Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Этикетка без Выделение и Обогащение клетки через бесконтактных диэлектрофореза

Published: September 3, 2013 doi: 10.3791/50634
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1School of Biomedical Engineering and Science, Virginia Tech, 2Department of Engineering Science and Mechanics, Virginia Tech

Summary

Бесконтактный диэлектрофорез (ПЗРО) достигает сортировки и обогащения частиц через их собственных диэлектрических свойств. Жидкостного электрода каналы заменить металлические электроды традиционные для DEP, подходящий CDEP чтобы неповреждающим стерильную характеристику и сортировки биологических частиц. Мы показываем, как подготовить микроустройство CDEP и провести клеток характеристику и сортировки эксперименты.

Abstract

Диэлектрофорез (DEP) является феномен, посредством которого поляризованных частиц в неоднородном электрическом поле проходить поступательное движение, и может быть использован, чтобы направить движение микрочастиц на поверхности маркера-независимым способом. Традиционно, DEP устройства включают плоские металлические электроды узорчатые в образце канала. Этот подход может быть дорогим и требует специализированного среды в рабочих помещениях. В последнее время без контакта подход, называемый бесконтактный диэлектрофорез (ПЗРО) была разработана. Этот метод использует принцип классического DEP, избегая прямого контакта между электродами и образца по паттерна жидкостных электродов и образец канал из одного полидиметилсилоксана (PDMS) подложки, и имеет применение в качестве быстрого микрофлюидных стратегии, направленной на сортировку и обогатить микрочастицы. Уникальный для этого метода является то, что электрическое поле генерируется с помощью жидкостных электродов каналов, содержащих высокой проводимостью жидкости, которые отделены друг отОбразец канал тонким изолирующим барьером. Поскольку металлические электроды не напрямую связаться образец, электролиз, электрод отслоение и загрязнение образца избежать. Кроме того, это дает возможность недорогого и простого процесса изготовления.

CDEP Таким образом, хорошо подходит для работы с чувствительным биологическим частицы. Dielectrophoretic сила, действующая на частицы зависит не только от пространственных градиентов электрического поля, создаваемого настраиваемый дизайн геометрии устройства, но собственных биофизических свойств клетки. Таким образом, CDEP это техника этикетки без, что позволяет избежать зависимости от поверхностно-выразил молекулярных биомаркеров, которые могут быть переменно выраженных в популяции, хотя и предоставляет характеристике, обогащение и сортировку bioparticles.

Здесь мы демонстрируем основам изготовления и экспериментов с использованием CDEP. Мы объяснить простой подготовку чипе CDEP используя мягкую литографиюу техники. Обсуждается экспериментальную процедуру для характеристики частоты кроссовера частицы или клетки, частоты, на которой dielectrophoretic сила равна нулю. Наконец, мы демонстрируем использование этой техники для сортировки смесь клеток рака яичников и флуоресцирующих микросфер (бисер).

Introduction

Обогащение биологического образца и сортировка частиц часто необходимо для последующего анализа. 1 Например, выделение клеток из редких жидкостей тела имеет важные применения в обнаружении рака и индивидуализированной медицине. 2,3 Наиболее часто используемые методы обогащения являются флуоресцентный активированный сортировки клеток (FACS ) 4 и магнитная сортировка клеток (ПДК), 5, которые полагаться на выраженных поверхностных маркеров для дифференциации клеток. Другие стратегии включают гидродинамическую 6 или инерциальная 7,8 сортировку, оптический пинцет, 9 acoustophoresis, 10 и диэлектрофореза. 11,12 Диэлектрофорез это движение поляризованного частицы в присутствии неоднородном электрическом поле. 13 DEP был использован для широкий спектр применения, в том числе 2,14 сортировки элементов на основе жизнеспособности, 15, характеризующего биоэлектрические свойства клеток, 16 и сортировкиING на индуцированных изменений в биофизических свойств клеток. 17,18 Традиционный DEP использует плоские электроды узорчатые в микрофлюидном канала, чтобы применить напряжение и индуцировать неоднородное электрическое поле. 13 Хотя это мощная техника, проблемы могут возникнуть, например, электрод отслоение и электролиз. Изолятор основе диэлектрофорез (ИДЕП) 19 обратился с проблемами загрязнения, электрода расслаивания и пространственной деградации области электрода через структурирование изоляционных конструкций, которые вызывают неоднородности в электрическом поле постоянного тока. IDEP был использован для селективного разделения живых и мертвых бактериальных клеток, 19 изолировать бактериальные споры, 20 и манипулировать ДНК 21 среди других приложений. Джоулев нагрев может быть проблемой, потому что это может произойти в результате высокого напряжения постоянного тока часто требуется. Для улучшения этих проблем, контактные без DEP микроприборы были разработаны. 22-24

22 Уникальный для этой стратегии является замена металлических электродов с жидкими электродных каналов, заполненных высокой проводимостью решение. Эти жидкости электроды емкостной связью через тонким изолирующим барьером для образца канала через напряжение переменного тока. Устранение контакта образца с электродами уменьшает проблемы, связанные с методами DEP, основанных на таких как электролиза и образования пузырьков, загрязнения образца и электрода расслаивания. В результате CDEP особенно полезно для биологических проб, поскольку он поддерживает жизнеспособности клеток в образце. Важно отметить, что CDEP может поддерживать образец стерильности. Чип может быть приготовлена ​​в капот культуре клеток и эксперимент может быть проведен без необходимости образец контакт с металлическими электродами или требует, чтобы образец быть открыты для Environmeнт. Простой резервуар может быть закреплен на выходе чипа, чтобы облегчить восстановление стерильной образца. Кроме того, изготовление электродов жидкости из одного биосовместимого полимерного материала (PDMS) в качестве образца канала снижает высокие затраты, понесенные с пользовательского паттерна металлических электродов, время, необходимое для изготовления и ограничивает необходимость в специализированном оборудовании чистых помещений в исходное структурирование многоразового кремниевой пластины марки.

Движение частиц за счет DEP зависит от характеристик частицы и среды, а также от пространственных градиентов электрического поля. Частица-и частотно-зависимый фактор, называемый Клаузиуса-Моссотти (см) фактор, принимает значение в диапазоне от -0,5 до 1, и определяет направление DEP силы. Частота, при которой коэффициент CM точно равна нулю, называется частота разделения. Это точка, в которой нет dielectrophoretic сила не оказывает на частицу и знак изменения коэффициента СМ. СИнгл частота кроссовера для твердых инертных микросфер происходит, когда изменяется коэффициент СМ с отрицательного на положительный 25 Для клеток млекопитающих в буфере с низким проводимости порядка 0,01 См / м, первой частоте кроссовера с указанием переход от Ndep к pDEP существует около 10. - 100 кГц, и зависит от размера, формы, цитоскелета и мембраны свойств клетки. 26,27 Второй частота кроссовера на переход от pDEP к Ndep режима составляет порядка 10 МГц, и находится под влиянием ядро-цитоплазма отношение, цитоплазма проводимость, и эндоплазматическая сеть. 27 DEP сила может быть приложена без присутствия потока жидкости, но здесь мы используем течет жидкость для достижения непрерывного сортировку взвешенных частиц. Совместное влияние на dielectrophoretic силы и Стокса сила сопротивления диктуют поступательное движение частицы.

Мы разработали устройства для работы в двух частотных диапазонах. Высшее частотноеу устройства (100-600 кГц) действовали с помощью pDEP и достигнутый пакетный сортировку клеток, таких как опухоли простаты инициирующих клеток (тики), мышиных яичников поверхности эпителиальных (Месе) клеток, MDA-MB-231 клеток рака молочной железы, или жить THP -1 клетки путем выборочного захвата интересующих клеток на изолирующих сообщения, расположенные в образце канала. 28-31 нижних частот (5-100 кГц) устройства работают непрерывно, и когда работает на частоте, при которой один население испытывает pDEP а фон население опыт Ndep, можно перенаправить траектории частиц для достижения сортировки. 32-34 низкочастотные Эти устройства были использованы для сортировки раковые клетки от красных кровяных клеток, определяют изменения диэлектрических свойств прогрессивной линии MOSE клеток и выяснить эффекты не- токсичные сфинголипида лечения на реверсивный агрессивные характеристики агрессивных Месе клеток. Кроме того, CDEP микроприборы может быть рассчитан на работу при повышенной пропускной способности, в настоящее время до 1 мл / чр. 31,35

Как описано, гибкость и низкая стоимость процесса изготовления позволяет индивидуальному заказу геометрии устройства, которые позволяют представлены экспериментальная процедура, чтобы быть актуальными для широкого спектра приложений. Долгосрочная цель CDEP это осознать, без наклеек сортировку клеток и обогащение на клиническом уровне, с восстановлением образца для последующей культуры или обработки. Методика, представленные здесь, простой и недорогой метод, от изготовления к экспериментам, что повышает доступность DEP. Мы демонстрируем подготовку чипе CDEP и экспериментальный протокол для достижения характеристику и обогащение клеток рака яичников от люминесцентных микросфер.

Protocol

1. Изготовление прототипа CDEP микрожидкостных устройств: Обзор

  1. Следуйте Ранее сообщалось, процедуры 22 с помощью фоторезиста и Deep реактивного ионного травления (DRIE) для травления нужный дизайн канала (рис. 1) в кремниевой пластине (рис. 2). Депозит тонкий слой тефлона, чтобы улучшить высвобождение Микроприбор от пластины.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема низкой частоты непрерывной сортировки устройства. Опыты канала образец слева направо, и имеет ширину с пилообразных сужений до 100 мкм 500 мкм. Две пары электродов жидкостных каналов строю источником и приемником электроды, соответственно, и отделены от образца канала толстой PDMS барьера 20 мкм.

Рисунок 2
Рисунок 2. FABRication процесс устройства CDEP. (а) в течение 60 секунд, ультрафиолетового света избирательно реагирует с фоторезиста экспонируют через шаблон маски геометрии устройства CDEP. (б) фоторезист удаляют с помощью проявителя. (с) Deep реактивного ионного травления (DRIE) используется для травления, глубину 50 мкм особенности, и 5 мин влажного травления по гидроксида тетраметиламмония (TMAH) 25% при 70 ° С используется для снижения шероховатости на боковых стенках. (D) тефлоновое покрытие добавляется улучшить высвобождение устройства из пластин. (е) PDMS выливают на повторного использования пластин штампа после дегазации и отверждают в течение 45 мин при 100 ° F (е) PDMS удаляется из пластины. PDMS и чистое предметное стекло подвергаются воздушной плазмы в течение 2 мин и соединены вместе.

  1. Оберните пластину с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить перелив. Смешайте полидиметилсилоксан (PDMS) в соотношении 10:01 эластомера с отверждающий агент, де-газ в течение примерно 20 мин, И залить на пластину. Тепло в течение 45 мин при 100 ° С, чтобы не повредить тефлоновое покрытие штампа. Разрешите устройству остыть.
  2. После охлаждения удалить алюминиевую фольгу, отделка PDMS с помощью хирургического ножа, и пробивки отверстий доступа на входе / выходе канала при помощи тупого перфоратор подходит по размеру трубки. Здесь, 1,5 мм тупой панчер используется.
  3. Очистите предметное стекло микроскопа с использованием полоскание мылом, этанол, DI воды и сушки с воздухом, соответственно. Очистите устройство PDMS с помощью Scotch Magic Tape. Изучите под микроскопом, чтобы убедиться, каналы чистые. Expose слайд и PDMS устройство к воздушной плазмы в течение 2 мин. Плотно прижмите сторону канала устройства стекло, избегая образования воздушных пузырей между устройством и слайде (рис. 3).

Рисунок 3
Рисунок 3. (а) Маска используется для фотолитографии при штамп изготовления кремниевой пластины, и (б) готовой PDMS стекла устройства с образцом и жидкости электродных каналов, заполненных зеленым и красным пищевым красителем, соответственно. См. рисунок 1 для размеров. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

2. Подготовка суспензии клеток в DEP буфера

  1. Подготовка низкую проводимость (100 мкСм / см) буфер, который будет упоминаться как "DEP буфера" (8,5% сахарозы [вес / объем], 0,3% глюкоза [вес / объем], 0,725% RPMI [вес / объем]) 16.
  2. Приостановить клеток в DEP буфера при 3 х 10 6 клеток / мл. Здесь используются раковыми поздней стадии мыши яичников поверхности эпителиальных (MOSE-L) клетки.

Примечание: анализ жизнеспособность клеток трипанового методом исключения синий краситель показали небольшое снижение жизнеспособности(От 95.1-91.6%) из ранней стадии MOSE (MOSE-E) клеток, взвешенных в DEP буфера при комнатной температуре после 5 часов. Он предсказал, что подобный незначительное снижение жизнеспособности происходит для MOSE-L клеток, указывая, что клетки не должны храниться в DEP буфер в долгосрочной перспективе.

  1. Краска клеток с использованием флуоресцентного мембраны проницаемой для красителя, такие как ферментативно-активного Calcein AM.
  2. Измерение проводимости окрашенных клеточной суспензии. Проводимость должна быть примерно 100 мкСм / см. Если измерение электропроводности является слишком высокой, вращать образец вниз, ресуспендируют в буфере при DEP 3 × 10 6 клеток / мл и повторить измерение проводимости.

3. Загрузка CDEP микрофлюидный чип

  1. Поместите микрофлюидных чип в вакууме в течение 30 мин.
  2. Между тем, вырезать кусок гибкой трубки, чтобы охватить расстояние от шприцевой насос к столику микроскопа, где микрофлюидных чип будет расположен. Здесь, длина 6 дюймов из трубтребуется. Fit трубки для кончика иглы на шприц.
  3. Расчетный требуемую длину для выпускной трубы путем деления целевого объема пробы, собранной с помощью площади поперечного сечения трубы. Вырезать требуют длину трубки.
  4. Нарисуйте клеточной суспензии в шприц. Убедитесь, что не было пузырей расположен в НКТ или шприца.
  5. По удалении чип из вакуума, вставить трубку на выходе и премьер-образец канал быстро, чтобы избежать осталось воздуха в каналах. Аккуратно нажмите на шприц при заливке, чтобы избежать разрыва тонкой (20 мкм) изолирующий барьер, хотя было отмечено, что барьер может выдерживать постоянную высокую пропускную способность около 5 мл / ч без разрыва.
  6. Для простых электродных каналов, быстро разместить пустые наконечники в одном выходе каждого жидкостного канала электрода. С помощью пипетки 200 мкл ЗФР, содержащим небольшое количество родамина B и осторожно нажать, чтобы ввести жидкость в противоположном конце канала электрода. Поддерживать мягкое давлениедо PBS родамином B заметно прогрессирует до кончик пустой пипетки. Повторите для каждого электрода канала. Родамин B используется только для флуоресцентной визуализации жидкостных электродов каналов.
  7. После грунтовки, заполнить каждый пипетки резервуар с PBS родамином Б. формирования Избегайте пузырьков в наконечников пипеток водоемов, и удалите видимый пузырь с помощью пипетки осторожно вверх и вниз. Снимите трубку на выходе и выбросить надо, затем вставить резервуар сливная трубка свежий собрать целевого объема.

4. Характеризуя Кроссовер Частота клеток с использованием CDEP Chip

  1. Расположите чип на стадии инвертированного микроскопа, оснащенного цифровой камерой (рис. 4).

Рисунок 4
Рисунок 4. (а) Общая экспериментальная установка для CDEP экспериментов. Чип CDEP находится на платформе инвертированного микроскопа. Камера посылает изображения на компьютер для записи. Шприцевой насос поддерживает постоянный поток на входе. Функциональный генератор генерирует сигнал, который активизировал усилителем высокого напряжения и подключенный к микросхеме CDEP по проволочных электродов. Осциллограф контролирует сигнал, посланный с чипом. (Б) Детальный вид чипа CDEP и жидкостных и электронных соединений. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

  1. Установите шприц на шприцевой насос и вставьте проволочных электродов в жидкостных резервуаров электрод канала.
  2. Насос жидкости через на 1 мл / ч, чтобы обеспечить хороший контакт между шприцевой насос и шприца. Осмотрите длину канала для обеспечения беспрепятственного перемещения клеток и отсутствие пузырьков или утечек. КрасныйUCE расход до 0,005 мл / час.
    Примечание: Пропускная так высоко, как 1 мл / час 31,35 был достигнут в устройствах других геометрий.
  3. В целях безопасности, проверить электронику, питание от функции генератора, усилителя высокого напряжения, и осциллографа, и приспособиться к желаемой напряжения и частоты. Вот эти параметры 200 В и 20 кГц. После проверки приемлемой производительности, питание. Подключите электроды к усилителю высокого напряжения.
    Примечание: Соблюдайте соответствующие процедуры электробезопасности при работе электроники на высоких напряжений, используемых для этих экспериментов.
  4. При достижении устойчивый поток, применить требуемое напряжение на нужную частоту. В этом эксперименте, напряжение 200 В RMS на частотах между 5-60 кГц.
  5. Запись видео файлов из клеточного ответа с методами обработки изображений (этап 5) для количественной оценки распределения клеток в канале и охарактеризовать частоту кроссовера. Чтобы сделать это,поддерживать постоянное напряжение и изменять частоту систематически. В начале и конце эксперимента, а также случайным образом между опытов, регистрировать распределение контроля клеток, распределение клеток без применения каких-либо электрическое поле. Оценить количество времени, необходимого для клеток течь от входа к наблюдаемом месте (здесь, 5 мин). После установки новой частоты, подождите такое количество времени, то начать запись (здесь, на 2 минуты видео распределения клеток).

5. Обработка изображений в характеризующие Crossover Frequency

  1. Использование вычислительной сценарий, анализировать каждый кадр за кадром, чтобы определить относительную у-позицию (где г-направлением является вертикальная глубина канала, у-направлении ширина канала, и х-направление является длина канала) каждого флуоресцирующих клеток или частицы в заданный х-координата вниз по течению от области высокого DEP силу в канале. Создайте график относительных расраспределение.
  2. Сравнение осевую линию распределения в каждой напряжения и частоты с центральной линии распределения управления. Для данного напряжения и различной частотой, определить частоту кроссовера, где осевая соответствует у-позицию элемента управления.

6. Варьируя эксперимент по выполнению сортировки клеток или обогащения

  1. Приостановка желаемой смеси в DEP буфере при общей концентрации 3 × 10 6 частиц / мл. Здесь эта смесь MOSE-L клетки с 4 флуоресцирующих мкм бисером в DEP буфера. Выполните описанные выше шаги, чтобы подготовить устройство CDEP.
  2. Для сортировки или обогатить клетки из смеси, определить значения частот среза клетки-мишени и фоновых частиц, как описано выше. Эксплуатация эксперимент на частоте между двумя частот среза клеток-мишеней и фоновых частиц, так что две популяции частиц испытывают DEP силы в противоположном Directions. Для сортировки MOSE-L клетки и 4 мкм бусы, работать выше 11,90 ± 0,63 кГц микроустройство. первый кроссовер частота MOSE-L клеток недавно сообщили Salmanzadeh др. 33.
  3. Для сбора содержимое отсортированного образца, снимите трубку на выходе на сбор целевого объема, путем размещения перчаток пальцем по выходным отверстием и осторожно дергая на трубе. Налейте собранную объем целевой в резервуар для дальнейшего анализа. Примечание: Другие методы восстановления образец может включать присоединение постоянный резервуар с чипом и удаление образца простым пипетки.

Representative Results

DEP следует соблюдать качественно в образце канала для подтверждения устройство находится в рабочем состоянии, когда электрическое поле присутствует. Один из способов проверить на наличие DEP является для регулировки частоты до значений далеко от частоты кроссовера, где сильны pDEP и Ndep, по прогнозам (примерно> 40 кГц наблюдать pDEP и <10 кГц наблюдать Ndep для большинства раковых клеток млекопитающих в буфер с проводимостью 100 мкСм / см). Следует отметить, что инертные микросферы обладают pDEP ниже их частоты кроссовера и Ndep выше их частоты кроссовера. Для пилообразной функцией геометрии, представленной здесь, pDEP следует рассматривать для клеток при более высокой частоте испытаний, свидетельствует возникновением жемчуг цепочки и фокусировки клеток или частиц при пилообразной функцией краю канала, в то время как на более низкой частоте тестового, Ndep Должно быть очевидно, как клетки ограничивается областью ближе прямой край канала. При таких низких частотах, клетки могут Lysе из-за электропорации, таким образом образец может видимому, содержат меньше клеток, а те, что открыты может появиться увеличено или размытым, если с помощью ферментативно-активированный флуоресцирующий краситель. Проверка частоты, на которых pDEP и Ndep происходят позволяет определить частоты кроссовера, как описано в протоколе. Для раковых клеток млекопитающих, таких как MOSE-L, используемых здесь, мы наблюдали Ndep на 5 кГц (фиг.5А) и сильной pDEP при 60 кГц (фиг.5В). MOSE-L-клетки имели диаметр 17,7 ± 3,3 мкм (N = 268 клеток) и гранулы имеют номинальный диаметр 4 мкм. Полный анализ диэлектрических свойств MOSE-L клеток по сравнению с Месе клеток в ранних стадиях прогрессии можно найти в недавней работе Salmanzadeh др. 33.

Если pDEP и Ndep не наблюдается при этих крайностей, различные проблемы могут иметь место. Образец проводимости может быть слишком высоким из-за загрязняющих веществ или клеток лизису. НЕДОСТАТОЧНЫЙнт электрическое поле может быть сгенерирован из-за пузырьков, захваченных в жидкости электродных каналов, которые предотвращают проведение тока в части каналов, граничащих с образец канал. Нестационарный поток может быть вызвано пузыря, захваченного в шприце или впускной трубы, в результате пузырьки не держит устройство под вакуумом в течение достаточного времени или нет быстро заполнение устройства при удалении от вакуума, утечки из-за отслоения плохо связанных с PDMS предметное стекло, слезы в барьерной мембраной из-за чрезмерной силы, действующей при заполнении каналов или скорости потока в крайности рабочего диапазона насоса.

В дополнение к определению частоты кроссовера клеток, этот метод может быть использован для сортировки смеси, показанный здесь смесью MOSE-L-клеток и бисером. Этот пример использует отрицательного диэлектрофореза (ППСИ), проявляемой 4 мкм бисером на частотах, где MOSE-L клетки испытывают положительный диэлектрофореза (pDEP). Мы оperated устройство на 200 вольт RMS и 10 кГц (рис. 6а) и отметил, что обе ячейки и Шарики смешивали, как они испытали Ndep. На 50 кГц мы наблюдали движение MOSE-L клеток в верхней части канала, в то время как шарики были ограничены нижней части канала, что позволяет разделение смеси на две компоненты (фиг.6В).

Рисунок 5
Рисунок 5. Положение MOSE-L клеток манипулируют изменения частоты приложенного электрического поля. Фото приняты на заключительном пилообразной функции в образце канала и струйные электроды расположены в углах на правой стороне. Они наполнены ФБР, содержащим родамина В, который флуоресцирует визуализировать каналов. (А) MOSE-L клетки испытывают Ndep в 200 вольт RMS и 5 кГц. (б) MOSE-L клетки испытывают жемчужное цепочки и pDEP в 200 вольт RMS и 60 кГц. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 6
Рисунок 6. Смесь MOSE-L клеток (зеленый) и 4 мкм шариков (красный) течь через конечном пилообразной функцией в примере канал низкой частоты CDEP устройства. (А) на 200 В и клетки и шарики 10 кГц смешиваются. Стрелки указывают на слабо появляться клетки, которые, вероятно, умерли из-за условий низких частот. (Б) В 200 В и клетки 50 кГц испытать pDEP и перейти к функции краю канала, в то время как бусы испытать Ndep и остаются приурочены к области ближе прямой край.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Discussion

DEP является мощным средством для определения диэлектрических свойств частиц и направления движения частиц к сортировки приложений, изоляции, или по обогащению. В связи с вредного воздействия прямого контакта электрода с образцом, другие взяли подходы, аналогичные ранее предложенного метода, чтобы избежать контакта. Например, Башир и др.. Разработаны бесконтактные DEP устройств с помощью микрофлюидных PDMS устройство, отделенный от печатных электродов печатных плат тонким покровным стеклом, и этот метод можно также ознакомиться в видео-формате. 23,36

Здесь мы показали, изготовление чипе CDEP и жидкостных электродов с использованием одного PDMS подложку и экспериментальный протокол для разделения клеток рака яичников из смеси клеток и флуоресцентных шариков. Представленная методика успешно используется для различных более сложных и физиологически соответствующих приложений, включая сортировку Ливе и мертвые клетки, 28 опухоль начала клетки от клеток рака простаты, раковые клетки 30 из разбавленных эритроцитов, 31,32 и дифференциации между стадиях рака молочной железы 37 и рака яичников. 29 CDEP также используется для смешивания частиц. 38 Эти приложений показывают, что с помощью простой метод, представленный, различных целей может быть достигнуто просто за счет изменения конструкции геометрии канала.

. DEP полезно на микроуровне для манипуляции частицами 13 Для сферических частиц, поступательное dielectrophoretic сила зависит от размера и электрических свойств частицы и ее суспендирующей среды, а также градиент электрического поля в квадрат:

Уравнение 1
где ε м является проницаемость суспендирующей среды, г-радиусчастицы, и Rc [к (ω)] является реальная часть Клаузиуса-Моссотти (СМ) фактора. Коэффициент CM представляет собой меру относительной поляризуемости частицы по сравнению с суспендирующей среды и определяет направление dielectrophoretic силы. Это описано как

Уравнение 2
где Уравнение 3 и Уравнение 4 являются сложные диэлектрические проницаемости частицы и среды, соответственно. Комплекс проницаемость, Уравнение 5 , Зависит от проводимости (σ) и частоты (ω). Коэффициент CM сферических частиц теоретически связаны между -0,5 и +1. Если коэффициент CM является отрицательным, частицы испытывают Ndep поскольку среда более чем поляризуемого частицы, так частицы движутся от регионоввысокие градиенты электрического поля. Если коэффициент CM является положительным, частицы более чем поляризуемого среды, и они испытывают pDEP в которой они движутся в направлении области высоких градиентов электрического поля.

Для биологических частиц, неоднородное по структуре, например, клеток, фактор Клаузиуса-Моссотти может быть определена из эффективного значения для проницаемости частиц:

Уравнение 6
где Уравнение 7 и Уравнение 8 это комплексная диэлектрическая проницаемость эффективной комплексной диэлектрической проницаемости внутренней части клетки, такие как цитоплазме и плазматической мембраны, соответственно;. г есть радиус ячейки, и г представляет собой толщину плазматической мембране 26

Когда происходит с DEP частиц, взвешенных вжидкость, движение частиц относительно жидкости будет генерировать силу сопротивления на частицы. Это сила сопротивления необходимо учитывать при определении общей силы, действующая на частицу. Для ситуаций, интересующих нас, вязкие силы доминировать и частицы считаются сферическими, маленький, и перемещение с относительно низкой скоростью, так что сопротивление закон Стокса обеспечивает хорошее приближение для силы сопротивления:

Уравнение 9
где η является вязкость жидкости, и р есть скорость частицы, а у ф является скорость жидкости, которые также могут быть в движении. Учитывая dielectrophoretic сила, известная жидкость и свойства частиц, и известный скорость потока, баланс между силы сопротивления и dielectrophoretic силу может быть решена оценить скорость частиц. Скорость сдвига, что опыт клетки должны быть ниже порога, при котором слокоть лизиса может произойти.

Характеристика электрических свойств частиц необходимо прогнозировать и контролировать то, как они будут реагировать в соответствии с DEP их. В этой работе, мы специально использовали низкочастотный CDEP с MOSE-L клеток, чтобы продемонстрировать протокол для определения первой частоты кроссовера клеток, а затем показал непрерывный сортировку полистирольных шариков и MOSE-L клеток на основе их противоположных DEP ответов.

Изменение геометрии устройства CDEP изменит пространственные градиенты электрического поля, что позволяет устройствам быть предназначена для высокой частоты или низкой частоте, так и для высокой селективности и эффективности сортировки для указанного типа клеток. Кроме того, высокие устройства пропускная способность может быть разработан изготовления более широкие каналы, 30 каналов параллельно, 30 или многослойными изготовления 35, в котором электродные каналы вертикально уложенными сверху и снизу относительно глубокийОбразец канал. Тонких мембран образуют барьер между слоями. Предварительное тестирование с устройствами, изготовленных в полиметилметакрилата (ПММА) и поликарбоната (PC) тонкие пленки продемонстрировали DEP ответ MOSE-L клеток. Настоящее время предпринимаются усилия для уточнения многослойные высокой пропускной устройств и улучшить периферическое системы к возможному плагин и играть платформы. Для расширения от основной экспериментальной техники, представленной, приложения и спецификации устройства могут быть приспособлены к конкретным требованиям, такие как сортировка по сравнению с характеристикой, или добавление образцов водохранилищ и полу-автоматизированной системы к устройству.

Disclosures

Доктор Рафаэль Давалос имеет патент для бесконтактного диэлектрофореза.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается была частично поддержана Национальным научным фондом под Грантом Номер EFRI 0938047, и на Virginia Tech Институт важнейшим технологиям и прикладной науки (ICTAS). Авторы хотели бы выразить признательность доктору Ева Schmelz и д-ра Пола Робертса за их любезное дар MOSE-L клеток. Авторы признают, Анжела Андерсон за помощь с культурой клеток, Caitlan Swaffar за ее помощь в редактировании этого документа и подготовке экспериментов, и все члены лабораторных Bioelectromechanical Systems.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning, Midland, MI,USA Sylgard 184
Glass slides The Microscope Depot 76079 2x3 inch-ground edges
Microbore PTFE Tubing Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA EW-06417-31 Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll
Luer-slip plastic syringes National Scientific company S7510-1
Needle tip Howard Electronic instruments JG20-1.0 20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"
D(+)-Sucrose Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S3-500
D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ AC410955000
RPMI-1640 Medium Quality Biological Inc. 112-025-101
Calcein AM, Molecular Probes Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA C3100MP excitation wavelength 488/emission wavelength 516
Rhodamine B, O Science Lab SLR1465-100G excitation wavelength 540/emission wavelength 625
Phosphate buffered saline (10X) Gbiosciences, St. Louis, MO RC-147
Leica, inverted light microscope Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA Leica DMI 6000B
Leica DFC420, color camera Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA Leica DFC420
Function generator GW Instek, Taipei, Taiwan GFG-3015
Wideband power amplifier Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA AL-50HF-A
HFHV Output Transformer AL-T50-V25/300-F100K-600K
High voltage amplifier Trek Model 2205
USB Modular Oscilloscope, 100 MHz AgilentTechnologies U2701A
Expanded Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001/002 (115/230V) air plasma
Scotch Magic tape 3M any available width is sufficient
1.5 mm puncher Harris Uni-Core Z708836-25EA
.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200-056
FluoSpheres Sulfate Microspheres Invitrogen F8858 4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)
AZ 9260 photoresist AZ Electronic Materials
AZ 400 K developer AZ Electronic Materials
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25% provided by Virginia Tech cleanroom
Teflon coating applied using DRIE machine
Silicon wafer University Wafer 452 100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP)
Deep Reactive Ion Etching (DRIE) Alcatrel AMS SDE 100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butler, M. Cell culture and upstream processing. , Taylor & Francis. (2007).
  2. Pratt, E. D., Huang, C., Hawkins, B. G., Gleghorn, J. P., Kirby, B. J. Rare Cell Capture in Microfluidic Devices. Chemical Engineering Science. 66, 1508-1522 (2011).
  3. Salmanzadeh, A. D., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science and Technology. 3, e112 (2013).
  4. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. The Review of Scientific Instruments. 43, 404-409 (1972).
  5. Adams, J. D., Kim, U., Soh, H. T. Multitarget magnetic activated cell sorter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18165-18170 (2008).
  6. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3191-3196 (2008).
  7. Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18892-18897 (2007).
  8. Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9, 3038-3046 (2009).
  9. Grover, S. C., Skirtach, A. G., Gauthier, R. C., Grover, C. P. Automated single-cell sorting system based on optical trapping. J. Biomed. Opt. 6, 14-22 (2001).
  10. Lin, S. C. S., Mao, X. L., Huang, T. J. Surface acoustic wave (SAW) acoustophoresis: now and beyond. Lab Chip. 12, 2766-2770 (2012).
  11. Pethig, R. Review Article-Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, (2010).
  12. Gascoyne, P. R. C., Wang, X. B., Huang, Y., Becker, F. F. Dielectrophoretic separation of cancer cells from blood. Ieee T. Ind. Appl. 33, 670-678 (1997).
  13. Pohl, H. A. Dielectrophoresis : the behavior of neutral matter in nonuniform electric fields. , Cambridge University Press. (1978).
  14. Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science. , Under-review (2012).
  15. Markx, G. H., Talary, M. S., Pethig, R. Separation of Viable and Nonviable Yeast Using Dielectrophoresis. J. Biotechnol. 32 (94), 29-37 (1994).
  16. Flanagan, L. A., et al. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 26, 656-665 (2008).
  17. Labeed, F. H., Coley, H. M., Thomas, H., Hughes, M. P. Assessment of multidrug resistance reversal using dielectrophoresis and flow cytometry. Biophys. J. 85, 2028-2034 (2003).
  18. Hoettges, K. F., et al. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Anal. Chem. 80, 2063-2068 (2008).
  19. Lapizco-Encinas, B. H., Simmons, B. A., Cummings, E. B., Fintschenko, Y. Insulator-based dielectrophoresis for the selective concentration and separation of live bacteria in water. Electrophoresis. 25, 1695-1704 (2004).
  20. Davalos, R. V., et al. Performance impact of dynamic surface coatings on polymeric insulator-based dielectrophoretic particle separators. Anal. Bioanal. Chem. 390, 847-855 (2008).
  21. Gallo-Villanueva, R. C., Rodriguez-Lopez, C. E., Diaz-De-La-Garza, R. I., Reyes-Betanzo, C., Lapizco-Encinas, B. H. DNA manipulation by means of insulator-based dielectrophoresis employing direct current electric fields. Electrophoresis. 30, 4195-4205 (2009).
  22. Shafiee, H., Caldwell, J. L., Sano, M. B., Davalos, R. V. Contactless dielectrophoresis: a new technique for cell manipulation. Biomed Microdevices. 11, 997-1006 (2009).
  23. Park, K., Suk, H. J., Akin, D., Bashir, R. Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board. Lab Chip. 9, 2224-2229 (2009).
  24. Jen, C. P., Maslov, N. A., Shih, H. Y., Lee, Y. C., Hsiao, F. B. Particle focusing in a contactless dielectrophoretic microfluidic chip with insulating structures. Microsyst Technol. 18, 1879-1886 (2012).
  25. Hughes, M. P. AC electrokinetics: applications for nanotechnology. Nanotechnology. 11, 124-132 (2000).
  26. Pethig, R. Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, 022811 (2010).
  27. Pethig, R. Ch. 4. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M. auro, Ozkan, M. ihrimah, Heller, M. ichael J. . 4, Springer. US. 103-126 (2007).
  28. Shafiee, H., Sano, M. B., Henslee, E. A., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Selective isolation of live/dead cells using contactless dielectrophoresis (cDEP). Lab Chip. 10, 438-445 (2010).
  29. Salmanzadeh, A., et al. Dielectrophoretic differentiation of mouse ovarian surface epithelial cells, macrophages, and fibroblasts using contactless dielectrophoresis. Biomicrofluidics. 6, (2012).
  30. Salmanzadeh, A., et al. Isolation of prostate tumor initiating cells (TICs) through their dielectrophoretic signature. Lab Chip. 12, 182-189 (2012).
  31. Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M., Davalos, R. V. Isolation of Rare Cancer Cells from Blood Cells Using Dielectrophoresis. EMBC 2012., Annual International IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Aug 28-Sep 1, San Diego, , (2012).
  32. Sano, M. B., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Modeling and development of a low frequency contactless dielectrophoresis (cDEP) platform to sort cancer cells from dilute whole blood samples. Biosens. Bioelectron. 30, 13-20 (2011).
  33. Salmanzadeh, A., et al. Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells. Biomicrofluidics. , (2013).
  34. Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2012 Annual International Conference of the IEEE, , 590-593 (2012).
  35. Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations. Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).
  36. Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar. J. Vis. Exp. (48), e2545 (2011).
  37. Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).
  38. Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).

Tags

Биомедицинская инженерия выпуск 79 Медицина клеточная биология молекулярная биология биоинженерии анатомии физиологии биофизики физики Microfluidics сотовый Разделение Микрофлюидных Аналитические методы электрофорез Microchip диагноз рака обогащение клеток клеток сортировка микрофлюидики диэлектрофорез Лаборатория на чипе клеток работы с изображениями
Этикетка без Выделение и Обогащение клетки через бесконтактных диэлектрофореза
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elvington, E. S., Salmanzadeh, A.,… More

Elvington, E. S., Salmanzadeh, A., Stremler, M. A., Davalos, R. V. Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis. J. Vis. Exp. (79), e50634, doi:10.3791/50634 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter