Summary
Nous présentons des méthodes pour l'isolement / culture efficace et rapide de la microglie viable du cortex cérébral néonatal et la moelle épinière adulte. La dissection et le placage de la microglie corticale peuvent être accomplies dans les 90 minutes, avec la récolte des microglies subséquente aura lieu ~ 10 jours suivant la dissection initiale.
Abstract
Les microglies sont les cellules de type macrophage résident du système nerveux central (SNC) et, à ce titre, ont un rôle d'une importance cruciale dans les processus physiologiques et pathologiques tels que SNC maturation dans le développement, la sclérose en plaques et les lésions de la moelle épinière. Microglie peut être activé et recruté à l'action par une blessure ou une stimulation neuronale, tels que des lésions axonales vu dans MS ou un traumatisme cérébral ischémique résultant d'une attaque. Ces membres immunocompétentes du SNC sont également pensé à avoir un rôle dans la plasticité synaptique dans des conditions non pathologiques. Nous utilisons des protocoles pour la microglie de culture des tissus néonatales et adultes qui visent à maximiser le nombre de cellules viables tout en minimisant les facteurs de confusion, tels que la présence d'autres types de cellules du système nerveux central et les débris de culture cellulaire. Nous utilisons des composants du système nerveux central, grandes et facilement discernable (par exemple cortex, les segments de la moelle épinière), ce qui rend l'ensemble du processus réalisable et reproductible. L'utilisation de la cellule adultes est une alternative appropriée à l'utilisation de la microglie du cerveau néonatal, comme beaucoup de pathologies étudiées touchent principalement la moelle épinière postnatal. Ces systèmes de culture sont également utiles pour tester directement l'effet des composés qui peuvent inhiber ou promouvoir activation de la microglie. Depuis activation de la microglie peut façonner les résultats de la maladie dans le SNC adulte, il existe un besoin pour des systèmes in vitro dans lequel la microglie néonatale et adulte peut être cultivée et étudiée.
Introduction
Microglies sont les cellules immunitaires résidentes du SNC, ressemblant plus étroitement macrophages périphériques dans la structure et la fonction 1. Il a été récemment démontré que les cellules microgliales postnatale proviennent de progéniteurs myéloïdes primitives et sont générés avant le huitième jour de l'embryogenèse, bouleversant la notion précédente qui progéniteurs hématopoïétiques postnatales sont la source de la microglie dans le cerveau adulte 2. Ils jouent un rôle clé dans plusieurs maladies neurologiques et peuvent réagir rapidement à une infection ou une blessure en libérant des cytokines pro-inflammatoires ou anti-inflammatoire 3. Ainsi microglie englober une unité autonome dans le système nerveux central qui peuvent être manipulés à affecter la progression de la maladie. Développer des méthodes robustes et reproductibles pour isoler et cultiver les cellules microgliales néonatale ou adulte est important pour de futures études.
Les microglies sont connus pour être des acteurs essentiels dans un certain nombre de pathologies cérébrales. Plus récemment, roles sont en train d'émerger pour les cellules dans le développement normal du cerveau et de la fonction que les cellules microgliales phagocytent excès de neurones progéniteurs du gyrus denté de l'hippocampe 1, 4. Microglie peut aussi moduler plusieurs conditions neurologiques qui affectent la moelle épinière, comme MS, les douleurs neuropathiques et les blessures de la moelle épinière 5-7. Spinal microglies de la moelle réagissent différemment par rapport à la microglie du cerveau en réponse à des signaux d'activation 8, 9, probablement en raison de différences dans l'environnement local. Il est donc important de mettre en place un système in vitro approprié à la culture et à étudier les microglies de la moelle épinière. Microglie néonatale produisent beaucoup plus de l'oxyde de cytokines pro-inflammatoires nitrique par rapport aux cellules adultes après stimulation in vitro avec l'IFN-γ ou TNF-a 10,11 soulignant la nécessité d'utiliser des cellules adultes pour étudier la microglie dans le cadre de certaines maladies plus loin.
Le protocole que nous utilisons en laboratoire pour culture microglie néonatale est une variante de méthodes récentes qui utilisent tremblement de cultures mixtes gliales dans un effort pour supprimer les microglies de la surface du flacon de culture cellulaire 12. Nous décrivons également une méthode de culture microglies de la moelle épinière de souris adulte sur base d'un protocole d'abord décrit par Yip, et al 13. Cette méthode fournit un moyen plus rapide de cellules adultes de la culture par rapport à d'autres protocoles disponibles 14. La préparation obtenue est de 70% microglie, le pourcentage restant se compose d'astrocytes. Bien que la pureté de notre culture est plus faible par rapport à d'autres méthodes publiées 13, ce système de culture est utile pour explorer la microglie dans la réponse de la culture à divers stimuli d'activation ainsi que pour l'étude des maladies qui affectent principalement la moelle épinière et dans lequel une forte réponse inflammatoire est une caractéristique principale.
Tous les protocoles décrits ont été approuvés par la Stony Brook University IACUC.
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Protocol
1. Dissection (jour 0)
- Induire une anesthésie à P0-2 souriceaux d'hypothermie. Essuyez les têtes des chiots avec un Kimwipe trempé dans l'éthanol à 70% pour désinfecter les tissus.
- Enlevez les têtes avec une paire de ciseaux, avec 4 petits par plaque de culture de 10 cm. Placez les têtes dans une boîte de Pétri contenant le tampon glacée Hank.
- Ancrer les têtes avec une pince courbe à travers les orbites et retirer délicatement la peau qui recouvre le crâne avec microforceps droites.
- Retirez les os du crâne avec microforceps droites, en utilisant attention à ne pas percer ou endommager le cortex. Le moyen le plus efficace est de commencer le déménagement de départ près du cervelet, qui est situé à la base de la tête, car cette région sera jeté.
- Retirez le cerveau avec une petite spatule et placer les quatre (4) des cerveaux dans une boîte de Pétri frais contenant le tampon glacée Hank.
- Toutes les étapes de ce point sur utilisent microforceps et sont réalisées sous une dissemicroscope ction. À partir de la face ventrale du cerveau, ancrer le tissu en tenant le cervelet et faire deux petites incisions de chaque côté du mésencéphale. Veillez à ne pas couper tout le chemin à travers le tissu, comme les cortex couvrent le mésencéphale dans cette région.
- Doucement taquiner le mésencéphale et le cervelet en une seule pièce les deux corticales. Les deux cortex devraient former une forme concave.
- Séparer les deux cortex et orienter un seul cortex avec la face interne en vue de poursuivre la dissection. L'hippocampe peut être difficile à observer, mais il est situé en face du bulbe olfactif qui apparaît comme un petit nodule sur l'extrémité pointue du cortex.
- Retirez l'hippocampe, qui a une forme de croissant. Retournez le cortex plus à voir la face dorsale.
- Utilisation du bulbe olfactif comme point de départ, supprimer toutes les méninges et le bulbe olfactif lui-même à partir du cortex.
- Les cortex disséqués devront être placés dans des tubes coniques de 15 ml avec 14 ml de colLa saline tamponnée d Hank sur la glace.
2. Culture cellulaire (jour 0)
- Pré-manteau 10 boîtes de culture de tissus cm avec 5 ug / ml de poly-D-lysine (PDL) dilué dans de l'eau stérilisée à l'autoclave pendant 3 heures à 37 ° C.
- Aspirer PDL, et des plaques de lavage une fois avec de l'eau autoclave. Plaque à sec sous les UV dans la hotte de culture tissulaire pendant 20 min. Cette étape doit être effectuée juste avant le processus de dissection.
- Aspirer le tampon de Hank à partir de tubes contenant les cortex de 4 cerveaux chacun, appliquer 4 ml de solution de trypsine / EDTA 1x, triturer tissu avec p1000 pointe, et placer des tubes à 37 ° C incubateur pendant 15 min.
- Ajouter 4 ml de milieu microgliales complets par tube pour arrêter la digestion enzymatique, mélanger et ralentit contenu à un régime 1.5K pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et répéter lavage avec 4 ml de milieu complet. Remettre les cellules dans 10 ml de milieu microgliales complets (DMEM avec 10% de FBS, 1% de pyruvate de sodium, 0,08% gentamicine) et filtrer à travers un 40 micron tamis cellulaire maille.
- Plaque à une densité de 8 cortex par 10 ml dans une plaque de 10 cm de culture de tissu et placer dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C et 5% de CO 2 (voir protocole Microglia adultes).
(Jour 3)
- Changer médias dans tous les plats de culture de cellules microgliales complets avec les médias.
(Jour 10)
- Ajouter 400 microlitres de 60 mm de lidocaïne dans HBSS (pour détacher la microglie) dans le milieu des plaques de culture tissulaire de 10 cm et incuber à température ambiante (TA) pendant 10-15 min.
- Recueillir des médias / suspension cellulaire de la plaque et laver la plaque une fois avec le tampon de Hank. Recueillir le tampon de lavage restant à recouvrer la microglie.
- Ajouter EDTA 5 mM (pH 8,0) à la suspension de cellules à une concentration finale de 50 pM ou à une dilution de 1/100.
- Isoler suspension cellulaire à 1000 x g (1500 rpm) pendant 5 min et remettre en suspension dans 1 ml de DMEM avec 1% de FBS.
- Compter le nombre de cellules viables (comme par Mi adultecroglia 3.1/3.2) et les cellules divisée en plaques de culture de tissus à la densité expérimentale souhaitée. Environ 1x10 6 cellules microgliales sont récoltées à partir d'une plaque de 10 cm contenant les cortex de 4 cerveaux. Par immunofluorescence, une densité de 2,5.10 4 cellules par lamelle 18 mm est recommandé.
- Attendre au moins 24 heures pour les cellules microgliales pour revenir pleinement à leur état de repos ramifié avant de l'utiliser.
Protocole texte: (Adult microglie)
1. Collection de tissus
- des plaques de culture de tissus de manteau de poly-D-lysine (PDL) pendant 3 heures à 37 ° C ou une nuit à 4 ° C. Laver les plaques une fois avec de l'eau immédiatement autoclave avant utilisation.
- Euthanasier souris par asphyxie au CO2 et de s'assurer que l'euthanasie est terminée. Nettoyer la zone de la moelle épinière avec 70% d'éthanol.
- En utilisant une paire de ciseaux couper la peau sur le dessus de la moelle épinière, puis passez à couper la moelle épinière à partir région T1 à T12. Couperle muscle restant hors des côtés de la moelle épinière.
- Lentement couper les vertèbres en utilisant microciseaux que vous maintenez doucement la moelle épinière avec vos doigts. Faites attention à ne pas percer la moelle épinière que le tissu est très doux. Extraire lentement la moelle épinière à l'aide microforceps.
- Immerger la moelle épinière dans une boîte de Pétri contenant HBSS glacée. L'utilisation d'un microscope optique retirer toutes méninges visibles à l'aide de microforceps
- Couper la moelle épinière en segments transversaux suffisamment petites pour générer plusieurs fragments. L'épaisseur des fragments ne doit pas être supérieure à 2 mm, afin de faciliter la digestion efficace. Transférer les morceaux de la moelle épinière dans un tube conique de 15 ml contenant 1 ml de HBSS glacée. Garder le tube sur la glace jusqu'à l'étape de digestion.
2. La digestion des tissus
- Aspirer HBSS de 15 ml tube conique contenant du tissu de la moelle épinière. Veillez à ne pas aspirer n'importe quel morceau de tissu.
- Ajouter 1 ml de trypsine (2.5 g / L irradié trypsine porcine et 0,2 g / L EDTA dans HBSS) et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
- Pour arrêter la digestion retirer la trypsine et ajouter 3 ml de milieu microglie primaire qui contient du sérum pour arrêter la digestion enzymatique.
- Pipet haut et bas pour déloger le tissu. Filtrer la suspension de cellules à l'aide d'un tamis cellulaire de 40 um.
3. Comptage des cellules et placage
- Mélanger volume égal de suspension de cellules et une solution de DAPI.
- Compter les cellules en utilisant un hématimètre.
- Plaque à une densité comprise entre 5 7x10 5 cellules / ml dans PDL revêtus 35 x 10 mm plats. Placage à une densité inférieure empêché la croissance des cellules, même lorsque les cellules ont été cultivées en plaques de 12 puits qui ont une zone plus petite par rapport à 35 x 10 mm plats.
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Representative Results
Un exemple de cellules de la microglie au repos et activées est illustré à la figure 1. La microglie ont été visualisée 24 heures après placage (figure 1a) et présentent ramifié morphologie (au repos). L'exposition au réactif d'amorçage, le lipopolysaccharide (LPS) bactériens résultats des changements dans la morphologie des microglies que les cellules sont activées (figure 1b).
Un exemple de comptage des cellules pour le placage est montré à la figure 2. En raison de la présence de débris cellulaires, DAPI Fluoromount (au lieu de bleu trypan) a été ajouté à un volume égal de la suspension cellulaire et placé dans un hématimètre pour compter comme décrit dans 4 cellules, 13. Cellules positives DAPI ont été visualisées en utilisant un microscope à fluorescence. Utilisez le réglage du champ lumineux facilité un décompte précis des cellules présentes (Figure 2). Environ 7x10 5 cellules ont été obtenues par moelle épinière de souris.
contenu "> Les cellules ont été étalées dans PDL revêtus 35 x boîtes de culture de tissu de 10 mm. Nous avons trouvé que le revêtement avec PDL a été une étape cruciale, car les cellules ne sont pas conformes / croissent moins que les plaques ont été recouvertes. Microglia joindre pleinement à la plaque de culture Après environ deux jours de culture (Figure 3). la moelle épinière de souris MacGreen, qui GFP express sous le contrôle du promoteur de la microglie / macrophage CSF-1R, a été utilisé pour cette expérience.
Figure 1. Représentant l'image de la microglie néonatale après deux jours de culture. Microglies ont été cultivées à partir de p0 C57/BL6 souriceaux et plaqué sur des lamelles non couchés à une densité de 2,5 x 10 5 cellules / ml. A, c. Microglie non traitées qui sont retournés dans un repos, état ramifié, b, d . Microglie traité avec 100 ng / ml de LPS pendant 4 heures et montrent, une forme amoeboid activé; Iba1 (vert, un marqueur spécifique pour un macrophages / microglie protéine de surface cellulaire) a été utilisé pour visualiser les cellules, tandis que les images de champ lumineux ont été utilisés pour montrer populations de cellules ensemble. DAPI Fluoromount a été utilisé pour visualiser les noyaux, et indiquer la pureté de la culture.
Figure 2. Le comptage des cellules. DAPI Fluoromount était mélangée avec un volume égal de suspension cellulaire et placé dans un hématimètre. Nous avons combiné le clair et le réglage de fluorescence pour visualiser les cellules positives DAPI et la grille de hémocytomètre pour une numération cellulaire précis.
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Figure 3. Des images représentatives des adultes microglies de la moelle épinière après deux jours de culture. a. la moelle épinière d'un MacGreen souris a été utilisé pour la procédure de culture. Les cellules ont été étalées dans un 35 x 10 mm boîte de culture tissulaire PDL revêtu à une densité de 7x10 5 cellules / ml. B. Image Bright domaine des microglies de la moelle épinière après deux jours de culture. Microglie (flèches bleues) et les astrocytes (flèches rouges) sont affichés. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Microglie moduler CNS fonctionnement normal ainsi que les réponses inflammatoires à diverses pathologies. Fonctionnel remodelage synaptique par la microglie a été impliquée dans le maintien de l'homéostasie du cerveau normal 15. Au cours de la cascade neurogène ils participent à la clairance des cellules progénitrices neurales du gyrus denté de l'hippocampe 4, 16. Par conséquent, il est nécessaire de développer un système de culture dans lequel pour étudier la microglie néonatale et adulte, qui couvrira le vaste secteur du développement et de l'âge adulte, tout au long de la microglie qui ont de multiples fonctions discrètes. Nous avons décrit une méthode rapide et efficace à la culture microglies de la moelle épinière et le cerveau adulte néonatale. Nous avons pu obtenir des préparations de cellules chez l'adulte qui était de 70% microglie avec le pourcentage restant consistant en astrocytes, et la pureté des préparations microgliales néonatales de près de 100%.
Compte tenu du rôle that astrocytes ont dans la régulation de l'état d'activation de la microglie 17-19, il est important d'optimiser les conditions de culture pour améliorer la pureté de la culture. Bien que la combinaison de la suspension cellulaire avec un volume égal de DAPI Fluoromount permet une numération cellulaire précis, il n'est pas possible de distinguer les microglies provenant d'autres types de cellules en utilisant cette méthode. Pour améliorer la pureté de la préparation des microglies adulte, Dynabeads GFP-revêtues peuvent être incubées avec la suspension cellulaire dérivée de MacGreen souris dont les cellules myéloïdes déjà expriment la GFP 20. Une autre suggestion serait de plaque de la suspension cellulaire mixte dans des boîtes de culture qui n'ont pas été préalablement revêtu d'PDL pour empêcher la fixation astrocytique 13. Cependant, nous avons constaté que les cellules se développent pas sur la plaque à moins qu'ils n'aient été préalablement enduit, qui dans nos mains est applicable à la fois aux cellules néonatales et adultes.
De nombreux protocoles décrivant les méthodes pour isolation et le placage de la microglie primaire de rat ou souris tissu cérébral utilisent tremblement de cultures mixtes gliales pour détacher la microglie et ainsi obtenir une population purifiée pour des expériences aval 12. Notre protocole diffère sensiblement plus en excluant l'étape secouer, et se concentrer plutôt sur la purification d'une population microglial-seulement par les conditions de culture précisément titrées. Dans notre expérience, en secouant cultures gliales mixtes afin d'éliminer les cellules microgliales est efficace, mais il a un inconvénient important - le fait que les microglies secoué prendre plusieurs jours pour revenir à une morphologie de repos complet 12. Cela peut être problématique étant donné que les microglies activées ont un profil de cytokine considérablement différent 21. Notre protocole, tout en prenant un peu plus de temps pour obtenir la microglie pure, maintient les cellules dans un état de repos tout au long. Comme pour la préparation des adultes discuté dans le paragraphe suivant, le seul inconvénient de notre méthode est une possibilitébilité de petite contamination d'autres types de cellules, notamment les astrocytes.
Notre technique de culture de cellules microgliales adultes varie considérablement des méthodes préexistantes. De nombreux protocoles prévoient l'utilisation d'un gradient de densité centrifugation (Percoll) ainsi que l'utilisation de la cytométrie en flux pour obtenir une population microglial pur 22. Dans notre méthode de création d'une culture microglial stable de la moelle épinière adulte, nous n'utilisons pas non plus technique, ce qui rend pour un temps le protocole beaucoup moins long et compliqué pour le chercheur à suivre. Alors que la grande majorité des préparations microgliales adultes proviennent de tissus du cerveau, la moelle épinière est composée des mêmes types de cellules - et donc notre protocole présente une comparaison équitable aux méthodes 22 décrites précédemment. Un compromis dans notre protocole est une préparation microglial légèrement moins pur, composé de 70% de la microglie, la fraction restante de cellules étant principalement des astrocytes origin. Ce décalage peut éventuellement être surmonté en utilisant une étape supplémentaire d'isolement de la microglie plus pur en utilisant des marqueurs de type de cellules très spécifiques de la lignée microgliale comme Iba-1 et F4/80 conjugué à des billes magnétiques.
La plupart des études qui évaluent le rôle de la microglie dans les maladies neurologiques qui affectent la moelle épinière ont été menées en utilisant des cellules du cerveau néonatal, et tout cela est une approche solide pour répondre à des questions sur le rôle de la microglie dans le développement normal ainsi que les pathologies affectant la cerveau spécifiquement, nous avons estimé qu'une méthode plus spécifique a dû être mis en place pour étudier la fonction microglie dans la moelle épinière adulte. Notre méthode néonatale est un moyen très efficace pour répondre à la plupart des questions concernant le fonctionnement normal du cerveau ainsi que dans certaines conditions pathologiques, et la méthode des adultes est une bonne alternative à l'utilisation de cellules néonatales de ces études compte tenu de la variabilité de la réponse immunologiques entre la microglie néonatale et des cellules adultes et entre les microglies du cerveau et de la moelle épinière 6-9. Microglies provenant des deux méthodes décrites sont également appropriés pour des études in vitro de co-culture (nous principalement la culture avec des neurones ou des oligodendrocytes dans notre laboratoire) qui adresse l'effet de la microglie sur d'autres types de cellules ainsi que la réponse des microglies néonatale et adulte à l'activation stimuli.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Tsirka pour leurs conseils et leurs commentaires utiles. Ce travail a été soutenu par R01NS42168 à définir, 12PRE12060489 de RB, un NSF-3MT IGERT et une thèse bourse Turner à LT, et NSF-3MT IGERT à JCN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
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