Summary
שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.
Abstract
כימות של ביטוי גנים ברמת התא הבודד חושפת מנגנוני ויסות רומן מטושטשים במדידות שבוצעו ברמת האוכלוסייה. שתי שיטות מבוססות על מיקרוסקופיה וcytometry זרימה מוצגות כדי להדגים כיצד ניתן לרכוש נתונים כאלה. הביטוי של כתב ניאון המושרה על שפעול מסלול MAPK גליצרול הגבוה osmolarity בשמרים משמש כדוגמא. היתרונות הספציפיים של כל שיטה מודגשים. Cytometry זרימה מודד מספר גדול של תאים (10,000) ומספק מדידה ישירה של הדינמיקה של ביטוי החלבון העצמאי של קינטיקה ההבשלה האיטית של חלבון פלואורסצנטי. הדמיה של תאי חיים על ידי מיקרוסקופ היא לעומת מוגבל למדידה של הטופס התבגר של הכתב בפחות תאים. עם זאת, ערכות נתונים שנוצרו על ידי טכניקה זו יכולה להיות עשיר מאוד הודות לשילובים של כתבים רבים ולמידע המרחב ובזמןהמתקבל מהתאים בודדים. שילוב של שתי שיטות מדידה אלה יכולים לספק תובנות חדשות על הרגולציה של ביטוי חלבון על ידי איתות מסלולים.
Introduction
איתות באמצעות מפלי התמרה לעתים קרובות מגיע לשיאו בביטוי של חלבונים. אפיון פרופיל ביטוי זה הוא מרכיב מפתח בהבנת התפקיד של מסלולים ביולוגיים. זיהוי של הספקטרום של חלבונים והדינמיקה של ההפעלה שלהם מוסדר עד יכול להיות מושגת על ידי טכניקות שונות, כגון מיקרו מערכים, כתמים הצפוניים או כתמים מערביים 1-3. עם זאת, טכניקות אלו הן בממוצע התגובה של אוכלוסייה שלמה של תאים. כדי להבין את הרגולציה הקנס של הביטוי של חלבונים, רצוי לאסוף מדידות ברמת התא בודדת. באופן אידיאלי, מדידות אלה אמורות גם לספק נתונים כמותיים נוחים לפתח מודלים מתמטיים של המסלול הבסיסי.
מיקרוסקופית וcytometry זרימה הן שתי טכניקות, שמתאימים באופן אידיאלי כדי לספק מדידות תא כזה כמותית אחת. תיוג אנדוגני של חלבונים בחלבון פלואורסצנטי יכול bדואר משמש לכמת רמת הביטוי שלהם 4. עם זאת, מאחר שהתוספת של מחצית ניאון גדולה בתחנה הסופית של החלבון יכולה להבהיר את זה שאינו פונקציונלי, הוא לעתים קרובות רצוי יותר כדי ליצור כתבי ביטוי ספציפיים המבוססים על אמרגן הנהיגה הביטוי למבנה ניאון. חלבון הכתב הזה הוא חיצוני למערכת הסלולרית, ולכן אינו משפיע על אירועי איתות המתרחשים בתא.
מיקרוסקופיה וcytometry זרימה שניהם הייתה בשימוש נרחב בתחום איתות השמרים. כדוגמאות; קולמן-לרנר ועמיתים לעבודה מתואמת, בתאים בודדים, הביטוי של הזדווגות כתבים ספציפיים והביעו constitutively על ידי מיקרוסקופ לכמת את הרעש במפל הולכים אותות שמרי הזדווגות 5, Acar ועמיתיו השתמשו cytometry זרימה ללמוד את רשת הרגולציה שליטה על הביטוי של גנים GAL 6. במחקר קודם 7, השתמשנו combinatiבשתי הטכניקות הללו כדי ללמוד את פלט הביטוי מגליצרול osmolarity הגבוה המסלול (HOG) בניצני שמרים. מסלול קינאז חלבון זה mitogen הופעל (MAPK) מופעל על ידי מתח Hyper-האוסמוטי. התוצאה הוא ההפעלה של Hog1 MAPK, אשר translocates לגרעין התא כדי לגרום לתכנית תעתיק וכתוצאה מכך הביטוי של בערך 300 גנים. ללמוד את התהליך הזה, היינו לנו מהונדס כתב ביטוי המבוסס על אמרגן STL1 (גן המושרה באופן ספציפי בתגובה לפעילות Hog1 8) נהיגה הביטוי של חלבון מרובע ונוס ניאון (עמ 'STL1-ע"ע). Cytometry זרימת מדידות חשפו את נוכחותם של שתי אוכלוסיות של תאים ברמה בינונית מתח (0.1 M NaCl) עם רק חלק קטן מהאוכלוסייה המבטאת את כתב הניאון. אנחנו השתמשנו במיקרוסקופ כדי לחקור את ההתנהגות הזאת עוד יותר וגילינו שהרעש הזה בביטוי חלבון היה נשלטת על ידי גורמים פנימיים 9. אנחנו could להתבונן עוד כי תאים עם רמה דומה של פעילות Hog1 יכולים להציג תוצאות ביטוי שונות לחלוטין. השילוב של שתי טכניקות אלה אפשר לנו להדגים כיצד שיפוץ האיטי של גנים תגובת לחץ השפיע על תוצאת הביטוי ברמת התא הבודד 7.
במאמר זה, אנו משתמשים בביטוי של כתב STL1-ע"ע עמ 'הנגרם על ידי הלם Hyper-האוסמוטי כדוגמא לכימות של ביטוי חלבון על ידי מיקרוסקופ וcytometry זרימה. אותו הזן נתון 0.2 מתח M NaCl נחקר בשני הטכניקות. זה יאפשר לנו להדגיש כמה הבדלים עיקריים בשתי טכניקות משלימות מאוד אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מדידות מיקרוסקופית
- לחסן 5 מיליליטר של מדיום סינטטי עם שמרים.
- לגדל תאים ב30 מעלות צלזיוס למשך לילה.
- מדוד את OD 600 של תרבות הלילה למחרת בבוקר.
- לדלל תרבות הלילה ב 5 מיליליטר בינוני סינתטית לOD 600 0.05.
- לגדול התרבות בדילול מלא ב30 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות.
- הכן פי 3 מרוכז (0.6 M) פתרון NaCl במדיום סינטטי.
- הכן פתרון 1 מ"ג / מיליליטר של concanavalin (ConA) ב-PBS.
- תסנין ~ 200 μl של פתרון ConA לתוך השקופית היטב.
- לתת לעמוד במשך 30 דקות.
- הסר פתרון ConA.
- הוסף 150 μl H 2 O אל הבאר.
- הסר H 2 O.
- מדוד 600 OD של תרבית תאים.
- הכן 300 μl של תרבית תאים בOD 600 = 0.02 בmicrotube 1.5 מיליליטר.
- Sonicate התאים באמבט מים במשך 45 שניות.
- בקצרה מערבולת מילcrotube.
- Sonicate התאים באמבט מים במשך 45 שניות.
- בקצרה מערבולת microtube.
- הוסף 200 μl של תרבית תאים לטוב.
- חכה 30 דקות כדי לאפשר לתאים ליישב לתחתית הבאר.
- מניחים את השקף גם במיקרוסקופ.
- בחר את הגדרות תאורה עבור ערוץ הניאון שיירשם.
- בחר את הגדרות התאורה לשתי תמונות בהירות שדה (אחד קצת מחוץ לפוקוס: 3 מיקרומטר מתחת למישור המוקד, כדי לאפשר פילוח נכון של התאים).
- בחר את מרווחי הזמן למדידת הזמן לשגות
- בחר את שדות מבט לתמונה.
- הפעל את הרכישה של כמה מסגרות.
- להשהות את הרכישה להוסיף ל0.6 בינוני M NaCl 100 μl.
- קורות חיים הדמיה.
2. מדידות זרימת cytometry
- לחסן 5 מיליליטר של מדיום סינטטי עם שמרים.
- לגדול ב30 מעלות צלזיוס למשך לילה.
- אמצעיOD 600 של תרבות הלילה למחרת בבוקר.
- לדלל תרבות הלילה ב 5 מיליליטר בינוני סינתטית לOD 600 0.1.
- לגדול ב30 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות כדי להגיע 600 OD של 0.2-0.4.
- הכן 1 מ"ג / מיליליטר פתרון cycloheximide בH 2 O.
- הכן פי 3 מרוכז (0.6 M) פתרון NaCl במדיום סינטטי.
- הכן microtube 1.5 מיליליטר אחד עם של 0.6 בינוני M NaCl 100 μl עבור כל נקודת זמן כדי להימדד.
- בזמן 0, להוסיף 200 μl של תרבית תאים לכל microtube.
- דגירה עם הרועד ב30 ° C.
- בזמן t, להוסיף 30 cycloheximide μl לmicrotube.
- חזור על שלב 2.11 עבור כל נקודות הזמן הרצויות.
- דגירה כל microtubes לפחות 45 דקות ועד 3 שעות ב30 ° C עם רעד.
- הכן צינורות FACS עם 400 μl PBS.
- Sonicate התאים באמבט מים במשך דקות 1.
- בקצרה מערבולת microtubes.
- בןicate התאים באמבט מים במשך דקות 1.
- בקצרה מערבולת microtubes.
- הוספת 100 תרבית תאי μl מmicrotube לצינור FACS המקביל שלה.
- בחר את לייזר 488 ננומטר עירור ו530/30 מסנן bandpass ננומטר לצורך זיהוי.
- מבחן אינו מביע ומבטא באופן מלא לדוגמא כדי לוודא אם הם נופלים בטווח רגישות גלאי.
- מדוד 10,000 תאים לכל דגימה שנרכשה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרוסקופית
תאי שמרים הנושאים את כתב ביטוי p STL1-ע"ע (7 ySP9) הוצמדו לחלק התחתון של השקופית היטב והניחו מתחת למיקרוסקופ. התאים היו מגורה על ידי התוספת של מדיום מתח ישירות לתוך הבאר במהלך פגישת ההדמיה. זה מאפשר לנו לרכוש כמה תמונות של התאים לפני גיוס מסלול ובצעו את גורלם לאחר הגירוי. במקרה הנוכחי, התאים היו במעקב במשך ~ שעה 2 עם מרווח של 10 דקות זמן. איור 1A הוא דימוי של תאים שאינם ניאון לפני האינדוקציה ואיור 1 מציג את אותם תאים 2 שעות לאחר לחץ כאשר כתב הביטוי יש כבר מושרה והפך ניאון.
כדי לחלץ את המידע כמוני נמצא בתמונות האלה, תהליך ניתוח תמונה מורכב צריך להתבצע. הוא כולל את הפילוח של התאים להגדיר אובייקטים בiקוסם, מעקב אחר העצמים הללו מפריים אחד למשנהו והמדידות של התכונות של אובייקטים אלה (מאפייני צורה ועוצמה). פיתחנו פלטפורמה משלנו בשם YeastQuant לבצע ניתוח זה 10. כמה תוכנות לא מסחריות אחרות זמינות לביצוע משימות הבאות:. 11 CellProfiler, CellID 12 או CellX 13 תרשים 1C מציג את התוצאות של ניתוח שבוצע עם YeastQuant. כל זכר אדום מייצג את האבולוציה הזמנית של עוצמת הקרינה הממוצעת של תא בודד. הקו הכחול מציג הממוצע של יותר מ500 תאים אשר מפולחים ולעקוב אחריו לאורך כל 20 המסגרות של חמישה זמן לשגות סרטים שנרכשו מחמישה תחומים שונים של נוף מאותו היטב. אזור האור הכחול מייצג את אחוזון 25th ו 75th של כל העוצמות שנמדדו בנקודת זמן נתונה.
Cytometry זרימה
לmeasurem cytometry הזרימההאנטים, תרבית התאים נשפכה בmicrotubes המכיל מדיום הלחץ. כדי לחקור את האבולוציה הזמנית של ביטוי p STL1-QV, התרגום היה עצור בנקודות זמן שונות (5 10 מרווחים דק ') עם cycloheximide (איור 2). לוקי תרופה זו הסינתזה של חלבונים חדשים, אך ההבשלה של החלבון פלואורסצנטי כבר הביע לא מוטרד. לכן, לאחר 45 דקות לשעה אחת של דגירה, ניתן למדוד את התאים בזרימה cytometer מאפשר כימות של כמות החלבון המיוצרת בזמן בנוסף cycloheximide. אסטרטגיה זו עוקפת את הבעיה של הבשלת חלבון פלואורסצנטי ובכך מכמתת את הדינמיקה האמיתית של סינתזת חלבון פלואורסצנטי.
השוואה בין שתי הטכניקות
איור 3 א משווה את הדינמיקה של כתב הביטוי נמדד על ידי מיקרוסקופ וcytometry זרימה. בעוד שאות הניאון מתחילה לעלות 30-40דקות לאחר מתח עם מיקרוסקופיה, מדידות הזרימה cytometry מוכיחות כי החלבונים כבר מיוצרים בין 10-15 דקות לאחר הגירוי. עיכוב זה חצי שעה בשל ההבשלה האיטית של חלבוני ניאון 14. למרות ששני השיטות לכמת את עוצמת הניאון של התאים, יש לזכור כי במחקר זה, הם לא מודדים את אותו תהליך ביולוגי. אמנם, מיקרוסקופיה כדלקמן ההתגלות של אות הניאון, cytometry הזרימה למעשה מכמת את הסינתזה של החלבון. זה חיוני לקחת בחשבון את שלב ההתבגרות הזה בעת ביצוע הדמיה לחיות תאים. במצב שבו חלבון אנדוגני מתויג עם חלבון פלואורסצנטי, חלבון אנדוגני יבוא לידי ביטוי ופעיל לפני הקרינה של תגה ניתן לאתר.
כפי שצוין לעיל, שתי הטכניקות לספק מידע משלים. Cytometry זרימה יכולה למדוד מספר גדול של תאים בקצב מהיר מאוד (10,000 או יותר). לכן יכול לספק ערכות נתונים סטטיסטיים עשירות שבו ניתן לזהות שתי אוכלוסיות חופפות או ניתן לצפות בכמה אירועים נדירים. מיקרוסקופית מספק מידע על מספר מוגבל של תאים (בסדר הגודל של 100). עם זאת, בגלל מערך נתונים זה מכיל מידע של זמן ומרחב ומאפשר למתאם של מדידות מרובות באותו התא, הוא יכול להציע תובנות יקרים מאוד לתהליך ביולוגי הנחקר.
איור 1. מדידה של ביטוי עיתונאי על ידי מיקרוסקופ. A ו-B. תמונות של תאים הנושאים את כתב ביטוי p STL1-ע"ע ניאון לפני (א) ו 2 שעות לאחר גירוי עם 0.2 M NaCl. C (ב '). כמובן זמן של שפעת התגלות orescence. העקומות האדומות מייצגות את עוצמת הקרינה סלולרית הממוצעת של כמה עקבות תא בודדות נציג. העקומה הכחולה מייצגת את הקרינה החציוני של 550 עקבות תא בודדות. אזור האור הכחול מייצג את אחוזון 25th ו 75th של ביטוי הניאון של אוכלוסיית תאים בכל נקודת זמן. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. מדידה של ביטוי עיתונאי על ידי cytometry זרימה. היסטוגרמות של הקרינה הסלולרית של תאים הנושאים את כתב ביטוי p STL1-ע"ע הניאון טופל 0.2 M NaCl ועכבות עם cycloheximide בנקודות זמן שונים.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. השוואה של דינמיקת הביטוי נמדדה על ידי מיקרוסקופ וcytometry זרימה. א 'ממוצע של עוצמת הקרינה שנמדד על ידי cytometry זרימה (קו מוצק) ומיקרוסקופי (קו מקווקו) כפונקציה של זמן עבור שלושה משכפל ביולוגי. הברים השגיאה מייצגים את שגיאת התקן של ממוצע. B ו-C היסטוגרמות של עוצמת הקרינה המנורמלת ב120 דקות לאחר לחץ למיקרוסקופיה (B) ו60 דקות לאחר לחץ עבור cytometry הזרימה (ג) לשלושה משכפל. לחצו כאן כדיצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיקרוסקופית
הטיפול בהיטב עם ConA הוא צעד חיוני כדי להבטיח הדמיה תקינה של התאים. בגלל ConA יש מסיסות נמוכה ב PBS (5 מ"ג / מיליליטר), תהליך הסינון מאפשר הסרת אגרגטים גדולים שנמצאים בפתרון מסונן ולהפריע להדמיה. תאים לצרף יחסית חזק אל פני השטח טופל והתוספת של פתרון גרימת לא צריכה להפריע ללוקליזציה של התאים, המאפשרת מעקב רציף לפני ואחרי הגירוי. טיפול זה יכול להיות מיושם גם לזרום ערוצים או מכשירי microfluidic היו התאים חשופים לזרימת 7,15 קבועים. אם גם הוא לא נשטף כראוי עם מים לאחר הטיפול, התאים לא ידבקו כראוי לזכוכית, כנראה משום ConA בפתרון נקשר לתאים באופן ישיר ומונע מהם ליצור קשר חזק במשטח הזכוכית. לאחר שלב השטיפה, גם יכול להישאר יבש ל3 -4 שעות לפני התוספת של התאים מבלי להשפיע באופן ניכר המחייבים של התאים לזכוכית.
הבחירה של זמן החשיפה לערוץ הניאון היא הגדרה קריטית להצלחה של הניסוי. מאז הקרינה של סלולרי תגדל לאורך הזמן לשגות, חשוב לבדוק מראש עם מדגם מושרה מה הוא את זמן החשיפה המקסימאלי שניתן להשתמש בם כדי למנוע הרוויה של התמונות במהלך הרכישה. פרמטר נוסף שיש לקחת בחשבון בעת בחירה את זמן החשיפה הוא הלבנת של אות הניאון. עבור כל דגימה, יש למצוא פשרה בין בהירות התמונה והשפלה של האות עקב הלבנת במהלך הזמן לשגות. מרווח הזמן בין כל רכישה גם משפיע מאוד הלבנת של fluorophore. מאז ביטוי חלבון הוא תהליך איטי יחסית, אנו משתמשים בדרך כלל 10-15 דקות. מרווחים. אם תהליכים מהירים יותר אחרים צריכים להיות followed במקביל לביטוי החלבון, זה יכול להיות מומלץ לשימוש בצעדי זמן שונה על פני כל סרט הזמן לשגות (1-2 דקות בתחילת ו5-15 דקות לרכישות בהמשך).
השליטה בצפיפות התאים היא פרמטר חיוני לקחת בחשבון. אם הצפיפות היא נמוכה מדי, רק כמה תאים יהיו נוכחים בכל שדה הראייה וכתוצאה מכך הנתונים הסטטיסטיים עלובים לערכת הנתונים. עם זאת, אם הצפיפות היא גבוהה מדי, זה עלול לעכב את הפילוח, המעקב וכימות של התאים, מה שהופך את זה קשה כדי לחלץ את המידע הרצוי מהתמונות. על מנת לקבוע את צפיפות הזריעה, פרמטר נוסף אחד לקחת בחשבון הוא את משך הניסוי. אם ניסוי נמשך מחזורי חטיבה מרובים, רצוי להתחיל עם שדה דליל של השקפה שימלא בהדרגה במהלך ההדמיה הזמן בשל חלוקת התאים ולהתיישב של תאים בתמיסה. בפרוטוקול, אנו ממליצים להשתמשOD של 600 0.02, תלוי בסוג של ניסוי שאנו מבצעים אנו משתמשים OD 600 מ0.05 לזמן לשגות סרטים קצרים ל0.005 לארוכים יותר.
מספר התאים ניתחו בבירור פרמטר מרכזי לתקפותו של הניסוי. לפעמים כמה כמו 20-30 תאים משולבים כדי ליצור מערך נתונים אחד. עם זאת, כדי להתחיל שיש מערכי נתונים משמעותיים מבחינה סטטיסטית, מאה תאים או יותר הם כנראה הכרחיים. ההגדלה של אובייקטיבי קובעת את גודל שטח הדמיה ובכך את מספר תאי הדמיה. למדידות ביטוי חלבון, שבו המטרה היא למדוד את הקרינה הממוצעת של התא, אובייקטיבי טבילה גבוהה מספרית 40X הצמצם הוא הפתרון הטוב ביותר לספק הן איתות טובה יחס רעש ושדה גדול של נוף. אם מבני משנה הסלולר צריכים להיות מנותחים, בהגדלה גבוהה יותר (מטרות 60x או 100x) הן לעתים קרובות יש צורך, וכתוצאה מהמדידה של פחות תאים. כניסתו של sCMOמצלמות S עם גודל גלאי כמעט פי ארבעה גדול יותר מזו של CCD הקונבנציונלי היא בבירור יתרון להשיג יותר תאים לכל שדה הראייה.
עם XY שלב ממונע, ניתן לתמונה בשדות מרובים במקביל מבט להגדיל את מספר התאים בבסיס הנתונים הסופיים. עם זאת, קיימת תחלופה בין מספר משרות XY ביקרו ואת המהירות של רכישת התמונה. תלוי במהירות של הבמה ומספר ההארות שנרשמו, זה בדרך כלל אפשרי לתמונה עשר עמדות בפחות מדקה. כדי לכמת את אירועי איתות מהירים, זה יכול להיות גורם מגביל. למדידות ביטוי חלבון, שבו שינויי הקרינה קורים בקנה מידת זמן איטי יותר, זה בדרך כלל לא מגבלה. לחלופין, משום שניסויים אלו ביטוי להימשך כמה שעות וגם בגלל הרזולוציה של הזמן האיטי הנדרשת, הוא הופך להיות יתרון לדגימות מרובות תמונה במקביל. בארות שכנות מרובות can להיות seeded עם סוג בר ותאים שעברו מוטציה, גירוי שונה יכול להיות מיושם על כל באר או ניתן למדוד משכפל ביולוגי במקביל. סריקה כל הבארות מצלחת 96 היטב מושגת באופן שיגרתי עם אובייקטיבי אוויר למסכי מיקרוסקופיה 16. בשל ריבוי הנמוך של חלבונים אנדוגניים בשמרים, כימותם דורש אובייקטיבי שמן עם צמצם מספרי גבוה. זה מגביל באופן חמור את הטווח שניתן נסע במטרה. יחד עם זאת אנו שגרתי תמונת ארבע בארות שכנות על ידי להישאר קרוב לפינה המשותפת שלהם. הוא לעומת זאת יותר מאתגר לתמונה מספר גדול יותר של בארות. מטרות מים עם מכשירי אוטומטיים עלולות לעקוף בעיה זו על חשבון אובדן קל בבהירות.
זרימת cytometry
איסוף מספר מספיק של תאים הוא בקושי בעיה עם הזרימה cytometers. בדרך כלל ניתן לרכוש 10,000-100,000 תאים בדקה. עם זאת, מכיוון שאין תמונה של tהוא תא שנרכש, חשוב שצריך לבחור אוכלוסיית התא כדי להיות מנותחים. Gating של התאים בהתבסס על מחליקי הצד נמדדו קדימה ויכול לאפשר לבחור תאים בודדים ולא אשכולות של תאים ולהסיר את פסולת תא מהניתוח. באיור 2, כל ההיסטוגרמה מייצגת אוכלוסייה של בערך 5,000 תאים, אשר נבחרו על בסיס מאפייני הפיזור שלהם מהאירועים 10,000 נמדדו.
על ידי שבירת אשכולות של תאים לתאים בודדים, sonication של תרבית התאים הוא דרך נוספת לשיפור איכות הנתונים שנרכשו. זה נכון גם לגבי מיקרוסקופית שבו אשכולות של תאים יכולים להיות קשים מאוד למגזר כמו שצריך. משך הזמן של שלב זה יש לבדוק באופן ניסויי. אנחנו בדרך כלל לבצע שני סבבים של sonication באמבט מים של 30 שניות לדקה ואחריו vortexing של ההשעיה התא. sonication ממושך יכול לגרום תמוגה של כמה תאים. עם זאת, אנחנו לא observe עד ויסות של גנים מגיבים ללחץ בשל צעד זה ניסיוני. שים לב שהצבירה של התאים היא פנוטיפ תלוי רקע, לתאי W303 למשל להציג נטייה חזקה יותר כדי לצבור יותר מאשר תאי S288C.
השתנות במדידות תא בודדות
באיור 3 א, הממוצע וסטיית ההתקן עבור שלושה ניסויים עצמאיים שבוצעו על ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית הוא להתוות. ההבדלים קלים בין שלוש העקומות נובעים מהעובדה שטעויות הניסוי קטנות יחסית למדידות פשוטות ושתאים רבים נמדדים (יותר מ 5,000 לcytometry זרימה, בין 370-550 למיקרוסקופ). ההתפתחות הזמנית של העיקולים מיקרוסקופיה היא חלקה יותר מאשר אחד של נתוני cytometry הזרימה. סיבה סבירה אחת להתנהגות זו היא מדגם תהליך ההכנה. למיקרוסקופיה, כל נקודות הזמן בניסוי כתוצאה מאותו אירוע המתח, ואילו עבורFACS, המדגם עבור כל נקודת זמן הוא הדגיש באופן אינדיבידואלי. שינויים קטנים בהיקף של פתרונות המתח והתרבות יכולים לגרום להבדל קטן בתפוקת ביטוי גנים. אסטרטגיה חלופית אחת תהיה להדגיש 5 מיליליטר תרבות של תאים ולהסיר aliquots בזמנים הרצויים לעכב אותם עם cycloheximide. שני השיטות עובדות היטב, אנו משתמשים בשיטת הכנת microtube כי הוא מציע גמישות רבה יותר וגם הוא מתאים היטב למדידות של מנת תגובה עקומות שבו ריכוזי NaCl מרובים יש למדוד במקביל.
הרעש הנמוך בעקומות בממוצע אלה עם זאת אינו משקף את מגוון רחב של הווה השתנות ברמת התא הבודד. באיור 3 ו3C, היסטוגרמות של הביטוי נמדדה על ידי מיקרוסקופ וcytometry זרימה בנקודת זמן אחת הם זממו. שני פנלים אלה ממחישים היטב את העובדה שהווריאציות טכניות בין משכפל הם קטנות יחסית, especially בהשוואה לשונות הגדולות שנצפו בביטוי של תאים בודדים. ההבדל בצורות של ההתפלגות בין מיקרוסקופיה וcytometry זרימת מדידות נובע מהעובדה שעם cytometry זרימת עוצמת הסלולר הכולל הוא לכמת ואילו בתמונות במיקרוסקופ עוצמת הסלולרית הממוצעת חושבה. ממוצעים זה אחרון מדידת שינויים בגודל תא החוצה, ולכן תוצאות בהפצות צרות יותר.
שתי הטכניקות שהוצגו כאן מאפשרות ללמוד כמותית את התנהגותם של תאים בודדים. תכונה זו היא מוסתר בדרך כלל במדידות ביולוגיות מסורתיות המבוצעות ברמת האוכלוסייה. הבנה כיצד ההשתנות בתגובה של תאים בודדים עולה יכולה להציע תובנות חשובות הרגולציה המורכבת של תהליכים ביולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים למתיאס פיטר וקבוצתו במכון לביוכימיה במכון הטכנולוגי בציריך שבו שיטות אלו פותחו. עבודה זו נתמכה על ידי שוויצרי הקרן הלאומית למדע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 | |
References
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Wu, J. -Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
- Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
- de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100 (2006).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
- Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).
