Quantification temporelle d'expression MAPK induite en simples cellules de levure

Summary

Deux méthodes complémentaires basées sur la cytométrie en flux et la microscopie sont présentées qui permettent la quantification, au niveau de la cellule unique, de la dynamique de l'expression génique induits par l'activation d'une voie de MAPK dans la levure.

Abstract

La quantification de l'expression des gènes au niveau d'une seule cellule découvre les mécanismes de régulation nouveaux occultés dans les mesures effectuées au niveau de la population. Deux méthodes basées sur la microscopie et cytométrie en flux sont présentés pour démontrer comment ces données peuvent être acquises. L'expression d'un rapporteur fluorescent induit lors de l'activation de la voie MAPK glycérol haute osmolarité dans la levure est utilisé comme un exemple. Les avantages spécifiques de chacune de ces méthodes sont mises en évidence. Cytométrie de flux mesure un grand nombre de cellules (10 000) et fournit une mesure directe de la dynamique de l'expression protéique indépendante de la cinétique de maturation lente de la protéine fluorescente. Imagerie des cellules vivantes par microscopie est en revanche limitée à la mesure de la forme mature de la journaliste dans moins de cellules. Cependant, les ensembles de données générées par cette technique peuvent être extrêmement riches grâce à la combinaison de plusieurs journalistes et à l'information spatiale et temporelleobtenu à partir de cellules individuelles. La combinaison de ces deux méthodes de mesure peut offrir de nouvelles perspectives sur la régulation de l'expression de la protéine par des voies de signalisation.

Introduction

La signalisation par l'intermédiaire de cascades de transduction aboutit souvent à l'expression de protéines. La caractérisation de ce profil d'expression est un élément clé dans la compréhension de la fonction des voies biologiques. L'identification du spectre de régulés à la hausse des protéines et la dynamique de leur activation peut être réalisée par diverses techniques telles que les micro-réseaux, des taches ou des taches Nord Ouest ^1-3. Cependant, ces moyens techniques de la réponse d'une population entière de cellules. Pour comprendre la régulation fine de l'expression des protéines, il est souhaitable de recueillir des mesures au niveau de la cellule unique. Idéalement, ces mesures devraient également fournir des données quantitatives se prêtent à développer des modèles mathématiques de la voie sous-jacent.

Microscopie et cytométrie en flux deux techniques, qui sont idéalement adaptés à la diffusion de telles mesures quantitatives de cellules individuelles. Le marquage endogène des protéines avec une protéine fluorescente peut be utilisé pour quantifier le niveau d'expression de ^4. Cependant, étant donné que l'addition d'un grand fragment fluorescent à l'extrémité de la protéine peut rendre non fonctionnel, il est souvent plus souhaitable de générer reporters d'expression spécifiques basés sur un promoteur commandant l'expression d'une construction fluorescent. Cette protéine rapporteur est exogène au système cellulaire et donc n'influence pas les événements de signalisation qui se déroulent dans la cellule.

À la fois la microscopie et la cytométrie en flux ont été largement utilisés dans le domaine de signalisation de la levure. A titre d'exemples, Colman-Lerner et collègues corrélés, dans des cellules individuelles, l'expression de l'accouplement journalistes spécifiques et exprimées de manière constitutive par microscopie à quantifier le bruit dans la levure accouplement transduction du signal cascade ^5, Acar et ses collègues ont utilisé la cytométrie en flux pour étudier le réseau de régulation contrôler l'expression des gènes GAL ^6. Dans une étude précédente ^7, nous avons utilisé un combinatisur ces deux techniques pour étudier la sortie de l'expression de l'osmolarité glycérol élevé (HOG) de la voie dans la levure bourgeonnante. Cette mitogen activated protein kinase (MAPK) est déclenchée par le stress hyper-osmotique. Elle se traduit par l'activation des MAPK Hog1, qui subit une translocation vers le noyau de la cellule pour induire la transcription d'un programme résultant dans l'expression d'approximativement 300 gènes. Pour étudier ce processus, nous avions conçu un journaliste d'expression basé sur le promoteur de STL1 (un gène induit spécifiquement en réponse à l'activité de Hog1 ⁸⁾ entraînant l'expression d'une protéine fluorescente Vénus quadruple (p STL1-qV). La cytométrie en flux des mesures ont découvert la présence de deux populations de cellules au niveau de la tension intermédiaire (0,1 M de NaCl) avec seulement une fraction de la population exprimant le rapporteur fluorescent. Nous avons utilisé la microscopie à approfondir ce comportement et découvert que ce bruit dans l'expression de la protéine a été régie par des facteurs intrinsèques ^9. Nous Could en outre observer que les cellules avec un niveau d'activité similaire Hog1 pourraient afficher de façon saisissante différents résultats d'expression. La combinaison de ces deux techniques nous a permis de montrer comment le remodelage lent des gènes de réponse au stress influencé le résultat de l'expression au niveau d'une seule cellule ^7.

Dans cet article, nous utilisons l'expression de la p-qV STL1 journaliste induite par le choc hyper-osmotique, par exemple, de la quantification de l'expression des protéines par microscopie et cytométrie de flux. La même souche soumis à NaCl 0,2 M de stress a été étudiée avec les deux techniques. Cela nous permettra de mettre en évidence certaines différences clés dans ces deux techniques très complémentaires.

Protocol

Une. Mesures de microscopie

1. Inoculer 5 ml de milieu synthétique avec de la levure.
2. Cultiver des cellules à 30 ° C pendant la nuit.
3. Mesurer la DO ₆₀₀ de la culture pendant une nuit, le lendemain matin.
4. Diluer culture d'une nuit dans 5 ml de milieu synthétique OD ₆₀₀ 0,05.
5. Cultiver la culture diluée à 30 ° C pendant au moins 4 heures.
6. Préparer trois fois concentré (0,6 M) une solution de NaCl dans un milieu synthétique.
7. Préparer une solution à 1 mg / ml de concanavaline de A (ConA) dans du PBS.
8. Filtrat ~ 200 pi de solution ConA dans la glissière de bien.
9. Laisser reposer pendant 30 min.
10. Retirer la solution ConA.
11. Ajouter 150 ul de H ₂ O dans le puits.
12. Retirer H ₂ O.
13. Mesurer la DO ₆₀₀ de la culture cellulaire.
14. Préparer 300 pl de culture cellulaire à _DO600 = 0,02 dans un microtube de 1,5 ml.
15. Soniquer les cellules dans un bain d'eau pendant 45 sec.
16. Vortex brièvement la microtube.
17. Soniquer les cellules dans un bain d'eau pendant 45 sec.
18. Vortex brièvement le microtube.
19. Ajouter 200 ul de la culture de cellules dans le puits.
20. Attendre 30 minutes pour laisser les cellules se déposent au fond du puits.
21. Placer la lame de bien sur le microscope.
22. Sélectionnez les réglages de l'éclairage pour le canal de fluorescence à enregistrer.
23. Sélectionnez les paramètres d'éclairage pour deux images de fond clair (un peu hors-sujet: 3 um ci-dessous le plan focal pour permettre une segmentation correcte des cellules).
24. Sélectionnez les intervalles de temps pour la mesure time-lapse
25. Sélectionnez les champs de vue de l'image.
26. Lancement de l'acquisition de quelques images.
27. Pause de l'acquisition d'ajouter les 100 ul de 0,6 M de NaCl moyen.
28. Reprendre imagerie.

2. Les mesures de cytométrie en flux

1. Inoculer 5 ml de milieu synthétique avec de la levure.
2. Croître à 30 ° C pendant la nuit.
3. Mesurela _DO600 de la culture pendant une nuit, le lendemain matin.
4. Diluer culture d'une nuit dans 5 ml de milieu synthétique DO ₆₀₀ de 0,1.
5. Croître à 30 ° C pendant au moins 4 heures pour atteindre une _DO600 de 0,2-0,4.
6. Préparer la solution de cycloheximide 1 mg / ml dans H ₂ O.
7. Préparer trois fois concentré (0,6 M) une solution de NaCl dans un milieu synthétique.
8. Préparer un microtube de 1,5 ml avec 100 ul de 0,6 M de NaCl moyen pour chaque point de temps pour être mesurés.
9. Au temps 0, ajouter 200 ul de la culture de cellules à chaque microtube.
10. Incuber sous agitation à 30 ° C.
11. A l'instant T, ajouter 30 ul de cycloheximide à un microtube.
12. Répéter l'étape 2.11 pour tous les points de temps désirés.
13. Incuber les microtubes pendant au moins 45 minutes et jusqu'à 3 heures à 30 ° C avec agitation par secousses.
14. Préparer des tubes FACS avec 400 ul de PBS.
15. Soniquer les cellules dans un bain d'eau pendant 1 min.
16. Vortex brièvement les microtubes.
17. Filsicat les cellules dans un bain d'eau pendant 1 min.
18. Vortex brièvement les microtubes.
19. Ajouter 100 ul de culture cellulaire de chaque microtube à son tube FACS correspondant.
20. Sélectionnez le laser d'excitation de 488 nm et 530/30 nm filtre passe-bande pour la détection.
21. Test de non-expression et exprimer pleinement échantillon pour vérifier si elles tombent dans la plage de sensibilité de détection.
22. Mesurer 10.000 cellules pour chaque échantillon acquis.

Representative Results

Microscopie

Les cellules de levure portant l'expression reporter p STL1-qV (ySP9 ⁷⁾ ont été fixées au fond de la diapositive et bien placés sous le microscope. Les cellules ont été stimulées par l'addition de milieu de contrainte directement dans le puits au cours de la session d'imagerie. Cela nous permet d'acquérir quelques images des cellules avant l'induction voie et suivons leur sort après la stimulation. Dans le cas présent, les cellules ont été suivis pendant ~ 2 heures avec un intervalle de temps de 10 min. Figure 1A est une image de cellules non fluorescentes avant l'induction et la figure 1B présente les mêmes cellules 2 h après le stress quand le journaliste d'expression a été induite et est devenu fluorescent.

Pour extraire les informations quantitatives présent dans ces images, un procédé d'analyse d'image complexe doit être effectuée. Il comprend la segmentation des cellules pour définir des objets dans l'image, le suivi de ces objets à partir d'une trame à la suivante et les mesures des caractéristiques de ces objets (forme et l'intensité propriétés). Nous avons développé notre propre plate-forme nommée YeastQuant pour effectuer cette analyse ^10. Quelques autres logiciels non-commerciaux sont disponibles pour effectuer les tâches suivantes:. CellProfiler ^11, CellID ¹² ou ¹³ CellX figure 1C affiche les résultats d'une analyse réalisée avec YeastQuant. Chaque trace rouge représente l'évolution temporelle de l'intensité de fluorescence moyenne d'une cellule unique. La ligne bleue affiche la médiane de plus de 500 cellules qui ont été segmentées et suivis tout au long des 20 cadres de cinq films time-lapse acquis de cinq différents domaines de vues de la même bien. La zone bleu clair représente le 25e percentile et le 75e de tous les intensités mesurées à un instant donné.

Cytométrie en flux

Pour la measurem de cytométrie en fluxents, la culture de cellules a été déversée dans des microtubes contenant le milieu de stress. Pour étudier l'évolution temporelle de la p STL1-qV expression, la traduction a été inhibée à différents points de temps (5 à 10 minutes d'intervalle) avec cycloheximide (figure 2). Ce médicament bloque la synthèse de nouvelles protéines, mais la maturation de la protéine fluorescente déjà exprimé n'est pas perturbé. Par conséquent, après 45 minutes à une heure d'incubation, les cellules peuvent être mesurés dans le cytomètre en flux qui permet la quantification de la quantité de protéine produite au moment de l'addition de cycloheximide. Cette stratégie évite le problème de la maturation de la protéine fluorescente et quantifie la véritable dynamique de la synthèse des protéines fluorescentes de ce fait.

La comparaison des deux techniques

La figure 3A compare la dynamique de l'expression de rapporteur mesurées par microscopie et cytométrie de flux. Alors que le signal fluorescent commence à monter 30-40minutes après le stress de microscopie, les mesures de cytométrie de flux prouvent clairement que les protéines sont déjà produites entre 10 à 15 minutes après le stimulus. Ce retard demi-heure est dû à la lente maturation des protéines fluorescentes ^14. Bien que les deux méthodes de quantifier l'intensité de fluorescence des cellules, il faut garder à l'esprit que dans cette étude, ils ne mesurent pas le même processus biologique. Alors que, à la microscopie en résulte l'apparition du signal de fluorescence, la cytométrie de flux permet de quantifier en fait la synthèse de la protéine. Il est essentiel de tenir compte de cette étape de maturation lors de l'exécution imagerie des cellules vivantes. Dans une situation où une protéine endogène est marqué avec une protéine fluorescente, la protéine endogène est exprimée et active avant la fluorescence de la balise puisse être détectée.

Comme indiqué plus haut, les deux techniques fournissent des informations complémentaires. La cytométrie de flux permet de mesurer un grand nombre de cellules très rapidement (10 000 ou plus). Il peut donc livrer statistiquement riches ensembles de données où deux populations se chevauchent peuvent être identifiés ou quelques événements rares peuvent être observées. Microscopie fournit des informations sur un nombre limité de cellules (de l'ordre de 100). Cependant, parce que cet ensemble de données contient des informations temporelles et spatiales et permet la corrélation de plusieurs mesures dans la même cellule, il peut donner des indications très précieuses sur le processus biologique étudié.

Figure 1. Mesure de l'expression de journaliste par microscopie. A et B. Images de cellules portant l'expression fluorescent reporter p STL1-qV avant (A) et 2 h après stimulation avec 0,2 M de NaCl (B). C. Évolution dans le temps de la grippe orescence apparition. Les courbes rouges représentent l'intensité moyenne de quelques traces simples cellulaires représentatives de fluorescence cellulaire. La courbe bleue représente la fluorescence médiane de 550 traces de cellules individuelles. La zone bleu clair représente le 25e percentile et le 75e de l'expression de fluorescence de la population de cellules à chaque point de temps. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2. Mesure de l'expression du reporteur par cytométrie de flux. Histogrammes de la fluorescence cellulaire de cellules portant l'expression reporter fluorescent STL1 p-qV traitée avec 0,2 M de NaCl et avec du cycloheximide inhibe à différents points dans le temps.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3. La comparaison de la dynamique d'expression mesurées par microscopie et cytométrie de flux. A. moyenne de l'intensité de fluorescence mesurée par cytométrie de flux (trait plein) et la microscopie (ligne pointillée) en fonction du temps pour trois répétitions biologiques. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. B et C. histogrammes de l'intensité de fluorescence normalisée à 120 min après un stress pour la microscopie (B) et 60 min après le stress de la cytométrie de flux (C) pour les trois répétitions. Cliquez ici pouragrandir l'image.

Discussion

Microscopie

Le traitement des puits avec de la ConA est une étape essentielle pour assurer une imagerie appropriée des cellules. Parce que la ConA a une faible solubilité dans du PBS (5 mg / ml), le procédé de filtration permet l'élimination des gros agrégats qui sont présents dans la solution filtrée et interfèrent avec la formation d'image. Les cellules se fixent relativement fortement à la surface traitée et l'addition de la solution ne doit pas perturber l'induction de la localisation des cellules, ce qui permet un suivi en continu avant et après le stimulus. Ce traitement peut également être appliqué à l'écoulement des canaux ou des dispositifs microfluidiques ont été les cellules sont soumises à un flux constant de ^7,15. Si le puits n'est pas correctement rincé à l'eau après le traitement, les cellules n'adhèrent pas correctement à la vitre, sans doute parce que la ConA se lie en solution directement dans les cellules et les empêche de former une liaison solide à la surface du verre. Après l'étape de lavage, le puits peut rester sec pour les 3 -4 heures avant l'addition des cellules sans affecter sensiblement la fixation des cellules sur le verre.

Le choix du temps d'exposition pour le canal de fluorescence est un paramètre critique pour le succès de l'expérience. Étant donné que la fluorescence de la cellule va augmenter tout au long de la time-lapse, il est important de tester au préalable avec un échantillon induit ce qui est le temps d'exposition maximal qui peut être utilisé pour éviter la saturation de l'image lors de l'acquisition. Un autre paramètre à prendre en considération lors du choix de la durée d'exposition est le blanchiment du signal fluorescent. Pour chaque échantillon, on doit trouver un compromis entre la luminosité de l'image et de la dégradation du signal due au blanchissement pendant la time-lapse. L'intervalle de temps entre chaque acquisition influence également fortement le blanchiment du fluorophore. Puisque l'expression de la protéine est un processus relativement lent, nous utilisons généralement 10-15 min. intervalles. Si d'autres processus plus rapides doivent être followed parallèlement à l'expression de la protéine, il pourrait être souhaitable d'utiliser des pas de temps à travers tout le film en time-lapse (1-2 min au début et à 5-15 min pour les acquisitions ultérieures).

Le contrôle de la densité de cellules est un paramètre essentiel à prendre en compte. Si la densité est trop faible, seulement un petit nombre de cellules seront présents dans chaque champ de vue obtenue dans les statistiques médiocres pour l'ensemble de données. Cependant, si la densité est trop élevée, il pourrait entraver la segmentation, le suivi et la quantification des cellules, ce qui rend difficile l'extraction de l'information désirée à partir des images. Pour déterminer la densité d'ensemencement, un paramètre supplémentaire à prendre en compte est la durée de l'expérience. Si une expérience dure plusieurs cycles de division, il est conseillé de commencer avec un champ clairsemée de vue qui va progressivement remplir au cours du temps de l'imagerie en raison de la division des cellules et à s'installer de cellules en solution. Dans le protocole, nous vous conseillons d'utiliserune _DO600 de 0,02, selon le type d'expérience que nous effectuons, nous utilisons OD ₆₀₀ de 0,05 pour les films en accéléré courtes à 0,005 pour les plus longues.

Le nombre de cellules analysées est évidemment un paramètre clé pour la validité de l'expérience. Parfois aussi peu que 20-30 cellules sont combinés pour générer un ensemble de données. Toutefois, afin de commencer à avoir des ensembles de données statistiquement significatives, une centaine de cellules ou plus sont probablement nécessaires. Le grossissement de l'objectif détermine la taille de la zone imagée et ainsi le nombre de cellules imagées. Pour les mesures d'expression de protéines, dont l'objectif est de mesurer la fluorescence moyenne de la cellule, un objectif de haute immersion ouverture de 40X numérique est la meilleure solution assurant à la fois bon rapport signal sur bruit et un grand champ de vision. Si les structures sous-cellulaires doivent être analysés, plus forts grossissements (objectifs 60X ou 100X) sont souvent nécessaires, résultant dans la mesure du moins de cellules. L'avènement des OCMS caméras avec une taille de détecteur près de quatre fois plus grande que celle des CCD classique est clairement un avantage pour obtenir plus de cellules par champ de vue.

Avec un étage XY motorisée, il est possible de l'image en plusieurs zones parallèles de vue d'accroître le nombre de cellules dans l'ensemble de données final. Cependant, il est un compromis entre le nombre de postes XY visités et la vitesse de l'acquisition de l'image. Selon la vitesse de la scène et le nombre d'illuminations enregistrées, il est généralement possible de l'image dix postes en moins d'une minute. Pour quantifier les événements de signalisation rapide, cela peut devenir un facteur limitant. Pour les mesures d'expression de protéine, où se produisent des changements de fluorescence sur une échelle de temps plus lente, il n'est généralement pas une limitation. Alternativement, parce que ces expériences d'expression durent pendant quelques heures et en raison de la résolution temporelle lente nécessaire, il devient avantageux d'images multiples échantillons en parallèle. Plusieurs puits voisins can être ensemencé avec de type sauvage et des cellules mutantes, stimulus différent peut être appliqué à chaque bien ou répétitions biologiques peut être mesurée en parallèle. Balayage de tous les puits d'une plaque de 96 puits est habituellement réalisé avec l'objectif de l'air pour les écrans de microscopie ^16. En raison de la faible abondance des protéines endogènes de la levure, leur quantification nécessite un objectif de l'huile avec une ouverture numérique élevée. Ce qui limite considérablement la plage qui peut être parcourue avec l'objectif. Néanmoins, nous routinière images quatre puits voisins en restant près de leur coin commun. Il est cependant plus difficile à l'image d'un grand nombre de puits. objectifs d'eau avec les distributeurs automatiques peuvent contourner ce problème, au détriment d'une petite perte de luminosité.

La cytométrie de flux

Recueillir un nombre suffisant de cellules n'est guère un problème avec cytomètres. Typiquement 10.000-100.000 cellules peuvent être acquis en une minute. Cependant, parce que pas d'image de til cellule est acquis, il est important de sélectionner correctement la population cellulaire à analyser. Déclenchement des cellules sur la base des disperse latérales mesurées avant et peut permettre de sélectionner des cellules individuelles plutôt que des amas de cellules et à éliminer les débris cellulaires à partir de l'analyse. Dans la figure 2, chaque histogramme représente une population d'environ 5000 cellules, qui ont été sélectionnés en fonction de leurs propriétés de diffusion des 10 000 événements mesurés.

En cassant des amas de cellules en cellules individuelles, la sonication de la culture cellulaire est un moyen supplémentaire pour améliorer la qualité des données acquises. Cela est vrai pour la microscopie où des amas de cellules peuvent être très difficiles à segmenter correctement. La durée de cette étape doit être testée expérimentalement. Nous effectuons habituellement deux cycles de sonication dans un bain d'eau de 30 secondes à une minute, suivie par tourbillonnement de la suspension de cellules. Sonication prolongée peut conduire à la lyse de quelques cellules. Cependant, nous n'avons pas observe une régulation des gènes sensibles au stress dû à cette étape expérimentale. A noter que l'agrégation des cellules est un phénotype dépendant de fond, pour les cellules W303 d'instance présentent une plus forte tendance à s'agréger que les cellules S288C.

La variabilité des mesures de cellules uniques

Sur la figure 3A, la moyenne et l'écart type pour trois expériences indépendantes effectuées par cytométrie en flux et la microscopie est tracée. Les différences mineures entre les trois courbes résultent du fait que les erreurs expérimentales sont relativement faibles pour ces mesures simples et que de nombreuses cellules sont mesurées (plus de 5000 pour la cytométrie en flux, la microscopie à entre 370 à 550). L'évolution dans le temps des courbes de microscopie est plus lisse que celle des données de cytométrie de flux. Une raison probable de ce comportement est le processus de préparation de l'échantillon. Pour la microscopie, tous les points temporels dans une expérience résultent de la même épreuve d'effort, alors que pourFACS, l'échantillon pour chaque point de temps est souligné individuellement. De petites variations de volume des solutions de stress et de culture peuvent se traduire par une légère différence de la sortie de l'expression génique. Une autre stratégie consisterait à souligner 5 ml de culture de cellules et de supprimer aliquotes aux moments voulus pour les empêcher de cycloheximide. Les deux méthodes fonctionnent bien, nous utilisons la méthode de préparation de microtubes, car il offre plus de souplesse et est également bien adapté pour les mesures de courbes dose-réponse où les concentrations de NaCl multiples doivent être mesurées en parallèle.

Le faible niveau de bruit dans ces courbes moyennes mais ne reflète pas la gamme complète de la variabilité présente au niveau de la cellule unique. Sur la figure 3B et 3C, les histogrammes de l'expression mesurée par cytométrie en flux et la microscopie à un point dans le temps sont représentées graphiquement. Ces deux panneaux illustrent bien le fait que les variations techniques entre les répétitions sont relativement faibles, spécially par rapport à la grande variabilité observée dans l'expression de cellules individuelles. La différence dans les formes de la distribution entre la microscopie et la cytométrie de flux mesure provient du fait que la cytométrie en flux avec l'intensité cellulaire total est quantifié alors que dans les images de microscopie cellulaire de l'intensité moyenne a été calculée. Ce dernier moyennes de mesure sur les variations de la taille des cellules et entraîne donc des distributions plus étroites.

Les deux techniques présentées ici permettent d'étudier quantitativement le comportement de cellules individuelles. Cette fonction est généralement caché dans les mesures biologiques traditionnelles réalisées au niveau de la population. Comprendre comment la variabilité de la réponse des cellules individuelles émerge peut donner des indications importantes sur la réglementation complexe de processus biologiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Yeast Nitrogen Base	ForMedium	CYN6202
CSM amino-acid mix	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
Cycloheximide	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Toxic
ySP9			W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope	Nikon	Ti-Eclipse
Microscope control software	Micro-manager	Ver 1.4.11
Incubation chamber	LIS	The Box
Fluorescence light source	Lumencor	SpectraX
Camera	Hamamatsu	Flash 4.0
Flow cytometer	BD	FACS calibur
Sonicator bath	Telesonic	TUC-150
8-well-slide	Thermo Lab-tek	155409
96-well-plate	Matrical bioscience	MGB096-1-2-LG
FACS tube	BD Falcon	352054