Odling Mikroglia från neonatal och vuxna centrala nervsystemet

Summary

Vi beskriva metoder för effektiv och snabb isolering / kultur livskraftig mikroglia från neonatal cerebral cortex och vuxna ryggmärgen. Den dissekering och plätering av kortikala mikroglia kan åstadkommas inom 90 minuter, med efterföljande microglial skörden sker ~ 10 dagar efter den första dissektion.

Abstract

Mikroglia är de inhemska makrofager-liknande celler i det centrala nervsystemet (CNS) och, som sådan, har kritiskt viktiga roller i fysiologiska och patologiska processer såsom CNS mognad i utveckling, multipel skleros och ryggmärgsskada. Mikroglia kan aktiveras och rekryteras till handling av neuronal skada eller stimulans, såsom skador på nervfibrer ses i MS eller ischemisk hjärnskada till följd av stroke. Dessa immunkompetenta medlemmar i CNS är också tänkt att ha roller i synaptisk plasticitet under icke-patologiska tillstånd. Vi använder protokoll för odling mikroglia från neonatala och vuxna vävnader som syftar till att maximera de livsdugliga cellantal samtidigt minimera störande variabler, såsom förekomsten av andra CNS celltyper och cellodling skräp. Vi använder stora och lätt urskiljbar CNS komponenter (t.ex. cortex, ryggmärgen segment), vilket gör hela processen genomförbart och reproducerbar. Användningen av vuxen cells är ett lämpligt alternativ till användning av neonatal hjärna mikroglia, eftersom många patologier studerade huvudsakligen påverka den postnatala ryggmärgen. Dessa odlingssystem är även användbara för direkt testa effekten av föreningar som antingen kan hämma eller främja microglial aktivering. Eftersom microglial aktivering kan forma resultaten av sjukdomen i de vuxna CNS, finns det ett behov av in vitro-system i vilka neonatal och vuxen mikroglia kan odlas och studeras.

Introduction

Mikroglia är de inhemska immunceller i CNS, som mest liknar perifera makrofager i struktur och funktion ^1. Det har nyligen visats att postnatal mikrogliaceller härrör från primitiva myeloida stamceller och genereras innan den åttonde dagen av fosterutvecklingen, upending den tidigare uppfattningen att postnatal hematopoetiska stamceller är källan mikroglia i den vuxna hjärnan ^2. De spelar viktiga roller i flera neurologiska sjukdomar och kan snabbt reagera på infektion eller skada genom att släppa pro-inflammatoriska eller anti-inflammatoriska cytokiner ^3. Således mikroglia omfatta en fristående enhet i CNS som kan manipuleras för att påverka sjukdomsförloppet. Utveckla robusta och reproducerbara metoder för att isolera och kultur neonatal eller vuxen mikrogliaceller är viktigt för framtida studier.

Mikroglia är kända för att vara kritiska aktörer i ett antal hjärnans sjukdomar. På senare tid, roles växer fram för cellerna i hjärnans normala utveckling och funktion som mikroglia fagocytera överskott neurala stamceller från gyrus gyrus i hippocampus ^{1, 4.} Mikroglia kan också modulera flera neurologiska tillstånd som påverkar ryggmärgen, såsom MS, neuropatisk smärta och ryggmärgsskador ^5-7. Ryggmärgen microgliaen reagerar annorlunda än hjärnan mikroglia som svar på aktiveringssignaler ^{8, 9,} troligen beroende på skillnader i den lokala miljön. Därför är det viktigt att inrätta ett lämpligt in vitro-system till kultur och studera ryggmärg mikroglia. Neonatal microgliaen producerar betydligt mer av pro-inflammatoriska cytokiner kväveoxid jämfört med vuxna celler efter stimulering in vitro med IFN-γ eller TNF-a ^10,11 ytterligare belysa behovet av att använda adulta celler för att studera mikroglia i samband med vissa sjukdomar.

Protokollet vi använder i labbet till culture neonatal mikroglia är en variant av de senaste metoder som utnyttjar skakning av blandade gliaceller kulturer i ett försök att avlägsna mikroglia från ytan av cellen odlingskolv ^12. Vi beskriver också en metod för att kultur mikroglia från vuxen mus ryggmärg baserad på ett protokoll först beskrevs av Yip et al ^13. Denna metod ger ett snabbare sätt att celler kultur vuxna jämfört med andra tillgängliga protokoll ^14. Den erhållna beredningen är 70% mikroglia, den återstående procenten består av astrocyter. Även renheten av vår kultur är lägre jämfört med andra publicerade metoder ^13, är denna kultur som är användbart för att utforska microglial i kultur svar på olika aktiverande stimuli samt för studier av sjukdomar som främst drabbar ryggmärgen och där en stark inflammatorisk respons är en viktig funktion.

Alla de nämnda protokoll har godkänts av Stony Brook University IACUC.

Protocol

Ett. Dissection (Dag 0)

1. Inducera anestesi till P0-2 mus ungar med hypotermi. Torka huvuden valpar med en Kimwipe indränkt i 70% etanol för att desinficera vävnaden.
2. Ta huvudena med en sax, med 4 valpar per 10 cm kultur plattan. Placera huvudena i en petriskål innehållande iskall Hanks buffert.
3. Förankra huvuden med böjd pincett genom ögonhålorna och försiktigt bort hud som täcker skallen med raka microforceps.
4. Ta skallbenen med raka microforceps, med försiktighet till inte punktera eller skada cortex. Det mest effektiva sättet är att starta borttagningen börjar nära lillhjärnan, som är belägen vid basen av huvudet, som denna region kommer att kasseras.
5. Avlägsna hjärnan med en liten spatel och placera de (4) hjärnor i en fräsch petriskål med iskall Hanks buffert.
6. Alla steg från denna punkt på utnyttja microforceps och utförs under en DisseInsatser mikroskop. Börjar på den ventrala sidan av hjärnan, förankra vävnaden genom att hålla lillhjärnan och göra två små snitt på vardera sidan av mellanhjärnan. Var noga med att inte skära hela vägen genom vävnaden, eftersom cortex täcker mellanhjärnan i denna region.
7. Försiktigt retas mellanhjärnan och lillhjärnan i ett stycke från de två cortex. De två cortex bör bilda en konkav form.
8. Separera de två cortex och orientera en enda cortex med den mediala sidan uppåt för ytterligare dissektion. Hippocampus kan vara svårt att observera, men det är beläget mittemot den olfaktoriska bulben som visas som en liten knöl på den spetsiga änden av cortex.
9. Avlägsna hippocampus, som har en halvmåne-form. Vänd cortex över att visa ryggsidan.
10. Använda luktbulben som utgångspunkt, ta bort alla hjärnhinnor och luktbulben sig från cortex.
11. De dissekerade cortex bör placeras i 15 ml koniska rör med 14 ml av cold Hanks buffrade saltlösning på is.

2. Cell Culture (Dag 0)

1. Förbeläggning 10 cm vävnadsodlingsplattor rätter med 5 ^ g / ml av poly-D-lysin (PDL) utspätt i autoklaverat vatten under 3 timmar vid 37 ° C.
2. Aspirera PDL, och plattorna tvätta en gång med autoklaveras vatten. Torr plattan under UV i vävnadsodling huva i 20 min. Detta steg bör utföras strax före dissektion processen.
3. Sug Hanks buffert från rör innehållande cortex från 4 hjärnor vardera, tillämpas 4 ml 1x trypsin / EDTA-lösning, finfördela vävnad med P1000 spets, och rör plats i 37 ° C inkubator i 15 min.
4. Tillsätt 4 ml av kompletta microglial medier per tub för att stoppa den enzymatiska nedbrytning, blanda, och spinn ner innehållet på 1.5K rpm i 5 min.
5. Aspirera supernatanten och upprepa tvätta med 4 ml av kompletta medium. Återsuspendera cellerna i 10 ml av kompletta microglial medium (DMEM med 10% FBS, 1% natriumpyruvat, 0,08% gentamycin) och filtrera genom en 40 mikron mesh cell sil.
6. Plate vid en densitet av 8 cortex per 10 ml i en 10 cm vävnadsodlingsplatta och placera i en vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C och 5% _CO2 (Se Adult Mikroglia protokoll).

(Dag 3)

1. Byt media i alla rätter cellkultur med komplett microglial media.

(Dag 10)

1. Lägg 400 mikroliter av 60 mM lidokain i HBSS (att lösgöra mikroglia) i medium med 10-cm vävnadsodlingsplattor och inkubera vid rumstemperatur (RT) under 10 till 15 min.
2. Samla media / cellsuspension från plattan, och tvätta plattan en gång med Hanks buffert. Samla tvättningsbufferten att återhämta kvarvarande mikroglia.
3. Lägg 5 mM EDTA (pH 8,0) till cellsuspensionen till en slutlig koncentration av 50 ^ M eller vid en 1/100 utspädning.
4. Centrifugera ner cellsuspension vid 1000 x g (1500 rpm) under 5 min och återsuspendera i 1 ml DMEM med 1% FBS.
5. Räkna antalet viabla celler (per vuxen Microglia 3.1/3.2) och dela upp celler i vävnadskulturplattor på önskad experimentella densiteten. Cirka 1x10 ⁶ microgliaen skördas från en 10 cm platta med cortex från 4 hjärnor. För immunofluorescens, är en densitet av 2.5x10 ⁴ celler per 18 mm täckglas rekommenderas.
6. Tillåt minst 24 h för mikrogliaceller att helt återgå till sin förgrenad, vilotillstånd före användning.

Protokoll Text: (Adult Microglia)

Ett. Tissue Collection

1. Coat vävnadsodlingsplattor med poly-D-lysin (PDL) under 3 timmar vid 37 ° C eller över natten vid 4 ° C. Tvätta plattorna en gång med autoklaverat vatten omedelbart före användning.
2. Euthanize mus med CO ₂ kvävning och förvissa sig om att dödshjälp är klar. Rengör ryggmärgen område med 70% etanol.
3. Med hjälp av en sax klippa i huden på toppen av ryggmärgen, sedan fortsätta att skära ryggmärgen ut från region T1 till T12. Skärresterande muskler bort av sidorna av ryggmärgen.
4. Sakta skär kotorna med microscissors som du försiktigt håller ryggmärgen med fingertopparna. Var noga med att inte punktera ryggmärgen eftersom vävnaden är väldigt mjuk. Sakta extrahera ryggmärgen med microforceps.
5. Sänk ryggmärgen i en petriskål innehållande is-kall HBSS. Använda ett ljusmikroskop bort alla synliga hjärnhinnorna använder microforceps
6. Skär ryggmärgen i tvärgående segment tillräckligt små för att generera flera fragment. Tjockleken av fragmenten bör inte vara mer än 2 mm för att underlätta en effektiv matsmältning. Överför ryggmärgen bitar till ett 15 ml koniskt rör innehållande 1 ml iskall HBSS. Håll röret på is tills matsmältningen steget.

2. Rötning av Tissue

1. Sug HBSS från 15 ml koniska rör som innehåller ryggmärg. Var noga med att inte aspirera någon bit vävnad.
2. Tillsätt 1 ml trypsin (2.5 g / L bestrålat porcint trypsin och 0,2 g / L EDTA i HBSS) och inkubera vid 37 ° C under 30 min.
3. För att stoppa matsmältningen bort trypsin och tillsätt 3 ml primär mikroglia medium som innehåller serum för att stoppa den enzymatiska nedbrytning.
4. Pipettera upp och ner för att lösgöra vävnad. Filtrera cellsuspension med en 40 sil ìm cell.

Tre. Cellräkning och plätering

1. Blanda lika volym cellsuspension och DAPI lösningen.
2. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer.
3. Platta vid en densitet mellan 5-7x10 ⁵ celler / ml i PDL-belagda 35 x 10 mm skålar. Plätering vid en lägre densitet förhindrade celltillväxt även när celler odlades i 12-brunnsplattor vilka har ett mindre område jämfört med 35 x 10 mm skålar.

Representative Results

Ett exempel på vilande och aktiverade mikrogliaceller visas i figur 1. Den mikroglia visualiserades 24 timmar efter plätering (Figur 1a) och uppvisar förgrenad (vila) morfologi. Exponering för priming reagens, blir bakteriell lipopolysackarid (LPS) resulterar i förändringar i microglial morfologi som cellerna aktiveras (Figur 1b).

Ett exempel på räkna cellerna för plätering visas i figur 2. På grund av närvaron av cellfragment, var DAPI Fluoromount (i stället för trypanblått) sattes till en lika volym av cellsuspensionen och placerades i en hemocytometer för cellräkning som beskrivs i ^{4, 13.} DAPI positiva celler visualiseras med hjälp av en fluorescerande mikroskop. Användning av den ljusa fältet inställningen underlättade en korrekt sammanräkning av närvarande celler (Figur 2). Omkring 7x10 ⁵ celler erhölls per mus ryggmärgen.

innehåll "> Cellerna ströks i PDL-belagda 35 x 10 mm vävnadsodlingsskålar. Vi fann att beläggningen med PDL var ett kritiskt steg, eftersom cellerna inte följer / växa om plattorna var belagda. Microglia fullt fäster odlingsplattan efter ungefär två dagar i odling (figur 3). ryggmärg från MacGreen möss, som uttrycker GFP under kontroll av den mikroglia / makrofag promotor CSF-1R, användes för detta experiment.

Figur 1. Representant bild av neonatal mikroglia efter två dagar i odling. Mikroglia odlades från p0 C57/BL6 mus pups, och ströks ut på obelagda täckglas vid en densitet av 2,5 x 10 ⁵ celler / ml. A, c. Obehandlade mikroglia som har återvänt till en vila, förgrenad tillstånd, b, d . Mikroglia behandlades med 100 ng / ml LPS under 4 h och visar en aktiverad, amoeboid form, Iba1 (grön, en markör specifik för en makrofager / mikroglia cellyteprotein) har använts för att visualisera celler, medan ljusa fältbilder användes för att visar totala cellpopulationer. DAPI Fluoromount användes för att visualisera kärnor och indikera renheten av kulturen.

Figur 2. Cellräkning. DAPI Fluoromount blandades med en lika stor volym av cellsuspension och placerades i en hemocytometer. Vi kombinerat brightfield och fluorescensen inställningen att visualisera DAPI-positiva celler och hemocytometer rutnät för en noggrann cellräkning.

"Fo: src =" / files/ftp_upload/50647/50647fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50647/50647fig3.jpg "/>
Figur 3. Representativa bilder av vuxna ryggmärgen mikroglia efter två dagar i odling. en. Ryggmärgen av en MacGreen mus användes för odlingen förfarandet. Celler ströks ut i PDL-belagd 35 x 10 mm vävnadsodlingsplatta vid en densitet av 7x10 ⁵ celler / ml.. B. Ljusfält avbildar av ryggmärgen mikroglia efter två dagar i kultur. Mikroglia (blå pilar) och astrocyter (röda pilar) visas. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Mikroglia modulera CNS normala funktion samt inflammatoriska svar på olika patologier. Funktionell synaptic ombyggnad av mikroglia har varit inblandad i underhållet av hjärnans normala homeostas ^15. Under neurogen kaskad de deltar i clearance av neurala stamceller från gyrus gyrus i hippocampus ^{4, 16.} Därför är det nödvändigt att utveckla en kultur system där för att studera neonatal och vuxen mikroglia, som kommer att täcka den stora stråk av utveckling och vuxenlivet, under vilken mikroglia har flera diskreta funktioner. Vi har beskrivit en snabb och effektiv metod för att kulturen mikroglia från den vuxna ryggmärgen och neonatal hjärna. Vi kunde få cellpreparat i den vuxna som var 70% mikroglia med de återstående procenten består av astrocyter, och renheten av de neonatala microglial preps närmare 100%.

Med tanke på den roll that astrocyter har vid reglering av aktiveringstillståndet hos mikroglia ^17-19, är det viktigt att optimera odlingsbetingelser för att förbättra renheten av kulturen. Även kombinera cellsuspensionen med en lika stor volym DAPI Fluoromount möjliggör en noggrann cellräkning, är det inte möjligt att särskilja mikroglia från andra celltyper med denna metod. För att förbättra renheten hos den vuxna microglial förberedelser kan GFP-belagda Dynabeads inkuberas med cellsuspensionen härledd från MacGreen möss, vars myeloid celler som redan uttrycker GFP ^20. Ett annat förslag skulle vara att plattan den blandade cellsuspensionen i kultur rätter som inte tidigare har belagts med PDL för att förhindra astrocytisk fäste ^13. Vi har emellertid funnit att inga celler växer på plattan om de inte tidigare har belagts, som i våra händer är tillämplig på både neonatala och vuxna celler.

Många protokoll som beskriver metoder för isolation och plätering av primär mikroglia från antingen råtta eller mus hjärnvävnad utnyttja skaka av blandade gliaceller kulturer att lösgöra mikroglia och därigenom erhålla en renad population för efterföljande experiment ^12. Vår protokollet skiljer sig mest märkbart i exklusive skaka steget, och istället fokusera på rening av ett microglial endast befolkningen genom noggrant titreras odlingsbetingelser. I vår erfarenhet, skaka blandade gliaceller kulturer i syfte att avlägsna microgliaen är effektivt, men har en stor nackdel - det faktum att den skakas microgliaen ta många dagar att återgå till en fullständig vila morfologi ^12. Detta kan vara problematiskt med tanke på att aktiverade mikroglia har en avsevärt annorlunda cytokinprofil ^21. Vår protokoll, samtidigt som något längre för att erhålla ren mikroglia, underhåller cellerna i vilotillstånd hela. Som med den vuxna prep diskuteras i nästa stycke, är det en nackdel med vår metod en möjligten av små föroreningar av andra celltyper, nämligen astrocyter.

Vår teknik för odling vuxna mikroglia varierar avsevärt från redan existerande metoder. Många protokoll kräver användning av densitetsgradientcentrifugering (Percoll) samt användningen av flödescytometri för att erhålla en ren microglial population ^22. I vår metod för att skapa en stabil microglial kultur från vuxna ryggmärgen vi inte utnyttjar antingen teknik, vilket gör för en betydligt mindre tidskrävande och komplicerat protokoll för forskaren att följa. Medan den stora majoriteten av vuxna microglial beredningar kommer från hjärnvävnad, är ryggmärgen består av samma celltyper - och därmed våra protokoll ger en rättvisande jämförelse med tidigare beskrivna metoder ^22. En kompromiss i våra protokoll är en något mindre ren microglial beredning, bestående av 70% mikroglia, med den återstående fraktionen av celler som mestadels av astrocytic ursprungn. Denna diskrepans kan potentiellt övervinnas med hjälp av ett ytterligare steg för isolering av mer ren mikroglia använder mycket specifika markörer celltyp den microglial härkomst, t.ex. Iba-1 och F4/80 konjugerad till magnetiska kulor.

De flesta studier som utvärderar rollen av mikroglia i neurologiska sjukdomar som drabbar ryggmärgen har mätts i celler från neonatal hjärnan, och medan detta är en solid strategi för att besvara frågor om en roll för mikroglia i normal utveckling samt patologier som påverkar hjärnan specifikt, kände vi att en mer specifik metod måste inrättas för att studera mikroglia funktion i den vuxna ryggmärgen. Vår neonatal metod är ett mycket effektivt sätt att svara på de flesta frågor om den normala funktionen av hjärnan samt i vissa patologiska tillstånd, och den vuxna metoden är ett bra alternativ till användningen av neonatala celler för sådana studier ges variationen i immunologiskt svars mellan neonatal mikroglia och adulta och mellan mikroglia från hjärnan och ryggmärgen ^6-9. Mikroglia erhållits från båda beskrivna metoderna är också lämplig för in vitro-co-kultur studier (vi främst kultur dem med nervceller eller oligodendrocyter i vårt labb) som adress effekten av mikroglia på andra celltyper samt neonatala och vuxna microglial svar på aktivering stimuli.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA, 5mM	Invitrogen	15567-028
Lidocaine, 60mM	Sigma	L-5647
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-052-CI
DMEM, 1X	Cellgro	10-017
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-Cl
Gentamycin Sulfate	Biowittaker	17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish	Falcon	353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml			Dilute 1:20
HBSS, 1X	Cellgro	20-023-CV