Summary
To komplementære fremgangsmåter basert på strømningscytometri og mikros presenteres som muliggjør kvantifiseringen, på celle-nivået, av dynamikken i genekspresjon indusert ved aktivering av en MAPK veien i gjær.
Abstract
Kvantifisering av genuttrykk på celle-nivå avdekker nye reguleringsmekanismer skjult i målinger utført på befolkningsnivå. To metoder basert på mikroskopi og flowcytometri presenteres for å demonstrere hvordan slike data kan bli kjøpt opp. Ekspresjonen av et fluorescerende reporter indusert ved aktivering av den høye osmolaritet glycerol MAPK veien i gjær blir brukt som eksempel. De spesifikke fordeler ved hver metode er uthevet. Strømningscytometri måler et stort antall av celler (10 000), og gir et direkte mål på dynamikken i proteinekspresjon uavhengig av den langsomme kinetikk modning av det fluorescerende protein. Avbilding av levende celler ved mikroskopi er derimot begrenset til målingen av den modne form av reporteren i færre celler. Imidlertid kan de datasettene som genereres av denne teknikken være ekstremt rike takket være kombinasjoner av flere journalister og til romlig og tidsmessig informasjonoppnådd fra individuelle celler. Kombinasjonen av disse to målemetoder kan levere nye innsikter om regulering av protein uttrykk ved signalveier.
Introduction
Signalering via transduksjon kaskader ofte kulminerer i uttrykket av proteiner. Karakteriseringen av dette uttrykket profilen er et nøkkelelement for å forstå funksjonen av biologiske mekanismer. Identifiseringen av spekteret av oppregulert proteiner og dynamikken i aktivering kan oppnås ved forskjellige teknikker slik som mikro-matriser, nord blots eller western blots 1-3. Imidlertid er disse teknikker gjennomsnittet responsen fra hele populasjonen av celler. For å forstå den fine regulering av ekspresjonen av proteinene, er det ønskelig å samle inn målinger på celle-nivået. Ideelt sett bør disse målingene også gi kvantitative data mottagelig for å utvikle matematiske modeller av den underliggende bane.
Mikroskopi og flowcytometri er to teknikker, som er ideell for å levere slike kvantitative encellete målinger. Den endogene merking av proteiner med et fluorescent protein kan be brukes til å kvantifisere deres uttrykk nivå fire. Imidlertid, siden tilsetningen av et stort fluorescerende rest ved terminus av proteinet kan gjengi det ikke-funksjonelt, er det ofte mer ønskelig å generere spesifikke ekspresjonssystemer reportere basert på en promoter som driver ekspresjonen av et fluoriserende konstruksjon. Denne rapportørprotein er eksogen til mobilsystemet, og derfor ikke påvirker signale hendelser som finner sted i cellen.
Både mikroskopi og flowcytometri har blitt mye brukt i gjærsignalfeltet. Som eksempler; Colman-Lerner og kolleger korrelert, i enkeltceller, uttrykk for parring spesifikke og konstitutivt uttrykt reportere ved mikroskopi for å kvantifisere støy i gjær parring signaltransduksjon cascade 5, Acar og kolleger brukte flowcytometri å studere regulatoriske nettverk kontrollere uttrykket av GAL gener seks. I en tidligere studie 7, har vi brukt en Oppkjøpon av disse to teknikker for å studere ekspresjonen utgangen fra høy osmolaritet glycerol (HOG) pathway in spirende gjær. Dette mitogen aktivert protein kinase (MAPK) veien er utløst av hyper-osmotisk stress. Det resulterer i aktivering av MAPK Hog1, som translocates til kjernen av cellen for å indusere en transkripsjonen program som resulterer i ekspresjonen av omtrent 300 gener. For å undersøke denne prosessen hadde konstruerte et uttrykk reporter basert på STL1 promoter (et gen induseres spesifikt i respons til Hog1 aktivitet 8) som driver ekspresjonen av en firedoble Venus fluorescerende protein (p STL1-qV). Strømningscytometri målinger avdekket nærværet av to populasjoner av celler på mellomspenningsnivå (0,1 M NaCl) med bare en del av befolkningen som uttrykker det fluorescerende reporter. Vi brukte mikroskop for å videre undersøke dette problemet og oppdaget at denne støyen i protein uttrykk ble styrt av indre faktorer ni. Vi COUld observere videre at celler med et tilsvarende nivå av Hog1 aktivitet kunne vise påfallende forskjellige uttrykk utfall. Kombinasjonen av disse to teknikkene tillatt oss å demonstrere hvordan den langsomme ombygging av stress respons gener påvirket uttrykket utfallet på celle-nivå syv.
I denne artikkelen bruker vi uttrykket av p STL1-qV reporter indusert av hyper-osmotisk sjokk som et eksempel på kvantifisering av protein uttrykk ved mikroskopi og flowcytometri. Samme stamme utsatt til 0,2 M NaCl stresset ble studert med begge teknikkene. Dette vil gi oss mulighet til å fremheve noen viktige forskjeller i disse to svært komplementære teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Mikros Målinger
- Inokulere 5 ml syntetisk medium med gjær.
- Dyrk celler ved 30 ° C over natten.
- Mål OD 600 av natten kultur neste morgen.
- Spe natten kultur i 5 ml syntetisk medium til od 600 0,05.
- Dyrk den fortynnede kultur ved 30 ° C i minst 4 timer.
- Forbered 3 ganger konsentrert (0,6 M) NaCl-løsning i syntetisk medium.
- Forbered en 1 mg / ml løsning av Concanavalin A (ConA) i PBS.
- Filtratet ~ 200 pl av ConA-løsning i brønnen lysbilde.
- La stå i 30 min.
- Fjern ConA løsning.
- Tilsett 150 pl H2O til brønnen.
- Fjern H 2 O.
- Måle OD 600 av cellekultur.
- Forbered 300 mL av cellekultur på OD 600 = 0,02 i en 1,5 ml mikrorør.
- Sonicate cellene i et vannbad i 45 sekunder.
- Vortex kort på microtube.
- Sonicate cellene i et vannbad i 45 sekunder.
- Vortex kort på micro.
- Tilsett 200 ul av cellekultur til brønnen.
- Vent i 30 min for å la cellene faller til bunnen av brønnen.
- Plasser godt skyv på mikroskopet.
- Velg innstillingene for belysning for den fluorescerende kanal for å bli registrert.
- Velg innstillingene for belysning for to lyse feltet bilder (en litt ute av fokus: 3 mikrometer under fokusplanet for å gi rom for en skikkelig segmentering av cellene).
- Velg tidsintervallene for time-lapse måling
- Velg synsfelt til bildet.
- Starte kjøp av noen få rammer.
- Pause oppkjøpet å legge de 100 mL 0,6 M NaCl medium.
- Gjenoppta bildebehandling.
2. Flowcytometri Målinger
- Inokulere 5 ml syntetisk medium med gjær.
- Vokse ved 30 ° C over natten.
- MålOD 600 av natten kultur neste morgen.
- Spe natten kultur i 5 ml syntetisk medium til od 600 0,1.
- Vokse ved 30 ° C i minst 4 timer for å nå en OD 600 av 0,2-0,4.
- Forbered cycloheximide løsning 1 mg / ml i H 2 O.
- Forbered 3 ganger konsentrert (0,6 M) NaCl-løsning i syntetisk medium.
- Tilbered en 1,5 ml mikrorør med 100 pl av 0.6 M NaCl medium for hvert tidspunkt å bli målt.
- Ved tid 0, tilsett 200 pl av cellekultur til hvert mikrorør.
- Inkuber med risting ved 30 ° C.
- Ved tiden T, tilsett 30 mL cycloheximide til en micro.
- Gjenta trinn 2,11 for alle de ønskede tidspunkter.
- Inkuber alle mikrorør i minst 45 minutter og opp til 3 timer ved 30 ° C med risting.
- Forbered FACS rør med 400 mL PBS.
- Sonicate cellene i vannbad i 1 min.
- Vortex kort de mikrorør.
- Sonsilikat cellene i vannbad i 1 min.
- Vortex kort de mikrorør.
- Tilsett 100 mL cellekultur fra hver micro til sin tilsvarende FACS tube.
- Velg 488 nm eksitasjon laser og 530/30 nm båndpassfilter for deteksjon.
- Test som ikke uttrykker og fullt uttrykker prøven for å kontrollere om de faller på detektoren følsomhetsområde.
- Mål 10.000 celler for hver prøve ervervet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikros
Gjærceller som bærer uttrykket reporter p STL1-qV (ySP9 7) ble festet til bunnen av brønnen-slide og plassert under mikroskopet. Cellene ble stimulert ved tilsetning av stresset medium direkte inn i brønnen i løpet av avbildnings sesjon. Dette gir oss muligheten til å skaffe seg et par bilder av cellene før pathway induksjon og følge deres skjebne etter stimulering. I det foreliggende tilfelle ble cellene fulgt i ~ 2 timer med et intervall på 10 min. Figur 1A er et bilde av ikke-fluorescerende celler før induksjon og Figur 1B viser de samme cellene i 2 timer etter stress når uttrykket reporter har blitt indusert og har som lyser opp.
For å trekke ut den kvantitative opplysninger som finnes i disse bildene, har en kompleks bildeanalyseprosess som skal utføres. Den omfatter en segmentering av cellene til å definere objekter i iMage, sporing av disse objektene fra ett bilde til det neste, og målinger av egenskapene til disse objektene (form og intensitet egenskaper). Vi har utviklet vår egen plattform heter YeastQuant å utføre denne analysen 10. Et par andre ikke-kommersielle programvare er tilgjengelig til å utføre disse oppgavene:. CellProfiler 11, CellID 12 eller CellX 13 Figur 1C viser resultatene av en analyse utført med YeastQuant. Hver røde kurven representerer den tidsmessige utvikling av den gjennomsnittlige fluorescensintensitet av en enkelt celle. Den blå linjen viser medianen av mer enn 500 celler som ble segmentert og spores gjennom 20 bilder av fem time-lapse filmer kjøpt fra fem ulike felt av utsikt fra samme brønn. Den lyseblå området representerer den 25. og 75. persentil av alle intensiteter målt på et gitt tidspunkt.
Strømnlngscvtometri
For flowcytometri måling utenents, ble cellekultur sølt i mikrorør som inneholder stress medium. For å studere tidsmessige utviklingen av p STL1-qV uttrykk, ble oversettelsen hemmet ved ulike tidspunkt (5 til 10 min intervaller) med cycloheximide (figur 2). Dette stoffet blokkerer syntesen av nye proteiner, men modningen av det fluorescerende protein som allerede er uttrykk ikke er perturbert. Derfor, etter 45 minutter til en time med inkubering, celler kan måles in strømningscytometeret tillater kvantifisering av mengden av protein som produseres samtidig med cykloheksimid tilsetningen. Denne strategien omgår problemet med fluorescerende protein modning og derved kvantifiserer den sanne dynamikken fluorescerende protein-syntesen.
Sammenligning av de to teknikkene
Figur 3A sammen dynamikken i uttrykket reporter målt ved mikroskopi og flowcytometri. Mens det fluorescerende signalet begynner å stige 30 til 40min etter belastning med mikroskopi, flowcytometri målinger klart viser at proteinene er allerede fremstilt mellom 10 og 15 min etter stimulus. Denne halvtime forsinkelsen skyldes den langsomme modning av de fluorescerende proteiner 14. Selv om begge metodene kvantifisere fluorescerende intensiteten av cellene, må man huske på at i denne studien, har de ikke måler samme biologiske prosessen. Mens, slik mikros fremtoning av det fluorescerende signal, flowcytometri faktisk kvantifiserer syntesen av proteinet. Det er viktig å ta hensyn til denne modningen trinnet når opptre live-cell imaging. I en situasjon hvor et endogent protein som er merket med et fluorescent protein, vil den endogene protein kan uttrykkes og aktiv før fluorescensen av sin signal kan detekteres.
Som angitt ovenfor, begge teknikkene gir tilleggsinformasjon. Strømningscytometri kan måle et stort antall celler meget hurtig (10 000 eller mer). Det kan derfor levere statistisk rike datasett der to overlappende populasjoner kan identifiseres eller noen sjeldne hendelser kan observeres. Mikros gir informasjon om et begrenset antall av celler (av størrelsesorden 100). Imidlertid, fordi dette datasett inneholder temporal og spatial informasjon og gir korrelasjonen av flere målinger i den samme celle, kan det gi svært verdifull innsikt i de undersøkte biologisk prosess.
Figur 1. Måling av reporter uttrykk ved mikroskopi. A og B. Bilder av celler som bærer det fluorescerende reporter uttrykket p STL1-qV før (A), og 2 timer etter stimulering med 0,2 M NaCl (B). C. Tid løpet av influensa orescence fremtoning. De røde kurvene representerer den gjennomsnittlige celle fluorescensintensiteten av noen få representative encellete spor. Den blå kurven representerer medianen fluorescens av 550 encellete spor. Den lyseblå området representerer den 25. og 75. persentil av fluorescerende uttrykk av cellen befolkningen på hvert tidspunkt. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Måling av reporter-ekspresjon ved strømningscytometri. Histogrammer over celle fluorescens av celler som bærer det fluorescerende reporter uttrykket p STL1-qV behandlet med 0,2 M NaCl og hemmet med cykloheksimid ved ulike tidspunkt.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Sammenligning av ekspresjonen dynamikk, målt ved mikroskopi, og strømningscytometri. A. Gjennomsnitt av fluorescens-intensiteten målt ved flowcytometri (heltrukket linje) og mikroskopi (stiplet linje) som funksjon av tid for tre biologiske replikater. De feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet. B og C. Histograms av normalisert fluorescens intensiteten på 120 min etter stress for mikroskopi (B) og 60 min etter stress for flowcytometri (C) for de tre gjentak. Klikk her for åse større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikros
Behandling av brønnen med ConA er et viktig skritt for å sikre en riktig avbildning av cellene. Fordi ConA har lav oppløselighet i PBS (5 mg / ml), kan filtrerings-prosess for fjerning av store aggregater som er tilstede i den ufiltrerte løsning og forstyrre avbildning. Cellene fester relativt sterkt til den behandlede overflate, og tilsetningen av det induserende oppløsningen bør ikke forstyrre lokalisering av cellene, slik at for en kontinuerlig sporing før og etter stimuleringen. Denne behandling kan også bli brukt til å strømme kanaler eller microfluidic enheter ble cellene er utsatt for en konstant strømnings 7,15. Dersom brønnen ikke er riktig renset med vann etter behandlingen, vil cellene ikke holder seg godt til glass, antagelig fordi ConA i løsning bindes direkte til cellene og forhindrer dem til å danne en sterk binding til glassoverflaten. Etter vasketrinnet, kan brønnen fortsatt tørke i 3 -4 timer før tilsetningen av cellene uten at det innvirker merkbart på binding av cellene til glasset.
Valget av eksponeringstiden for det fluorescerende kanal er en kritisk innstilling for suksessen av forsøket. Siden fluorescensen av cellen vil øke i løpet av time-lapse, er det viktig å teste på forhånd med en indusert prøven hva som er den maksimale eksponeringstiden som kan brukes for å unngå metning av bildene under overtakelsen. En annen parameter å ta i betraktning ved valg av eksponeringstiden er bleking av det fluorescerende signal. For hver prøve, må man finne en avveining mellom lysstyrken på bildet og degradering av signalet på grunn av bleking under time-lapse. Tidsintervallet mellom hver oppkjøpet påvirker også sterkt bleking av fluoroforen. Siden protein uttrykk er en relativt langsom prosess, vi bruker vanligvis 10-15 min. intervaller. Hvis andre raskere prosesser må være followed parallelt med protein uttrykk, kan det være lurt å bruke ulike tids trinn over hele time-lapse film (1-2 min i begynnelsen og 5-15 min for senere oppkjøp).
Kontrollen av celletetthet er en avgjørende parameter for å ta hensyn til. Dersom tettheten er for lav, vil bare noen få celler være tilstede i hver synsfelt som resulterer i dårlige statistikk for datasettet. Dersom densiteten er for høy, kan det hindre segmentering, sporing og kvantifisering av cellene, noe som gjør det vanskelig å trekke ut den ønskede informasjonen fra bildene. For å bestemme seeding tetthet, er en ytterligere parameter for å ta hensyn til varigheten av forsøket. Dersom et forsøk varer i flere divisjonssyklusen kan det være tilrådelig å starte med et tynt synsfelt som etter hvert vil fylle løpet av tidsforløpet av den avbildning som følge av delingen av cellene og slo seg ned på celler i løsning. I protokollen, foreslår vi at du brukeren OD 600 på 0,02, avhengig av hvilken type eksperiment vi utfører vi bruke OD 600 fra 0,05 for korte filmer med tidsintervall til 0.005 for lengre.
Antallet celler analysert er helt klart en viktig parameter for gyldigheten av forsøket. Noen ganger er så lite som 20 til 30 celler blir kombinert for å generere en datasettet. Men for å begynne å ha statistisk signifikante datasett, hundre celler eller flere er trolig nødvendig. Forstørrelsen av tittel bestemmer størrelsen på det avbildede området, og følgelig antall avbildes celler. For protein expression målinger, hvor målet er å måle gjennomsnittlig fluorescens av cellen, er en høy numerisk apertur 40X nedsenking objektiv den beste løsningen som gir både godt signal til støy-forhold og et stort synsfelt. Hvis sub-cellulære strukturer må analyseres, høyere forstørrelse (60x eller 100X mål) er ofte nødvendig, noe som resulterer i måling av færre celler. Ankomsten av sCMOS-kameraer med en detektor størrelse nesten fire ganger større enn den konvensjonelle CCD er helt klart en fordel å få flere celler per synsfelt.
Med en motorisert XY-fasen, er det mulig å avbilde i parallelle flere felt med sikte på å øke antallet celler i sluttsettet. Men det er en avveining mellom antall XY stillinger besøkt og hastigheten på bildet oppkjøpet. Avhengig av hastigheten av scenen, og antallet belysning tatt opp, er det vanligvis mulig å bilde ti stillinger i mindre enn ett minutt. For å kvantifisere raske signaleringshendelser, kan dette bli en begrensende faktor. For protein expression målinger, hvor fluorescens endringer skjer på en langsommere tidsskala, er det vanligvis ikke en begrensning. Alternativt, fordi disse uttrykk eksperimenter vare i noen få timer, og på grunn av den langsomme tidsmessig oppløsning er nødvendig, blir det fordelaktig å avbilde flere prøver parallelt. Flere nærliggende brønner can bli sådd med villtype og mutante celler, kan forskjellige stimuli påføres til hver brønn eller biologiske replikater kan måles parallelt. Scanning gjennom alle brønner fra en 96-brønns plate blir rutinemessig oppnådd med luft mål for mikros skjermene 16. På grunn av den lave mengde av endogene proteiner i gjær, krever deres kvantifisering en olje Formålet med høy numerisk apertur. Dette begrenser sterkt området som kan bli reist med målsettingen. Likevel vi rutinemessig bilde fire nabobrønner ved å bo nær sine felles hjørne. Det er imidlertid mer utfordrende å image et større antall brønner. Vann mål med automatiske dispensere kan omgå dette problemet på bekostning av et mindre tap i lysstyrke.
Flowcytometri
Samle et tilstrekkelig antall celler er neppe et problem med flowcytometere. Vanligvis 10.000-100.000 celler kan bli kjøpt opp i et minutt. Imidlertid, fordi ikke noe bilde av tHan celle er ervervet, er det viktig å velge riktig cellepopulasjonen som skal analyseres. Gating av celler basert på de målte forover og side scatter kan tillate å velge individuelle celler i stedet for grupper av celler, og til å fjerne celleavfall fra analysen. I figur 2, representerer hver et histogram befolkning på omtrent 5,000 celler som ble valgt basert på deres spredningsegenskaper fra 10.000 hendelser målt.
Ved å bryte klynger av celler inn i de enkelte celler, er sonikering av cellekulturen ytterligere måte å forbedre kvaliteten på dataene som er innhentet. Dette gjelder for mikroskopi, hvor grupper av celler kan være svært vanskelig å segment på riktig måte. Varigheten av dette trinn må bli testet eksperimentelt. Vi har vanligvis utfører to runder med sonikering i et vannbad på 30 sek til ett minutt, etterfulgt av vortex-blanding av cellesuspensjonen. Langvarig sonikering kan resultere i lysering av noen få celler. Imidlertid gjorde vi ikke observe en opp-regulering av stress-responsive gener på grunn av denne eksperimentelle trinn. Legg merke til at aggregering av cellene er en bakgrunnsavhengig fenotype, f.eks W303-celler viser en sterkere tendens til å aggregere enn S288C celler.
Variasjon i encellete målinger
I figur 3A, er den gjennomsnitt og standardfeil for tre uavhengige eksperimenter utført ved strømningscytometri og mikros plottes. De små forskjellene mellom de tre kurvene oppstår fra det faktum at de eksperimentelle feil er forholdsvis liten for disse enkle målinger, og at mange celler er målt (mer enn 5000 for strømningscytometri, mellom 370 til 550 for mikroskopi). Den tidsmessige utviklingen av mikros kurvene er glattere enn en av flowcytometri data. En sannsynlig årsak til denne oppførselen er prøveopparbeidelse prosessen. For mikroskopering alle tidspunkter i et eksperiment resultere fra den samme belastning arrangement, mens forFACS prøven for hvert tidspunkt streket individuelt. Små variasjoner i volumet av stress-og kulturløsninger kan resultere i en liten forskjell i genekspresjon utgang. En alternativ strategi ville være å understreke 5 ml kultur av celler og fjerne alikvoter til ønskede tider for å inhibere dem med cykloheksimid. Begge metodene fungerer godt, vi bruker micro forberedelse metoden fordi det gir mer fleksibilitet, og er også godt egnet for målinger av dose-responskurver der flere NaCl konsentrasjon må måles i parallell.
Den lave støy i disse gjennomsnittskurvene imidlertid ikke reflekterer hele spekteret av variasjon til stede på celle-nivå. I figur 3B og 3C, histogrammene for ekspresjon, målt ved mikroskopi, og strømningscytometri ved et enkelt tidspunkt er plottet. Disse to paneler illustrerer også det faktum at de tekniske variasjoner mellom replikater er relativt små, especially i forhold til den store variasjon observert i ekspresjonen av individuelle celler. Forskjellen i former av fordelingen mellom mikroskopi og flowcytometri målinger oppstår fra det faktum at med flowcytometri totalt celleintensiteten er kvantifisert mens i mikroskopi-bilder gjennomsnittlig celleintensiteten ble beregnet. Denne sistnevnte måle gjennomsnitt ut variasjoner i cellestørrelse og derfor resulterer i smalere distribusjoner.
De to teknikkene som presenteres her, tillater å studere kvantitativt oppførselen til enkeltceller. Denne funksjonen er vanligvis skjult i tradisjonelle biologiske målinger utført på befolkningsnivå. Forstå hvordan variasjon i responsen av individuelle celler oppstår kan tilby viktig innsikt i den komplekse reguleringen av biologiske prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Matthias Peter og hans gruppe ved Institutt for biokjemi ved ETH i Zürich hvor disse metodene har blitt utviklet. Dette arbeidet har vært støttet av den sveitsiske National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 | |
References
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Wu, J. -Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
- Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
- de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100 (2006).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
- Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).
