Компьютерный многоэлектродной патч-зажим система

Summary

Многоэлектродной патч-зажим записи представляют собой сложную задачу. Здесь мы показываем, как, за счет автоматизации многих экспериментальных шагов, можно ускорить процесс, ведущий к качественному улучшению производительности и числа записей.

Abstract

Техника патч-зажим является сегодня наиболее устоявшихся способ записи электрической активности от отдельных нейронов или их субклеточных отсеков. Тем не менее, достижение стабильно записи, даже от отдельных клеток, остается много времени процедура значительной сложностью. Автоматизация многих шагов в сочетании с эффективной отображения информации могут оказать большую помощь экспериментаторов в выполнении большего количества записей с большей надежностью и за меньшее время. Для достижения масштабных записи мы пришли к выводу наиболее эффективным подходом не полностью автоматизировать процесс, но для упрощения экспериментальные шаги и уменьшить шансы человеческой ошибки во время эффективно включения опыт экспериментатора и визуальную обратную связь. С учетом этих целей мы разработали с помощью компьютера системы, которая централизует все элементы управления, необходимые для многоэлектродной патч-зажим эксперимента в в одном интерфейсе, в Commercially доступные беспроводные геймпад, при выводе эксперимента, связанных с информационно-сигналы наведения на экране компьютера. Здесь мы опишем различные компоненты системы, которая позволила нам сократить время, необходимое для достижения конфигурацию записи и существенно увеличить шансы на успешное записи большого числа нейронов одновременно.

Introduction

Емкость для записи и стимулировать несколько сайтов с точностью микрометра является чрезвычайно полезным для экспериментально достижения лучшего понимания нейронных систем. Многие методы были разработаны с этой целью, но ни один не позволяют разрешение submillivolt достигается с помощью техники патч-зажим, существенной для изучения подпороговых активность и индивидуальные постсинаптические потенциалы. Здесь мы рассмотрим развитие двенадцати электрода с помощью компьютера патч-зажим системы, направленной на одновременной записи и стимулирования большое количество отдельных клеток с достаточной точностью для изучения нейронной связи. В то время как многие другие приложения можно представить для такой системы, она поддается особенно хорошо изучению синаптической связи, учитывая, что число возможных соединений в группе нейронов возрастает пропорционально квадрату числа нейронов в вопросе. Таким образом, в то время как система с тремя электродами позволяет тестированияВозникновение до шести соединений и чаще всего записи ни одного, записи двенадцать нейронов позволяет тестирование возникновение до 132 соединений и часто наблюдая за один десяток (рис. 1). Наблюдение десятков соединений одновременно позволяет проанализировать организацию небольших сетей и вывести статистические свойства структуры сети, которые не могут быть проверены в противном случае ^1. Кроме того, точное стимулирование многочисленных клеток также позволяет оценить количественно набора постсинаптических клеток ^2.

Protocol

1. Подготовка оборудования

1. Управления манипуляторы с компьютера
   1. Подключите каждый контроллер окно Микроманипулятор к компьютеру через последовательные порты (RS-232).
   2. Реализация команды для позиционирования, запросов и настройки параметров для отправки через последовательный порт. Учитывая проблемы со скоростью и совместимости оборудования C / C + + рекомендуется в качестве языка программирования.
   3. Стандартизация опорного систему манипуляторов так что нуль ближайшее положение по отношению к двигателям и позитивное движение направлено от двигателей.
   4. Установите микроскоп на ее центральном положении 2 мм выше образца фокальной плоскости (координаты [0, 0, 2000]).
   5. Магазин, для каждого манипулятора, локальные координаты, которые позволяют кончик пипетки, которые должны соблюдаться в центре поля зрения микроскопа. Это начальный точкой отсчета для каждого электрода.
2. Видеотехникативно локализуют электродов позиции. Это очень полезно, чтобы иметь возможность отслеживать положение каждого электрода во время эксперимента. Графическое представление является наиболее интуитивный из способов достичь этого. С этой целью системы отсчета каждого электрода и, что микроскопа должны быть согласованы. Простой способ достижения этой цели является:
   1. Доведите кончик электрода в центре поля зрения.
   2. Сохранить положение на каждой оси манипулятора и каждый оси микроскопа.
   3. Выполнение с осью х манипулятора относительно большое движения (1 мм).
   4. Найдите наконечник еще раз движется только микроскоп.
   5. Рассчитайте разницу в положении микроскопа, поскольку он был в прошлом измерить. Таковы прогнозы движения оси электрода на оси микроскопа.
   6. Повторите шаги 2.3 - 2.5 для Y и Z осей электрода манипулятора. Это позволяет матрица проекций на микроскопом осей, которые будут определены (<сильный> рис. 2) также называется косинус матрица:
      
   7. Переверните эту матрицу, чтобы сделать возможным для расчета движения, в трех измерениях, необходимые для электродной манипулятора для достижения заданной позиции в микроскоп системе координат:
      
   8. Использование начальную точку отсчета и косинус матрица определить положение каждого электрода в микроскоп координат.
   9. Дисплей графически, на основе микроскопа координирует, положение каждого электрода через регулярные промежутки времени. Мы решили использовать C / C + + рисунок библиотеки (GDI +), чтобы привлечь расположения электродов каждые 40 мс.
   10. Повторите этапы 1.2.1 - 1.2.7 каждый раз углы манипулятор изменены или если положение изменения нескольких миллиметров необходимы, например, когда тип электрода изменяется.
3. Включить хранения Positioнс соответствующих функций в ткани, такие как клетки или анатомических ориентиров, в микроскоп координаты.
4. Приобретать видео и наложения соответствующую информацию.
   1. Механически выровнять ось х движения микроскопом с горизонтальной осью микроскопа камеры.
   2. Установите на компьютере с Платы видеозахвата с видео в реальном времени и возможности наложения и комплект разработки программного обеспечения (SDK).
   3. Реализация живой операцию отображения видео с SDK.
   4. Преобразование микроскоп системы координат к опорной камеры системы на соответствующий перевод и масштабирования.
   5. Нарисуйте соответствующие функции в координатах камеры и наложения на видео в реальном времени в результате изображение на регулярной основе около 40 мсек (рис. 3).
5. Усилители управления.
   1. Используйте программное обеспечение усилителя контролировать настройки усилителя из интерфейса.
6. Колорадоуправляете осциллографы.
   1. Подключите осциллографы к компьютеру с помощью последовательных портов.
   2. Определите масштаб осциллографа, сцепление и временное разрешение на различных этапах процедуры патч-зажим в фиксации потенциала (например, электрод в ванной, формирования уплотнения, конфигурации цельноклеточной) и вольт-зажима.
   3. Отправить соответствующие команды настройки осциллографа, когда команды усилитель выдаются из интерфейса.
7. Контроль давления пипетки.
   1. Соберите систему контроля давления в соответствии с рисунком 4.
      1. Используйте 12 В / 5 В питания снабдить каждую электронный компонент соответствующим образом.
      2. Соедините выход одного мембранного насоса к положительному буфера давления (мл контейнера 100).
      3. Подключите вход одного мембранного насоса с отрицательным буфером давления (мл контейнера 100).
      4. Подключите трубку держателя пипетки с датчиком давления в давлеповторно систему управления и пневматический клапан, который подключается к основным отделением давления.
      5. Подключение каждого из буферов давления к клапану соединен с главным отсеком давления.
      6. Подключение клапан между основным отделением давления и атмосферой.
      7. Подключите датчик давления в основном отделении давления.
      8. Подключите датчик давления в каждом буфере.
      9. Подключите систему контроля давления в плате сбора данных.
      10. Подключите каждый датчик давления к одному аналоговому входу.
      11. Подключите каждый клапан на цифровой выход.
   2. Удалить смещение от всех датчиков, открыв все клапаны, кроме тех, подключения к мембранных насосов и вычитая измеренное давление атмосферное давление.
   3. Реализовать контроль давления
      1. Определить в интерфейсе управления для включения или де-активации положительный контроль давления для каждого пипетки.
      2. Определить минимальное положительное давление для пипеткис около 70 мбар.
      3. Периодически (раз в 0.5 сек) обнаружить, когда давление в пипеток под контролем активного давления падает ниже установленного порога.
      4. По пересечения порога не открыть положительный буфер давления для основного отделения давления и этот отсек к пипетки в вопросе во время кратких периодов (20 мс), пока давление в пипеток выше порога. Закройте все другие клапаны.
      5. Де активировать дополнительный контроль давления, как окончательный подход к ячейке интерес инициируется.
   4. Применить отрицательное давление для формирования уплотнения
      1. Закройте все клапаны и открыть негативное буфера давления клапан в сторону основного отделения давления и этот отсек к пипетки в вопросе в течение всего срока экспериментатор требует, сохраняя кнопку нажатой.
8. Централизация команды на устройство интерфейса человека.
   1. Подключите имеющийся в продаже Wireleсс геймпад к компьютеру.
   2. Реализация считывание состояния джойстика. Например, использовать библиотеки DirectX для C / C + + для выполнения показания каждые 5 мс.
   3. Сравнение текущего состояния с предыдущего состояния для обнаружения, которые были нажата, отпущена или нажата кнопки с момента последнего временного шага.
   4. Связать функции каждой кнопке в геймпада. Примером этого отображения показан на рисунке 5.

2. Процедура патч-зажим

1. Подготовить ломтики мозговые области, представляющей интерес.
2. Поставьте мозга кусочек интерес, с интересующей нас области в центре диапазона перемещения микроскопа.
3. Выбор сотового
   1. Идентификации клеток, представляющих интерес при просмотре под микроскопом. Храните положение клеток на основе микроскопа системе координат с правой кнопкой мыши щелкните на видеоизображение дисплее в верхней части ячейки интерес. Графический интерфейс будет отображать выбранные ячейки, а также микропипетки для глобального обзора и программного обеспечения добавит маркер на позицию клеток, которые будут наложены на изображения. Кроме того образ ячейки захватывается для дальнейшего использования в файле 'Сотовый #. JPG'.
4. Отнесение клеток пипеток
   1. После выбора клетки интерес, назначить которые пипетки будет записывать каждую ячейку. Графический интерфейс обеспечивает управление назначения, которые должны быть установлены. Визуализация предварительный просмотр окончательной конфигурации, установив флажок "Показывать окончательные позиции.
   2. Выберите каждый пипетки, для которых конечное положение предварительного просмотра желаемого или проверить 'Select All' флажок. Отключение отображения текущего положения для лучшей визуализации в случае необходимости.
5. Подготовьте Пипетки
   1. Заполните пипетки (6 - 8 МОм, как правило, лучше всего, если используются многие пипетки) шй внутриклеточный решение и загружать их в их владельцам. Поместите головкам в своих записях, но не скользить их вперед, не прикасаясь к ванной с кончика пипетки.
   2. Включить контроль положительным давлением и выбрать все пипетки для того, чтобы советы останется чистой. Аккуратно вставьте каждый headstage на месте.
6. Расположение кнопок наконечники
   1. Расположите микроскоп в центральное положение с упором 3 мм выше среза, нажав кнопку R2, удерживая кнопку «А». Используйте соответствующую позицию для каждого манипулятора как хранится от предыдущего эксперимента, нажав кнопку L2, удерживая кнопку A.
      Примечание: На данный момент не должно быть либо отличительной тень пипетки с учетом или небольшой движение по оси пипетки должны быть достаточно, чтобы наблюдать его в большинстве случаев. Компенсация за небольшими различиями в форме пипетки должна быть выполнена вручную.
   2. Принесите пипетки в фокус. Поместите кончик на красной центральной точкой в ​​видео-дисплей без перемещения микроскопа (это все равно должны быть в позиции [0, 0, 2000]).
   3. Сообщить программное обеспечение, которое пипетка находится в центре дисплея, нажав кнопку Z, удерживая кнопку С. После каждой пипетки находится, отправить этот пипетку назад так, что следующий за ним могут быть расположены, нажав кнопку L1, удерживая кнопку A.
7. Подойдя клетки
   1. После того как все наконечники были точно расположена и каждый пипетки отнести к клетке, автоматически расположить пипетки, близких к их соответствующих клеток. Просто щелкните правой кнопкой мыши в центре группы клеток и выбрать опцию 'Cluster "на всплывающем меню. На окне настроек кластера, который появится, выберите все пипетки, которые вы хотите поместить в это время и нажмите на 'Go со всеми проверенных пипеток. Повторите эту операцию для каждого кластера клеток, представляющих интерес.
   2. Пеrform окончательный подход вручную. Положение пипеток по отношению к клеткам может быть указано по-другому, но обычно это просто от ячейки по оси пипетки и 200 мкм над ним в вертикальном направлении, которое достаточно, чтобы кончик пипетки за пределами ткани 200 мкм . Подождите, пока позиционирование пипеток не закончено и переместите микроскопа к пипетки, нажав удерживая кнопку C. кнопку R1
   3. Перекалибруйте каждую позицию пипетки, сосредоточив внимание микроскоп на его кончике нигде в видео-дисплей и нажав кнопку В удерживая C. Кнопка квадратной сетки должны ненадолго появится указанием выявленных положение пипетки. Если положение не является правильным, позиционировать кончик на центральной точкой видеодисплея и нажмите кнопку Z, удерживая кнопку C.
8. Установите конфигурацию клеток подключением
   1. Подтвердите, что клетка представляет интерес для текущего пипетки правильноотмечен. В противном случае перемещения микроскопа, чтобы соответствовать ячейку интересов с центральной красной точкой. Марк клетка, нажав кнопку Y, удерживая кнопку C. Нажмите кнопку L2, удерживая кнопку С, чтобы поместить пипетку 200 мкм от ее установленного клетки, микроскоп автоматически переместится в соответствующее положение.
   2. Отрегулируйте положение пипетки таким образом, это совпадает с красной меткой. Отрегулируйте пипетки смещение, нажав удерживая кнопку X. кнопку R1
   3. Активируйте тестовую пульс нажатием кнопки L1, удерживая кнопку X. Медленно подойти пипетку его отнести клетки.
   4. При наблюдении образование углубления на поверхности клеточной мембраны применять краткое импульс отрицательного давления при нажатии на кнопку Y, удерживая кнопку Z, чтобы приложенное давление, чтобы достичь клетку. Должны создан холдинг потенциал о-65mV на данный момент, нажав на кнопку L2, удерживая кнопку X.
9. Конфигурация Цельноклеточная
   1. После того, как печать Giga-формируется для каждой ячейки, начать разрыва мембраны, применяя отрицательное давление.
10. Выполните записи
    1. Используйте систему стимуляции / приобретения выполнять свои записи. Применение импульсов или серии импульсов на один отдельной клетки одновременно наблюдать и ответов на остальных клеток к карте соединения из записанных клеток.
11. Отступите пипетки
    1. После записи завершена, отступать пипетки медленно из ткани щелкнув правой кнопкой мыши на радио-кнопки Таблица. Выберите 'Отступите-> Пипетки 500 мкм' иметь пипетки отступать нескольких минутах ходьбы вдоль их осей. Соблюдайте дрейф в потенциале клеток (очистка советы, применяя некоторые положительное давление может помочь).
    2. Отступать пипетки весь путь обратно, установить скорость позиционирования в "Быстрый" и повторить ту же операцию, но выберите опцию «Все». Удалить используетсяпипетки, осторожно перемещая вне головкам и открутив пипетки из держателей. Это полезно, чтобы избежать скручивания держателей в глазницах, так как это может существенно повлиять на положение кончика пипетки.

Representative Results

После описанных выше методов нам удалось выполнения записи цельноклеточной до двенадцати нейронов одновременно, почти в два раза наибольшее количество нейронов одновременно патч-зажат до сих пор. Примеры сетей прямых синаптических связей между пирамидальных нейронов, записанной в Layer V в соматосенсорной коре крыс показаны на рисунке 6.

Определение вероятности соединение профилей в зависимости от меж-соматической расстояния для данного типа клеток представляет собой типичный измерение Интересно, что могут быть выполнены эффективно с многоэлектродной системы ¹ патч-зажим. Недавно фото-стимуляция стали появляться как еще более эффективный средств получения таких ^3,4 данных. Важно отметить, однако, данные, полученные с мульти-электродных систем патч-зажим позволяет экспериментаторы, чтобы получить более полное отображение сети изучаемого, а также с высоким разрешением окрашивание внутрисотовой рассеянный красители. В многоэлектродных экспериментов патч-зажим каждая клетка может быть записан и стимулировали, который часто не в случае с другими методами, такими как фото-стимуляции или изображений кальция. Эта функция позволяет экспериментаторы отслеживать предрассудков в связи, например, высокой заболеваемости взаимных связей, которые не могут быть измерены в противном случае. Стимулируя и записывать каждый изучал нейрон мы показали, что нейроны не только смещен в сторону их взаимно связаны, но и образуют кластеры. Масштабы наших записях также позволили нам заметить, что более высокая вероятность существует связь между парами нейронов, разделяющими общие соседей, то есть оба одновременно подключенных к другим отдельных нейронов в выборку сети (рис. 7а). Это наблюдение было значительным на каждом intersomatic расстояния бен 50 мм (от 50 до 250 мм). Мы также наблюдали пары нейронов, разделяющих много общих соседей произошло значительно большедесять, чем ожидалось случайно (рис. 7, б). Кроме того, мы обнаружили эффект на вероятность соединения согласно количеству общих соседей, разделяемых данной пары нейронов. Более общие соседи Он разделяет более вероятно пару нейронов должно быть взаимосвязано (рис. 7в).

Эта тенденция приводит к образованию групп нейронов, которые более плотно соединенных между собой, чем в среднем. Интересно, что весьма взаимосвязанные группы нейронов не только выставлены более многочисленные связи, но и, в среднем, более сильными ^1. Эти данные привел нас к выводу, что неокортекса схема не только организованной в слоях и столбцов, но и в клеточные ансамбли, т.е. группы нейронов, разделяющих плотную и сильную синаптическую взаимосвязанности как постулируется Дональдом Hebb несколько десятилетий назад.

Другие результаты интересов, которые могут быть достигнуты с несколькими одновременно патч-зажаты пeurons включают количественное определение набора ингибирования выше порога активности в разных номеров возбуждающих клеток ^2. Повсеместно форма торможения в коре головного мозга ⁵ опосредуется Маринотти клеток (8А и В, адаптированных с Бергер и др.)., Которые получают входной сигнал от пирамидальных клеток и интегрировать его в свою очередь влияет на, с некоторой задержкой, других клеток пирамидальных. Мы показали, что после краткой всплесков пики активности в качестве всего лишь как четыре пирамидальных клеток, каждый пирамидальная клетка в местном микросхемы получает эту форму торможения (Цифры 8c, с, е). Мы также показали, что эти тормозные постсинаптические потенциалы, как правило, насыщают когда восемь или более пирамидальные клетки стимулируются одновременно (фиг. 8Е).

Обзор компонентов системы можно увидеть на рисунке 9. Программное обеспечение интерфейса и аппаратного аре показано на фиг.9а и В, а также интерфейса контроллера на рисунке 9c направляющий электроды к клеткам для записи под объектив микроскопа (рис. 9d).

Рисунок 1. Расчет количества соединений наблюдаемых в эксперименте в зависимости от числа нейронов одновременно записанных показывает квадратичный рост. Численные расчеты (топ). Наглядная схема, где дальнейшие нейроны той же сети последовательно добавляют (внизу).

Рисунок 2. Системы координат каждого электрода манипулятора (желтый) и микроскопа (красный).

Рисунок 3. Экран захвата пипеткой в подходе к назначенной ячейке с накладным вектора подход, сотовые позиций и масштабной линейки.

Рисунок 4. Диаграмма, иллюстрирующая пневматическую систему для контроля давления пипетки.

Рисунок 5. Команды на человеческий интерфейс устройства, которое централизует управления, используемые во время патч-зажим экспериментов.

Рисунок 6. Пример из трех сетейпрямые синаптические связи, отображенные в отдельных экспериментов

Рисунок 7. Общий эффект сосед. (А) Пары нейронов, которые одновременно соединяются с по крайней мере одним другим нейроном в дискретизированного сети (синий) демонстрируют значительно повышенную вероятность быть соединены между собой. (Б) Пары нейронов, разделяющих несколько общих соседей происходить чаще, чем ожидалось случайно отобранных в сети. (с) вероятность соединения в пар нейронов возрастает в зависимости от количества общих соседей, разделяемых пары.

Рисунок 8. Количественное определение набора Маринотти клеток. () Графическое представление Cell пирамидальной (красный), что формирует синапсы на Martinotti мобильный (голубой), которые в свою очередь, образует синапсы на второй пирамидальная клетка (черный). (б) Supra-порог стимуляции клетки пирамидальной ( красный) приводит к вербовке в Cell Martinotti (синий) путем интеграции содействия возбуждающие постсинаптические потенциалы. Затем Нанятые Martinotti сотовый подавляет вторую пирамидальная клетка (черный). (С) схема, представляющая стимуляцию увеличением числа патч-зажимается пирамидальных клеток и воздействия на другого пирамидальная клетка. (Г) Средние тормозные постсинаптические потенциалы, записанные с пирамидальная клетка в зависимости от количества других близлежащих пирамидальных клеток, которые стимулируются. Адаптировано из Berger и соавт. ² (е) Амплитуда disynaptic торможения в локальной цепи имеет тенденцию к насыщению при 9 или более пирамидальные клетки, стимulated указывая максимальную вербовку Маринотти клеток в, вероятно, достигли в этой точке. (е) доля клеток, получающих disynaptic ингибирование быстро поднимается к 1 при увеличении числа пирамидальных клеток стимулируются.

Рисунок 9. Иллюстрация ансамбля системы. (А) Графический пользовательский интерфейс с главного окна, живого изображения видео, окно и графическое представление войти. (Б) микроскоп и манипуляторы. (С) Человек интерфейс устройства с элементами управления для экспериментальной процедуры. (D) стекла микропипетки в положение для записи нескольких нейронов.

Рисунок 10. Бином probabilitфункции распределения у, описывающие часть экспериментов, которые успешно записывать заданное число клеток учетом использования двенадцать электродов. Сравнение между доходностью эксперименты проводили с использованием визуальной обратной связи на опытных пользователей приведены в синий и менее опытными пользователями в неидеальных условиях красным цветом.

Discussion

Сразу возникает вопрос, как правило, возникает в отношении показатель успеха процедуры мы описали. За высокие показатели успеха подготовка имеет важное значение. Пипетки должны быть наконечник отверстия, которые адекватны для клеток существ записанных. Фильтрация внутриклеточный решение, чтобы избежать забиты пипетки, также важно. Очень чистые, недавно вытащил пипетки еще одно требование. Биномиальное распределение является простой моделью, которую можно использовать, чтобы понять, как эти проблемы влияют на конечный выход. Резонно ожидать экспериментатора опыта и соответствующего оборудования для достижения успеха составляет 80% или более в записи отдельных нейронов с визуальной обратной связи. Новички могут быть как ожидается, достигнет гораздо более низкие показатели успеха, особенно если важные шаги по подготовке остаются без должного внимания. Как эти показатели перевести в ряды клеток, записываемых в эксперименте можно увидеть на рисунке 10. Дальнейшее увеличение количества одновременно патч-моллюскPED нейроны, вероятно, потребует миниатюризации манипуляторов и повышенную надежность процедуры, которая, в свою очередь, требует существенного внимания к деталям, но вполне возможно.

Универсальность системы, представленной здесь по-прежнему изучаются и новые приложения часто обнаруживали, в частности в исследовании взаимосвязи между внеклеточных сигналов и индивидуальной активности нейронов ^7. Анатомические соображения становятся более важными, как расстояние между записанными клеток увеличивается. Тем не менее, эта система, безусловно, позволяет исследовать большие расстояния и подключения межуровневого где соединения остаются нетронутыми в соответствии с процедурой нарезки.

Контроль Микроманипулятор

Включение автоматического позиционирования с микроманипуляторов значительно ускоряет процесс многоэлектродной патч-зажим и повышает его надежность уменьшая появлениечеловеческие ошибки. Разные производители предоставляют различные решения для того, чтобы установить связь между ПК манипуляторов. Распространенным вариантом является последовательным или USB-порт. В целях обеспечения оперативной связи мы посвятили последовательный порт для каждого контроллера манипулятора. Наиболее полезная функция автоматического позиционирования, вероятно, ликвидация большей боковой и вертикального перемещения электродов внутри ткани и ограничивающих ее искажения. Поскольку движение электродов внутри ткани происходит почти исключительно в осевом направлении, механическое вмешательство сводится к минимуму. Боковые движения необходимы только время от времени избежать кровеносные сосуды и клетки.

Визуализация расположения электродов

Это очень полезно, чтобы иметь возможность отслеживать положение каждого электрода во время эксперимента. В традиционной установки упуская из электрода может быстро стать проблематичным. При использовании большого количества электродов неможно сохранить все электроды в поле зрения во все времена. Опираясь на графическом представлении является наиболее интуитивно понятный альтернатива, а также помогает в отслеживании прогресса эксперимента, мгновенно показывая которой электроды уже позиционируется в их окончательной конфигурации, а какие нет.

Приобретение видео и наложения

Возможность отображения видео в реальном времени с поля зрения микроскопа в окне приложения является очень полезным. Окно дисплея был запрограммирован реагировать на щелчки мыши, позволяющих хранить позиций по процентным (сотовый somata), а также быстрое обновление относительных позиций между микроскопом и электродов удаления накопившихся ошибок, когда они появляются. Мы также внедрили накладку практической информации на видео в реальном времени, таких как подход траектории для каждого электрода к выбранных клеток или маркировке этих клеток (рис. 3). Регистрация оособенности е и суперпозиция вспомогательных изображений, таких как текст, фигуры из анатомических атласов также осуществляться для оказания содействия где регионах, представляющих интерес не сразу понятно.

Усилители

Компьютерным управлением микроскопа усилители могут позволить управления, которые пройдут с другими приложениями, а также. Это значительно увеличивает скорость и надежность, с которой несколько ячеек можно записывать одновременно и устраняет основной источник человеческих ошибок. После позиционирования и давления пипетки контроля с помощью компьютера это шаг, который производит самые заметные успехи в времени, но выгоды в надежности еще более важны.

Осциллографы

Обеспечения того, чтобы тестовые сигналы могут быть визуализированы в реальном времени на соответствующем уровне и временное разрешение значительно повышает эффективность, с которой экспериментатор может выполнять экспериментальные шаги. Объединяя множество осциллографаTings к усилителю режимы (например, тока или напряжения зажимом) мы обеспечили, что критичные ко времени шаги были казнены и визуализированы с небольшим усилием, таких как приемники-распределители на соответствующих мембранных потенциалов сразу после достижения прилагаемый конфигурацию клеток. Правильное визуализация была обеспечена, отправив соответствующие масштабирования и соединительные команды через последовательный порт в собственный протокол осциллографа, чтобы соответствовать амплитуду и смещение тестовых сигналов в экране осциллографа.

Система контроля давления в Внесите

По мере роста числа электродов, используемых в эксперименте увеличивается, гарантируя, что положительное давление подается постоянно держать кончик стеклянных электродов чистым становится более требовательным к точке, составляющих важную препятствие. Достаточное положительным и отрицательным давлением (несколько сотен мбар) могут быть получены с помощью простых мембранных насосов. Для того чтобы стабилизировать давление, эти насосы были соединены с повторноservoirs из примерно 100 мл, чьи открытия и закрытия контролировалась пневматических клапанов. Клапаны в свою очередь, были компьютерным управлением с помощью карты сбора данных. Схема пневматической цепи можно видеть на фигуре 4. Контроллер давления играет важную роль не только обеспечивающие наконечники остаются чистыми, но и условий для образования гигаом уплотнений быстро, при наблюдении ямочки на клеточной мембране, как пипетки коснуться клетки, что еще больше ускоряет процедуру.

Устройство интерфейса человек

Большинство экспериментальных установок имеют органов управления экспериментального оборудования широко рассеяны на большой площади. Мы сосредоточены наиболее часто используемых элементов управления на одной беспроводной геймпад (рис. 5) значительно сокращает время и усилия, необходимые для записи каждой ячейки, но самое главное, устранения источников ошибок человека, которые часто могут принести большие эксперименты к преждевременному ебез обозначения даты

Язык программирования

У нас было очень мало выбора с точки зрения языка программирования для этого приложения, так как единственный язык, который поддерживается интеграции всех необходимого оборудования был C / C + +. Одним из существенных преимуществ C / C + + является возможность реализации нескольких вычислительных потоков и полностью получать прибыль от повышения производительности разрешенной многоядерных процессоров.

Электрофизиологические сбора данных

Система, которую мы описано оставляет выбор электрофизиологических записи программного обеспечения и системы сбора данных до экспериментатора. Обмен связи между программным обеспечением снятия данных и нашего приложения может протекать в последовательных портов или через разъем связи по сети.

Будущие перспективы

Более 30 лет с тех пор Sakmann и нехер в семенных экспериментов, методика патч-зажим стилодин в предоставлении данных с определенной комбинации разрешением сигнала и частоты дискретизации, которые требуются для широкого спектра экспериментов, в частности те, которые вовлекают л обнаружение отдельных постсинаптических токов или потенциалов. Развивая помощью компьютера система, которая позволяет запись многих нейронов одновременно мы направлены на расширение экспериментальные возможности техники патч-зажим. Сочетание таких новых возможностей с последними событиями в экспериментальной неврологии ^8-13 может открыть путь к более глубокому пониманию нейронных цепей с беспрецедентной скоростью и подробно.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus	BX51WI	40X Immersion Objective
Manipulators	Luigs Neumann	SM-5	Serial protocol used
Amplifiers	Axon Instruments	MultiClamp 700B	SDK used
Camera	Till Photonics	VS 55	BNC analog output
Framegrabber	Data Translation	DT3120	SDK used
Oscilloscopes	Tektronix	TDS 2014	Serial communication
Data acquisition	InstruTECH	ITC 1600
Data acquisition	National Instruments	PCI-6221	Library used (.dll)
Pressure valve	SMC	SMC070C-6BG-32
Pressure sensor	Honeywell	24PCDFA6G
Membrane pump	Schego	Optimal