중 전극 패치 클램프 실험, COMMERC에 필요한 모든 컨트롤을 중앙 집중식으로 컴퓨터를 이용한 시스템을 개발ially 사용할 수있는 무선 게임 패드, 컴퓨터 화면에 실험 관련 정보 및 안내 신호를 표시하는 동안. 여기에서 우리는 우리가 기록 구성을 달성하기 위해 필요한 시간을 감소시키고 실질적으로 동시에 성공적 뉴런 다수의 기록 가능성을 높일 수 시스템의 다른 구성 요소를 설명한다.
Introduction
마이크로 미터 정밀도로 다수의 사이트를 기록하고 자극하는 능력은 실험적 신경 시스템의 더 나은 이해를 달성하기 위해 매우 유용하다. 대부분의 기술은이를 위해 개발되었습니다 만, 어느 것도 submillivolt 해상도가 서브 스레숄드 활동 및 개별 시냅스 잠재력을 공부에 필수적인 패치 클램프 기술에 의해 달성 할 수 없습니다. 여기에서 우리는 동시에 녹음하고 신경원 연결성의 연구를위한 충분한 정밀도로 각 셀을 다수 자극 겨냥 열두 전극 컴퓨터 보조 패치 - 클램프 시스템의 개발을 포함한다. 많은 다른 애플리케이션이 같은 시스템에 대해 생각 될 수 있지만, 뉴런의 그룹 내에서 가능한 연결의 수가 문제 뉴런의 수의 제곱에 비례하여 성장한다는 관련 시냅스 연결의 연구에 특히 잘 빌려 준다. 따라서, 세 개의 전극 시스템에게 테스트 수 있지만최대 6 개의 연결의 발생과 가장 자주 열두 뉴런을 기록, 단일 한 기록은 최대 132 연결의 발생을 테스트하고 자주 (그림 1) 하나 이상의 다스을 관찰 할 수 있습니다. 연결 수십 동시에 관측 가능 소규모 네트워크의 구성을 분석하고, 그렇지 않으면 1 프로빙 할 수없는 네트워크 구조의 통계적 성질을 유추 할 수있다. 또한, 수많은 세포의 정확한 자극은 시냅스 후 세포 2 모집의 정량화 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 장비 준비
- 컴퓨터에서 제어 조작기
- 시리얼 포트 (RS-232)를 통해 컴퓨터에 각각의 미세 조작기 컨트롤러 박스를 연결합니다.
- 쿼리 및 직렬 포트를 통해 전송 될 수 있도록 설정을 조정, 위치에 대한 명령을 구현합니다. 주어진 속도와 하드웨어 호환성 문제는 C / C + +는 프로그래밍 언어로 추천합니다.
- 제로 모터 및 긍정적 인 움직임이 모터로부터 멀리 지향에 대하여 가장 근접한 위치가되도록 매니퓰레이터의 참조 시스템을 표준화한다.
- 2mm 시편 초점면 (좌표 [0, 0, 2000]) 위의 중앙 위치에 현미경을 배치합니다.
- 상점, 각 조작기 들어 피펫 팁이 현미경의 시야의 중심에서 관찰 될 수 있도록 로컬 좌표. 이것은 각 전극의 초기 기준점이다.
- 기기, 비즈니스LIZE 전극 포지션.이 실험 중에 각 전극의 위치를 추적 할 수 있어야하는 것은 매우 유용하다. 그래픽 표현이 달성의 가장 직관적 인 방법입니다. 이를 위해 기준 각 전극의 시스템과 현미경의는 일치해야합니다. 이를위한 간단한 방법이다 :
- 시야의 중심 전극의 선단을 가져온다.
- 매니퓰레이터의 각 축의 위치 및 현미경 각축을 저장한다.
- 매니퓰레이터 비교적 큰 운동 (1mm)의 x-축으로 실행한다.
- 한 번 더 현미경의 이동 끝을 찾습니다.
- 그것이 마지막으로 측정 한 이후 현미경 위치의 차이를 계산한다. 이러한 현미경 축 상 전극 축 이동의 돌출부이다.
- Y 전극의 조작의 Z 축에 대한 2.5 - 반복 2.3 단계를 반복합니다. 이것은 현미경 상 돌기의 행렬 <(결정 축을 허용강한> 그림 2) 또한 코사인 매트릭스라고 :
- 그것이 가능 좌표계 현미경에 지정된 위치에 도달하는 전극 매니퓰레이터에 필요한 입체적 움직임을 계산할 수 있도록이 행렬을 전환 :
- 초기 기준점을 사용하고 코사인 행렬은 현미경의 각 전극의 위치를 결정하는 코디네이터.
- 현미경, 정기적으로 각 전극의 위치 좌표에 기초하여 그래픽 표시. 우리는 전극의 위치마다 40 밀리 초를 그리는 C / C + + 그리기 라이브러리 (GDI +)를 사용하기로 결정했습니다.
- 1.2.7 수 밀리의 위치 변경이 필요한 경우 매니퓰레이터 각도가 변경되거나마다, 예를 들면, 전극의 종류가 변경 될 때 - 반복 1.2.1 단계.
- positio를 저장 가능이러한 세포 또는 해부학 적 기준점으로 조직의 관련 기능의 NS는 현미경으로 조정합니다.
- 영상을 획득하고 관련 정보를 오버레이.
- 기계적 현미경 카메라의 수평축과 현미경의 움직임의 x-축 정렬.
- 컴퓨터에 라이브 비디오 및 오버레이 기능 및 소프트웨어 개발 키트 (SDK)를 가진 프레임 그래버 설치.
- SDK와 함께 라이브 비디오 디스플레이의 동작을 구현합니다.
- 현미경은 적절한 번역 및 스케일링 카메라 레퍼런스 시스템에 좌표계 변환합니다.
- 약 40 밀리 초 (그림 3)의 정기적 인 라이브 결과 이미지에 카메라 좌표와 오버레이에 관련 기능을 그립니다.
- 컨트롤 앰프.
- 인터페이스로부터 증폭기 설정을 제어하는 증폭기 소프트웨어를 이용한다.
- 공동오실로스코프를 ntrol.
- 시리얼 포트를 사용하여 PC에 오실로스코프를 연결합니다.
- 전압 클램프 패치 클램프 절차의 여러 단계의 오실로스코프 규모, 커플 링 및 시간 해상도를 확인합니다 (예 : 전극 목욕, 인감 형성, 전체 셀 구성) 및 전류 클램프.
- 앰프의 명령이 인터페이스에서 업데이트 될 때마다 적절한 오실로스코프 설정 명령을 보냅니다.
- 제어 피펫 압력.
- 도 4에 따른 압력 제어 장치를 조립한다.
- 적절 각 전자 부품을 공급하는 12 V / 5 V 전원을 사용한다.
- 양압 버퍼 (100 ㎖ 용기) 한 막 펌프의 출력을 연결한다.
- 음압 버퍼 (100 ㎖ 용기)에 하나의 막 펌프의 입구를 연결합니다.
- pressu의 압력 센서에 피펫 홀더 튜브를 연결합니다제어 시스템 및 메인 압력 실에 연결되어 공압 밸브를 재.
- 메인 압력 실에 연결된 밸브에 압력 각 버퍼를 연결합니다.
- 메인 압력 구획과 대기 사이에 밸브를 연결합니다.
- 메인 압력 실에 압력 센서를 연결합니다.
- 각 버퍼에 압력 센서를 연결합니다.
- 데이터 수집 보드에 압력 제어 시스템을 연결한다.
- 하나의 아날로그 입력으로 각 압력 센서를 연결합니다.
- 디지털 출력에 각 밸브를 연결합니다.
- 막 펌프에 연결을 제외한 모든 밸브를 열고 측정 된 압력을 뺀 모든 센서로부터의 오프셋 (offset) 대기의 압력을 제거합니다.
- 압력 제어를 구현
- 인터페이스의 각 피펫에 대한 긍정적 인 압력 제어를 활성화 또는 비 활성화시킬 수있는 컨트롤을 정의합니다.
- 피펫에 대한 최소한의 긍정적 인 압력을 정의약 70 밀리바의의.
- 활성 압력 제어하에 피펫의 압력이 설정 임계 값 아래로 떨어질 때마다 주기적으로 (매 0.5 초)을 검출한다.
- 임계 값 초과시 피펫의 압력이 임계 값을 초과 할 때까지 짧은 기간 (20 밀리 초) 동안 문제의 피펫으로 메인 압력 실이 구획에 긍정적 인 압력 버퍼를 엽니 다. 다른 모든 밸브를 닫습니다.
- 그 셀을 향한 최종 접근을 시작으로 더 압력 제어를 드 활성화.
- 씰 형성에 부정적인 압력을가
- 모든 밸브를 닫고 실험을 누르면 버튼을 유지하여 필요로하는 시간에 대한 질문에 피펫으로 메인 압력 실이 구획을 향해 부정적인 압력 버퍼 밸브를 엽니 다.
- 도 4에 따른 압력 제어 장치를 조립한다.
- 휴먼 인터페이스 장치에 명령을 중앙 집중화.
- 시판 wirele 연결PC에 SS 게임 패드.
- 조이스틱 상태의 판독을 구현합니다. 예를 들어, 판독마다 5 밀리 초를 수행하는 C / C + +에 대한 다이렉트 라이브러리를 사용합니다.
- 버튼은 마지막 단계 이후, 프레스 릴리스 또는 계속 누르고 된 어느를 감지하는 이전 상태와 현재 상태를 비교합니다.
- 게임 패드의 각 버튼에 기능을 할당합니다. 이 매핑의 예는도 5에 도시된다.
2. 패치 클램프 절차
- 관심 영역의 뇌 조각을 준비합니다.
- 현미경의 변위 범위의 중앙에있는 관심 영역으로 관심의 뇌 조각을 놓습니다.
- 셀 선택
- 현미경으로 탐색하여 그 세포를 식별합니다. 좌표계를 현미경에 따라 세포의 위치를 저장 바로 그 셀의 상단에 라이브 비디오 화면에 마우스를 클릭합니다. 이미지에 중첩 될 셀 위치에 마커를 추가 할 그래픽 인터페이스는 글로벌 개요와 소프트웨어를 선택한 셀뿐만 아니라 마이크로 피펫을 표시합니다. 또한 셀의 이미지는 파일 '셀 #. JPG'에서 향후 참조를 위해 캡처됩니다.
- 피펫으로 세포의 속성
- 관심의 셀을 선택 한 후, 각 셀을 기록 할 피펫 할당합니다. 그래픽 인터페이스를 설정해야 할당 컨트롤을 제공합니다. 확인란 '쇼 최종 위치'를 선택하여 최종 구성의 미리보기를 시각화.
- 최종 위치 미리보기가 원하는 또는 '전체 선택'을 체크 박스에 체크되는 각각의 펫을 선택합니다. 필요한 경우 더 나은 시각화를 위해 현재의 위치 표시를 사용하지 않도록 설정합니다.
- 피펫을 준비
- (- 많은 피펫을 사용하는 경우 8 MΩ 일반적으로 최고 6) 위스콘신 피펫 채우기세포 내 솔루션을 토륨 및 그 소유자에로드. 자신의 고착에 headstages을 배치하지만, 피펫 팁으로 화장실에 손이 닿지 않도록 앞으로 그들을 밀어하지 않습니다.
- 긍정적 인 압력 제어를 가능하게하고 끝은 깨끗한 남아 있는지 확인하기 위해 모든 피펫을 선택합니다. 조심스럽게 제자리에 각 headstage를 밀어 넣습니다.
- 피펫 팁을 찾기
- 3mm 'A'버튼을 누른 채 버튼 R2를 눌러 조각 위의 초점을 중앙 위치로 현미경을 배치합니다. 버튼 L2를 눌러 이전 실험에서 저장된 A 버튼을 누른 상태에서 각 조작에 대한 해당 위치를 사용
참고 : 대부분의 경우에서 관찰하기에 충분해야한다이 때보기에서 피펫의 독특한 그림자 또는 피펫의 축을 따라 작은 움직임 하나가 있어야합니다. 피펫 모양에 약간의 차이에 대한 보상은 수동으로 수행해야합니다. - 초점에 피펫 팁을 가져와. (아직 [0, 0 2000] 위치에 있어야합니다) 현미경을 이동하지 않고 비디오 디스플레이의 빨간색 중앙 점에 끝을 놓으십시오.
- 피펫 각 피펫 팁이있는 후 버튼 C를 누른 상태에서 버튼 Z를 눌러 디스플레이의 중심에 소프트웨어를 알려, 거꾸로 그 피펫을 보낼 수 있도록 단추 A를 누른 상태에서 하나의 버튼 L1을 눌러 찾을 수 있습니다 다음
- 3mm 'A'버튼을 누른 채 버튼 R2를 눌러 조각 위의 초점을 중앙 위치로 현미경을 배치합니다. 버튼 L2를 눌러 이전 실험에서 저장된 A 버튼을 누른 상태에서 각 조작에 대한 해당 위치를 사용
- 세포 접근
- 모든 피펫 팁을 정밀하게 위치 된 각각의 피펫이 세포에 기인하면, 자동으로 각 셀에 가까운 피펫을 배치합니다. 단순히 세포의 그룹의 중심을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 팝업 메뉴에서 옵션을 '클러스터'를 선택합니다. , 표시이 시간에 위치 할 모든 피펫을 선택하고 '모두 선택 피펫으로 이동'을 클릭합니다 클러스터 옵션 창에서. 그 세포의 각 클러스터에 대해이 작업을 반복합니다.
- PE수동으로 최종 접근을 rform. 세포를 기준으로 피펫의 위치를 다르게 지정하지만, 일반적으로 200 ㎛ 떨어져 조직 외부 피펫의 선단을 유지하는 충분한 수직 방향 피펫 및 그 위에 200 ㎛의 축에서 셀로부터 단순히 수 . 피펫의 위치가 완료 될 때까지 기다렸다가 버튼 C를 누른 상태에서 버튼 R1을 누르면 피펫으로 현미경 이동
- 비디오 디스플레이의 아무 곳이나 그 끝에 현미경을 집중하고 버튼 C.에게 사각형 격자를 누른 상태에서 B 버튼을 눌러 각 피펫의 위치를 재 보정하면 간단히 피펫의 식별 된 위치를 나타내는 표시됩니다. 위치가 정확하지 않으면 버튼 C를 유지하면서, 비디오 디스플레이와 버튼을 누르면 Z의 중앙 점에 팁의 위치를
- 세포 부착 된 구성을 설정
- 현재 피펫에 대한 관심의 세포가 제대로 있는지 확인표시. 그렇지 않으면 중앙 빨간 점과 함께 관심의 세포에 맞게 현미경을 이동합니다. 마크 피펫 거리에 할당 된 셀에서 200 ㎛의 위치를 C 버튼을 누른 상태에서 버튼을 눌러 C. L2 버튼을 누른 상태에서 버튼 Y를 눌러 셀, 현미경은 자동으로 해당 위치로 이동합니다.
- 이 빨간 점을 일치하도록 피펫의 위치를 조정합니다. 버튼 X를 누른 상태에서 버튼 R1을 눌러 오프셋 피펫을 조정
- 천천히 기인 셀에 피펫 접근 버튼 X를 누른 상태에서 버튼을 L1을 눌러 테스트 펄스를 활성화합니다.
- 세포막의 표면에 딤플의 형성을 관찰시인가 압력이 셀에 도달 할 수 있도록 버튼 Z 채 Y 버튼을 누름으로써 부압의 짧은 펄스를 적용한다. 약-65mV의 유지 가능성이 버튼 X를 누른 상태에서 버튼 L2를 눌러이 시점에서 설립한다
- 전체 - 세포 구성
- 기가 시일은 각 셀에 대해 형성되면, 부압을인가함으로써 세포막을 파열 시작.
- 녹음을 수행
- 당신의 레코딩을 수행하는 자극 / 수집 시스템을 사용합니다. 한 번에 펄스 또는 하나의 개별 셀에 펄스의 기차를 적용하고 기록 세포 사이의 연결을 매핑하는 나머지 셀에 반응을 관찰합니다.
- 피펫을 떼다
- 녹음이 완료되면, 테이블 라디오 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 조직에서 서서히 피펫을 떼다. 피펫은 자신의 축을 따라 짧은 거리를 후퇴 가지고 '을 떼 -> 피펫 500 μm의'를 선택합니다. (몇 가지 긍정적 인 압력을 적용하여 조언을 취소 도움이 될 수 있습니다) 세포의 잠재력 드리프트를 관찰합니다.
- 모든 방법을 다시 피펫을 떼다, '빠른'에 위치 결정 속도를 설정하고 같은 작업을 반복하지만, '모든'옵션을 선택합니다. 사용을 제거부드럽게 headstages을 슬라이딩 홀더에서 피펫을 풀면 피펫. 그것은이 크게 피펫 팁의 위치를 방해 할 수 있기 때문에 해당 소켓에 홀더를 왜곡되는 것을 방지하는 데 유용합니다.
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Representative Results
상술의 방법으로 우리는 다음 거의 동시에 신경 세포의 큰 숫자 패치 클램프 따라서 작게 배로 동시에 최대 열두 뉴런의 전체 - 세포의 기록을 행하는 것에 성공. 쥐의 체 감각 피질의 레이어 V에 기록 된 피라미드 뉴런 사이의 직접 시냅스 연결의 네트워크의 예는 그림 6에 나와 있습니다.
주어진 세포 유형에 대한 간 체세포의 거리의 함수로서 접속 확률 정보의 판정은 다중 전극 패치 - 클램프 시스템 (1)을 효율적으로 수행 할 수있는 그 대표적인 측정이다. 최근 사진 자극은 데이터 3,4를 얻는 훨씬 더 효율적인 방법으로 표시하기 시작했다. 중요하게, 그러나, 다중 전극 패치 - 클램프 시스템으로 취득한 데이터는 실험자가 더욱 연구중인 네트워크의 맵핑뿐만 아니라 인트라 가진 고해상도 염색을 얻을 수세포는 염료를 확산. 다중 전극 패치 클램프 실험에서 모든 세포는 종종 사진 자극 칼슘 이미징과 같은 다른 기술의 경우와하지 않은, 기록 및 자극 할 수있다. 이 기능은 실험자는 달리 측정 할 수없는 상호 연결의 높은 빈도로, 연결에 편견을 추적 할 수 있습니다. 모든 공부 신경을 자극하고 기록함으로써 우리는 신경 세포뿐만 아니라 수 있습니다 상호 연결되는 편중뿐만 아니라 클러스터를 형성하는 것으로 나타났다. 우리의 기록의 규모는 우리가 더 높은 연결 확률이 공통의 이웃, 즉 모두가 동시에 샘플링 네트워크 (도 7a)의 다른 개별 뉴런에 연결된 공유 뉴런 쌍 사이에 존재하는 것을 관찰 할 수 있었다. 이 관찰은 (50-250밀리미터) 50 ㎜의 모든 intersomatic 거리 빈에서 유의 하였다. 우리는 또한 많은 일반적인 이웃을 공유하는 신경 세포의 쌍의 훨씬 더 발생 관찰열 기회 (도 7b)에 의해 예상보다. 더욱이, 우리는 신경의 주어진 쌍에 의해 공유 된 공통의 이웃의 수에 따라 연결 확률에 영향을 검출. 이 가능성 뉴런의 쌍을 주 일반적인 이웃 (도 7C) 상호 연결한다.
이러한 경향은 더욱 조밀 평균보다 상호 접속된다 뉴런 집단의 형성에 이르게한다. 흥미롭게도, 신경의 높은 상호 그룹은 평균, 강한 사람 1에서, 또한 더 많은 연결을 전시뿐만 아니라. 이러한 연구 결과는 신피질 회로가 층과 열로 조직뿐만 아니라 셀 어셈블리에뿐만 아니라 결론에 우리를 이끌고, 수십 년 전 도널드 Hebb에 의해 가정으로 치밀하고 강력한 시냅스 상호 연결을 공유하는 뉴런, 즉 그룹.
여러 동시에 패치 클램프 N 달성 할 수 가볼 결과eurons 흥분성 세포 2의 서로 다른 숫자 위에 임계 활동에 의해 억제의 채용의 정량화 있습니다. 신피질 5 억제의 유비쿼터스 형태는 피라미드 세포로부터 입력을 수신하고 대기 시간, 다른 피라미드 세포에 영향을 미치는 교대로 통합 (버거 등.에서 적응도 8a와 b) Martinotti 세포에 의해 매개된다. 우리는 네 개의 피라미드 세포 적은 활동을 못을 박는의 짧은 버스트 후, 지역의 미세 회로의 모든 피라미드 셀이 억제의 형태 (그림 8 C, C 및 F)를받는 것으로 나타났다. 우리는 또한 이러한 억제 시냅스 후 전위가 8 개 이상의 피라미드 세포 (그림 8E)을 동시에 자극 할 때 포화하는 경향이 있음을 보여 주었다.
시스템 구성 요소의 개요는도 15에서 볼 수있다. 소프트웨어 인터페이스 및 하드웨어 AR전자는도 9a 및 B뿐만 아니라 현미경 목표 (그림 9D)에서 기록 세포를 향해 전극을 안내도 9c의 컨트롤러 인터페이스에 표시됩니다.
그림 1. 동시에 기록 된 뉴런의 수의 함수로서 실험에서 관찰 된 연결의 수의 계산은 이차 성장을 나타낸다. 수치 계산 (베스트). 동일한 네트워크에 더 신경을 연속적으로 추가 설명도 (아래).
그림 2. 각 전극의 조작 (노란색) 및 현미경 (빨간색)의 좌표 시스템.
그림 3. 오버레이 방식 벡터, 세포의 위치와 스케일 바 할당 세포를 향해 접근 피펫의 화면 캡처.
그림 4. 다이어그램 피펫 압력 제어를위한 공압 시스템을 도시.
그림 5. 패치 클램프 실험 중에 사용되는 컨트롤을 중앙 집중식으로 휴먼 인터페이스 장치에 명령.
그림 6. 세 가지 네트워크의 예각각의 실험에 매핑 직접 시냅스 연결
그림 7. 동시에 서로 연결되고 크게 증가 가능성을 나타내는 샘플 네트워크 (파란색)에서 적어도 하나의 다른 신경 세포에 연결하는 신경 세포의 일반적인 이웃 효과. () 쌍. (B) 여러 공통 이웃을 공유하는 신경 세포의 쌍은 예상보다 더 자주 발생 샘플링 네트워크에서 만일. (c) 접속에 의해 공유 된 공통 쌍 이웃의 수의 함수로서 뉴런 증가 쌍 사이 확률.
그림 8. Martinotti 세포의 모집의 정량화. () 그래픽 표현입니다. 피라미드 세포 (B) 위에의 임계 자극 ( 적색) 흥분성 시냅스 후 전위를 촉진의 통합을 통해 Martinotti 셀 (파란색)의 채용으로 이어집니다. 모집 Martinotti 셀은 두 번째 피라미드 세포 (검은 색)을 억제한다. (C)도이 패치 클램프 피라미드 세포와 다른 피라미드 세포에 미치는 영향의 증가 수의 자극을 나타내는. 피라미드 세포에서 기록 (D) 평균 억제 시냅스 전위 자극 된 다른 부근 피라미드 세포의 수의 함수로서. 버거 등. 2 (e)에서 적응 로컬 회로 disynaptic 억제의 진폭은 15 이상의 피라미드 세포 STIM 때 포화 경향ulated 아마이 시점에서 도달에 Martinotti 세포의 최대 모집을 나타낸다. (F) 빨리 disynaptic 억제를받은 세포의 비율은 피라미드 세포의 숫자 자극을 증가 1로 상승한다.
그림 9. 시스템의 앙상블의 그림입니다. () 메인 윈도우 라이브 비디오 디스플레이와 그래픽 사용자 인터페이스는 윈도우와 그래픽 표현을 기록합니다. 실험 절차에 대한 컨트롤 (B) 현미경 및 조작기. (C) 휴먼 인터페이스 장치. (D) 유리에게 여러 개의 뉴런을 기록하는 위치에 마이크로 피펫.
그림 10. 이항 probabilit실험은 숙련 된 사용자에 의해 시각적 피드백을 사용하여 수행의 수율 사이에 성공적으로 사용에게 열두 전극을 주어 세포의 특정 수를 기록 실험의 비율을 설명하는 Y의 분포 함수. 비교가 파란색으로 비 이상적인 조건에서 경험이 적은 사용자가 표시됩니다 빨간색.
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Discussion
즉각적인 문제는 우리가 일반적으로 기술 된 과정 성공률 관한 생긴다. 높은 성공률에 대한 준비는 필수적이다. 피펫은 기록 된 세포의 존재에 대한 적절 팁 구멍이 있어야합니다. 막힌 피펫을 피하기 위해 세포 내 액을 여과하는 것도 중요하다. 매우 깨끗하고, 갓 뽑아 피펫은 다른 요구 사항입니다. 이항 분포는 이러한 문제를 최종 수율에 영향을 미치는 방법을 이해하는 데 사용할 수있는 간단한 모델입니다. 그것은 80 % 시각적 피드백 개별 뉴런을 기록 더의 성공률을 달성하기 위해 경험과 적절한 장비와 실험을 기대하는 것이 합리적이다. 초보자 중요한 준비 단계가 간과 특히, 매우 낮은 성공률을 달성 할 것으로 예상 할 수있다. 이 비율은 실험 당 기록 된 세포의 숫자가 변환되는 방법을 그림 10에서 볼 수 있습니다. 동시에 패치 조개의 수 또한 증가PED 신경 가능성이 조작기의 소형화와 차례로 세부 사항에 상당한주의를 필요로하는 절차의 신뢰성 향상을 필요로하지만, 완전히 실현 가능한 것입니다.
여기에 제시된 시스템의 범용성은 아직 탐구되고 및 신규 애플리케이션은 자주 세포 외 신호 및 개별 신경 활동 (7) 사이의 관계의 탐사에서 특히 발견되었다. 해부 고려 기록 셀 사이의 거리가 증가 같은 더 중요 해지고. 연결이 깔끔히 절차에 따라 그대로 남아 어디 그럼에도 불구하고,이 시스템은 확실히 장거리 및 계층 간 연결성을 조사 할 수 있습니다.
미세 조작기 제어
미세 조작기로 자동 배치를 사용하면 크게 다중 전극 패치 클램프의 과정을 가속화하고 발생을 줄이고 신뢰성을 증가인간의 오류. 다른 제조업 자들은 매니퓰레이터에 PC에서 연결을 설정하기 위해 다른 해결책을 제공한다. 일반적인 옵션은 직렬 또는 USB 포트입니다. 빠른 통신을 보장하기 위해서, 우리는 각각의 매니퓰레이터 제어기에 시리얼 포트를 전용. 자동 배치의 가장 유용한 기능은 아마도 조직 내부의 왜곡을 제한하는 전극의 대부분의 횡 방향 및 수직 움직임의 제거이다. 조직 내부 전극의 이동이 축 방향을 따라 거의 독점적으로 수행됨에 따라, 기계적 간섭이 최소화된다. 횡 방향 움직임은 때때로 혈액 및 혈관 세포를 피하기 위해 단지 필요하다.
전극의 위치를 시각화
이 실험 기간 동안 각 전극의 위치를 추적 할 수 매우 유용합니다. 전극의 전통적인 설정지는 광경에 신속하게 문제가 될 수 있습니다. 전극의 다수를 사용하는 경우는 아니다가능한 모든 시간에 시야 내의 모든 전극을 유지합니다. 그래픽 표현에 의존하는 것은 가장 직관적 인 대안이며, 또한 즉시 전극이 이미 사람이하지 않은 최종 구성에 위치하고있는 한 어떤 보여주는 실험의 진행 상황을 추적하는 데에 도움이됩니다.
비디오 수집 및 오버레이
응용 프로그램 창에서보기의 현미경 필드에서 라이브 비디오를 표시 할 수있는 기능은 매우 유용합니다. 디스플레이 창은 또한 (셀 인 somata)의 위치의 저장뿐만 아니라 현미경 및 나타나는마다 축적 된 에러를 제거하는 전극 간의 상대 위치의 빠른 업데이트를 가능 마우스 클릭에 응답하도록 프로그래밍 하였다. 우리는 또한 이러한 접근 방식의 선택 세포를 향해 각 전극에 대한 궤도 또는 이들 세포의 표시 (그림 3)과 같은 라이브 비디오에 대한 실제적인 정보의 오버레이를 구현했습니다. 등록 OF 기능과 같은 해부학 적지도 책에서 그림과 같은 보조 이미지의 중첩은 관심 영역이 즉시 명확하지 않은 곳을 지원하기 위해 구현되었습니다.
앰프
컴퓨터 제어 현미경 앰프 제어뿐만 아니라 다른 응용 프로그램에서 일어날 수있다. 이 획기적으로 여러 개의 셀을 동시에 기록과 인간의 오류의 주요 원인을 제거 할 수있는 속도와 안정성을 증가시킨다. 컴퓨터를 이용한 위치 피펫 압력 제어 다음이 시간에 가장 눈에 띄는 향상을 생산하고 있지만, 신뢰성있는 이익이 더 중요한 단계입니다.
오실로스코프
해당 시험 신호를 보장하는 적절한 스케일에서 실시간으로 시각화 및 시간 해상도는 크게 실험자가 실험 단계를 실행할 수있는 효율을 향상 할 수있다. 오실로스코프 세트를 결합하여우리는 그 시간이 중요한 단계가 바로 이러한 세포 부착 된 구성을 달성 한 후 적절한 막 전위 세포를 들고 적은 노력으로 실행되고 가시화되었다 보장 (예 : 전류 또는 전압 클램프 등) 모드를 앰프에 딸랑 딸랑. 적절한 시각화는 진폭에 맞게 오실로스코프 화면 내에서 테스트 신호의 오프셋 (offset)하는 오실로스코프의 자신의 프로토콜에 직렬 포트를 통해 적절한 스케일링과 결합 명령을 전송하여 확보 하였다.
피펫 압력 제어
정압 영구적 깨끗한 유리 전극의 선단을 유지하는 것을 보장인가 실험 증가에 채용 전극의 개수는 중요 지장 구성의 점에 더 요구대로. 충분한 양 및 음의 압력 (mbar에서의 수백)는 간단한 막 펌프에 의해 생성 될 수있다. 압력을 안정화하기 위해, 이러한 펌프는 다시 결합했다개폐 공압 밸브에 의해 제어 된 약 100 ㎖를 servoirs. 차례로 밸브는 컴퓨터 제어 데이터 수집 카드를 사용했다. 공압 회로의 다이어그램은 그림 4에서 볼 수 있습니다. 압력 제어기는 피펫은 세포를 터치로 확보 피펫 팁은 상기 절차를 가속화 세포막에 딤플 관찰시 클린 남아 또한 신속 기가 옴 시일의 형성을 허용하지 않는 유일한 중요한 역할을 수행한다.
휴먼 인터페이스 장치
대부분의 실험 설정은 널리 넓은 지역에 분산 된 실험 장비의 컨트롤이 있습니다. 우리는 매우 종종 조기 E에 큰 실험을 가져올 수있는 인간의 오류의 원인을 제거하는 각각의 셀을 기록하지만, 가장 중요한 데 필요한 시간과 노력을 감소시키는 하나의 무선 게임 패드 (도 5)에 가장 일반적으로 사용되는 제어를 집중차.
프로그래밍 언어
필요한 모든 장비의 통합을 지원하는 유일한 언어는 C / C + + 이후 우리는이 응용 프로그램에 대한 프로그래밍 언어의 측면에서 거의 선택의 여지가 있었다. C / C + +의 큰 장점 중 하나는 다중 - 코어 프로세서에 의해 허용되는 성능 개선에게서 다수의 처리 스레드를 구현하고 완전히 이익 가능성이다.
전기 생리학 데이터 수집
우리가 기술 시스템은 실험까지 전기 생리 기록 소프트웨어 및 데이터 획득 시스템의 선택을 남긴다. 데이터 수집 소프트웨어와 우리의 응용 프로그램 사이의 통신의 교환 직렬 포트를 통해 또는 네트워크를 통해 소켓 통신을 통해 일어날 수있다.
향후 전망
30 년 이상 Sakmann 및 Neher의 정액 실험 이후, 패치 클램프 기술은 STIL입니다홀로 특히, 다양한 실험에 필요한 신호의 해상도와 샘플링 주파수의 특정 조합을 사용하여 데이터를 제공하는 L 개별 시냅스 후 전위 또는 전류의 검출을 포함하는 것과. 많은 뉴런의 기록을 가능 컴퓨터 보조 시스템을 개발하여 동시에 우리는 패치 - 클램프 기법의 실험 가능성을 확대 겨냥. 실험적인 신경 과학 8-13의 최근 개발과 같은 새로운 가능성의 결합은 전례없는 속도와 디테일의 연결 회로에 대한보다 깊은 이해를 향한 길을 열 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 패치 클램프 절차의 자동화를위한 개선에 유용한 조언을 길 라드 Silberberg 다음, 미셸 피나 텔리, 토마스 K. 버거, 루카 Gambazzi 및 소니아 가르시아에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 가치있는 조언과 소프트웨어 구현에 대한 지원은 Rajnish 란잔 감사합니다. 이 작품은 유럽 연합 (EU) 시냅스의 프로젝트에 의해 부분적으로 인간 프론티어 과학 프로그램에 의해 부분적으로 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
References
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