Temporal Kvantificering af MAPK induceret ekspression i Single gærceller

Summary

To komplementære metoder baseret på flowcytometri og mikroskopi præsenteres som muligt at kvantificere, på enkelt celle niveau, af dynamikken i genekspression induceret ved aktivering af en MAPK-vejen i gær.

Abstract

Kvantificeringen af ​​genekspression på enkelt celle niveau afdækker nye reguleringsmekanismer overstregede oplysninger i målinger på befolkningsniveau. To metoder baseret på mikroskopi og flowcytometri præsenteres for at vise, hvordan disse data kan erhverves. Ekspressionen af ​​en fluorescerende reporter fremkaldt ved aktivering af den høje osmolaritet glycerol MAPK-vejen i gær anvendes som et eksempel. De specifikke fordele ved hver metode er fremhævet. Flowcytometri måler et stort antal celler (10.000) og tilvejebringer en direkte måling af dynamikken i protein-ekspression uafhængigt af de langsomme modningsformer kinetik af fluorescerende protein. Billeddannelse af levende celler ved mikroskopi er derimod begrænset til måling af modnet form af reporteren i færre celler. Datasæt genereret af denne teknik, kan dog være ekstremt rige takket være kombinationer af flere journalister, og til den rumlige og tidsmæssige informationopnået fra de enkelte celler. Kombinationen af ​​disse to målemetoder kan levere nye indsigter om regulering af protein udtryk ved signalveje.

Introduction

Signalering via transduktion kaskader ofte kulminerer i ekspression af proteiner. Karakteriseringen af ​​dette udtryk profil er et centralt element i at forstå funktionen af ​​biologiske veje. Identifikationen af spektret af opregulerede proteiner og dynamikken i deres aktivering kan opnås ved forskellige teknikker, såsom mikro-arrays, northern blots eller western blots ^1-3. Men gennemsnittet disse teknikker svaret af en hel population af celler. For at forstå den fine regulering af ekspression af proteiner, er det ønskeligt at samle målinger på enkelt celle niveau. Ideelt set bør disse målinger også give kvantitative data medgørlige at udvikle matematiske modeller af den underliggende vej.

Mikroskopi og flowcytometri er to teknikker, som er velegnet til at levere disse kvantitative encellede målinger. Den endogene mærkning af proteiner med et fluorescerende protein, kan be anvendes til at kvantificere deres udtryk niveau ^4. , Da tilsætningen af ​​en stor fluorescerende del på terminalen af ​​proteinet kan gøre det ikke-funktionelle, er det ofte mere hensigtsmæssigt at skabe specifikke ekspressionssystemer reportere er baseret på en promotor, der driver ekspressionen af ​​en fluorescerende konstruktion. Denne reporter protein er eksogen til den cellulære system, og derfor ikke indflydelse på signalering begivenheder, der finder sted i cellen.

Både mikroskopi og flowcytometri har været meget udbredt i gær felt signalering. Som eksempler; Colman-Lerner og kollegaer korreleret, i enkelte celler, udtryk for parring specifikke og konstitutivt udtrykt journalister ved mikroskopi at kvantificere støj i gær parring signaltransduktionskaskade ^5, Acar og kolleger, der anvendes flowcytometri til at studere regulerende netværk kontrollerer ekspressionen af GAL generne ^6. I en tidligere undersøgelse ^7, har vi anvendt en kombinatiden af ​​disse to teknikker til at studere ekspressionen output fra høj osmolaritet glycerol (HOG) pathway spirende gær. Denne mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK)-vej er udløst af hyper-osmotisk stress. Det resulterer i aktiveringen af ​​MAPK Hog1, der translokerer til kernen af ​​cellen til at fremkalde en transkriptionel program resulterer i ekspressionen af ​​omkring 300 gener. For at undersøge denne proces, vi havde udviklet et udtryk reporter baseret på STL1 promotoren (et gen induceres specifikt i respons på Hog1 aktivitet ^8), som driver ekspressionen af et firdobbelt Venus fluorescerende protein (p ​​STL1-qV). Flowcytometri målinger afslørede tilstedeværelsen af ​​to populationer af celler ved mellemliggende spændingsniveau (0,1 M NaCl), med kun en del af befolkningen, der udtrykker det fluorescerende reporter. Vi brugte mikroskopi for yderligere at undersøge denne adfærd, og opdagede, at denne støj i protein-ekspression blev styret af iboende faktorer ^9. Vi could observere endvidere, at celler med et tilsvarende niveau for Hog1 aktivitet kunne vise påfaldende forskellige udtryk resultater. Kombinationen af disse to teknikker tilladt os at demonstrere, hvordan den langsomme ombygning af stress respons gener påvirket udtrykket resultat på enkelt celle niveau ^7.

I dette papir, bruger vi udtrykket for p STL1-qV reporter induceret af hyper-osmotisk chok som et eksempel på kvantificering af protein-ekspression ved mikroskopi og flowcytometri. Den samme stamme underkastes 0,2 M NaCl stress blev undersøgt med begge teknikker. Dette vil give os mulighed for at fremhæve nogle af de vigtigste forskelle i disse to meget komplementære teknikker.

Protocol

1.. Mikroskopi Målinger

1. Podes 5 ml syntetisk medium med gær.
2. Dyrk cellerne ved 30 ° C natten over.
3. Måle _OD600 på overnatskulturen næste morgen.
4. Fortyndet natten over kultur i 5 ml syntetisk medium til _OD600 0,05.
5. Grow den fortyndede kultur ved 30 ° C i mindst 4 timer.
6. Forbered 3-fold koncentreret (0,6 M) NaCI-opløsning i syntetisk medium.
7. Der fremstilles en opløsning af Concanavalin A (ConA) i PBS 1 mg / ml.
8. Filtrat ~ 200 pi ConA løsning i brønden dias.
9. Lad det stå i 30 minutter.
10. Fjern ConA løsning.
11. Tilsæt 150 ul _H2O til brønden.
12. Fjern H ₂ O.
13. Måle _OD600 på cellekultur.
14. Forbered 300 pi cellekultur ved OD ₆₀₀ = 0,02 i et 1,5 ml mikrorør.
15. Sonikeres cellerne i et vandbad i 45 sekunder.
16. Vortex kortvarigt microtube.
17. Sonikeres cellerne i et vandbad i 45 sekunder.
18. Vortex kortvarigt mikrorør.
19. Tilsæt 200 pi cellekultur til brønden.
20. Vent 30 minutter for at lade cellerne sig på bunden af ​​brønden.
21. Placer godt slide på mikroskopet.
22. Vælg belysning indstillingerne for fluorescerende kanal, der skal optages.
23. Vælg belysning indstillinger for to lyse felt billeder (en lidt ude af fokus: 3 m under brændplanet for at muliggøre en ordentlig segmentering af cellerne).
24. Vælg de tidsintervaller for time-lapse måling
25. Vælg de synsfelter til billede.
26. Start overtagelse af nogle få frames.
27. Pause købet at tilføje 100 ul 0,6 M NaCl medium.
28. Genoptag billeddannelse.

2. Flowcytometri Målinger

1. Podes 5 ml syntetisk medium med gær.
2. Vokse ved 30 ° C natten over.
3. Measure_OD600 af overnatskulturen næste morgen.
4. Fortyndet natten over kultur i 5 ml syntetisk medium til _OD600 0,1.
5. Vokse ved 30 ° C i mindst 4 timer for at opnå en _OD600 på 0,2-0,4.
6. Forbered cycloheximid opløsning 1 mg / ml i H ₂ O.
7. Forbered 3-fold koncentreret (0,6 M) NaCI-opløsning i syntetisk medium.
8. Forbered et 1,5 ml mikrorør med 100 pi 0,6 M NaCl medium for hvert tidspunkt, der skal måles.
9. På tidspunkt 0, tilsættes 200 pi cellekultur til hver mikrorør.
10. Der inkuberes med omrystning ved 30 ° C.
11. På tidspunktet T, tilsættes 30 ul cycloheximid til en mikrorør.
12. Gentag trin 2.11 for alle de ønskede tidspunkter.
13. Inkuber alle mikrorør i mindst 45 minutter og op til 3 timer ved 30 ° C med omrystning.
14. Forbered FACS-rør med 400 pi PBS.
15. Sonikeres cellerne i vandbad i 1 min.
16. Vortex kort de mikrorør.
17. Sonfikat cellerne i vandbad i 1 min.
18. Vortex kort de mikrorør.
19. Tilsæt 100 pi cellekultur fra hvert mikrorør til den tilsvarende FACS rør.
20. Vælg 488 nm excitation laser og 530/30 nm båndpasfilter til påvisning.
21. Test ikke udtrykke og fuldt udtrykke prøve for at kontrollere, hvis de falder i detektoren følsomhed.
22. Mål 10.000 celler for hver prøve erhvervet.

Representative Results

Microscopy

Gærceller bærer udtrykket reporter p STL1-qV (ySP9 ^7), blev fastgjort til bunden af brønden-slide og placeres under mikroskop. Cellerne blev stimuleret ved tilsætning af stress medium direkte i brønden i løbet af det billeddannende session. Dette giver os mulighed for at erhverve et par billeder af de celler, før pathway induktion og følge deres skæbne efter stimulering. I det foreliggende tilfælde blev cellerne fulgt for ~ 2 timer med et tidsinterval på 10 minutter. 1A er et billede af ikke-fluorescerende celler før induktion og 1B viser de samme celler 2 timer efter stress, når udtrykket reporter har blevet fremkaldt og er blevet fluorescerende.

At udtrække kvantitative oplysninger til stede i disse billeder, et komplekst billede analyse proces skal udføres. Det omfatter segmenteringen af ​​cellerne til at definere objekter i itroldmand, sporing af disse objekter fra en ramme til den næste, og målingerne af de elementer i disse objekter (form og intensitet egenskaber). Vi har udviklet vores egen platform ved navn YeastQuant at udføre denne analyse ^10. Et par andre ikke-kommercielle software er tilgængelige til at udføre disse opgaver:. CellProfiler ¹¹ CellID ¹² eller CellX ¹³ Figur 1C viser resultaterne af en analyse udført med YeastQuant. Hver af de røde spor repræsenterer den tidslige udvikling af den gennemsnitlige fluorescensintensitet af en enkelt celle. Den blå linje viser medianen af ​​mere end 500 celler, som blev segmenteret og spores gennem de 20 frames i fem time-lapse film erhvervet fra fem forskellige områder af synspunkter fra samme godt. Den lyseblå område repræsenterer den 25. og 75. percentil af alle lysstyrker målt på et givet tidspunkt.

Flowcytometri

Til flowcytometri measuremforældre, celle kultur blev spildt i mikrorør indeholdende stress medium. At studere den tidslige udvikling af p STL1-qV udtryk blev oversættelsen hæmmet på forskellige tidspunkter (5 til 10 min intervaller) med cycloheximid (Figur 2). Dette stof blokerer syntesen af ​​nye proteiner, men modningen af ​​fluorescerende protein allerede givet udtryk for, ikke forstyrres. Derfor efter 45 minutter til en times inkubation kan måles cellerne i flowcytometeret tillade kvantificering af mængden af ​​protein produceret på cycloheximid tilsætning. Denne strategi omgår problemet med fluorescerende protein modning og derved kvantificerer sande dynamik fluorescerende protein syntese.

Sammenligning af de to teknikker

3A sammenligner dynamikken i ekspressionen reporter målt ved mikroskopi og flowcytometri. Mens det fluorescerende signal begynder at stige 30-40min efter stress med mikroskopi, flowcytometri målinger klart bevise, at de proteiner, der allerede er produceret mellem 10 til 15 min efter at stimulus. Denne halv times forsinkelse skyldes den langsomme modning af fluorescerende proteiner ^14. Selv om begge metoder kvantificere fluorescensintensiteten af ​​cellerne, må man huske på, at i denne undersøgelse, at de ikke måle den samme biologiske proces. Mens mikroskopi følger tilsynekomsten af ​​det fluorescerende signal, flowcytometri faktisk kvantificerer syntesen af ​​proteinet. Det er vigtigt at tage hensyn til denne modning trin, når du udfører live-cell imaging. I en situation, hvor et endogent protein mærket med et fluorescerende protein, vil endogent protein udtrykkes og aktiv før fluorescensen af ​​dens mærke kan detekteres.

Som anført ovenfor, begge teknikker levere supplerende oplysninger. Flowcytometri kan måle et stort antal celler meget hurtigt (10.000 eller mere). Det kan derfor levere statistisk rige datasæt, hvor der kan identificeres to overlappende populationer eller nogle få sjældne hændelser kan observeres. Mikroskopi giver oplysninger om et begrænset antal celler (i størrelsesordenen 100). Men da dette datasæt indeholder tidsmæssige og geografiske oplysninger og tillader korrelation af flere målinger i samme celle, kan det give meget værdifuld indsigt i det undersøgte biologiske proces.

Figur 1. Måling af reporter udtryk ved mikroskopi. A og B. Billeder af celler, der bærer det fluorescerende udtryk reporter p STL1-qV før (A) og 2 timer efter stimulering med 0,2 M NaCI (B). C. Tidsforløb for influenza orescence genfærd. De røde kurver viser den gennemsnitlige cellulære fluorescens intensiteten af ​​nogle repræsentative encellede spor. Den blå kurve repræsenterer medianen fluorescens af 550 encellede spor. Den lyseblå område repræsenterer den 25. og 75. percentil af det fluorescerende udtryk cellepopulationen på hvert tidspunkt. Klik her for at se større billede .

Figur 2. Måling af reporter-ekspression ved flowcytometri. Histogrammer af den cellulære fluorescens fra celler, som bærer det fluorescerende udtryk reporter p STL1-qV behandlet med 0,2 M NaCI og inhiberet med cycloheximid på forskellige tidspunkter.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Figur 3. Sammenligning af ekspressionssystemer, målt ved mikroskopi og flowcytometri. A. Mean fluorescensintensitet målt ved flowcytometri (fuldt optrukket linie) og mikroskopi (stiplet linje) som funktion af tiden for tre biologiske replikater. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien. B og C. histogrammer af den normaliserede fluorescensintensitet ved 120 min efter stress til mikroskopi (B) og 60 min efter stress for flowcytometri (C) for de tre gentagelser. Klik her for atse større billede.

Discussion

Microscopy

Behandlingen af ​​brønden med ConA er et vigtigt skridt for at sikre en korrekt billeddannelse af cellerne. Fordi ConA har lav opløselighed i PBS (5 mg / ml), kan filtreringen fjernelse af store aggregater, der er til stede i det ufiltrerede opløsning og forstyrre billeddannelse. Celler vedhæfte forholdsvis kraftigt til den behandlede overflade, og tilsætningen af ​​det inducerende opløsning bør ikke forstyrre lokalisering af cellerne, giver mulighed for en løbende overvågning før og efter stimulering. Denne behandling kan også anvendes til at strømme kanaler eller mikrofluidenheder blev cellerne udsættes for en konstant strøm ^7,15. Hvis brønden ikke er korrekt skylles med vand efter behandlingen, vil cellerne ikke korrekt fast til glasset, formentlig fordi ConA i opløsning binder direkte til cellerne og forhindrer dem i at danne en stærk binding på glasoverfladen. Efter vasketrinnet, kan brønden forbliver tørre i 3 -4 timer før tilsætning af cellerne uden at påvirke mærkbart binding af cellerne til glasset.

Udvælgelsen af ​​eksponeringstiden for det fluorescerende kanal er en kritisk indstilling til succes af forsøget. Eftersom fluorescensen af ​​cellen øges hele tidsforskudt, er det vigtigt at teste på forhånd med en induceret prøve, hvad der er den maksimale eksponeringstid, der kan anvendes for at undgå mætning af billeder under overtagelsen. En anden parameter, for at tage i betragtning ved udvælgelsen eksponeringstiden er blegning af det fluorescerende signal. For hver prøve, må man finde en afvejning mellem billedets lysstyrke og nedbrydning af signal på grund af blegning under time-lapse. Tidsintervallet mellem hver erhvervelse påvirker også kraftigt blegning af fluoroforen. Eftersom protein-ekspression er en forholdsvis langsom proces, vi bruger typisk 10-15 min. intervaller. Hvis andre hurtigere processer skal være followed parallelt med protein udtryk, kan det være tilrådeligt at anvende forskellige tidsskridt på tværs af hele time-lapse film (1-2 min i begyndelsen og 5-15 min til senere opkøb).

Styringen af ​​celledensiteten er en afgørende parameter for at tage hensyn til. Hvis massefylden er for lav, vil kun et par celler være til stede i hvert synsfelt resulterer i dårlige statistikker for datasættet. Hvis tætheden er for høj, kan det hæmme segmentering, sporing og kvantificering af cellerne, hvilket gør det vanskeligt at uddrage den ønskede information fra billederne. For at bestemme podningstæthed yderligere en parameter til at tage hensyn til, er varigheden af ​​eksperimentet. Hvis et eksperiment varer flere division cykler, er det tilrådeligt at starte med en sparsom synsfelt, som gradvis vil fylde under tidsforløbet for billeddannelse på grund af deling af celler og slå sig ned af celler i opløsning. I protokollen, foreslår vi at brugeen _OD600 på 0,02, afhængigt af den type forsøg, vi udfører vi bruger _OD600 fra 0,05 til korte time-lapse film til 0,005 for længere dem.

Antallet af analyserede celler er klart en nøgleparameter for gyldigheden af ​​eksperimentet. Undertiden så få som 20-30 celler kombineres til at generere et datasæt. Men for at begynde at få statistisk signifikante datasæt, hundrede celler eller mere er formentlig nødvendig. Forstørrelsen af ​​målet bestemmer størrelsen af ​​det afbildede område og dermed antallet af afbildede celler. For proteinudtrykkelsesprodukter målinger, hvor målet er at måle den gennemsnitlige fluorescens af cellen, en høj numerisk blænde 40X immersionsobjektivet er den bedste løsning giver både god signal støjforhold og et stort synsfelt. Hvis sub-cellulære strukturer skal analyseres, højere forstørrelser (60X eller 100X mål) er ofte nødvendige, hvilket resulterer i målingen af ​​færre celler. Fremkomsten af ​​sCMOS kameraer med en detektor størrelse næsten fire gange større end den ene af konventionelle CCD er klart en fordel at få flere celler pr synsfelt.

Med en motoriseret XY-scene, er det muligt at billedet i parallelle flere synsfelter for at øge antallet af celler i det endelige datasæt. Men der er et trade-off mellem antallet af XY positioner besøgte og hastigheden af ​​købet billedet. Afhængig af hastigheden af ​​scenen og antallet af belysninger optaget, er det typisk muligt at billedet ti positioner i mindre end et minut. For at kvantificere hurtige signaleringsbegivenheder, kan dette blive en begrænsende faktor. For proteinudtrykkelsesprodukter målinger, hvor fluorescens ændringer der sker på en langsommere tid skala, er det normalt ikke en begrænsning. Alternativt, fordi disse ekspressionseksperimenter vare et par timer, og på grund af den langsomme tidsmæssige opløsning kræves, bliver det fordelagtigt at billede flere prøver parallelt. Flere nabolande brønde can seedes med vildtype og mutant celler, kan forskellige stimulus anvendes til hver brønd eller kan måles biologiske gentagelser parallelt. Scanning gennem alle brønde fra en 96-brønds plade rutinemæssigt opnås med luft mål for mikroskopi skærme ^16. På grund af den lave tæthed af endogene proteiner i gær, deres kvantificering kræver en olie mål med høj numerisk blænde. Dette begrænser alvorligt det område, der kan rejste med målsætningen. Ikke desto mindre vi rutinemæssigt billede fire tilstødende brønde ved at bo tæt på deres fælles hjørne. Det er imidlertid mere udfordrende at afbilde et større antal brønde. Vand målsætninger med automater kan omgå dette problem på bekostning af et mindre tab i lysstyrke.

Flowcytometri

Indsamling et tilstrækkeligt antal celler er næppe et problem med flowcytometre. Typisk 10.000-100.000 celler kan erhverves i et minut. Men fordi intet billede af than celle er opnået, er det vigtigt at vælge korrekt cellepopulation, der skal analyseres. Gating af celler baseret på de målte frem og side scatters kan gøre det muligt at vælge individuelle celler snarere end klynger af celler og til at fjerne cellerester fra analysen. I figur 2 hver histogram repræsenterer en befolkning på omkring 5.000 celler, der blev valgt på grundlag af deres spredning egenskaber fra de 10.000 arrangementer måles.

Ved at bryde klynger af celler i de enkelte celler, lydbehandling af cellen kultur er en ekstra måde at forbedre kvaliteten af ​​de indhentede data. Dette gælder for mikroskopi, hvor klynger af celler kan være meget vanskeligt at segment ordentligt. Varigheden af ​​dette trin skal testes eksperimentelt. Vi normalt udfører to runder lydbehandling i et vandbad på 30 sek til et minut efterfulgt af hvirvelbehandling af cellesuspensionen. Langvarig lydbehandling kan resultere i lyse af nogle få celler. Men vi gjorde ikke o'LG en opregulering af stress responsive gener på grund af denne eksperimentelle trin. Bemærk, at sammenlægning af cellerne er en baggrund afhængig fænotype, f.eks W303 celler vise en stærkere tendens til at aggregere end S288C celler.

Variabilitet i encellede målinger

I figur 3A er middelværdien og standardafvigelsen for tre uafhængige forsøg udført ved hjælp af flowcytometri og mikroskopi plottes. De mindre forskelle mellem de tre kurver skyldes, at de eksperimentelle fejl er relativt lille for disse simple målinger, og at mange celler måles (mere end 5.000 for flowcytometri mellem 370-550 til mikroskopi). Den tidsmæssige udvikling af mikroskopi kurver er glattere end en af ​​de flowcytometri data. En sandsynlig årsag til denne adfærd er prøven forberedelsesprocessen. Til mikroskopi, alle tidspunkter i et eksperiment ved den samme stress begivenhed, mens det forFACS, prøve for hvert tidspunkt understreges individuelt. Små variationer i mængden af ​​stress og kultur løsninger kan resultere i en lille forskel i genekspression output. En alternativ strategi vil være at understrege 5 ml kultur af celler og fjerne aliquoter på de ønskede tidspunkter for at hæmme dem med cycloheximid. Begge metoder fungerer godt, vi bruger mikrorør forberedelse metode, fordi det giver mere fleksibilitet og er også velegnet til måling af dosis-respons-kurver, hvor flere NaCl-koncentrationer skal måles parallelt.

Den lave støj i disse gennemsnit kurver dog ikke afspejler hele spektret af variabilitet til stede på enkelt celle niveau. I figur 3B og 3C, histogrammerne i udtrykket målt ved mikroskopi og flowcytometri på et enkelt tidspunkt er plottet. Disse to paneler viser godt, at de tekniske variationer mellem gentagelser er relativt små, especially i forhold til den store variabilitet observeret i ekspressionen af ​​de enkelte celler. Forskellen i formerne af fordelingen mellem mikroskopi og flowcytometri målingerne skyldes det faktum, at med flowcytometri den totale cellulære intensitet er kvantificeret, mens i mikroskopi billeder gennemsnitlige cellulære intensitet blev beregnet. Sidstnævnte måling gennemsnit ud variationer i cellestørrelse og derfor resulterer i snævrere distributioner.

De to teknikker, der præsenteres her muligt at studere kvantitativt adfærd enkeltceller. Denne funktion er normalt skjult i traditionelle biologiske målinger på befolkningsniveau. Forstå, hvordan den variation i responsen af ​​de enkelte celler dukker kan tilbyde vigtig indsigt i den komplekse regulering af biologiske processer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Yeast Nitrogen Base	ForMedium	CYN6202
CSM amino-acid mix	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
Cycloheximide	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Toxic
ySP9			W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope	Nikon	Ti-Eclipse
Microscope control software	Micro-manager	Ver 1.4.11
Incubation chamber	LIS	The Box
Fluorescence light source	Lumencor	SpectraX
Camera	Hamamatsu	Flash 4.0
Flow cytometer	BD	FACS calibur
Sonicator bath	Telesonic	TUC-150
8-well-slide	Thermo Lab-tek	155409
96-well-plate	Matrical bioscience	MGB096-1-2-LG
FACS tube	BD Falcon	352054