Бесконтактный диэлектрофорез (ПЗРО) достигает сортировки и обогащения частиц через их собственных диэлектрических свойств. Жидкостного электрода каналы заменить металлические электроды традиционные для DEP, подходящий CDEP чтобы неповреждающим стерильную характеристику и сортировки биологических частиц. Мы показываем, как подготовить микроустройство CDEP и провести клеток характеристику и сортировки эксперименты.
Диэлектрофорез (DEP) является феномен, посредством которого поляризованных частиц в неоднородном электрическом поле проходить поступательное движение, и может быть использован, чтобы направить движение микрочастиц на поверхности маркера-независимым способом. Традиционно, DEP устройства включают плоские металлические электроды узорчатые в образце канала. Этот подход может быть дорогим и требует специализированного среды в рабочих помещениях. В последнее время без контакта подход, называемый бесконтактный диэлектрофорез (ПЗРО) была разработана. Этот метод использует принцип классического DEP, избегая прямого контакта между электродами и образца по паттерна жидкостных электродов и образец канал из одного полидиметилсилоксана (PDMS) подложки, и имеет применение в качестве быстрого микрофлюидных стратегии, направленной на сортировку и обогатить микрочастицы. Уникальный для этого метода является то, что электрическое поле генерируется с помощью жидкостных электродов каналов, содержащих высокой проводимостью жидкости, которые отделены друг отОбразец канал тонким изолирующим барьером. Поскольку металлические электроды не напрямую связаться образец, электролиз, электрод отслоение и загрязнение образца избежать. Кроме того, это дает возможность недорогого и простого процесса изготовления.
CDEP Таким образом, хорошо подходит для работы с чувствительным биологическим частицы. Dielectrophoretic сила, действующая на частицы зависит не только от пространственных градиентов электрического поля, создаваемого настраиваемый дизайн геометрии устройства, но собственных биофизических свойств клетки. Таким образом, CDEP это техника этикетки без, что позволяет избежать зависимости от поверхностно-выразил молекулярных биомаркеров, которые могут быть переменно выраженных в популяции, хотя и предоставляет характеристике, обогащение и сортировку bioparticles.
Здесь мы демонстрируем основам изготовления и экспериментов с использованием CDEP. Мы объяснить простой подготовку чипе CDEP используя мягкую литографиюу техники. Обсуждается экспериментальную процедуру для характеристики частоты кроссовера частицы или клетки, частоты, на которой dielectrophoretic сила равна нулю. Наконец, мы демонстрируем использование этой техники для сортировки смесь клеток рака яичников и флуоресцирующих микросфер (бисер).
Обогащение биологического образца и сортировка частиц часто необходимо для последующего анализа. 1 Например, выделение клеток из редких жидкостей тела имеет важные применения в обнаружении рака и индивидуализированной медицине. 2,3 Наиболее часто используемые методы обогащения являются флуоресцентный активированный сортировки клеток (FACS ) 4 и магнитная сортировка клеток (ПДК), 5, которые полагаться на выраженных поверхностных маркеров для дифференциации клеток. Другие стратегии включают гидродинамическую 6 или инерциальная 7,8 сортировку, оптический пинцет, 9 acoustophoresis, 10 и диэлектрофореза. 11,12 Диэлектрофорез это движение поляризованного частицы в присутствии неоднородном электрическом поле. 13 DEP был использован для широкий спектр применения, в том числе 2,14 сортировки элементов на основе жизнеспособности, 15, характеризующего биоэлектрические свойства клеток, 16 и сортировкиING на индуцированных изменений в биофизических свойств клеток. 17,18 Традиционный DEP использует плоские электроды узорчатые в микрофлюидном канала, чтобы применить напряжение и индуцировать неоднородное электрическое поле. 13 Хотя это мощная техника, проблемы могут возникнуть, например, электрод отслоение и электролиз. Изолятор основе диэлектрофорез (ИДЕП) 19 обратился с проблемами загрязнения, электрода расслаивания и пространственной деградации области электрода через структурирование изоляционных конструкций, которые вызывают неоднородности в электрическом поле постоянного тока. IDEP был использован для селективного разделения живых и мертвых бактериальных клеток, 19 изолировать бактериальные споры, 20 и манипулировать ДНК 21 среди других приложений. Джоулев нагрев может быть проблемой, потому что это может произойти в результате высокого напряжения постоянного тока часто требуется. Для улучшения этих проблем, контактные без DEP микроприборы были разработаны. 22-24
<p clasс = "jove_content"> Методика, представленная здесь использует бесконтактную диэлектрофореза (ПЗРО), названная так из-за отсутствия прямого контакта между металлическими электродами и образца канала. 22 Уникальный для этой стратегии является замена металлических электродов с жидкими электродных каналов, заполненных высокой проводимостью решение. Эти жидкости электроды емкостной связью через тонким изолирующим барьером для образца канала через напряжение переменного тока. Устранение контакта образца с электродами уменьшает проблемы, связанные с методами DEP, основанных на таких как электролиза и образования пузырьков, загрязнения образца и электрода расслаивания. В результате CDEP особенно полезно для биологических проб, поскольку он поддерживает жизнеспособности клеток в образце. Важно отметить, что CDEP может поддерживать образец стерильности. Чип может быть приготовлена в капот культуре клеток и эксперимент может быть проведен без необходимости образец контакт с металлическими электродами или требует, чтобы образец быть открыты для Environmeнт. Простой резервуар может быть закреплен на выходе чипа, чтобы облегчить восстановление стерильной образца. Кроме того, изготовление электродов жидкости из одного биосовместимого полимерного материала (PDMS) в качестве образца канала снижает высокие затраты, понесенные с пользовательского паттерна металлических электродов, время, необходимое для изготовления и ограничивает необходимость в специализированном оборудовании чистых помещений в исходное структурирование многоразового кремниевой пластины марки.Движение частиц за счет DEP зависит от характеристик частицы и среды, а также от пространственных градиентов электрического поля. Частица-и частотно-зависимый фактор, называемый Клаузиуса-Моссотти (см) фактор, принимает значение в диапазоне от -0,5 до 1, и определяет направление DEP силы. Частота, при которой коэффициент CM точно равна нулю, называется частота разделения. Это точка, в которой нет dielectrophoretic сила не оказывает на частицу и знак изменения коэффициента СМ. СИнгл частота кроссовера для твердых инертных микросфер происходит, когда изменяется коэффициент СМ с отрицательного на положительный 25 Для клеток млекопитающих в буфере с низким проводимости порядка 0,01 См / м, первой частоте кроссовера с указанием переход от Ndep к pDEP существует около 10. – 100 кГц, и зависит от размера, формы, цитоскелета и мембраны свойств клетки. 26,27 Второй частота кроссовера на переход от pDEP к Ndep режима составляет порядка 10 МГц, и находится под влиянием ядро-цитоплазма отношение, цитоплазма проводимость, и эндоплазматическая сеть. 27 DEP сила может быть приложена без присутствия потока жидкости, но здесь мы используем течет жидкость для достижения непрерывного сортировку взвешенных частиц. Совместное влияние на dielectrophoretic силы и Стокса сила сопротивления диктуют поступательное движение частицы.
Мы разработали устройства для работы в двух частотных диапазонах. Высшее частотноеу устройства (100-600 кГц) действовали с помощью pDEP и достигнутый пакетный сортировку клеток, таких как опухоли простаты инициирующих клеток (тики), мышиных яичников поверхности эпителиальных (Месе) клеток, MDA-MB-231 клеток рака молочной железы, или жить THP -1 клетки путем выборочного захвата интересующих клеток на изолирующих сообщения, расположенные в образце канала. 28-31 нижних частот (5-100 кГц) устройства работают непрерывно, и когда работает на частоте, при которой один население испытывает pDEP а фон население опыт Ndep, можно перенаправить траектории частиц для достижения сортировки. 32-34 низкочастотные Эти устройства были использованы для сортировки раковые клетки от красных кровяных клеток, определяют изменения диэлектрических свойств прогрессивной линии MOSE клеток и выяснить эффекты не- токсичные сфинголипида лечения на реверсивный агрессивные характеристики агрессивных Месе клеток. Кроме того, CDEP микроприборы может быть рассчитан на работу при повышенной пропускной способности, в настоящее время до 1 мл / чр. 31,35
Как описано, гибкость и низкая стоимость процесса изготовления позволяет индивидуальному заказу геометрии устройства, которые позволяют представлены экспериментальная процедура, чтобы быть актуальными для широкого спектра приложений. Долгосрочная цель CDEP это осознать, без наклеек сортировку клеток и обогащение на клиническом уровне, с восстановлением образца для последующей культуры или обработки. Методика, представленные здесь, простой и недорогой метод, от изготовления к экспериментам, что повышает доступность DEP. Мы демонстрируем подготовку чипе CDEP и экспериментальный протокол для достижения характеристику и обогащение клеток рака яичников от люминесцентных микросфер.
DEP является мощным средством для определения диэлектрических свойств частиц и направления движения частиц к сортировки приложений, изоляции, или по обогащению. В связи с вредного воздействия прямого контакта электрода с образцом, другие взяли подходы, аналогичные ранее предложенного метода, чтобы избежать контакта. Например, Башир и др.. Разработаны бесконтактные DEP устройств с помощью микрофлюидных PDMS устройство, отделенный от печатных электродов печатных плат тонким покровным стеклом, и этот метод можно также ознакомиться в видео-формате. 23,36
Здесь мы показали, изготовление чипе CDEP и жидкостных электродов с использованием одного PDMS подложку и экспериментальный протокол для разделения клеток рака яичников из смеси клеток и флуоресцентных шариков. Представленная методика успешно используется для различных более сложных и физиологически соответствующих приложений, включая сортировку Ливе и мертвые клетки, 28 опухоль начала клетки от клеток рака простаты, раковые клетки 30 из разбавленных эритроцитов, 31,32 и дифференциации между стадиях рака молочной железы 37 и рака яичников. 29 CDEP также используется для смешивания частиц. 38 Эти приложений показывают, что с помощью простой метод, представленный, различных целей может быть достигнуто просто за счет изменения конструкции геометрии канала.
. DEP полезно на микроуровне для манипуляции частицами 13 Для сферических частиц, поступательное dielectrophoretic сила зависит от размера и электрических свойств частицы и ее суспендирующей среды, а также градиент электрического поля в квадрат:
где ε м является проницаемость суспендирующей среды, г-радиусчастицы, и Rc [к (ω)] является реальная часть Клаузиуса-Моссотти (СМ) фактора. Коэффициент CM представляет собой меру относительной поляризуемости частицы по сравнению с суспендирующей среды и определяет направление dielectrophoretic силы. Это описано как
где и являются сложные диэлектрические проницаемости частицы и среды, соответственно. Комплекс проницаемость, , Зависит от проводимости (σ) и частоты (ω). Коэффициент CM сферических частиц теоретически связаны между -0,5 и +1. Если коэффициент CM является отрицательным, частицы испытывают Ndep поскольку среда более чем поляризуемого частицы, так частицы движутся от регионоввысокие градиенты электрического поля. Если коэффициент CM является положительным, частицы более чем поляризуемого среды, и они испытывают pDEP в которой они движутся в направлении области высоких градиентов электрического поля.
Для биологических частиц, неоднородное по структуре, например, клеток, фактор Клаузиуса-Моссотти может быть определена из эффективного значения для проницаемости частиц:
где и это комплексная диэлектрическая проницаемость эффективной комплексной диэлектрической проницаемости внутренней части клетки, такие как цитоплазме и плазматической мембраны, соответственно;. г есть радиус ячейки, и г представляет собой толщину плазматической мембране 26
Когда происходит с DEP частиц, взвешенных вжидкость, движение частиц относительно жидкости будет генерировать силу сопротивления на частицы. Это сила сопротивления необходимо учитывать при определении общей силы, действующая на частицу. Для ситуаций, интересующих нас, вязкие силы доминировать и частицы считаются сферическими, маленький, и перемещение с относительно низкой скоростью, так что сопротивление закон Стокса обеспечивает хорошее приближение для силы сопротивления:
где η является вязкость жидкости, и р есть скорость частицы, а у ф является скорость жидкости, которые также могут быть в движении. Учитывая dielectrophoretic сила, известная жидкость и свойства частиц, и известный скорость потока, баланс между силы сопротивления и dielectrophoretic силу может быть решена оценить скорость частиц. Скорость сдвига, что опыт клетки должны быть ниже порога, при котором слокоть лизиса может произойти.
Характеристика электрических свойств частиц необходимо прогнозировать и контролировать то, как они будут реагировать в соответствии с DEP их. В этой работе, мы специально использовали низкочастотный CDEP с MOSE-L клеток, чтобы продемонстрировать протокол для определения первой частоты кроссовера клеток, а затем показал непрерывный сортировку полистирольных шариков и MOSE-L клеток на основе их противоположных DEP ответов.
Изменение геометрии устройства CDEP изменит пространственные градиенты электрического поля, что позволяет устройствам быть предназначена для высокой частоты или низкой частоте, так и для высокой селективности и эффективности сортировки для указанного типа клеток. Кроме того, высокие устройства пропускная способность может быть разработан изготовления более широкие каналы, 30 каналов параллельно, 30 или многослойными изготовления 35, в котором электродные каналы вертикально уложенными сверху и снизу относительно глубокийОбразец канал. Тонких мембран образуют барьер между слоями. Предварительное тестирование с устройствами, изготовленных в полиметилметакрилата (ПММА) и поликарбоната (PC) тонкие пленки продемонстрировали DEP ответ MOSE-L клеток. Настоящее время предпринимаются усилия для уточнения многослойные высокой пропускной устройств и улучшить периферическое системы к возможному плагин и играть платформы. Для расширения от основной экспериментальной техники, представленной, приложения и спецификации устройства могут быть приспособлены к конкретным требованиям, такие как сортировка по сравнению с характеристикой, или добавление образцов водохранилищ и полу-автоматизированной системы к устройству.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа поддерживается была частично поддержана Национальным научным фондом под Грантом Номер EFRI 0938047, и на Virginia Tech Институт важнейшим технологиям и прикладной науки (ICTAS). Авторы хотели бы выразить признательность доктору Ева Schmelz и д-ра Пола Робертса за их любезное дар MOSE-L клеток. Авторы признают, Анжела Андерсон за помощь с культурой клеток, Caitlan Swaffar за ее помощь в редактировании этого документа и подготовке экспериментов, и все члены лабораторных Bioelectromechanical Systems.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI,USA | Sylgard 184 | |
Glass slides | The Microscope Depot | 76079 | 2×3 inch-ground edges |
Microbore PTFE Tubing | Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA | EW-06417-31 | Thin walled 20 gauge, 0.032″ID x 0.056″OD, 100 ft/roll |
Luer-slip plastic syringes | National Scientific company | S7510-1 | |
Needle tip | Howard Electronic instruments | JG20-1.0 | 20 Gauge 1.0″, ID=0.025″ OD=0.036″ |
D(+)-Sucrose | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S3-500 | |
D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous | Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ | AC410955000 | |
RPMI-1640 Medium | Quality Biological Inc. | 112-025-101 | |
Calcein AM, Molecular Probes | Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA | C3100MP | excitation wavelength 488/emission wavelength 516 |
Rhodamine B, O | Science Lab | SLR1465-100G | excitation wavelength 540/emission wavelength 625 |
Phosphate buffered saline (10X) | Gbiosciences, St. Louis, MO | RC-147 | |
Leica, inverted light microscope | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | Leica DMI 6000B | |
Leica DFC420, color camera | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | Leica DFC420 | |
Function generator | GW Instek, Taipei, Taiwan | GFG-3015 | |
Wideband power amplifier | Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA | AL-50HF-A | |
HFHV Output Transformer | AL-T50-V25/300-F100K-600K | ||
High voltage amplifier | Trek | Model 2205 | |
USB Modular Oscilloscope, 100 MHz | AgilentTechnologies | U2701A | |
Expanded Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001/002 (115/230V) | air plasma |
Scotch Magic tape | 3M | any available width is sufficient | |
1.5 mm puncher | Harris Uni-Core | Z708836-25EA | |
.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
FluoSpheres Sulfate Microspheres | Invitrogen | F8858 | 4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605) |
AZ 9260 photoresist | AZ Electronic Materials | ||
AZ 400 K developer | AZ Electronic Materials | ||
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25% | provided by Virginia Tech cleanroom | ||
Teflon coating | applied using DRIE machine | ||
Silicon wafer | University Wafer | 452 | 100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP) |
Deep Reactive Ion Etching (DRIE) | Alcatrel | AMS SDE 100 |