Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Published: August 9, 2013 doi: 10.3791/50647
Automatic Translation
*1,2, *2,3, *2,3, 2
1Program in Neuroscience, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Sciences, Stony Brook University, 3Program in Molecular and Cellular Pharmacology, Stony Brook University
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Abstract

Microglia הם התאים דמויי מקרופאג התושבים של מערכת העצבים המרכזית (CNS), וככזה, יש תפקידים חשובים וקריטי בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים כגון CNS התבגרות בפיתוח, טרשת נפוצה, ופגיעה בחוט השדרה. יכול להיות מופעל microglia וגייס לפעולה על ידי פציעה או גירוי עצבי, כגון פגיעה בaxonal ראתה ב-MS או טראומה המוחית איסכמי כתוצאה משבץ מוחי. חברי immunocompetent אלה של מערכת העצבים המרכזית גם הם חשבו שיש תפקידים בפלסטיות הסינפטית בתנאים שאינם פתולוגיים. אנו מעסיקים פרוטוקולים לmicroglia culturing מן רקמות היילודים ומבוגרים שהמטרה למקסם את המספרים הסלולריים קיימא תוך מזעור משתנים מבלבלים, כגון נוכחות של סוגי תאים במערכת העצבים המרכזית ופסולת אחרים תרבית תאים. אנו משתמשים ברכיבים גדולים ולהבחין בקלות במערכת העצבים המרכזית (לדוגמה: קליפה, פלחי חוט השדרה), מה שהופך את כל התהליך אפשרי לשחזור. השימוש בתא בוגרים הוא חלופה מתאימה לשימוש בmicroglia מוח ילוד, כפי שפתולוגיות רבות למדה בעיקר משפיעות על חוט השדרה לאחר הלידה. מערכות התרבות אלה הן גם שימושיות עבור ישירות בדיקת ההשפעה של תרכובות שיכולים גם לעכב או לקדם את הפעלת microglial. מאז הפעלת microglial יכולה לעצב את התוצאות של מחלה של מערכת העצבים המרכזית למבוגרים, יש צורך במערכות מבחנה שבה יכול להיות מתורבת microglia יילודים ומבוגרים ולמדו.

Introduction

Microglia הם התאים החיסוניים המקומיים של מערכת העצבים המרכזית, המזכירים באופן הדוק ביותר מקרופאגים היקפיים במבנה ותפקוד 1. זה כבר הוכיח לאחרונה כי תאי microglial לאחר לידה נובעים מאבות מיאלואידית פרימיטיביות ונוצרים לפני היום השמיני של עובר, הפילו את הרעיון הקודם שאבות hematopoietic לאחר לידה הם המקור של microglia במוח הבוגר 2. הם משחקים תפקידי מפתח במספר מחלות נוירולוגיות ויכולים להגיב במהירות לזיהום או פגיעה על ידי שחרור הפרו ציטוקינים דלקתיים ואנטי דלקתיים 3. לפיכך microglia להקיף יחידה עצמאית של מערכת העצבים המרכזית שניתן להשפיע להשפיע התקדמות מחלה. פיתוח שיטות חזקות ולשעתק לבודד ותאי microglial ילוד או מבוגר תרבות חשוב למחקרים עתידיים.

Microglia ידוע להיות שחקנים קריטיים במספר פתולוגיות מוחיות. לאחרונה, רולes הם מתעוררים לתאים בהתפתחות מוח הנורמלי ולתפקד כתאי microglia phagocytose עודפים עצביים אב מהרכס משוננת של ההיפוקמפוס 1, 4. Microglia יכול גם לווסת את מספר תנאי נוירולוגיות שמשפיעים על חוט השדרה, כגון טרשת נפוצה, כאב נוירופתי, ופגיעה בחוט השדרה 5-7. microglia בעמוד השדרה מגיב באופן שונה בהשוואה למוח microglia בתגובה לאותות הפעלה 8, 9, כנראה בשל הבדלים בסביבה המקומית. לכן חשוב להקים מתאים במערכת במבחנה לתרבות וללמוד microglia חוט השדרה. microglia הילוד לייצר באופן משמעותי יותר של תחמוצת חנקן ציטוקינים פרו דלקתית בהשוואה לתאים בוגרים לאחר גירוי במבחנה עם IFN-γ או TNF-10,11 נוסף המדגיש את הצורך בשימוש בתאי בוגרים ללמוד microglia בהקשר של מחלות מסוימות.

הפרוטוקול אנחנו מעסיקים במעבדה למ"קmicroglia ילוד lture הוא וריאציה של השיטות האחרונות אשר מנצלים רועד של תרבויות גליה מעורבות במאמץ להסיר את microglia מפני השטח של תא בקבוק התרבות 12. אנחנו גם מתארים שיטה לתרבות microglia מחוט השדרה למבוגרים העכבר מבוסס על פרוטוקול שתואר לראשונה על ידי ייפ, ואח' 13. שיטה זו מספקת דרך מהירה לתאים בוגרים תרבות בהשוואה לפרוטוקולים זמינים 14 אחרים. ההכנה המתקבלת היא 70% microglia; האחוז הנותר מורכב מהאסטרוציטים. למרות טוהר התרבות שלנו הוא נמוך יותר בהשוואה לשיטות אחרות שפורסמו 13, מערכת התרבות זו היא שימושית לחקר תרבות microglial בתגובה לגירויים הפעלה שונים, כמו גם למחקר של מחלות שבעיקר משפיעים על חוט השדרה ושבו חזק תגובה דלקתית היא תכונה עיקרי.

כל הפרוטוקולים שתוארו כבר אושר על ידי סטוני ברוק Universiטאי IACUC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. נתיחה (יום 0)

  1. לגרום הרדמה לP0-2 גורי עכבר עם היפותרמיה. נגב את ראשיהם של הגורים עם Kimwipe ספוג באתנול 70% כדי לחטא את הרקמה.
  2. הסר את הראש עם זוג מספריים, באמצעות 4 גורים בצלחת תרבות 10 ס"מ. מניחים את הראשים בצלחת פטרי שמכילה המאגר של האנק הקר כקרח.
  3. לעגן את הראשים באמצעות מלקחיים מעוקלים דרך ארובות העיניים ולהסיר את העור המכסה את הגולגולת עם microforceps ישר בזהירות.
  4. הסר את עצמות גולגולת עם microforceps ישר, תוך שימוש בזהירות כדי לא לנקב או נזק הקורטקס. הדרך היעילה ביותר היא להתחיל את ההסרה מתחילה ליד המוח הקטן, הנמצא בבסיסו של הראש, כפי שהאזור זה יהיה מושלך.
  5. הסר את המוח עם מרית קטנה, והמקום (4) את המוח בצלחת פטרי שמכילה טרי החיץ קר כקרח של האנק.
  6. כל הצעדים מנקודה זו והלאה לנצל microforceps ומבוצעים תחת disseמיקרוסקופ ction. החל בצד הגחוני של המוח, לעגן את הרקמה על ידי מחזיק את המוח הקטן ולעשות שני חתכים קטנים בכל צד של המוח התיכון. היזהר שלא לחתוך את כל הדרך דרך הרקמה, כמו הקורטקס לכסות את המוח התיכון באזור זה.
  7. בעדינות להקניט המוח התיכון והמוח הקטן בחתיכה אחת משתי קליפת המוח. שני הקורטקס צריך ליצור צורה קעורה.
  8. להפריד בין שני הקורטקס ולכוון את קליפה אחד עם הצד המדיאלי עד לנתיחה נוספת. ההיפוקמפוס יכול להיות קשה להתבונן, אבל הוא ממוקם מול של הנורה חוש הריח שמופיע כגולה קטנה בקצה המחודד של קליפת המוח.
  9. הסר את ההיפוקמפוס, שבו יש צורת סהר. להעיף את הקליפה מעל לצפייה בצד הגב.
  10. שימוש בנורת חוש הריח כנקודת התחלה, להסיר את כל קרומי המוח ונורת חוש הריח עצמו מקליפת המוח.
  11. הקורטקס גזור צריך להיות ממוקם בתוך 15 צינורות חרוטי מ"ל עם 14 מ"ל של colמלוח נאגר של האנק ד על קרח.

2. תרבית תאים (יום 0)

  1. 10 מנות בתרבית רקמת ס"מ מראש מעיל עם 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של פולי-D-ליזין (PDL) מדוללים במי autoclaved עבור 3 שעות ב 37 ° C.
  2. לשאוב PDL, וצלחות לשטוף פעם עם מים autoclaved. צלחת יבש תחת UV במכסת המנוע בתרבית הרקמה למשך 20 דקות. צעד זה צריך להתבצע רק לפני תהליך הנתיחה.
  3. חיצו של האנק לשאוב מצינורות המכילים את קליפת המוח מהמוח של 4 כל אחת, להחיל 4 מ"ל של תמיסת טריפסין / EDTA 1x, triturate רקמה עם P1000 טיפ, וצינורות מקום 37 ° C בחממה במשך 15 דקות.
  4. הוסף 4 מ"ל של תקשורת microglial המלאה לכל צינור כדי לעצור את עיכול אנזימטי, לערבב, ומסובב את תכנים בסל"ד 1.5K למשך 5 דקות.
  5. לשאוב supernatant וחזור על לשטוף עם 4 מ"ל של מדיה מלאה. תאי Resuspend ב 10 מ"ל של תקשורת microglial המלאה (DMEM עם 10% FBS, 1% פירובט נתרן, 0.08% gentamycin), ולסנן דרך 40 מיקרומסננת תא רשת N.
  6. צלחת בצפיפות של 8 לקורטקס 10 מ"ל בצלחת 10 ס"מ תרבות רקמות ומקום בתרבות רקמות חממה ב 37 ° C ו 5% CO 2 (ראה למבוגרים Microglia פרוטוקול).

(יום 3)

  1. שינוי בתקשורת בכל מנות תרבות התאים עם תקשורת microglial מלאה.

(יום 10)

  1. הוסף 400 מיקרוליטר של 60 מ"מ לידוקאין בHBSS (לנתק microglia) לתוך מדיום של תרבות צלחות רקמות של 10 ס"מ והדגירה בטמפרטורת חדר (RT) למשך 10-15 דקות.
  2. לאסוף את התקשורת / השעיה תא מהצלחת, ולשטוף את צלחת פעם אחת עם החיץ של האנק. לאסוף חיץ לשטוף להתאושש microglia שנותר.
  3. הוסף 5 מ"מ EDTA (pH 8.0) להשעית התא לריכוז סופי של 50 מיקרומטר או בדילול 1/100.
  4. ספין למטה השעיה תא XG ב 1000 (1,500 סל"ד) במשך 5 דקות ומחדש להשעות ב1 מ"ל DMEM עם 1% FBS.
  5. ספירת מספר תאי קיימא (לפי Mi מבוגריםcroglia 3.1/3.2) ותאים מחולקים לצלחות תרבית רקמה בצפיפות הניסוי הרצויה. כ 1x10 6 microglia נקצרים מצלחת 10 ס"מ המכילה את קליפת המוח מגיל 4 מוחות. לimmunofluorescence, צפיפות של 2.5x10 4 תאים לכל coverslip 18 מ"מ מומלצת.
  6. אפשר לפחות 24 שעות לתאי microglial לחזור באופן מלא למצבו המסועף, מנוחתם לפני השימוש.

טקסט פרוטוקול: (למבוגרים Microglia)

1. אוסף רקמות

  1. צלחות תרבית רקמה מעיל עם פולי-D-ליזין (PDL) עבור 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס או הלילה ב 4 ° C. לשטוף את צלחות פעם אחת עם מים autoclaved מייד לפני השימוש.
  2. להרדים את העכבר בחנק CO 2, ויוודא כי המתת חסד היא מוחלטת. יש לנקות את אזור חוט השדרה עם 70% אתנול.
  3. באמצעות מספריים לחתוך את העור בחלקו העליון של חוט השדרה, ואז להמשיך לחתוך את חוט השדרה מהאזור T1 לT12. לחתוךשרירים את שנותרו מהצדדים של חוט השדרה.
  4. לאט לאט לחתוך את החוליות באמצעות microscissors כמו שאתה בעדינות להחזיק את חוט השדרה עם קצות אצבעותיך. היזהר שלא לנקב את חוט השדרה כרקמה רכה מאוד. לאט לחלץ את חוט השדרה באמצעות microforceps.
  5. להטביע את חוט השדרה בצלחת פטרי המכילה HBSS קר כקרח. השימוש במיקרוסקופ אור להסיר את כל קרומי המוח הגלויים באמצעות microforceps
  6. חותכים את חוט השדרה למקטעים רוחביים קטנים מספיק כדי לייצר כמה שברים. העובי של שברים לא צריך להיות יותר מ 2 מ"מ על מנת להקל על עיכול יעיל. להעביר את החלקים בעמוד השדרה לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 1 HBSS קר כקרח מ"ל. שמור את הצינור על קרח עד שלב העיכול.

2. עיכול של רקמות

  1. HBSS לשאוב מצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל רקמת חוט השדרה. היזהר שלא לשאוב כל פיסת הרקמה.
  2. הוסף 1 מ"ל של טריפסין (2.5 גר '/ ליטר מוקרן חזירי טריפסין ו0.2 גר' / ל 'בHBSS EDTA) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. כדי לעצור את העיכול להסיר טריפסין ומוסיף 3 מ"ל של מדיום microglia העיקרי המכיל סרום לעצור עיכול אנזימטי.
  4. Pipet למעלה ולמטה כדי לסלק את הרקמה. סנן את ההשעיה התא באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר.

3. ספירת תאים וציפוי

  1. מערבבים נפח שווה של השעיה תא ופתרון DAPI.
  2. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
  3. צלחת בצפיפות בין 5-7x10 5 תאים / מ"ל ב35 x 10 מ"מ צלחות PDL מצופים. ציפוי בצפיפות נמוכה מנע צמיחת תאים גם כאשר תאים בתרבית 12 צלחות גם בו יש שטח קטן יותר בהשוואה ל -35 מ"מ x 10 מנות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דוגמה של תאי microglial מנוחה והופעלו מוצגת באיור 1. Microglia היה דמיין 24 שעות לאחר ציפוי (איור 1 א) ולהציג מורפולוגיה מסועפת (מנוחה). חשיפה למגיב תחול, lipopolysaccharide (LPS) תוצאות חיידקיים בשינויים במורפולוגיה microglial כמו התאים להיות מופעלת (איור 1).

דוגמה של ספירת התאים לציפוי מוצגת באיור 2. בשל נוכחותו של תא פסולת, DAPI Fluoromount (במקום Trypan הכחול) התווסף לנפח שווה של ההשעיה התא והניח בתא hemocytometer לספירה, כמתואר ב4, 13. תאים חיוביים DAPI היו דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שימוש בהגדרת השדה הבהיר הקלה ספירה מדויקת של התאים בהווה (איור 2). ברחבי 7x10 5 תאים התקבלו לחוט השדרה עכבר.

תוכן "> התאים היו מצופה ב35 10 מנות בתרבית רקמת PDL מצופי x מ"מ. מצאנו ציפוי שעם PDL היה שלב קריטי, כמו תאים לא ידבקו / לגדול אלא אם כן הצלחות היו מצופים. Microglia לצרף באופן מלא לתרבות הצלחת לאחר כשני ימים בתרבות (איור 3). חוט השדרה של עכברי MacGreen, שGFP המפורש תחת השליטה של אמרגן microglia / מקרופאג CSF-1R, שימש לניסוי זה.

איור 1
איור 1. תמונה מייצגת של microglia ילוד לאחר יומיים בתרבות. Microglia היו בתרבית מP0 C57/BL6 גורי עכבר, ומצופה על coverslips ללא ציפוי בצפיפות של 2.5 x 10 5 תאים / מ"ל. ב, microglia לא טופל. ג אשר חזר ל מצב מנוחה, מסועף; B, D . Microglia מטופלים עם 100 LPS ng / mL לשעה 4 ולהראות צורה פעילה, amoeboid; Iba1 (ירוק, סמן ספציפי למשך מקרופאגים / פני חלבון תא microglia) נעשה שימוש כדי להמחיש את התאים, ואילו תמונות שדה בהירות שמשו כדי להראות אוכלוסיות תאים הכוללות. DAPI Fluoromount שימש כדי להמחיש גרעינים ולציין את הטוהר של התרבות.

איור 2
איור 2. ספירת תאים. DAPI Fluoromount היה מעורבב עם נפח שווה של השעיה תא והניח בhemocytometer. שלבנו brightfield והגדרת הקרינה לדמיין תאים חיוביים DAPI ורשת hemocytometer לספירת תאים מדויק.

"עבור: src =" / files/ftp_upload/50647/50647fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50647/50647fig3.jpg "/>
איור 3. נציג תמונות של microglia חוט השדרה מבוגר לאחר יומיים בתרבות. . חוט השדרה של עכבר MacGreen שימש להליך התרבות. תאים היו מצופה ב35 x 10 מ"מ צלחת רקמת PDL מצופה תרבות בצפיפות של 7x10 5 תאים / מ"ל. ב. תמונה בשדה בהירה של microglia חוט השדרה אחרי יומיים בתרבות. Microglia (חצים כחולים) והאסטרוציטים (חצים אדומים) מוצגים. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microglia לווסת את מערכת העצבים המרכזית תפקוד תקין, כמו גם תגובות דלקתיות לפתולוגיות שונות. שיפוץ הסינפטי פונקציונלי על ידי microglia היה מעורב בשמירה על הומאוסטזיס המוח הנורמלי 15. במהלך מפל neurogenic הם משתתפים באישור של תאים עצביים מהרכס משוננת של ההיפוקמפוס 4, 16. לכן, יש צורך לפתח מערכת תרבות שבה ללמוד microglia יילודים ומבוגרים, אשר יכסה הטווח העצום של פיתוח ובבגרות, בכל אשר יש לי microglia פונקציות דיסקרטיות מרובות. נציין כאן שיטה מהירה ויעילה לתרבות microglia מחוט השדרה והמוח למבוגרים בילוד. אנחנו הצלחנו להשיג הכנות תא במבוגרים שהיו microglia 70% עם האחוז הנותר המורכב מהאסטרוציטים, וטוהר של preps microglial הילוד מתקרב ל -100%.

בהתחשב בתפקיד thaהאסטרוציטים לא צריכים בויסות מצב ההפעלה של microglia 17-19, חשוב כדי לייעל את תנאי התרבות כדי לשפר את הטוהר של התרבות. למרות ששילוב של ההשעיה התא עם נפח שווה של DAPI Fluoromount מאפשר לספירת תאים מדויקת, לא ניתן להבחין microglia מסוגי תאים אחרים באמצעות שיטה זו. כדי לשפר את טוהר הכנת microglial המבוגר, יכול להיות מודגרות Dynabeads GFP מצופה עם ההשעיה התא נגזרת מMacGreen עכברים, שתאי מיאלואידית כבר מביע GFP 20. הצעה נוספת תהיה צלחת ההשעיה התא המעורבת בתרבות מנות שלא היה מצופים בעבר עם PDL כדי למנוע עיקול astrocytic 13. עם זאת, מצאנו כי אין תאים גדלים בצלחת אלא אם כן הם היו מצופים בעבר, שבידות שלנו הוא ישים לשני תאי יילודים ומבוגרים.

פרוטוקולים רבים המתארים שיטות לisolation וציפוי של microglia העיקרי מכל אחת מרקמות מוח חולדה או עכבר לנצל רועד של תרבויות גליה מעורבות לנתק microglia ובכך להשיג אוכלוסייה מטוהרת לניסויים במורד הזרם 12. הפרוטוקול שלנו משתנה באופן ניכר ביותר בנטרול הצעד הרועד, ובמקום זאת להתמקד בטיהור של אוכלוסיית microglial בלבד באמצעות תנאי culturing טיטרציה בדיוק. מניסיוננו, רועד תרבויות גליה מעורבות על מנת להסיר microglia הוא יעיל, אבל יש לו חסרון אחד משמעותי - העובדה שmicroglia המזועזע לקחת ימים רבים כדי לחזור למורפולוגיה 12 מלאה מנוחה. זה עשוי להיות בעייתי בהתחשב בכך שהפעיל microglia פרופיל ציטוקינים שונה במידה ניכרת 21. הפרוטוקול שלנו, תוך לקיחה מעט יותר להשיג microglia הטהור, שומר על התאים במצב מנוחה לאורך כל הדרך. כמו בהכנה למבוגרים דנו בפסקה הבאה, חסרון אחד של השיטה שלנו הוא possiמפני אפשרות של זיהום הקטן של סוגי תאים אחרים, כלומר האסטרוציטים.

הטכניקה שלנו עבור culturing מבוגר microglia משתנה במידה ניכרת מpreexisting שיטות. פרוטוקולים רבים קוראים לשימוש בצנטריפוגה שיפוע הצפיפות (Percoll), כמו גם את השימוש בcytometry הזרימה לקבל אוכלוסייה טהורה 22 microglial. בשיטה של ​​יצירת תרבות microglial יציב מחוט השדרה בוגר שלנו אנחנו לא לנצל או טכניקה, מה שהופך לפרוטוקול רב ומסובך הרבה פחות זמן לחוקר לעקוב. בעוד הרוב המכריע של הכנות microglial מבוגרים מגיע מרקמת המוח, חוט השדרה מורכב מאותם סוגי תאים - ולכן הפרוטוקול שלנו מציג השוואה הוגנת לשיטות שתוארו קודם לכן 22. תחלופה אחת בפרוטוקול שלנו היא הכנת microglial מעט פחות טהורה, בהיקף של 70% microglia, עם החלק הנותר של תאים להיות בעיקר של origi astrocyticn. פוטנציאל ניתן להתגבר על פער זה באמצעות צעד נוסף של בידוד של microglia הטהור יותר באמצעות סמני סוג תא ספציפיים מאוד של שושלת microglial כגון איבא-1 וF4/80 מצומדת לחרוזים מגנטיים.

רוב המחקרים שלהעריך את התפקיד של microglia במחלות נוירולוגיות המשפיעות על חוט השדרה שנערכו תוך שימוש בתאים ממוח הילוד, ובזמן הזה הוא גישה מוצקה למתן תשובות לשאלות על תפקיד לmicroglia בהתפתחות תקינה, כמו גם פתולוגיות המשפיעות המוח באופן ספציפי, אנחנו חשים ששיטה ספציפית יותר הייתה צריך להיות שהוקמה כדי ללמוד לתפקד microglia בחוט השדרה למבוגר. שיטת הילוד שלנו היא דרך יעילה מאוד כדי לענות על רוב השאלות הנוגעות לתפקוד התקין של המוח, כמו גם במצבים פתולוגיים מסוימים, והשיטה למבוגרים היא אלטרנטיבה טובה לשימוש בתאי ילוד ללימודים כאלה בהתחשב בשונות בתגובה חיסוניתים בין microglia הילוד ותאי בוגרים ובין microglia מהמוח וחוט השדרה 6-9. Microglia מתקבל משתי השיטות שתוארו מתאים גם למחקרים במבחנה שיתוף תרבות (בעיקר תרבותנו אותם עם תאי עצב או oligodendrocytes במעבדה שלנו) שכתובת השפעת microglia על סוגי תאים אחרים, כמו גם את תגובת microglial יילודים ומבוגרת להפעלה גירויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש מחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לחברים במעבדה Tsirka לעצתם והערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי R01NS42168 להגדיר, 12PRE12060489 לRB, IGERT NSF-3MT ומלגת דוקטורט טרנר לשעון מקומי, וNSF-3MT IGERT לJCN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA, 5mM Invitrogen 15567-028
Lidocaine, 60mM Sigma L-5647
Trypan Blue Sigma T8154
Trypsin/EDTA Cellgro 25-052-CI
DMEM, 1X Cellgro 10-017
Sodium Pyruvate Cellgro 25-000-Cl
Gentamycin Sulfate Biowittaker 17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish Falcon 353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml Dilute 1:20
HBSS, 1X Cellgro 20-023-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
  3. Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).
  4. Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
  5. Emmetsberger, J., Tsirka, S. Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury. Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).
  6. Gao, Z., Tsirka, S. E. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis. Neurol Res. Int. , 383087 (2011).
  7. Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain. Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).
  8. Olson, J. K. Immune response by microglia in the spinal cord. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).
  9. Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury. J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).
  10. Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia. J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).
  11. Brannan, C. A., Roberts, M. R. Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression. Glia. 48, 120-131 (2004).
  12. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).
  13. Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).
  14. Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).
  15. Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. Microglia actively regulate the number of functional synapses. PLoS One. 8, e56293 (2013).
  16. Tremblay, M. -È, Majewska, A. A role for microglia in synaptic plasticity. Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).
  17. DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer's disease. Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).
  18. Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).
  19. Min, K. -J., Yang, M. -S., Kim, S. -U., Jou, I., Joe, E. -H. Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation. J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).
  20. Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101, 1155-1163 (2003).
  21. Ekdahl, C. Microglial activation - tuning and pruning adult neurogenesis. Front Pharmacol. 3, 14 (2012).
  22. Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55, 412-424 (2007).

Tags

אימונולוגיה גיליון 78 מדעי המוח נוירוביולוגיה ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית רפואה הנדסה ביו רפואית Bioengineering אנטומיה פיזיולוגיה דיכוי חיסוני מדעי חיים ביולוגיה בעלי חיים מודלים של בעלי חיים ביוכימיה מיקרוגלים קליפה עכבר תרבות ילוד תא חוט השדרה למבוגרים תרבית רקמה מודל חיה
Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bronstein, R., Torres, L., Nissen,… More

Bronstein, R., Torres, L., Nissen, J. C., Tsirka, S. E. Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System. J. Vis. Exp. (78), e50647, doi:10.3791/50647 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter