Summary
유동 세포 계측법 및 현미경에 따라 두 개의 보완적인 방법은 효모에서 MAPK 경로의 활성화에 의해 유도되는 유전자 발현의 역학의 단일 세포 수준에서 정량을, 가능하게하는 표시됩니다.
Abstract
단일 세포 수준에서의 유전자 발현의 정량화는 집단 수준에서 수행되는 측정에 가려진 신규 규제 메커니즘을 폭로. 두 가지 방법 현미경을 기반으로 유동 세포 계측법은 이러한 데이터를 취득 할 수있는 방법을 보여주기 위해 제공됩니다. 효모에서 고 삼투압 글리세롤 MAPK 경로의 활성화시에 유도 된 형광 리포터의 발현은 예로서 사용된다. 각 방법의 구체적인 장점은 강조 표시됩니다. 계측법 다수의 셀 (10000)을 측정하고 형광 단백질의 성숙 느린 동역학 독립적 단백질 발현의 역학의 직접적인 측정을 제공 흐른다. 현미경으로 살아있는 세포의 영상이 적은 세포에서 기자의 성숙 형태의 측정에 한정 대조적입니다. 그러나,이 기술에 의해 생성 된 데이터 세트는 여러 기자의 조합 및 시공간 정보에 매우 풍부 감사 될 수각각의 세포에서 얻은. 이 두 가지 측정 방법의 조합은 신호 전달 경로에 의해 단백질 발현의 조절에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
Introduction
전달 폭포를 통해 신호는 종종 단백질의 발현에 절정. 이 발현 프로파일의 특성화는 생물학적 경로의 기능을 이해하는데 중요한 요소이다. 위로 통제 단백질과 그들의 활성화의 역학의 스펙트럼의 식별은 마이크로 어레이, 북부 오 또는 서부 오 1-3와 같은 다양한 기술에 의해 달성 될 수있다. 그러나, 이러한 기술은 세포의 전체 모집단의 응답을 평균. 단백질 발현의 미세 조절을 이해하기 위해, 단일 세포 수준에서 측정을 수집하는 것이 바람직하다. 이상적으로, 이러한 측정은 기본 경로의 수학적 모델을 개발하는 의무가 정량적 데이터를 제공해야합니다.
현미경 및 유동 세포 계측법 이상적으로 이러한 양적 단일 세포 측정을 제공하기 위해 적합한 두 가지 기술이다. 형광 단백질과 단백질의 내생 태그는 B 수전자 발현 레벨 4를 정량화하는 데 사용됩니다. 단백질의 말단에 큰 형광 부분의 첨가는 비 기능을 렌더링 할 수 있기 때문에 그러나, 형광 구조체의 발현을 구동 프로모터에 따라 특정 식 기자를 생성하는 것이 더욱 바람직하다. 이 기자의 단백질은 셀룰러 시스템에 외생 적이며, 따라서 세포에서 일어나고있는 신호 이벤트에 영향을주지 않습니다.
현미경 및 유동 세포 계측법 모두 널리 효모 신호 분야에서 사용되어왔다. 예로서, 콜먼 - 러너와 동료는 상관 관계, 하나의 세포, 효모 짝짓기 신호 전달 캐스케이드 5의 노이즈를 정량화하기 위해 현미경으로 구체적이고 구조적으로 표현 기자 짝짓기의 표현, ACAR 및 규제 네트워크를 연구하는 유동 세포 계측법을 사용하는 동료 GAL 6 유전자의 발현을 제어한다. 이전 연구 7에서, 우리는 combinati을 사용했습니다높은 삼투압 글리세롤 효모 신진에서 (HOG) 경로에서 표현의 출력을 연구하는이 두 기술에. 이 미토 겐 활성화 단백질 키나제 (MAPK) 경로는 하이퍼 삼투압 스트레스에 의해 트리거된다. 그것은 약 300 유전자의 발현 결과 전사 프로그램을 유도하는 세포의 핵으로 옭 Hog1 MAPK의 활성화를 초래한다. 이 과정을 연구하기 위해, 우리는 배 금성 형광 단백질 (P의 STL1-QV)의 발현을 구동 STL1 프로모터 (Hog1 활동 8에 대한 응답으로 구체적으로 유도하는 유전자)를 기반으로 식 기자를 설계했다. 측정은 형광 기자를 표현하는 인구의 비율과 중간 스트레스 수준 (0.1 M의 NaCl)에서 세포의 두 집단의 존재를 발견 유동 세포 계측법. 우리는 더 이상이 문제를 조사하기 위해 현미경을 사용하고 단백질 발현이 노이즈가 고유 요인 (9)에 의해 지배 된 것을 발견했다. 우리는 기LD 더욱 Hog1 활동의 유사한 수준의 세포가 현저하게 상이한 발현 결과를 표시 할 수 있다는 것을 관찰한다. 이 두 기술의 조합은 우리가 스트레스 반응 유전자의 느린 리모델링이 하나의 셀 레벨 7의 발현 결과에 영향을 방법을 설명 할 수있었습니다.
이 논문에서, 우리는 현미경에 의한 단백질 발현의 정량의 예를 들어 하이퍼 삼투 충격에 의해 유도 된 P STL1-QV 기자의 표현을 사용하고 유동 세포 계측법. 0.2 M의 NaCl 스트레스 대상이 같은 변형은 두 가지 방법으로 연구 하였다. 이것은 우리가 이러한 상호 보완적인이 두 기술의 몇 가지 주요 차이점을 강조 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 현미경 측정
- 효모와 합성 배지 5 ㎖를 접종한다.
- 하룻밤 30 ° C에서 세포를 성장.
- 다음날 아침 밤새 문화의 OD 600을 측정합니다.
- 600 0.05 과다 복용 5 ㎖ 합성 배지에서 하룻밤 문화를 희석.
- 최소 4 시간 동안 30 ° C에서 희석 문화를 성장.
- 준비 3 배 합성 배지 (0.6 M) NaCl 용액 집중.
- PBS에서 인 Concanavalin A (CONA)의 1 ㎎ / ㎖의 솔루션을 준비합니다.
- 여과 액 ~ 잘 슬라이드에 CONA 용액 200 μL.
- 30 분 동안 서 보자.
- CONA 솔루션을 제거합니다.
- 웰에 150 μL의 H 2 O를 추가합니다.
- H 2 O를 제거
- 세포 배양의 OD 600을 측정합니다.
- 1.5 ml의 마이크로 튜브에 = 0.02 OD 600에서 세포 배양의 300 μl를 준비합니다.
- 45 초 동안 수욕에서 초음파 처리 셀.
- 소용돌이 짧게 마일crotube.
- 45 초 동안 수욕에서 초음파 처리 셀.
- 간단히 소용돌이 모세관.
- 우물에 세포 배양 200 μl를 추가합니다.
- 세포가 우물의 바닥에 정착하도록 30 분을 기다립니다.
- 현미경에 잘 슬라이드를 놓습니다.
- 기록 될 채널에 대한 형광 조명 세팅을 선택한다.
- (: 세포의 적절한 분할 수 있도록 초점면 아래의 3 μm의 약간 초점의 하나) 두 명 시야 이미지의 조명 설정을 선택합니다.
- 시간 경과 측정 시간 간격을 선택
- 이미지 뷰의 필드를 선택합니다.
- 몇 프레임의 인수를 시작합니다.
- 0.6 M의 NaCl 매체의 100 μl를 추가 인수를 일시 중지합니다.
- 영상을 다시 시작합니다.
2. 유동 세포 계측법 측정
- 효모와 합성 배지 5 ㎖를 접종한다.
- 하룻밤 30 ° C에서 성장.
- 측정OD 하룻밤 문화의 600 다음날 아침.
- 600 0.1 과다 복용 5 ㎖ 합성 배지에서 하룻밤 문화를 희석.
- OD 0.2 ~ 0.4의 600에 도달하기 위해 최소 4 시간 동안 30 ° C에서 성장.
- H 2 O에서 사이클로 헥시 미드 용액을 1 ㎎ / ㎖를 준비
- 준비 3 배 합성 배지 (0.6 M) NaCl 용액 집중.
- 측정 할 때마다 포인트 0.6 M의 NaCl 매체의 100 μL와 하나의 1.5 ML 마이크로 튜브를 준비합니다.
- 시간 0에서, 각각의 마이크로 튜브에 세포 배양 200 μl를 추가합니다.
- 30 ℃에서 진탕 배양한다
- 시간 t에서, 마이크로 튜브에 30 μL의 사이클로 헥시 미드를 추가합니다.
- 원하는 모든 시점에 2.11 단계를 반복합니다.
- 적어도 45 분 동안 모든 마이크로 튜브를 품어 떨고와 30 ° C에서 최대 3 시간.
- 400 ㎕의 PBS와 FACS 튜브를 준비합니다.
- 1 분 동안 수욕에서 초음파 처리 셀.
- 간단히 소용돌이 모세관.
- 아들1 분 동안 수욕 세포 icate.
- 간단히 소용돌이 모세관.
- 각 모세관에서의 대응 FACS 튜브에 100 ㎕의 세포 배양을 추가합니다.
- 검출을위한 488 nm의 여기 레이저와 30분의 530 nm의 대역 통과 필터를 선택합니다.
- 테스트가 아닌 표현과 완전히 그들이 검출기 감도 범위에 빠지고 있는지 확인하기 위해 샘플을 표현.
- 획득 한 각 샘플에 대한 10,000 세포를 측정한다.
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Representative Results
현미경 사용
발현 리포터 P STL1-QV (ySP9 7) 베어링 효모 세포는 잘 슬라이드 하단에 부착되고, 현미경하에 넣었다. 세포 이미징 세션 도중에 직접 우물에 응력 매체의 첨가에 의해 자극 하였다. 이것은 우리가 통로 유도하기 전에 세포의 몇 가지 이미지를 획득하고 자극 후 자신의 운명을 수행 할 수 있습니다. 본 경우에, 세포를 10 분의 시간 간격으로 1 ~ 2 시간 동안 관찰 하였다.도 1a는 유도 및도 1b 전에 비 - 형광 세포의 이미지가 발현 리포터가 가지는 2 시간 스트레스 후에 동일한 셀에게 표시 유도 된 형광되고있다.
이러한 이미지에 존재하는 정량적 정보를 추출하기 위해 복잡한 이미지 분석 처리가 수행되어야한다. 그것은 I의 객체를 정의하는 세포의 분할을 포함한다마법사, 다음에 하나의 프레임에서 이러한 객체의 추적 및 이러한 개체 (모양과 강도 특성)의 기능을 측정. 우리는이 분석 (10)을 수행 할 YeastQuant라는 우리 자신의 플랫폼을 개발했다. 몇 가지 다른 비 상업용 소프트웨어가 이러한 작업을 수행 할 수 있습니다. CellProfiler 11, 12 CellX 13 CellID 그림 1C는 YeastQuant 수행 분석 결과를 표시합니다. 각 적색 트레이스는 단일 세포의 평균 형광 강도의 시간적 변화를 나타낸다. 파란색 선은 같은 잘에서 전체의 다섯 가지 분야에서 획득 한 다섯 시간 경과 영화의 20 프레임에 걸쳐 분할 및 추적 된 500 개 이상의 세포의 평균을 표시합니다. 밝은 파란색 영역은 주어진 시점에서 측정 된 모든 농도의 25 및 75 번째 백분위 수를 나타냅니다.
유동 세포 계측법
유동 세포 계측법하는 측량을위한엔트, 세포 배양은 응력 매체를 포함하는 마이크로 튜브에 흘렸는. P STL1-QV 식의 시간적 진화를 연구하기 위해, 번역은 사이클로 헥시 미드와 다른 시점 (5 ~ 10 분 간격) (그림 2)에서 억제되었다. 이 약물 블록은 새로운 단백질의 합성,하지만 이미 표현 된 형광 단백질의 성숙이 교란되지 않습니다. 따라서, 배양 1 시간 45 분 후, 세포를 사이클로 헥시 미드의 첨가시 생성 된 단백질의 양의 정량화를 허용 흐름 cytometer로 측정 할 수있다. 이 전략은 형광 단백질 성숙의 문제를 우회시켜 형광 단백질 합성의 진정한 역학을 정량화한다.
두 가지 방법의 비교
도 3a는 식 기자의 역학 현미경으로 측정 및 유동 세포 계측법을 비교합니다. 형광 신호는 30 ~ 40를 상승하기 시작하면서분 현미경과 스트레스 후, 유동 세포 계측법 측정은 명확하게 단백질이 이미 자극 한 후 10 ~ 15 분 사이에 생산 된 것을 증명. 이 반 시간 지연은 형광 단백질 (14)의 느린 성숙에 기인한다. 두 방법 모두 세포의 형광 강도를 정량화 있지만, 하나는이 연구에서, 그들은 같은 생물학적 과정을 측정하지 않는 것을 명심해야한다. 하지만, 현미경이 형광 신호의 발현을 다음, 유동 세포 계측법은 실제로 단백질의 합성을 정량화한다. 그것은 라이브 세포 이미징을 수행 할 때 계정에이 성숙 단계를 수행하는 것이 필수적입니다. 해당 태그의 형광 검출 할 수있다 전에 내인성 단백질이 형광 단백질 태그 된 상황에서, 내인성 단백질 발현 및 활성화됩니다.
상기 한 바와 같이, 두 기술이 상호 보완적인 정보를 제공하고 있습니다. (매우 빠르게 다수의 셀을 측정 할 수있는 유세포10,000 이상). 따라서 두 개의 중복 인구가 식별 할 수 있습니다 또는 몇 드문 이벤트를 관찰 할 수있다 통계적으로 풍부한 데이터 세트를 제공 할 수 있습니다. 현미경 (100 정도의) 셀들의 한정된 수에 대한 정보를 제공한다. 이 데이터 세트는 공간적 정보를 포함하고 동일한 셀의 다수의 측정의 상관 관계를 허용하기 때문에 그러나, 조사 생물학적 과정에 매우 가치있는 통찰을 제공 할 수있다.
그림 1. 현미경으로 기자의 표현의 측정. 0.2 M의 NaCl (B). C와 자극 후 (A)와 2 시간 전에 형광 발현 기자 P STL1-QV 베어링 세포와 B. 이미지. 독감의 시간 코스 orescence 유령. 적색 곡선은 몇몇 대표적인 단일 세포 트레이스 보통 셀룰러 형광 강도를 나타낸다. 파란색 곡선은 550 단일 셀 트레이스의 평균 형광을 나타낸다. 밝은 파란색 영역은 각 시점에서의 세포 인구의 형광 발현의 25와 75 백분위 수를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 유동 세포 계측법에 의해 기자의 표현의 측정. 서로 다른 시간 지점에서 0.2 M의 NaCl 및 사이클로 헥시 미드와 억제 치료 형광 발현 기자 P STL1-QV 베어링 세포의 세포 형광의 히스토그램.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 현미경으로 측정 및 유동 세포 계측법 표현 역학의 비교. 형광 강도의 A. 평균 세 생물은 복제에 대한 시간의 함수로 유동 세포 계측법 (실선) 및 현미경 (점선)로 측정. 오차 막대는 현미경에 대한 스트레스 (B)와 세 개의 반복을위한 유동 세포 계측법 (C)에 대한 스트레스 후 60 분 후 평균. B와 120 분의 정규화 된 형광 강도의 C. 히스토그램의 표준 오차를 나타냅니다. 여기를 클릭하여큰 이미지를 볼 수 있습니다.
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Discussion
현미경 사용
CONA와 잘 치료는 세포의 적절한 이미징을 보장하는 필수 단계이다. CONA은 PBS (5 ㎎ / ㎖)에서 낮은 용해도를 갖기 때문에, 여과 처리 수는 여과되지 않은 용액에 존재하고 촬상 방해 큰 응집물의 제거. 세포는 처리 된 표면에 비교적 강하게 부착하고 유도 용액의 첨가는 자극 전후 지속적인 추적을 허용 세포의 현지화를 방해해서는 안된다. 세포는 정 유량 7,15을 실시 하였다이 치료는 또한 마이크로 유체 소자 채널 또는 흐름에 적용될 수있다. 확실히이 제대로 처리 후에 물로 세정하지 않으면 용액 CONA이 세포에 직접 결합 및 유리 표면에 강한 결합을 형성하는 것을 방해 아마도 때문에, 세포는 유리에 적절히 부착되지 것이다. 세척 단계 후, 잘은 3 건조 남아있을 수 있습니다 -띄게 유리 세포의 결합에 영향을주지 않고 세포를 첨가하기 전에 4 시간.
형광 채널에 대한 노출 시간의 선택은 실험의 성공을위한 중요한 설정이다. 셀의 형광이 시간 경과에 걸쳐 증가하기 때문에, 취득시 화상 포화를 피하기 위해 사용될 수있다 최대 노광 시간에 무엇 유도 샘플 미리 테스트하는 것이 중요하다. 노출 시간을 선택할 때 고려해야하는 또 다른 매개 변수는 형광 신호의 표백입니다. 각 샘플은 한 시간 경과시에 의한 표백 신호의 화상 열화의 밝기 사이의 절충을 찾을 수있다. 각 획득 사이의 시간 간격은 또한 강하게 형광의 표백에 영향을 미친다. 단백질 발현이 상대적으로 느린 과정이기 때문에, 우리는 일반적으로 10 ~ 15 분을 사용합니다. 간격. 다른 더 빠른 프로세스는 f를해야하는 경우단백질 발현에 병렬로 ollowed, 그것은 전체 시간 경과 영화 (나중에 인수의 시작과 5 ~ 15 분에서 1-2 분)에 걸쳐 서로 다른 시간의 단계를 사용하는 것이 좋습니다 수 있습니다.
세포 밀도의 제어가 고려해야 할 중요한 매개 변수입니다. 농도가 너무 낮 으면, 단 몇 셀은 데이터 세트에 대해별로 통계 결과 뷰의 각 필드에 존재한다. 농도가 너무 높은 경우에는 그것이 어려울 이미지로부터 원하는 정보를 추출하기 위해 만들어 세분화, 추적 및 세포의 정량을 방해 할 수 있습니다. 파종 밀도를 결정하기 위해 고려해야 할 하나의 추가적인 파라미터는 실험 기간이다. 실험은 여러 부문 사이클 지속하면 점차적으로 인해 세포의 분열과 솔루션에있는 세포의 정착에 영상의 시간 과정 채울 것보기의 스파 스 필드로 시작하는 것이 좋습니다. 프로토콜에서, 우리는 사용하는 것이 좋습니다우리는 우리가 더 이상 사람을 위해 0.005에 짧은 시간 경과 영화에 0.05 OD (600)를 사용하여 수행하는 실험의 종류에 따라 0.02의 OD 600.
분석 된 세포의 수는 명확하게 실험의 유효성을위한 핵심 변수이다. 때로는 몇 20-30 세포는 하나의 데이터 집합을 생성하기 위해 결합됩니다. 그러나, 통계적으로 의미있는 데이터 집합, 백 세포 이상을 가지고 시작하는 것은 아마도 필요합니다. 목적의 배율은 이미지화 된 영역의 크기와 묘화 셀의 개수에 따라서 결정한다. 목표 세포의 평균 형광을 측정하는 단백질 발현 측정을 위해, 높은 개구 40X 침지 목적 잡음비 양호한 신호 및 넓은 시야를 모두 제공하는 최적의 솔루션이다. 하위 세포 구조를 분석해야하는 경우, 높은 배율 (60X 나 100X 목적은) 적은 세포의 측정 결과, 종종 필요합니다. sCMO의 출현기존의 CCD의보다 거의 4 배 큰 검출기 크기 S 카메라는 시야 당 세포를 얻기 위해 분명히 장점이다.
전동 XY 단계로, 최종 데이터 집합의 세포의 수를 증가시키기 위해보기의 병렬 여러 분야의 이미지에 가능합니다. 그러나 방문한 XY 위치의 개수와 화상 획득의 속도 간의 트레이드 오프가있다. 스테이지의 속도와 기록 일루미네이션의 개수에 따라서는, 화상 분 미만의 열 위치를 전형적으로 가능하다. 빠른 신호 이벤트를 정량화하기 위해이 제한 요인이 될 수 있습니다. 형광의 변화가 느린 시간 스케일에서 일어나는 단백질 발현 측정을 위해, 그것은 일반적으로 한정하지 않다. 이러한 식의 실험은 몇 시간 동안 지속되고 필요하기 때문에 속도가 느린 시간 분해능으로하기 때문에 다른 방법으로, 그것은 병렬로 여러 이미지 샘플에 유익이됩니다. 여러 이웃 우물 캘리포니아N 야생형 및 돌연변이 세포로 시딩 될 다른 자극은 각 웰에 적용 할 수있는 생물 또는 복제물은 병렬로 측정 될 수있다. 96 - 웰 플레이트에서 모든 우물을 통해 스캔을 정기적으로 현미경 스크린 16 공기 목적으로 달성된다. 때문에 효모의 내인성 단백질의 낮은 풍요, 자신의 정량화는 높은 개구와 오일 목적이 필요합니다. 이것은 심각한 목적으로 여행 할 수있는 범위를 제한하는 역할을합니다. 그럼에도 불구하고 우리는 가까운 공통의 코너에 머물에 의해 일상적으로 이미지 주변 4 우물. 그러나 그것은 우물의 더 많은 수의 이미지에 더 많은 도전입니다. 자동 디스펜서 물 목표는 밝기의 작은 손실의 비용으로이 문제를 피할 수 있습니다.
유동 세포 계측법
세포의 충분한 수를 수집하는 것은 거의 유동 세포 계측기에 문제가 없다. 일반적으로 10,000-100,000 세포 분에서 획득 할 수 있습니다. 그러나, T의 이미지가 표시되지 않는다셀이 취득된다 그는, 제대로 분석하는 세포 집단을 선택하는 것이 중요하다. 순방향 측정 및 측면 산란을 기준 셀의 게이팅은 개별 세포가 아닌 세포의 클러스터를 선택하고 분석에서 세포 파편을 제거 할 수있다. 그림 2에서 각 히스토그램은 측정 된 10,000에서 자신의 산란 특성에 따라 선택되었다 약 5,000 세포의 인구를 나타냅니다.
개개의 세포로 세포의 클러스터를 파괴하여 세포 배양의 초음파는 획득 된 데이터의 품질을 개선하는 또 다른 방법이다. 이것은 세포의 클러스터가 제대로 세그먼트 매우 어려울 수 있습니다 현미경을위한 진정한 보유하고 있습니다. 이 단계의 지속 기간은 실험적으로 시험되어야한다. 우리는 보통 세포 현탁액 텍싱 하였다 분 30 초의 수욕 초음파의 두 라운드를 수행한다. 장시간 초음파는 몇 가지 세포의 용해가 발생할 수 있습니다. 그러나, 우리는 O를하지 않았다이 실험 단계에 의한 스트레스 반응 유전자의 위로 규칙을 bserve. 인스턴스 W303 세포 S288C 세포보다 응집하는 경향을 강하게 표시 용 셀의 집계, 배경 종속 표현형되어 있습니다.
단일 세포 측정의 변동성
도 3a에서, 유동 세포 계측법 및 현미경에 의해 수행 세 독립적 인 실험의 평균 및 표준 오차가 플롯되어있다. 세 개의 곡선 사이에 약간의 차이는 실험 오류가 이러한 간단한 측정을 위해 상대적으로 작은 많은 세포 (현미경 370-550 사이, 유동 세포 계측법에 대한 5000 개 이상)를 측정하고 그 사실에서 발생한다. 현미경 곡선의 시간적 발전은 유동 세포 계측법 데이터보다 더 매끄럽다. 이 문제에 대한 하나의 가능한 이유는 샘플 준비 과정입니다. 현미경의 경우, 실험의 모든 시간 지점은 잠시 동안, 같은 스트레스 사건의 결과FACS는, 각 시점 용 샘플을 개별적으로 강조된다. 스트레스와 배양 용액의 체적의 작은 변화는 유전자 발현 출력의 작은 차이가 발생할 수있다. 하나의 대안 전략은 세포의 5 ㎖의 문화를 강조하고 사이클로 헥시 미드로 억제하기 위해 원하는 시간에 분주을 제거하는 것입니다. 두 가지 방법은 더 많은 유연성을 제공하며, 여러 염화나트륨 농도가 병렬로 측정해야하는 용량 - 반응 곡선의 측정에 적합하기 때문에 우리는 마이크로 튜브의 제조 방법을 사용하여, 잘 작동합니다.
이러한 평균화 곡선 저잡음 그러나 단일 세포 수준에서의 변화의 존재의 전체 범위를 반영하지 않는다. 그림 3B 및 3C, 현미경으로 측정 한 시점에서 유동 세포 계측법 식의 막대 그래프가 그려집니다. 이러한 두 패널은 ESPEC 잘 복제물 간의 기술적 인 변형이 비교적 작다는 사실을 예시ially 개별 세포의 발현에서 관찰 큰 다양성 비교. 계측법 측정 현미경 흐름 간의 분포의 형상의 차이는 현미경 이미지에서 보통 셀룰러 강도를 계산하면서 전체 셀룰러 강도 유세포로 정량화되는 사실로부터 발생한다. 따라서 후자의 측정 셀의 크기의 변화 중 평균과는 좁은 분포가 발생합니다.
여기에 제시된 두 가지 기술은 정량적으로 단일 세포의 동작을 연구 할 수 있습니다. 이 기능은 일반적 집단 수준에서 수행 전통적인 생물 측정에 숨겨져있다. 개별 세포의 반응에 변화가 나온다 방법을 이해하는 것은 생물학적 과정의 복잡한 조절에 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 마티아스 베드로와 이러한 방법이 개발되었다 취리히의 ETH에서 생화학 연구소에서 자신의 그룹을 감사합니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 | |
References
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