Summary
Nosotros describimos métodos para el aislamiento / cultura eficiente y rápida de la microglia viable desde la corteza cerebral neonatal y adulto de la médula espinal. La disección y placas de microglia cortical se puede lograr dentro de los 90 minutos, con la cosecha microglial posterior que tiene lugar ~ 10 días después de la disección inicial.
Abstract
La microglía son los residentes células similares a los macrófagos del sistema nervioso central (SNC) y, como tal, tienen un papel de importancia crítica en procesos fisiológicos y patológicos tales como la maduración del SNC en desarrollo, la esclerosis múltiple y lesión de la médula espinal. La microglía se puede activar y reclutó a la acción por una lesión o estimulación neuronal, tales como daño axonal visto en la EM o trauma cerebral isquémica resultante de un accidente cerebrovascular. Estos miembros inmunocompetentes del SNC también se cree que tienen papeles en la plasticidad sináptica en condiciones no patológicas. Empleamos protocolos para la microglía cultivo de los tejidos neonatales y adultos que tienen como objetivo maximizar el número de células viables y reducir al mínimo las variables de confusión, tales como la presencia de otros tipos de células del sistema nervioso central y los restos de cultivo celular. Utilizamos componentes del SNC grandes y fácilmente perceptible (por ejemplo, la corteza, los segmentos de la médula espinal), lo que hace que todo el proceso sea factible y reproducible. El uso de célula adultas es una alternativa adecuada para el uso de la microglía del cerebro neonatal, como muchas patologías estudiadas afectan principalmente a la médula espinal después del parto. Estos sistemas de cultivo también son útiles para probar directamente el efecto de los compuestos que pueden inhibir o promover la activación de la microglia. Puesto que la activación microglial puede dar forma a los resultados de la enfermedad en el SNC adulto, hay una necesidad de sistemas in vitro en el que la microglía neonatal y adulto puede cultivar y estudió.
Introduction
La microglía son las células inmunes residentes del SNC, se asemejan más estrechamente macrófagos periféricos en la estructura y la función 1. Recientemente se ha demostrado que las células microgliales postnatal derivan de progenitores mieloides primitivas y se generan antes de que el octavo día de la embriogénesis, volteando la noción anterior de que los progenitores hematopoyéticos postnatales son la fuente de la microglia en el cerebro adulto 2. Juegan un papel clave en varias enfermedades neurológicas y pueden responder rápidamente a una infección o lesión mediante la liberación de citoquinas pro-inflamatorias o anti-inflamatoria 3. Por lo tanto microglia abarca una unidad independiente en el SNC que pueden ser manipulados para afectar la progresión de la enfermedad. El desarrollo de métodos robustos y reproducibles para aislar y cultivar células microgliales neonatal o adulto es importante para futuros estudios.
La microglía son conocidos por ser jugadores críticos en una serie de patologías cerebrales. Más recientemente, rolES están surgiendo para las células en el desarrollo del cerebro y la función normal como microglia fagocitan el exceso de células progenitoras neurales de la circunvolución dentada del hipocampo 1, 4. Microglía también puede modular varias condiciones neurológicas que afectan la columna vertebral, como la esclerosis múltiple, dolor neuropático, y lesiones de la médula espinal 5-7. Microglía de la médula espinal reaccionan de manera diferente en comparación con el cerebro microglia en respuesta a señales de activación 8, 9, probablemente debido a las diferencias en el medio ambiente local. Por lo tanto, es importante establecer un adecuado sistema in vitro para estudiar la cultura y la microglía la médula espinal. Neonatal microglia producen significativamente más de la óxido nítrico citoquina pro-inflamatoria en comparación con las células adultas después de la estimulación in vitro con IFN-γ o TNF-un 10,11 más destacando la necesidad de utilizar células adultas para estudiar la microglía en el contexto de ciertas enfermedades.
El protocolo que utilizamos en el laboratorio para culture neonatal microglia es una variación de los métodos recientes que utilizan agitación de cultivos gliales mixtos en un esfuerzo para eliminar la microglía de la superficie del frasco de cultivo celular 12. También describimos un método para la cultura de la microglia ratón adulto médula espinal sobre la base de un protocolo descrito por primera vez por Yip, et al 13. Este método proporciona una manera más rápida de las células adultas de cultivo en comparación con otros protocolos disponibles 14. La preparación resultante es 70% microglía; el porcentaje restante se compone de los astrocitos. Aunque la pureza de nuestra cultura es más baja en comparación con otros métodos publicados 13, este sistema de cultivo es útil para explorar la cultura microglial en respuesta a diversos estímulos de activación, así como para el estudio de enfermedades que afectan principalmente a la médula espinal y en el que una fuerte respuesta inflamatoria es una característica principal.
Todos los protocolos descritos han sido aprobados por la Stony Brook University IACUC.
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Protocol
1. Disección (día 0)
- Inducir la anestesia que p0-2 crías de ratón con la hipotermia. Limpie las cabezas de los cachorros con un Kimwipe empapado en etanol al 70% para desinfectar el tejido.
- Retire las cabezas con un par de tijeras, con 4 crías por 10 cm placa de cultivo. Coloque las cabezas en una placa de Petri que contiene tampón de helado Hank.
- Anclar los cabezales con pinzas curvas a través de las cuencas de los ojos y retirar con cuidado la piel que cubre el cráneo con microforceps rectas.
- Retirar los huesos del cráneo con microforceps rectas, teniendo cuidado para no romper o dañar la corteza. La manera más efectiva es para comenzar la extracción de partida cerca del cerebelo, que se encuentra en la base de la cabeza, como se descartará esta región.
- Retire el cerebro con una pequeña espátula, y colocar los (4) cerebros en una placa de petri fresco que contiene tampón de Hank enfriada en hielo.
- Todos los pasos de este punto en utilizar microforceps y se realizan bajo un Dissemicroscopio cción. Empezando por el lado ventral del cerebro, anclar el tejido mediante la celebración de el cerebelo y hacer dos pequeñas incisiones a cada lado del cerebro medio. Tenga cuidado de no cortar todo el camino a través del tejido, como las cortezas cubren el cerebro medio en esta región.
- Suavemente se burlan de el mesencéfalo y el cerebelo de una pieza de las dos cortezas. Los dos cortezas deben formar una forma cóncava.
- Separe las dos cortezas y orientar una sola corteza con el lado medial para su posterior disección. El hipocampo puede ser difícil de observar, pero está situado enfrente del bulbo olfatorio, que aparece como un pequeño nódulo en la punta de la corteza.
- Retire el hipocampo, que tiene una forma de media luna. Voltear la corteza a ver el lado dorsal.
- Usando el bulbo olfatorio como punto de partida, eliminar todas las meninges y el propio bulbo olfatorio de la corteza.
- Las cortezas disecados deben ser colocados en tubos cónicos de 15 ml con 14 ml de colsolución salina tamponada de Hank d en hielo.
2. Cell Culture (Día 0)
- Pre-capa 10 cm placas de cultivo de tejido con 5 mg / ml de poli-D-lisina (PDL) diluido en agua tratada en autoclave durante 3 horas a 37 ° C.
- Aspirar PDL, y las placas de lavado una vez con agua tratada en autoclave. Se seca la placa bajo la UV en la campana de cultivo de tejido durante 20 min. Este paso debe realizarse justo antes del proceso de disección.
- Aspirar el tampón de Hank a partir de tubos que contienen las cortezas de 4 cerebros cada uno, se aplican 4 ml de solución de 1x tripsina / EDTA, se tritura el tejido con p1000 de la punta, y los tubos en lugar de 37 ° C incubadora durante 15 min.
- Añadir 4 ml de medios completos microglial por tubo para detener la digestión enzimática, la mezcla, y girar hacia abajo contenidos en 1.5K rpm durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y repetir el lavado con 4 ml de medio completo. Resuspender las células en 10 ml de medio microgliales completo (DMEM con 10% de SFB, 1% de piruvato de sodio, 0,08% gentamicina), y filtrar con un 40 micron filtro de células de malla.
- Placa con una densidad de 8 cortezas por 10 ml de una placa de cultivo de 10 cm de tejido y colocar en un incubador de cultivo de tejidos a 37 º C y CO2 al 5% (ver protocolo Microglia adulto).
(Día 3)
- Cambie los medios en todos los platos de cultivo celular con medios microgliales completos.
(Día 10)
- Añadir 400 microlitros de 60 mM de lidocaína en HBSS (para separar la microglía) en el medio de las placas de cultivo de tejidos de 10 cm y se incuba a temperatura ambiente (RT) durante 10-15 min.
- Recoge los medios de comunicación / suspensión de células de la placa, y lavar la placa una vez con tampón de Hank. Recoger el tampón de lavado para recuperar microglia restante.
- Añadir 5 mM de EDTA (pH 8,0) a la suspensión celular a una concentración final de 50 mM o a una dilución 1/100.
- Centrifugar la suspensión celular a 1000 xg (1.500 rpm) durante 5 minutos y volver a suspender en 1 ml de DMEM con FBS al 1%.
- Contar el número de células viables (según Mi Adultocroglia 3.1/3.2) y las células se dividieron en placas de cultivo de tejidos en la densidad experimental deseado. Aproximadamente 1x10 6 microglia se recolectan de una placa de 10 cm que contiene la corteza del cerebro 4. Por inmunofluorescencia, se recomienda una densidad de 2.5x10 4 células por 18 mm cubreobjetos.
- Permitir al menos 24 horas para las células microgliales para volver completamente a su, ramificado estado de reposo antes de su uso.
El texto del Protocolo: (Microglia adulto)
1. Colección de tejidos
- Placas de cultivo de tejidos de capa con poli-D-lisina (PDL) durante 3 horas a 37 ° C o durante la noche a 4 ° C. Lavar las placas una vez con agua tratada en autoclave inmediatamente antes de su uso.
- La eutanasia ratón por asfixia de CO 2 y de cerciorarse de que la eutanasia se ha completado. Limpiar el área de la médula espinal con etanol al 70%.
- El uso de un par de tijeras corta la piel en la parte superior de la médula espinal, a continuación, proceder al corte de la médula espinal a cabo región de T1 a T12. Cortarel músculo restante fuera de los lados de la médula espinal.
- Reducir lentamente las vértebras usando micro tijeras mientras sostiene suavemente la médula espinal con los dedos. Sea no se tiene cuidado a la punción de la médula espinal como el tejido es muy suave. Extraer lentamente la médula espinal utilizando microforceps.
- Sumergir la médula espinal en una placa de Petri que contiene HBSS enfriado con hielo. El uso de un microscopio de luz eliminar todos meninges visibles utilizando microforceps
- Cortar la médula espinal en los segmentos transversales suficientemente pequeños como para generar varios fragmentos. El espesor de los fragmentos no debe ser más de 2 mm con el fin de facilitar la digestión eficiente. Transferencia de las piezas de la médula espinal a un tubo cónico de 15 ml que contiene 1 ml de HBSS enfriado con hielo. Mantenga el tubo en hielo hasta la etapa de digestión.
2. La digestión del tejido
- Aspirar HBSS de tubo cónico de 15 ml que contiene tejido de la médula espinal. Tenga cuidado de no aspirar cualquier pedazo de tejido.
- Añadir 1 ml de tripsina (2.5 g / L de tripsina porcina irradiada y 0,2 g / l de EDTA en HBSS) y se incuba a 37 ° C durante 30 min.
- Para detener la digestión eliminar la tripsina y añadir 3 ml de medio de microglia primario que contiene suero para detener la digestión enzimática.
- Pipetear hacia arriba y hacia abajo para sacar el tejido. Se filtra la suspensión celular usando un filtro de células de 40 micras.
3. Recuento celular y Recubrimiento
- Mezclar un volumen igual de suspensión de células y la solución de DAPI.
- Contar las células usando un hemocitómetro.
- Placa a una densidad entre 5-7x10 5 células / ml en PDL recubiertos 35 x 10 mm platos. Revestimiento a una densidad más baja impidió el crecimiento celular incluso cuando las células se cultivaron en placas de 12 pocillos que tienen un área más pequeña en comparación con 35 platos de 10 mm x.
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Representative Results
Un ejemplo de las células microgliales en reposo y activados se muestra en la Figura 1. La microglía se visualizaron 24 h después de la siembra (Figura 1a) y exhiben morfología ramificada (en reposo). La exposición al reactivo de cebado, lipopolisacárido (LPS) bacterianos en los resultados de los cambios en la morfología microglial como las células se activan (Figura 1b).
Un ejemplo de recuento de las células para la deposición se muestra en la Figura 2. Debido a la presencia de restos de células, se añadió DAPI Fluoromount (en lugar de azul de tripano) a un volumen igual de la suspensión celular y se coloca en un hemocitómetro para el recuento de células como se describe en 4, 13. Células positivas DAPI se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia. El uso de la configuración de campo brillante facilitado un recuento exacto de las células presentes (Figura 2). Alrededor de 7x10 5 células se obtuvieron por médula espinal de ratón.
contenido "> Las células se sembraron en PDL recubiertos 35 x 10 mm en placas de cultivo de tejidos. Hemos encontrado que el recubrimiento con el PDL era un paso crítico, ya que las células no se adhieren / crecen a menos que las placas se recubrieron. microglía completamente fijación a la placa de cultivo Después de aproximadamente dos días de cultivo (Figura 3). La médula espinal de los ratones MacGreen, que se utilizó expresa GFP bajo el control del promotor de microglía / macrófagos CSF-1R, para este experimento.
Figura 1. Imagen representativa de la microglia neonatal después de dos días de cultivo. Microglía se cultivaron de P0 C57/BL6 crías de ratón, y se sembraron en cubreobjetos recubiertos con una densidad de 2,5 x 10 5 células / ml. A, c. Microglia no tratadas que han retornado a un , el estado de reposo ramificado, b, d . La microglía trató con 100 ng / ml de LPS durante 4 horas y muestran una, forma ameboide activado; Iba1 (verde, un marcador específico de macrófagos / microglia una proteína de superficie celular) se ha utilizado para visualizar las células, mientras que las imágenes de campo claro se utilizaron para mostrar poblaciones de células totales. DAPI Fluoromount se utilizó para visualizar los núcleos e indicar la pureza de la cultura.
Figura 2. Recuento de células. Fluoromount DAPI se mezcló con un volumen igual de suspensión de células y se coloca en un hemocitómetro. Se combinaron el campo claro y el ajuste de fluorescencia para visualizar las células positivas DAPI y la rejilla hemocitómetro para un recuento de células precisa.
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Figura 3. Imágenes representativas de adultos microglia la médula espinal después de dos días de cultivo. un. La médula espinal de un ratón MacGreen se utilizó para el procedimiento de cultivo. Las células se sembraron en un PDL-revestido 35 x 10 mm de placa de cultivo tisular a una densidad de 7x10 5 células / ml. B. Imagen de campo brillante de la microglia la médula espinal después de dos días en cultivo. Microglía (flechas azules) y astrocitos (flechas rojas) se muestran. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
La microglía modular SNC funcionamiento normal, así como las respuestas inflamatorias a diversas patologías. Funcional remodelación sináptica por la microglía se ha implicado en el mantenimiento de la homeostasis normal del cerebro 15. Durante la cascada neurogénica que participan en el aclaramiento de las células progenitoras neurales de la circunvolución dentada del hipocampo 4, 16. Por lo tanto, es necesario desarrollar un sistema de cultivo en el que para estudiar la microglía neonatal y adulto, que cubrirá la vasta franja del desarrollo y la edad adulta, a lo largo de la microglia que tiene múltiples funciones discretas. Hemos descrito un método rápido y eficiente a la cultura microglía del adulto médula espinal y el cerebro neonatal. Hemos sido capaces de obtener preparaciones de células en el adulto que eran 70% microglia con el porcentaje restante que consiste en los astrocitos, y la pureza de las preparaciones de microgliales neonatales se aproximan al 100%.
Dado el papel that han astrocitos en la regulación del estado de activación de la microglia 17-19, es importante para optimizar las condiciones de cultivo para mejorar la pureza de la cultura. Aunque la combinación de la suspensión de células con un volumen igual de DAPI Fluoromount permite un recuento de células precisa, no es posible distinguir la microglía de otros tipos de células utilizando este método. Para mejorar la pureza de la preparación microglial adulto, Dynabeads recubiertas con GFP pueden ser incubadas con la suspensión celular derivada de MacGreen ratones, cuyas células mieloide ya expresa GFP 20. Otra sugerencia sería la de la placa de la suspensión de células mixtas en placas de cultivo que no han sido previamente recubierto con el PDL para impedir la adhesión astrocítico 13. Sin embargo, hemos encontrado que no hay células crecen en la placa a menos que hayan sido previamente recubierto, que en nuestras manos es aplicable tanto a las células neonatales y adultos.
Muchos protocolos que describen métodos para aisladoración y las planchas de microglia primaria de cualquiera de rata o ratón tejido cerebral utilizan temblor de culturas gliales mixtos para separar la microglia y obtener así una población purificada para experimentos posteriores 12. Nuestro protocolo difiere más notablemente en la exclusión de la etapa de agitación, y en lugar de centrarse en la purificación de una población microglial-sólo a través de condiciones de cultivo tituladas precisamente. En nuestra experiencia, sacudiendo cultivos gliales mixtos con el fin de eliminar la microglía es eficaz, pero tiene un inconveniente significativo - el hecho de que la microglia sacudido tomar muchos días para volver a una morfología de reposo completo 12. Esto puede ser problemático dado que la microglia activada tiene un perfil de citoquina considerablemente diferente 21. Nuestro protocolo, mientras que toma un poco más largo para obtener la microglía pura, mantiene las células en un estado de reposo a lo largo de. Al igual que con la preparación de adultos discutido en el párrafo siguiente, la única desventaja de este método es una posibilidad de pequeña contaminación de otros tipos de células, a saber, astrocitos.
Nuestra técnica para el cultivo de adultos microglia varía considerablemente de métodos preexistentes. Muchos protocolos requieren el uso de centrifugación en gradiente de densidad (Percoll), así como el uso de la citometría de flujo para obtener una población pura microglial 22. En nuestro método de crear una cultura microglial estable de médula espinal adulta no utilizamos cualquiera de estas técnicas, lo que lo convierte en un tiempo considerablemente menor protocolo y complicado para el investigador a seguir. Mientras que la gran mayoría de las preparaciones microgliales adultos provienen de tejido cerebral, la médula espinal está compuesto de los mismos tipos de células - y por lo tanto nuestro protocolo presenta una comparación justa con los métodos descritos previamente 22. Una solución de compromiso en nuestro protocolo es una preparación microglial ligeramente menos puro, que consiste en 70% microglia, con la fracción restante de las células son en su mayoría de los astrocitos originalesn. Esta discrepancia potencialmente se puede superar usando una etapa adicional de aislamiento de la microglia más puro utilizando marcadores muy específicas del tipo de células del linaje microglial tales como IBA-1 y F4/80 conjugado a perlas magnéticas.
La mayoría de los estudios que evalúan el papel de la microglia en las enfermedades neurológicas que afectan la médula espinal se han llevado a cabo utilizando células del cerebro neonatal, y, mientras que este es un enfoque sólido para responder a preguntas acerca de un papel para la microglía en el desarrollo normal, así como patologías que afectan a la cerebro específicamente, sentimos que un método más específico tuvo que ser creado para estudiar la función de la microglia en el adulto la médula espinal. Nuestro método neonatal es una forma muy eficiente para responder a la mayoría de preguntas relacionadas con el funcionamiento normal del cerebro, así como en ciertas condiciones patológicas, y el método de adulto es una buena alternativa para el uso de células neonatales para tales estudios, dada la variabilidad en la respuesta inmunológicas entre neonatal microglia y células adultas y entre la microglía del cerebro y la médula espinal 6-9. La microglía obtenido a partir de los dos métodos descritos también son apropiados para los estudios in vitro de co-cultivo (que principalmente les cultura con las neuronas u oligodendrocitos en nuestro laboratorio) que la dirección del efecto de la microglia en otros tipos de células, así como la respuesta microglial neonatal y adulto para activar estímulos.
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Disclosures
Los autores tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a los miembros del laboratorio Tsirka por sus consejos y comentarios útiles. Este trabajo fue apoyado por R01NS42168 a SET, 12PRE12060489 a RB, un IGERT NSF-3MT y una disertación comunión Turner a LT, y NSF-3MT IGERT a JCN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
References
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