Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

Summary

Zwei komplementäre Verfahren basierend auf Durchflusszytometrie und Mikroskopie vorgestellt, die die Quantifizierung auf der Ebene einer einzelnen Zelle, die Dynamik der Genexpression durch die Aktivierung eines MAPK-Weg in Hefe induziert ermöglichen.

Abstract

Die Quantifizierung der Genexpression auf Einzelzellebene deckt neuen Regulationsmechanismen bei Messungen auf Bevölkerungsebene durchgeführt verdeckt. Zwei Methoden, die auf Mikroskopie und Durchflusszytometrie werden dargestellt, um zu demonstrieren, wie solche Daten erfasst werden. Die Expression eines fluoreszierenden Reporter bei Aktivierung der hohe Osmolarität Glycerin MAPK in Hefe induziert wird als Beispiel verwendet. Die spezifischen Vorteile der einzelnen Verfahren werden hervorgehoben. Durchflusscytometrie misst eine Vielzahl von Zellen (10.000) und liefert ein direktes Maß für die Dynamik der Protein-Expression unabhängig von der langsamen Reifung Kinetik des fluoreszierenden Proteins. Abbildung von lebenden Zellen durch Mikroskopie ist im Gegensatz zu der Messung der gereiften Form der Reporter in weniger Zellen beschränkt. Jedoch können die Datensätze durch diese Technik erzeugt extrem reich durch die Kombinationen von mehreren Reportern und um die räumliche und zeitliche Informationen seinaus Einzelzellen erhalten. Die Kombination dieser beiden Messmethoden können neue Erkenntnisse über die Regulation der Proteinexpression durch Signalwege zu liefern.

Introduction

Signalisierung über transduktionskaskaden oft gipfelt in der Expression von Proteinen. Die Charakterisierung des Expressionsprofils ist ein Schlüsselelement für das Verständnis der Funktion der biologischen Wege. Die Identifizierung des Spektrums hochreguliert Proteine ​​und die Dynamik ihrer Aktivierung kann durch verschiedene Techniken wie Mikroarrays, Northern-Blots und Western Blots ^1-3 erreicht werden. , Im Durchschnitt jedoch diese Techniken die Antwort einer ganzen Population von Zellen. Um die Feinregulierung der Expression von Proteinen zu verstehen, ist es wünschenswert, Messungen auf Einzelzellebene zu sammeln. Idealerweise sollten diese Messungen auch quantitative Daten zugänglich mathematische Modelle des Basiswegs zu entwickeln.

Mikroskopie und Durchflusszytometrie sind zwei Techniken, die ideal geeignet sind, wie quantitative Einzelzellmessungen liefern. Die endogenen Markierung von Proteinen mit einem fluoreszierenden Protein kann bE verwendet werden, um ihre Expression Level ⁴ zu quantifizieren. Da die Zugabe einer großen fluoreszierenden Gruppe am Terminus des Proteins kann es machen nicht-funktionellen, ist es jedoch oft wünschenswert, spezifische Expression Reporter basierend auf einem Promotor, der die Expression eines Fluoreszenz Konstrukt zu erzeugen. Dieses Reporter-Protein exogen zu dem zellularen System und daher nicht die Signalisierungsereignisse, die in der Zelle stattfinden, beeinflussen.

Sowohl Mikroskopie und Durchflusszytometrie wurden weitgehend im Signalisierungsfeld Hefe verwendet. Als Beispiele; Colman-Lerner und Mitarbeiter korreliert sind, in einzelnen Zellen die Expression von spezifischen Paarung und konstitutiv exprimiert Reportern durch Mikroskopie, um den Lärm in Hefe Paarung Signalübertragungskaskade ⁵ quantifizieren, Acar und Kollegen verwendeten Durchflusszytometrie, um die regulatorische Netzwerk studieren Steuern der Expression der GAL-Gene ^6. In einer früheren Studie ⁷ haben wir eine Kombina verwendetauf dieser zwei Techniken, um die Expressionsleistung aus der Hoch Osmolarität Glycerin (HOG) Weg in Hefezellen zu studieren. Diese Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Weg wird durch Hyper osmotischen Stress ausgelöst. Es führt zu der Aktivierung der MAPK Hog1, die in den Kern der Zelle transloziert, ein Transkriptionsprogramm, was zur Expression von etwa 300 Gene zu induzieren. Um diesen Prozess zu untersuchen, haben wir einen Ausdruck Reporter bezogen auf das STL1 Promotor (ein Gen, das unter den Hog1 Aktivität ⁸ induziert), die Expression von einem Vierfach-Venus fluoreszierendes Protein (p-STL1 qV) entwickelt hatten. Durchflusszytometrie Messungen entdeckt die Anwesenheit von zwei Populationen von Zellen bei mittleren Belastungsniveau (0,1 M NaCl) nur mit einem Bruchteil der Bevölkerung die fluoreszierenden Reporter exprimieren. Wir verwendeten Mikroskopie dieses Verhalten weiter zu untersuchen und entdeckt, dass dieses Geräusch in der Proteinexpression wurde durch intrinsische Faktoren ⁹ geregelt. Wir could beobachten weiter, dass Zellen, die mit einem ähnlichen Niveau von Hog1 Aktivität könnte auffallend unterschiedliche Expressionsergebnisse anzuzeigen. Die Kombination dieser beiden Techniken konnten wir zeigen, wie die langsamen Umbau der Stressantwortgene beeinflusst die Expression Ergebnis auf Einzelzellebene ^7.

In diesem Papier verwenden wir die Expression des p-STL1 qV Reporter durch hyper-osmotischen Schock als ein Beispiel für die Quantifizierung der Proteinexpression induziert durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie. Der gleiche Stamm bis 0,2 M NaCl beansprucht wurde mit beiden Methoden untersucht. Dies wird es uns ermöglichen, einige der wichtigsten Unterschiede in diesen beiden Techniken ergänzen sich zu markieren.

Protocol

1. Mikroskopie-Messungen

1. Impfen 5 ml synthetisches Medium mit Hefe.
2. Zellen wachsen bei 30 ° C über Nacht.
3. Messen Sie die OD ₆₀₀ der Übernachtkultur am nächsten Morgen.
4. Verdünnen Nacht-Kultur in 5 ml synthetisches Medium bis DA ₆₀₀ 0,05.
5. Wachsen die verdünnte Kultur bei 30 ° C für mindestens 4 Stunden.
6. Bereiten Sie 3-fach konzentriert (0,6 M) NaCl-Lösung in synthetischem Medium.
7. Vorbereitung einer 1 mg / ml Lösung von Concanavalin A (ConA) in PBS.
8. Filtrat ~ 200 ul ConA-Lösung in die gut Rutsche.
9. Lassen Sie stehen für 30 min.
10. ConA-Lösung entfernen.
11. In 150 ul H ₂ O zum Brunnen.
12. Entfernen H ₂ O
13. OD _600-Messung der Zellkultur.
14. Planen 300 ul Zellkultur bei einer OD ₆₀₀ = 0,02 in einem 1,5 ml Mikroröhrchen.
15. Beschallen der Zellen in einem Wasserbad für 45 Sekunden.
16. Vortex kurz die microtube.
17. Beschallen der Zellen in einem Wasserbad für 45 Sekunden.
18. Vortex kurz den Mikroröhrchen.
19. Geben Sie 200 ul der Zellkultur zum Brunnen.
20. Warten Sie 30 min die Zellen auf dem Boden der gut absetzen zu lassen.
21. Legen Sie die Folie auch auf dem Mikroskop.
22. Wählen Sie die Beleuchtungseinstellungen für die Leuchtstoff Kanal aufgezeichnet werden.
23. Wählen Sie die Beleuchtungseinstellungen für zwei Hellfeld-Bilder (ein etwas unscharf: 3 um unterhalb der Fokusebene, für eine angemessene Segmentierung der Zellen zu ermöglichen).
24. Wählen Sie die Zeitintervalle für die Zeitraffer-Messung
25. Wählen Sie die Felder der Ansicht zu Bild.
26. Starten Sie die Aufnahme von ein paar Frames.
27. Pause den Erwerb, die 100 ul von 0,6 M NaCl Medium hinzufügen.
28. Resume-Bildgebung.

2. Durchflusszytometrie Messungen

1. Impfen 5 ml synthetisches Medium mit Hefe.
2. Wachsen bei 30 ° C über Nacht.
3. Messendie OD ₆₀₀ der Übernacht-Kultur am nächsten Morgen.
4. Verdünnen Nacht-Kultur in 5 ml synthetisches Medium bis DA ₆₀₀ 0.1.
5. Wachsen bei 30 ° C für mindestens 4 Stunden bis zu einer OD ₆₀₀ von 0,2-0,4 zu erreichen.
6. Vorbereitung Cycloheximid-Lösung 1 mg / ml in H ₂ O.
7. Bereiten Sie 3-fach konzentriert (0,6 M) NaCl-Lösung in synthetischem Medium.
8. Vorbereitung einer 1,5 ml-Mikroröhrchen mit 100 &mgr; l 0,6 M NaCl Medium für jeden Zeitpunkt gemessen werden.
9. Zum Zeitpunkt 0, 200 &mgr; l Zellkultur jedem Mikroröhrchen.
10. Inkubation mit bei 30 ° C schüttelnd
11. Zum Zeitpunkt T, fügen Sie 30 ul Cycloheximid zu einem Mikroröhrchen.
12. Wiederholen Sie Schritt 2.11 für alle gewünschten Zeitpunkten.
13. Alle Röhrchen Inkubation für mindestens 45 min und bis zu 3 h bei 30 ° C unter Schütteln.
14. Bereiten FACS-Röhrchen mit 400 ul PBS.
15. Beschallen die Zellen im Wasserbad für 1 min.
16. Vortex kurz die Mikroröhrchen.
17. Sohnfindliche die Zellen im Wasserbad für 1 min.
18. Vortex kurz die Mikroröhrchen.
19. 100 ul Zellkultur von jedem Mikroröhrchen in das entsprechende FACS-Röhrchen.
20. Wählen Sie die 488 nm Anregungslaser und 530/30 nm Bandpassfilter für die Erkennung.
21. Test-nicht-exprimierenden und Proben voll zum Ausdruck, um zu überprüfen, ob sie in der Detektor-Empfindlichkeitsbereich fallen.
22. Messen 10.000 Zellen für jede erworbene Probe.

Representative Results

Mikroskopie

Hefe-Zellen, die das Reportergen Expression STL1 p-qV (ySP9 ⁷⁾ zu dem Boden des Bohrlochs-Schlitten angebracht ist und unter das Mikroskop gelegt. Die Zellen wurden während des Verlaufs der Bildgebungssitzung durch Zugabe von Stress Medium direkt in das Bohrloch gefördert. Dies ermöglicht es uns, ein paar Bilder von den Zellen vor Induktion Weg erwerben und folgen Sie ihr Schicksal nach der Stimulation. Im vorliegenden Fall wurden die Zellen für ca. 2 h mit einem Zeitintervall von 10 min. 1A ist ein Bild eines nicht fluoreszierenden Zellen vor der Induktion, und Fig. 1B den gleichen Zellen 2 h nach der Belastung, wenn die Expression Reporter zeigt induziert worden und hat sich zu fluoreszierend.

Um die in diesen Bildern vorhanden quantitative Informationen zu extrahieren, muss eine komplexe Bildanalyseprozess durchgeführt werden. Es umfasst die Segmentierung der Zellen, um Objekte in der i definieren,Mage, das Spur dieser Objekte von einem Bild zum nächsten und die Messungen der Eigenschaften dieser Objekte (Form und Intensitätseigenschaften). Wir haben unsere eigene Plattform namens YeastQuant entwickelt, um diese Analyse ¹⁰ durchzuführen. Ein paar andere nicht-kommerzielle Software sind verfügbar, um diese Aufgaben durchführen:. CellProfiler ^{11, 12} oder CellID CellX ¹³ 1C zeigt die Ergebnisse einer Analyse mit YeastQuant durchgeführt. Jeder rote Kurve stellt die zeitliche Entwicklung der mittleren Fluoreszenzintensität einer einzelnen Zelle. Die blaue Linie zeigt den Median von mehr als 500 Zellen, die segmentiert und verfolgt wurden während der 20 Rahmen von fünf Zeitraffer-Filme aus fünf verschiedenen Bereichen der Blick aus dem gleichen auch erworben. Die hellblaue Fläche stellt den 25. und 75. Perzentil aller gemessenen Intensitäten zu einem bestimmten Zeitpunkt.

Durchflusszytometrie

Für die Durchflusszytometrie MeasuremEltern, wurde die Zellkultur in Mikroröhrchen, den Stress Medium verschüttet. Um die zeitliche Entwicklung des p-STL1 qV Ausdruck zu untersuchen, wurde die Übersetzung zu verschiedenen Zeitpunkten (5 bis 10 min-Takt) mit Cycloheximid (Abbildung 2) gehemmt. Dieses Medikament blockiert die Synthese neuer Proteine, aber die Reifung des fluoreszierenden Proteins exprimiert wird, bereits nicht gestört. Deshalb wird nach 45 Minuten bis einer Stunde Inkubation werden die Zellen im Durchflußzytometer ermöglicht die Quantifizierung der Menge des Proteins bei der Zugabe von Cycloheximid zu messen sind. Diese Strategie umgeht das Problem der fluoreszierenden Protein Reifung und quantifiziert die wahre Dynamik der Fluoreszenzprotein-Synthese, wodurch.

Vergleich der beiden Techniken

3A vergleicht die Dynamik der Expression von Reportermikroskopie und Durchflusszytometrie. Während das Fluoreszenzsignal zu steigen beginnt 30-40min nach Belastung mit Mikroskopie, die Durchflusszytometrie Messungen belegen eindeutig, dass die Proteine ​​sind bereits 10 bis 15 min nach dem Stimulus erzeugt. Diese halbe Stunde Verzögerung ist aufgrund der langsamen Reifung der fluoreszierenden Proteine ^​​14. Obwohl beide Methoden zu quantifizieren, die Fluoreszenzintensität der Zellen, muss man beachten, dass in dieser Studie, haben sie nicht die gleiche biologische Verfahren zu messen. Während folgt Mikroskopie die Erscheinung des Fluoreszenzsignals, das tatsächlich Durchflusszytometrie quantifiziert die Synthese des Proteins. Es ist wichtig, diese Reifungsschritt bei der Durchführung von Live-Cell-Imaging zu berücksichtigen. In einer Situation, in der ein endogenes Protein mit einem fluoreszierenden Protein markiert ist, wird das endogene Protein exprimiert wird und aktiv werden, bevor die Fluoreszenz der Tag detektiert werden kann.

Wie oben angedeutet, beide Techniken liefern ergänzende Informationen. Durchflusszytometrie kann eine große Anzahl von Zellen sehr rasch zu messen (10.000 oder mehr). Es kann daher zu liefern statistisch reich Datensätzen, wo zwei überlappenden Populationen identifiziert werden kann oder ein paar seltene Ereignisse beobachtet werden kann. Mikroskopie liefert Informationen über eine begrenzte Anzahl von Zellen (in der Grßenordnung von 100). Da dieses Datensatzes enthält zeitliche und räumliche Informationen und ermöglicht die Korrelation von mehreren Messungen in der gleichen Zelle, kann es sehr wertvolle Einblicke in den untersuchten biologischen Prozess anzubieten.

Fig. 1 ist. Messung der Reporterexpression durch Mikroskopie. A und B. Bilder von Zellen, die das fluoreszierende Reporter Ausdruck p STL1-qV vor (A) und 2 h nach Stimulation mit 0,2 M NaCl (B). C. Zeitverlauf der Grippe Fluoreszenz Erscheinung. Die roten Kurven stellen die durchschnittliche zelluläre Fluoreszenzintensität von einigen repräsentativen Einzelzellspuren. Die blaue Kurve stellt die mittlere Fluoreszenz von 550 Einzelzellspuren. Die hellblaue Fläche stellt den 25. und 75. Perzentil der Fluoreszenz Ausdruck der Zellpopulation zu jedem Zeitpunkt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

2. Messung der Reporterexpression mittels Durchflusszytometrie. Histogramme der zellulären Fluoreszenz von Zellen, die den fluoreszierenden Reporterexpressions p STL1-qV mit 0,2 M NaCl und mit Cycloheximid gehemmt zu verschiedenen Zeitpunkten behandelt.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

3. Vergleich der Expressionsdynamik gemessen durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie. A. Mittelwert der Fluoreszenzintensität mittels Durchflusszytometrie (durchgezogene Linie) und Mikroskopie (gestrichelte Linie) als Funktion der Zeit für drei biologischen Replikaten gemessen. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts. B und C. Histogramme der normierten Fluoreszenzintensität bei 120 min nach Stress für die Mikroskopie (B) und 60 Minuten nach der Belastung für die Durchflusszytometrie (C) für die drei Wiederholungen. Klicken Sie hier, umgrößeres Bild zu betrachten.

Discussion

Mikroskopie

Die Behandlung der mit ConA und ist ein wesentlicher Schritt, um eine richtige Abbildung der Zellen sicherzustellen. Da ConA eine geringe Löslichkeit in PBS (5 mg / ml), kann die Filtration der Entfernung von großen Aggregaten, die in der ungefilterten Lösung vorliegen und stören die Bildgebung. Zellen befestigen relativ stark auf die behandelte Oberfläche und die Zugabe der Lösung zu induzieren nicht die Lokalisierung der Zellen stören, was eine kontinuierliche Verfolgung vor und nach dem Stimulus. Diese Behandlung kann auch angewendet werden, um Strömungskanäle oder Mikrofluidvorrichtungen wurden die Zellen in einer konstanten Strömungs ^7,15 unterworfen. Wenn das Bohrloch nicht richtig mit Wasser nach der Behandlung gespült wird, werden die Zellen nicht richtig am Glas haften, vermutlich weil die ConA in Lösung bindet direkt an den Zellen und verhindert, dass sie eine starke Bindung an der Glasoberfläche zu bilden. Nach dem Waschschritt, kann der Brunnen trocken bleiben für 3 -4 h vor der Zugabe der Zellen, ohne die merklich die Bindung der Zellen auf dem Glas.

Die Auswahl der Belichtungszeit für die Fluoreszenzkanal ist eine kritische Einstellung für den Erfolg des Experiments. Da die Fluoreszenz der Zelle wird während der Zeitraffer erhöhen, ist es wichtig, mit einer Probe induziert wird, was die maximale Belichtungszeit, die verwendet werden können, um eine Sättigung der Bilder während der Aufnahme zu vermeiden, vorher testen. Ein weiterer Parameter zu berücksichtigen, wenn die Auswahl der Belichtungszeit zu nehmen ist das Ausbleichen der Fluoreszenzsignal. Für jede Probe, muss man einen Kompromiss zwischen der Helligkeit des Bildes und eine Verschlechterung des Signals durch Bleichen im Zeitraffer finden. Das Zeitintervall zwischen jeder Erfassung beeinflusst auch stark die Bleichung des Fluorophors. Da die Proteinexpression ist ein relativ langsamer Prozess, wir verwenden in der Regel 10 bis 15 min. Intervalle. Wenn andere Prozesse müssen schneller werden fparallel zur Proteinexpression ollowed, könnte es sinnvoll, unterschiedliche Zeitschritte der Zeitraffer-Film (1-2 min am Anfang und 5-15 Minuten für eine spätere Akquisitionen) zu verwenden.

Die Steuerung der Zelldichte ist ein wichtiger Parameter zu berücksichtigen. Wenn die Dichte zu niedrig ist, nur wenige Zellen in jedem Blickfeld, was zu schlechter Statistiken für den Datensatz vorhanden sein wird. Jedoch, wenn die Dichte zu hoch ist, könnte es die Segmentierung, Tracking und Quantifizierung der Zellen zu verhindern, wodurch es schwierig wird, die gewünschten Informationen aus den Bildern zu extrahieren. Um die Aussaatdichte zu bestimmen, ist ein zusätzlicher Parameter zu berücksichtigen, die während der Versuchsdauer. Wenn ein Experiment dauert mehrere Teilungszyklen, ist es ratsam, mit einem spärlichen Sichtfeld, das nach und nach während des Zeitverlaufs der Abbildungs ​​füllen wird durch Teilung der Zellen und der Ansiedlung von Zellen in der Lösung starten. In dem Protokoll, empfehlen wir die Verwendungeine OD ₆₀₀ von 0,02, abhängig von der Art des Experiments führen wir verwenden wir OD ₆₀₀ von 0,05 für kurze Zeitraffer-Filme auf 0,005 für längere.

Die Anzahl der analysierten Zellen eindeutig ein Schlüsselparameter für die Gültigkeit des Experiments. Manchmal so wenig wie 20-30 Zellen werden kombiniert, um einen Datensatz zu erzeugen. Allerdings, starten mit statistisch signifikanten Datensätzen, hundert oder mehr Zellen sind wahrscheinlich notwendig. Die Vergrößerung des Objektivs bestimmt die Größe der Bildfläche und dadurch die Anzahl von Zellen abgebildet. Zur Proteinexpression Messungen, wo das Ziel ist, um die durchschnittliche Fluoreszenz der Zelle zu messen, ist eine hohe numerische Apertur 40X Immersionsobjektiv die beste Lösung, die sowohl gutes Signal-Rausch-Verhältnis und ein großes Sichtfeld. Wenn subzellulären Strukturen analysiert werden, sind höhere Vergrößerung (60x bzw. 100x) oft erforderlich, was bei der Messung von weniger Zellen. Das Aufkommen der einheitliche GMOS-Kameras mit einer Detektorgröße nahezu viermal grßer als die eines herkömmlichen CCD ist ein klarer Vorteil, mehr Zellen pro Gesichtsfeld zu erhalten.

Mit einem motorisierten XY-Stufe ist es, die parallel mehrere Sichtfelder möglich, Bild um die Anzahl der Zellen in der letzten Datenmenge zu erhöhen. Es besteht jedoch ein Kompromiß zwischen der Anzahl von XY-Positionen besucht und der Geschwindigkeit der Bildaufnahme. Abhängig von der Geschwindigkeit der Bühne und der Anzahl der Beleuchtung erfasst, ist es typischerweise möglich, Bild zehn Positionen in weniger als einer Minute. Schnelle Signalübertragungen zu quantifizieren, kann dies ein Begrenzungsfaktor. Zur Proteinexpression Messungen, bei denen Fluoreszenzänderungen geschehen auf einem langsameren Zeitskala, ist es in der Regel keine Einschränkung. Alternativ, weil diese Expressionsversuche dauern für einige Stunden und wegen der langsamen zeitlichen Auflösung erforderlich ist, wird es vorteilhaft sein, mehrere Bild Proben parallel. Mehrere benachbarte Brunnen can mit Wildtyp-und mutierten Zellen besiedelt werden, können verschiedene Konjunktur jedem angewendet werden oder biologische Replikate können parallel gemessen werden. Scannen durch alle Brunnen von einer 96-Well-Platte wird routinemäßig mit Klimaziel für die Mikroskopie Bildschirme ¹⁶ gelöst. Aufgrund der geringen Häufigkeit von endogenen Proteinen in Hefe, deren Quantifizierung erfordert eine Ölobjektiv mit großer numerischer Apertur. Dies schränkt den Bereich, mit dem Ziel zurückgelegt werden kann. Trotzdem wir routinemäßig vier benachbarten Bild Vertiefungen durch die Nähe zu ihrem gemeinsamen Ecke. Es ist jedoch schwieriger zu Bild eine größere Anzahl von Vertiefungen. Wasserziele mit automatischer Spender könnte dieses Problem auf Kosten eines kleinen Helligkeitsverlust zu umgehen.

Durchflusszytometrie

Sammeln eine ausreichende Anzahl von Zellen ist kaum ein Problem mit Durchflusszytometer. Typischerweise 10.000-100.000 Zellen können in einer Minute aufgenommen werden. Da jedoch kein Bild von ter Zelle erfasst wird, ist es wichtig, die Zellpopulation analysiert werden richtig auszuwählen. Gating der Zellen auf der Basis der gemessenen Vorwärts-und Seiten streut ermöglichen es, einzelne Zellen, anstatt Gruppen von Zellen auszuwählen und Zelltrümmer aus der Analyse zu entfernen. In Fig. 2, die jeweils Histogramm stellt eine Population von etwa 5000 Zellen, die auf der Grundlage ihrer Streueigenschaften von 10.000 Ereignissen gemessen wurden ausgewählt.

Durch Brechen Cluster von Zellen in einzelne Zellen wird die Beschallung der Zellkultur eine zusätzliche Möglichkeit, die Qualität der gesammelten Daten zu verbessern. Dies gilt für die Mikroskopie, in denen Cluster von Zellen kann sehr schwierig zu segmentieren richtig sein. Die Dauer dieses Schritts muss experimentell getestet werden. Wir führen in der Regel zwei Runden der Beschallung in einem Wasserbad von 30 Sekunden bis eine Minute, gefolgt von Vortexen der Zellsuspension. Längerer Beschallung in der Lyse von wenigen Zellen führen. Jedoch haben wir nicht observe eine up-Regulation von Stress responsive Gene aufgrund dieser experimentellen Schritt. Beachten Sie, dass die Aggregation der Zellen ist ein Hintergrund-Phänotyp abhängig, zum Beispiel W303-Zellen zeigen eine stärkere Tendenz zu aggregieren als S288C Zellen.

Variabilität in Einzelzellmessungen

In Fig. 3A wird der Mittelwert und der Standardfehler von drei unabhängigen Experimenten mittels Durchflusszytometrie und Mikroskopie durchgeführt aufgetragen. Die geringen Unterschiede zwischen den drei Kurven ergeben sich aus der Tatsache, dass die experimentellen Fehler für diese einfache Messungen relativ gering ist und dass viele Zellen gemessen werden (mehr als 5.000 für die Durchflusszytometrie, zwischen 370 bis 550 für die Mikroskopie). Die zeitliche Entwicklung der Mikroskopie Kurven ist glatter als die der Durchflusszytometrie Daten. Ein möglicher Grund für dieses Verhalten ist die Probenvorbereitung. Für die Mikroskopie, alle Zeitpunkte in einem Experiment aus dem gleichen Stressereignis, während fürdie FACS, wird die Probe für jeden Zeitpunkt einzeln betont. Kleine Schwankungen in der Menge der Belastung und Kulturlösungen in einem kleinen Unterschied in der Genexpression Ausgabe führen. Eine alternative Strategie wäre zu betonen, 5 ml-Kultur von Zellen zu entfernen, und Aliquote zu den gewünschten Zeiten, um sie mit Cycloheximid inhibiert. Beide Verfahren funktionieren gut, wir das Mikroröhrchen Herstellungsverfahren, denn es bietet mehr Flexibilität und für die Messungen der Dosis-Wirkungs-Kurven, in denen mehrere NaCl-Konzentrationen müssen parallel gemessen werden, ist auch gut geeignet.

Die geringe Geräuschentwicklung in diesen gemittelten Kurven jedoch spiegelt nicht das gesamte Spektrum der gegenwärtigen Variabilität auf Einzelzellebene. In Fig. 3B und 3C zeigen die Histogramme der Expression durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie gemessen an einem einzelnen Zeitpunkt aufgetragen. Diese beiden Tafeln veranschaulichen auch die Tatsache, dass die technischen Unterschiede zwischen den Wiederholungen sind relativ klein, especmathematisch im Vergleich zu der großen Variabilität der Expression von einzelnen Zellen beobachtet. Der Unterschied in den Formen der Verteilung zwischen der Mikroskopie und Durchflusszytometrie Messungen ergibt sich aus der Tatsache, dass mit Durchflusszytometrie zellulären Gesamtintensität quantifiziert wird, während in den Mikroskopaufnahmen der durchschnittliche Zellintensität wurde berechnet. Diese letztere Messung im Durchschnitt Variationen in der Zellgröße und führt daher in enger Distributionen.

Die beiden hier vorgestellten Verfahren ermöglichen, quantitativ untersuchen das Verhalten von Einzelzellen. Diese Funktion wird in der Regel in den traditionellen biologischen Messungen auf Bevölkerungsebene durchgeführt versteckt. Verstehen, wie die Variabilität in der Reaktion der einzelnen Zellen entsteht kann wichtige Einblicke in die komplexe Regulation von biologischen Prozessen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Yeast Nitrogen Base	ForMedium	CYN6202
CSM amino-acid mix	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
Cycloheximide	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Toxic
ySP9			W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope	Nikon	Ti-Eclipse
Microscope control software	Micro-manager	Ver 1.4.11
Incubation chamber	LIS	The Box
Fluorescence light source	Lumencor	SpectraX
Camera	Hamamatsu	Flash 4.0
Flow cytometer	BD	FACS calibur
Sonicator bath	Telesonic	TUC-150
8-well-slide	Thermo Lab-tek	155409
96-well-plate	Matrical bioscience	MGB096-1-2-LG
FACS tube	BD Falcon	352054