Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

منهج في التثقيف الجنينية Published: September 21, 2013 doi: 10.3791/50649
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

Summary

نحن هنا وصف البروتوكول المنقح للثقافة واسعة النطاق من الجنينية C. ايليجانس الخلايا. الجنينية C. ايليجانس الخلايا المستزرعة في المختبر باستخدام هذا الأسلوب، ويبدو أن التفريق وألخص التعبير عن الجينات بطريقة معينة من الخلايا. التقنيات التي تتطلب الوصول المباشر إلى الخلايا أو عزل أنواع معينة من الخلايا من الأنسجة الأخرى يمكن تطبيقها على C. ايليجانس الخلايا المستزرعة.

Abstract

C. ايليجانس هو نظام نموذجي قوية، حيث التقنيات الوراثية الجزيئية وقابلة للتطبيق بسهولة. حتى وقت قريب على الرغم من التقنيات التي تتطلب الوصول المباشر إلى الخلايا وعزل أنواع معينة من الخلايا، لا يمكن تطبيقها في C. ايليجانس. وكان يرجع ذلك إلى حقيقة أن تقتصر الأنسجة داخل بشرة الضغط الذي لا يهضم بسهولة عن طريق العلاج مع الانزيمات و / أو المنظفات هذا القيد. على أساس العمل الرائد في وقت مبكر عن طريق ليرد بلوم، كريستنسن وزملاؤه 1 وضعت طريقة قوية لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في نطاق واسع. يتم عزل البيض من البالغين حامل عن طريق العلاج مع التبييض / هيدروكسيد الصوديوم وعلاجها في وقت لاحق مع كيتيناز لإزالة قشر البيض. ثم يتم فصل الخلايا الجنينية من قبل pipetting اليدوي ومطلي على الزجاج المغطاة الركيزة في وسائل الإعلام التخصيب المصل. في غضون 24 ساعة من زنازين العزل تبدأ في التفريق عن طريق تغيير التشكل وبالإعراب عن MARKE خلية معينةروبية. C. ايليجانس الخلايا مثقف باستخدام هذا الأسلوب البقاء على قيد الحياة لمدة تصل 2 أسابيع في المختبر، وكانت تستخدم للالكهربية، immunochemical، ويحلل التصوير، فضلا عن أنها تم فرزها واستخدامها لالتنميط ميكروأري.

Introduction

انواع معينة ايليجانس (C. ايليجانس) هو كائن نموذج قوي للتحقيق الأسس الجزيئية وظيفة الخلوية، والتمايز، والسلوك. بينما في الجينوم، الأيض، المسارات البنائية تشبه الفقاريات '، قابلية الإستطراق الوراثية والجزيئية التي هي أكبر بكثير 2. بين مزاياه وحجمها والتشريح بسيطة، ودورة الحياة السريع (3 أيام في 25 درجة مئوية)، فترة حياة قصيرة (2 أسابيع)، وعدد كبير من ذرية (> 200). نظرا لطبيعتها خنثوي ودورة حياة قصيرة، التلاعب الجزيئية والجينية هي واضحة في C. ايليجانس، بما في ذلك جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا 3،4 وتطبيق تقنيات الجينات تدق إلى أسفل مثل تدخل الحمض النووي الريبي 5. C. الجسم ايليجانس وقشر البيض هي شفافة. لذا الخلايا يمكن تصور بسهولة في كل من الكبار والجنين باستخدام المجهر القياسية. في السنوات ال 40 الماضية، وC. ايليجانس لC. البحث ايليجانس بما في ذلك مجموعة كبيرة من المسوخ، وبالضربة القاضية المعدلة وراثيا، وصفا مفصلا لعلم التشريح والتنمية 6،7، بما في ذلك إعادة كاملة للجهاز العصبي 8، والجينوم التسلسل تماما وهو مشروح بشكل جيد ومتاحة للمجتمع بأكمله ( www.wormbase.com ).

على الرغم من العديد من المزايا، وبعض المناهج التجريبية تم تحدي في C. ايليجانس. وتشمل هذه تلك التي تتطلب الوصول إلى غشاء البلازما من الخلايا والأنسجة أو عزل أنواع الخلايا. في الواقع C. تقتصر الأنسجة ايليجانس داخل هيكل عظمي الهيدروستاتيكي الضغط، والتي لا يتم هضمها بسهولة عن طريق العلاج الأنزيمية أو المنظفات. في نهاية 1990s ميريام غودمان وجانيت ريتشموند رائدة أساليب التسجيلات الكهربية من C. ايليجانسالخلايا العصبية والخلايا العضلية في الموقع 9،10. في حين أن هذه الأساليب قدم لنا معلومات هامة عن العصبية وظيفة العضلات في الجسم الحي، فهي صعبة وانخفاض الإنتاجية. وقد وضعت وسائل بديلة لدراسة وظيفة الخلايا في الجسم الحي، ومعظمهم لا سيما في مجال التصوير الكالسيوم الجسم الحي باستخدام أجهزة استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا مثل GCamP وCAMELEON 11-13. على الرغم من هذه الأساليب، لا تسمح باستخدام أدوات الدوائية لأنها تطبق على الحيوانات الحية سليمة.

المحاولة الأولى في زراعة C. وقدم الخلايا ايليجانس في المختبر في نطاق واسع من قبل ليرد بلوم أثناء إعداد أطروحة الدكتوراه 14. للأسف، واجه صعوبات مع التصاق الفقراء من الخلايا إلى الركيزة، وسوء تمايز الخلايا والبقاء على قيد الحياة حالت دون قيام هذا البروتوكول في وقت مبكر باعتبارها طريقة قوية ثقافة الخلية. في عام 1995 نشرت إدغار وزملاؤه إجراءللتحقيق في انقسام الخلايا والتشكل من خلال العزلة وثقافة C واحد. ايليجانس أجنة 15. الخلايا الجنينية التي حصل عليها الهضم من قشر البيض مع مزيج من العلاج الأنزيمية والتفكك دليل، واصلت لتتكاثر، وتنتج ما يصل الى 500 ~ 15 الخلايا. في وقت لاحق، ليونج وزملاء العمل مثقف أعداد صغيرة من لدراسة التشكل عن Blastomeres المعوية. أنها أظهرت أن واحدا في المختبر معزولة E قسيم أرومي إنتاج الخلايا المعوية الاستقطاب التي خلقت بنية مشابهة لمعة الأمعاء من خلال التفاعل مع بعضهم البعض من خلال تقاطعات الملتصقة القمي 16. كما ذكرت بخنر وزملاؤه طريقة مماثلة لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في المختبر 17.

على أساس هذا العمل في وقت مبكر، وضعت كريستنسن وزملاؤه بروتوكول قوية لزراعة الجنينية C. ايليجانس الخلايا في المختبر 1. همأظهرت أن معزولة C. ايليجانس الخلايا يمكن أن تفرق في أنواع الخلايا المختلفة، والمحافظة على الميزات التي يمتلكها في الجسم الحي، بما في ذلك التعبير عن علامات خلية محددة. العديد من التقنيات التي تشكل تحديا في الجسم الحي، ويمكن تطبيقها على معزولة C. ايليجانس الخلايا الجنينية. وتشمل هذه الكهربية 1،18 19، والتصوير، وتقنيات immunochemical 20،21، وكذلك عزل أنواع معينة من الخلايا عن طريق خلية نيون المنشط الفرز (FACS) لبناء مكتبات [كدنا] خلية محددة 22،23. تقنيات الجينات ضربة قاضية مثل تدخل الحمض النووي الريبي (رني) يمكن تطبيقها على مثقف C. ايليجانس الخلايا 1 ورواية أسلوب وضع العلامات الأيضية باستخدام Azido السكر كأداة لاكتشاف بروتين سكري تم تطويرها مؤخرا للمثقف في المختبر C. ايليجانس الخلايا 24.

في الختام، يوسع طريقة زراعة الخلايا المصفوفة ستقنيات و التي يمكن تطبيقها على C. ايليجانس نموذج في محاولة فك وظيفة الجين في سياق كائن حي. نحن هنا وصف بروتوكول لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في المختبر، والتي تقوم أساسا على البروتوكول وصف لأول مرة من قبل كريستيانسن و1 الزملاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

العلامات النجمية (*) تشير إلى خطوات جديدة أو معدلة بالمقارنة مع كريستنسن وآخرون. 1

1. إعداد المواد

  1. يتطلب إجراء زراعة الخلايا كميات كبيرة من البيض معزولة عن البالغين حامل. تنمو C. ايليجانس على 8P لوحات أجار المصنف مع NA22 (المتاحة من خلال كونسورتيوم الوراثية C. ايليجانس - CGC) لعزل البكتيريا كميات كبيرة من البيض. في هذه اللوحات كمية ببتون المستخدمة هي 8 أضعاف المبلغ الذي يستخدم عادة لوحات NGM. تركيز أعلى ببتون يحافظ على نمو البكتيريا NA22 أكثر كفاءة، والتي تتعارض مع OP50، تنمو في طبقات سميكة.

8P لوحات وصفة:

حل 3 غرام كلوريد الصوديوم، 20 غراما Bacto-ببتون، 25 غراما أجار في 1 لتر من الماء المعقم المقطر والأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة. اسمحوا بارد في المتوسط ​​55 درجة مئوية ثم قم بإضافة تصفيتها العقيمة-1 مل من الكولسترول (5 ملغ / مل في ETOH)، 1 مل من 1 MgCl 2، 1 مل من MgSO 4 و 25 مل من العازلة KP (الأسهم من 500 مل: 5 ز K 2 هبو 4، 30 غ KH 2 PO 4، ودرجة الحموضة 6.00). صب السائل أجار المتوسطة إلى 10 سم أطباق بتري (25 مل / لوحة).

  1. نشر في اليوم التالي السطح كله من كل المخصب ببتون وحة آغار مع 1 مل من NA22 E. القولونية بين عشية وضحاها مثقف في وسائل الإعلام 2XYT (16 ز تريبتون، استخراج 10 ز الخميرة، 5 ز كلوريد الصوديوم في 1 لتر من الماء المعقم، ودرجة الحموضة 7.0) في 37 درجة مئوية. تشكل هذه البكتيريا مصدر الغذاء وفيرة من شأنها أن تشكل طبقة سميكة دعم نمو كميات كبيرة من البالغين حامل. ترك لوحات المصنف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة للسماح نمو البكتيريا. ويمكن تسريع هذه العملية عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 4-5 ساعة.
  2. نقل الحيوانات جوعا حتى المصنفة 8P لوحات. غسل الحيوانات قبالة لوحة NGM جوعا باستخدام 5-6 مل من العازلة M9 أو الماء وإضافة 1-2 مل من هذا التعليق على كل لوحة 8P.
  3. تسمح بنمو وتكاثر الحيوانات الاتحاد الوطني للعماليتم ملؤها ايل لوحات في التقاء قبل الكبار حامل.
  4. عزل البيض اللازمة لإعداد C. ايليجانس الخلايا الجنينية، من البالغين حامل باستخدام 5-6 مل من محلول تحلل.

حل تحلل وصفة

5 مل من الطازجة بليتش، 1.25 مل من هيدروكسيد الصوديوم 10 N و 18.5 مل من H 2 O. العقيمة يجب أن يكون مستعدا هذا الخليط الطازجة قبل كل استعمال.

  1. غسل البيض معزولة عن البالغين باستخدام حامل البيض العازلة:

العازلة البيض وصفة

118 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 48 ملي بوكل، 2 مم CaCl 2، 2 مم MgCl 2، 25 ملي Hepes، ودرجة الحموضة 7.3، الأسمولية 340 الميلي أسمول.

  1. إزالة قشر البيض الذي يحيط البيض عن طريق العلاج مع كيتيناز. كيتيناز هو انزيم مع أعلى نشاط في الرقم الهيدروجيني الحمضية 25. حل كيتيناز (سيغما، كتالوج رقم C6137) في البيض العازلة درجة الحموضة 6.5 عند تركيز النهائي من 2 ملغ / مل. تخزين الأسهم كيتينازالحل في -20 درجة مئوية في 1 مل مأخوذة في معقم 15 مل أنابيب مخروطية. ويمكن تخزين aliquots في -20 درجة مئوية تصل إلى بضعة أشهر.
  2. تنمو C. ايليجانس الخلايا المستزرعة coverslips على تعقيمها (12 مم) مغطاة الفول السوداني كتين. حل الفول السوداني كتين في الماء المعقم (0.5 ملغ / مل). لا ينبغي أن تتم تصفيته الفول السوداني حل كتين أو تعقيمها. كما أنها لا تحتاج إلى أن تعامل مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. مخزن 2 مل aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  3. كاملة مستنبت الخلية (500 مل) يحتوي على 500 مل L-15 مستنبت من GIBCO، 50 مل مصل بقري جنيني (الحرارة المعطل)، 7.7 غرام السكروز (45 الميلي أسمول)، 5 مل من 100 U / مل البنسلين و100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين (2٪). ثم يتم تصفية المتوسطة كاملة باستخدام فلتر المسام 0.20 ميكرون.

لاحظ أن المخزن المؤقت البيض ومستنبت لها الأسمولية من 340 و 345 على التوالي الميلي أسمول. في الواقع، خلافا للخلايا الثدييات، C. الخلايا ايليجانس ديك الأسمولية عالية نسبياالتي تحتاج إلى أن تؤخذ في العد عند إعداد الحلول التي سوف تأتي في اتصال مباشر مع غشاء البلازما من الخلايا. تم تعديل وصفات من هذه الكواشف للوصول إلى الأسمولية المطلوب، الذي يقاس باستخدام مقياس التناضح 1. فإنه ليس من الضروري استخدام مقياس التناضح إذا تم اتباع هذه الوصفات بالضبط ويتم استخدام الرعاية في إعداد هذه الكواشف. ومع ذلك، ينبغي للمرء أن استخدام osmoter إذا كان بحاجة إلى حلول أخرى لتكون مستعدة، التي لا يتم الإبلاغ عن وصفات هنا أو في أي من المطبوعات التي تستخدم C. ايليجانس الخلايا المستزرعة.

2. عزل البيض

  1. فمن المستحسن أن تبدأ مع أربعة 8P على الأقل لوحات لجمع ما يكفي من البيض لمدة 12 بئرا من الخلايا المستزرعة (في 24 لوحات جيدة).
  2. قبل البدء مع الإجراء ذوبان الجليد أنبوب واحد من محلول الفول السوداني الأسهم كتين. وضع coverslips تعقيمها في الجزء السفلي من الآبار في 24 لوحة جيدا وإضافة 200 ميكرولتر من الفول السوداني لكتين لل coverslips. احتضان لمدة 1 ساعة أو شntil الخلايا جاهزة للمطلي. إزالة تماما كتين الفول السوداني ويغسل مرة واحدة مع الآبار 1 مل من الماء المعقم تعقيمها. الاستئصال الكامل للكتين الفول السوداني من لل coverslips أمر ضروري لتجنب تراكمها الخلية.
  3. غسل البالغين حامل قبالة لوحات أجار تعقيمها باستخدام الماء المعقم. جمع التعليق إلى قسمين العقيمة المخروطية أنبوب 50 مل. ترك الأنابيب على الجليد لمدة تصل إلى 5 دقائق للسماح للترسيب الديدان في الجزء السفلي من الأنابيب (*). إزالة المياه مع ماصة نقل البلاستيك واستبدالها بالماء تعقيمها العقيمة الطازجة. بيليه الديدان حسب الجدول بين كبار الطرد المركزي في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة (*). كرر هذه الخطوة الأخيرة على الأقل 3.
  4. نقل الديدان الى العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي وبيليه لهم في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة (*). لا تستخدم أعلى سرعة الطرد المركزي لتجنب جمع البكتيريا في الجزء السفلي من الأنبوب كذلك. أحيانا بعد centrifugations لا مكعبات الديدان تماما. بالعربيةثالثا كل غسل وقبل إزالة طاف، ووضع الأنابيب لمدة 5 دقائق على الجليد. في مبرد المياه الديدان يعجل في الجزء السفلي من الأنبوب.
  5. إزالة الماء وإضافة 5-6 مل من محلول تحلل (انظر ضبط المواد متابعة). صخرة تعليق بلطف لمدة 5-10 دقائق ثم تبدأ رصد دودة تحلل تحت stereomicroscope كل 2-3 دقائق. يمكن وضع قطرة من التعليق أيضا على ساترة لتسهيل التفتيش. فترة حضانة تختلف تبعا لنضارة التبييض، شراء زجاجات صغيرة من التبييض وفتح زجاجة جديدة كل شهر.
  6. عندما يتم ~ هي lysed 70-80٪ من الديدان (10 دقيقة من بداية الحضانة)، ووقف رد فعل تحلل بإضافة 9 مل من البيض العازلة درجة الحموضة 7.3 (انظر ضبط المواد متابعة). الطرد المركزي تعليق في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة. من هذه النقطة لديك ناسخ بنسن على، على مقاعد البدلاء لمنع إعادة التلوث من البيض (*).
  7. إزالة بعناية طاف باستخدام ماصة معقمة نقل البلاستيك وغسل بيليه 3-4س مع العازلة البيض حتى الحل واضح. تأكد من أن يمزج جيدا بيليه في المخزن المؤقت البيض أثناء كل غسل.
  8. يتم فصل البيض من جثث الحيوانات باستخدام 30٪ محلول السكروز. resuspend وبيليه في 2 مل من العازلة بيضة معقمة وإضافة 2 مل من 60٪ محلول السكروز (الأسهم في المخزن بيضة معقمة). تخلط جيدا وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) (*).
  9. إزالة بعناية من أنابيب الطرد المركزي. البيض تطفو في الجزء العلوي من الحل. باستخدام pipettor P1000 ونصائح عقيمة، ونقل عن البيض الطازج في 15 مل العقيمة أنبوب مخروطي.
  10. إضافة 10 مل من العازلة البيض العقيمة في أنبوب والطرد المركزي في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة. تكرار غسل 3 ×. تأكد من معلق البيض تماما في المخزن المؤقت البيض أثناء كل غسل.

3. خلايا الجنينية التفكك

إجراء الخطوات التالية من الإجراء تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء تدفق الصفحي. بينما الحيواناتثوب على البكتيريا لوحات، ويغسل والعلاج مع الحل تحلل تحتوي على مواد التبييض يجب القضاء على معظم إن لم يكن كل البكتيريا. وبالتالي استخدام غطاء الصفحي في هذه المرحلة من الإجراء يمنع تلوث جديدة لتعليق البيض.

  1. في resuspend مكعبات البيض في 1 مل من 2 ملغ / مل كيتيناز (الأسهم في البيض العازلة درجة الحموضة 6.5 (*)) ونقلها إلى العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. موسيقى الروك في أنبوب لمدة 10-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فترة حضانة بالضبط يتغير وفقا لنضارة الإنزيم ودرجة حرارة الغرفة، ولذا ينبغي أن تحدد لكل إعداد. فمن المستحسن لبدء مراقبة البيض تحت المجهر مقلوب خلية الثقافة بعد 10 دقيقة من الحضانة. ملاحظة: في تجربتنا، وانخفاض الرقم الهيدروجيني يزيد من النشاط الأنزيمي كيتيناز. لهذا السبب نستخدم العازلة البيض في درجة الحموضة 6.5 حل كيتيناز (وصفة ذكرت أعلاه، حيث يتم ضبط درجة الحموضة إلى 6.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم).
  2. عندما يتم هضمها ~ 80٪ من البيض من قبلالعلاج كيتيناز (الشكلان 1 AB)، بيليه البيض بواسطة الطرد المركزي في 900 x ج (~ 2،500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق (*). باستخدام pipettor P1000 ونصائح عقيمة، وإزالة بعناية طاف وإضافة 3 مل من L-15 متوسطة (*).
  3. نقل البيض في طبق قطره 6 سم وفصل بلطف الخلايا باستخدام محقنة معقمة 10 مل مزودة إبرة G 18. رصد درجة التفكك عن طريق وضع قطرة من تعليق في البلاستيك طبق بيتري الطازجة وعن طريق عرض تحت المجهر. لا نضح الهواء في حقنة خلال هذا الإجراء لتجنب الخلايا الضارة. تواصل التفكك حتى يتم فصلها ~ 80٪ من الخلايا.
  4. تحديد التعليق باستخدام العقيمة 5 ميكرون ميليبور التصفية. يجب أن تتم تصفيته تعليق خلية من أجل إزالة كتل الخلايا والبيض واليرقات عسر الهضم. تصفية 4-5 مل إضافية من جديد L-15 وسائل الإعلام من خلال تصفية لاسترداد جميع الخلايا. لا تستخدم القوة المفرطة أثناء خطوة الترشيح لتجنب داmaging مرشح و / أو الخلايا.

4. زراعة خلايا

  1. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في فصلها 900 x ج (~ 2،500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق (*). باستخدام pipettor P1000 ونصائح عقيمة إزالة بعناية طاف جميع. resuspend الخلايا مكعبات كاملة في L-15 لوحة متوسطة و1 مل / جيد. مبلغ المتوسطة أضاف يعتمد على عدد من لوحات 8P المستخدمة، والتقاء الديدان على لوحات، ونوع التجارب التي سوف يتم تنفيذها على الخلايا. يمكن تحديد كثافة الخلية باستخدام عدادة الكريات. للحصول على تسجيلات التصحيح، المشبك تصفيح كثافة ~ 230،000 خلية / سم 2 هو الأمثل.
  2. الحفاظ على لوحة 24 بئرا في وعاء تثبرور بلاستيكية تحتوي على مناشف ورقية مبللة لتجنب التبخر من مستنبت. تخزين الحاويات في حاضنة ترطيب عند 20 درجة مئوية والهواء المحيط.
  3. وعادة ما تكون الخلايا جاهزة للتجارب في غضون 24 ساعة عندما تمايز المورفولوجية وصريحةايون من علامات GFP كاملة. يمكن أن تظل الخلايا في الثقافة لمدة تصل الى 2 أسابيع ولكنها عادة ما تكون أكثر صحية تصل إلى 7-9 أيام بعد الطلاء. المتوسط ​​يحتاج إلى استبداله مرة واحدة يوميا للحفاظ على الخلايا السليمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C. ايليجانس الخلايا المستزرعة والتفريق خلية صريحة علامات محددة

أظهرت كريستنسن وزملاؤه باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق أن> 99٪ من الجنينية C. الخلايا ايليجانس تنجو من إجراء العزل. في يوم 9 و 22 بعد الطلاء، 85٪ و 65٪ على التوالي لا تزال على قيد الحياة 1. معزولة الجنينية C. الخلايا ايليجانس يجب أن تلتزم ركيزة من أجل التفريق. الخلايا التي تفشل في الالتزام كتل الشكل وليس من الواضح ما اذا كانوا على قيد الحياة. تمايز الخلايا تبدأ 2-3 ساعة بعد الطلاء ويستمر لمدة 24 ساعة ~. في غضون 24 ساعة، والخلايا تأخذ على الأشكال التضاريسية محددة. وبالتالي، الخلايا العصبية ترسل العمليات 1،18-20، تشكيل خلايا العضلات مثل إصبع ممدود هياكل مماثلة لتلك التي ينظر في الجسم الحي 1 و خلايا القناة تشكيل التجويف 17. الميزات المورفولوجية في المختبر هي مماثلا لتلك الموجودة في الجسم الحي. على سبيل المثال، <م> في المختبر مثقف الخلايا العصبية التي تعمل باللمس ALM وPLM (حددها التعبير عن بميك-4 :: GFP) تطوير اثنين فقط من العمليات العصبية مع يعد واحد من غيرها، كما هو الحال في الجسم الحي 1،20 (الشكل 2A). هذا يشير إلى أن بعض الآليات الجزيئية التي تدفع التفريق بين ما لا يقل عن C. الخلايا ايليجانس هي خلايا مستقلة وبالتالي يمكن تلخيصها في المختبر.

في عام 1990، رائدة تشالفي استخدام بروتين الفلورية الخضراء (GFP) في C. ايليجانس لتسمية أنواع الخلايا التي يتم التعبير عن الجينات في المصالح 26. العمل المنجز حتى الآن على مثقف C. ايليجانس الخلايا الجنينية التي تدعم التعبير عن GFP في أنواع معينة من الخلايا يمكن تلخيصها في المختبر 1،18-20،27 (الشكل 2A). وعلاوة على ذلك نسبة الخلايا التي تعبر عن GFP في المختبر مشابهة للنسبة الموجودة في الجسم الحي. على سبيل المثال، UNC-4 مراسل homeodomainيتم التعبير عن الجينات في الخلايا العصبية الحركية في 13 الجنين ناضجة (13 من 550 خلايا 2.3٪) 28،29. الثعلب والزملاء، عد خلايا GFP :: UNC-4 في الثقافة وجدت أنها هي 2٪ من العدد الكلي للخلايا 23. وبالمثل، UNC-119، وهو بروتين اللازم لG البروتين الاتجار 30، وأعرب في معظم C. ايليجانس الخلايا العصبية وبعض خلايا العضلات (76٪ من الخلايا في يرقة L1 31). ذكرت كريستنسن وزملاؤه أن في الثقافة وحظ UNC-119 :: GFP التعبير في 74-76٪ من خلايا تشبه الخلايا العصبية والخلايا العضلية 1. وأخيرا، أعرب MEC-4، وmechanosensitive نا + / كا 2 + قناة الوحيدات اللازمة لمسة رقيقة في 32 6 الخلايا العصبية التي تعمل باللمس في الكبار C. ايليجانس. من هذه الخلايا العصبية التي تعمل باللمس ستة، وتستمد أربعة (زكاة المال وPLMs) embryonically. وبالتالي 4 من 550 (0.7٪) الخلايا الجنينية يجب التعبير عن GFP تحت سيطرة المروج MEC-4. في الواقع، الخلايا العصبية في الثقافةه التي تعبر عن بميك-4 :: GFP تشكل ~ 0.5٪ من العدد الكلي للخلايا 18،20.

علامات البروتين وتعديلات ما بعد النقل التي هي خلية محددة يمكن ملاحظتها أيضا في المختبر. على سبيل المثال، الأسيتيل تويولين ألفا فقط في الخلايا العصبية التي تعمل باللمس في C. ايليجانس 33. في المختبر، والعمليات من الخلايا العصبية التي تعمل باللمس وصمة عار مع الأجسام المضادة التي أثيرت ضد الأسيتيل ألفا تويولين 20 (الشكل 2B). الخلايا العصبية التي تعمل باللمس مثقف أيضا أن أعرب عن السامة متحولة قناة MEC-4 (د)، والذي يسبب موت الخلايا العصبية في الجسم الحي مسة 34. في الواقع، معربا عن GFP الخلايا العصبية التي أعدت من MEC-4 (د)؛ بميك-4 :: GFP سلالة في البداية موجودة في الثقافة ولكن بعد ذلك يتحول 20. الأهم من ذلك، لمس الخلايا العصبية أعدت من MEC-4 (د)؛ بميك-4 :: GFP تتصرف في المختبر على غرار كيف يتصرفون في الجسم الحي. على سبيل المثال، يمكن انقاذهم من الموت عن طريق العلاج معmiloride ودانترولين، أن قطع الغيار MEC-4 (د) الخلايا العصبية التي تعمل باللمس من انحطاط في الجسم الحي 20،35. على أن تبرم، ليس فقط C. ايليجانس الخلايا الجنينية شكليا تشبه الخلايا في الجسم الحي، لكنها أيضا تعبير عن علامات خلية معينة وموجودة بنفس النسبة كانت موجودة في الجسم الحي. أخذت معا، ودعم هذه البيانات التي مثقف C. الخلايا ايليجانس تشكل نظام جيد عموما لدراسة العمليات البيولوجية على المستويين الخلوي والجزيئي.

التصحيح، المشبك تحليل الكهربية من مثقف C. ايليجانس الخلايا

تقنية التصحيح، المشبك، الذي عرضه Sakmann وNeher في السبعينات لدراسة النشاط القنوات الأيونية من الخلايا في عزلة أو في الأنسجة يمكن تطبيقها على مثقف C. ايليجانس الخلايا 36. كانت كريستنسن وزملاؤه أول من القنوات الأيونية في دراسة مثقف C. الخلايا ايليجانس باستخدامالتصحيح، المشبك 1. منذ ذلك الحين، وقد وصفت K +، أنيوني، والقنوات غير انتقائية الموجبة (أرقام 2 م)، وكذلك نقل الدوبامين تعتمد في تربيتها قنوات C. ايليجانس 1،18،19،37. تقدم هذه الدراسات فهمنا لدور المواصلة الأيونية في وظيفة C. ايليجانس الخلايا العصبية. هناك عدد قليل من التعديلات التي تحتاج إلى أخذها في الاعتبار عند استخدام تقنية المشبك التصحيح لتسجيل نشاط القناة الايونية من مثقف C. ايليجانس الخلايا. هذه التعديلات ذات الصلة في معظمها إلى تسجيلات خلية كاملة. أولا، C. الخلايا ايليجانس صغيرة، على سبيل المثال، الخلايا العصبية ويبلغ قطرها 1-2 ميكرون. وبالتالي، تحتاج الماصات الزجاج لديك نصيحة صغيرة (0.5 ميكرومتر). نصائح ماصة صغيرة زيادة مقاومة المدخلات، مما أدى إلى تحفيز وتسجيل الأخطاء. للتخفيف من حدة هذه المشكلة، يمكن بناؤها الماصات لديك نصيحة صغيرة لكن مخروط واسعة. وضعت غودمان وLockery الأسلوب EMPloying الملمع النار مجهزة بمضخة هواء ذات ضغط مرتفع للماصات صب لهذا الشكل 38. الثانية، ونظرا لصغر حجم الخلايا، الحصول خلية كاملة باستخدام الشفط عادة النتائج في الأضرار التي لحقت الخلية. وعادة ما يتحقق نجاح أعلى من ذلك بكثير من خلال تطبيق دفعة عالية الجهد (للأقمار الكهربائية) إلى رقعة من الغشاء تحت غيض من ماصة. تكوينات أخرى من تقنية المشبك التصحيح (الخلية المرفقة، من الداخل إلى الخارج وخارج التدريجي) هي واضحة لتطبيقها على C. ايليجانس الخلايا المستزرعة، مع التعديل الوحيد الذي غيض من ماصة ينبغي أن تكون صغيرة إلى أن تأخذ في الاعتبار صغر حجم C. ايليجانس الخلايا. تقنية التصحيح مثقبة هو المعروف أكثر شاقة وتستغرق وقتا طويلا من تقنيات المشبك التصحيح الأخرى. ومع ذلك، فإنه قد تم تطبيقها بنجاح على C. وينبغي أن يكون ايليجانس الخلايا في الموقع 39، 40، وبالتالي المعمول بها في الثقافة كذلك.

التصوير الكالسيومتقنيات تطبيقها على C. الخلايا ايليجانس مثقف

وقد تم التحقيق في دور وظيفي من الكالسيوم الجهد بوابات قنوات 2 + (VGCC) في الخلايا العصبية والدبقية في مثقف C. ايليجانس الخلايا عن طريق التصوير الكالسيوم 20، 21، 41. وقد سمح تطبيق التصوير الكالسيوم في ثقافة استخدام المحاليل المحتوية على تركيزات عالية من بوكل للحث على الاستقطاب الخلية وحاصرات قنوات الكالسيوم لتبين مساهمة أنواع مختلفة من القنوات لتدفق الكالسيوم. على سبيل المثال، تم تحديد مساهمة نا + / كا 2 + نفاذية MEC-4 (د) القناة إلى تركيز الكالسيوم داخل الخلايا عن طريق التصوير باستخدام الكالسيوم CAMELEON YC2.12 في حضور وغياب DEG / ENAC حاصرات قنوات الأميلوريد. أثبتت تلك التجارب أن تدفق الكالسيوم الحساسة للأميلوريد موجود في الخلايا العصبية التي تعمل باللمس معربا عن MEC-4 (د) ولكن ليس في النوع البري الخلايا العصبية التي تعمل باللمس. استخدام حامل الأيون لpermeabilize غشاءلمس الخلايا العصبية ومعايرة CAMELEON (أرقام 3A وباء)، بيانكي وزملاؤه مصممون أيضا أن متوسط ​​تركيز الكالسيوم في الخلايا العصبية الحرة التي تعمل باللمس هي 200 نانومتر 20 (أرقام 3C وD). وبالمثل، حققت Frokjaer-جنسن وزملاؤه دور VGCCs EGL-19-36 وUNC في تنظيم الاستقطاب الناجم عن تدفق الكالسيوم في C. مثقف ايليجانس الخلايا العصبية ميكانيكية حسية معربا عن CAMELEON 21. وجدوا أن الاستقطاب من الخلايا العصبية التي تعمل باللمس الناجم عن الخلية K + في نطاق بين 20 ملم و 100 ملم، أدى إلى ارتفاع الكالسيوم داخل الخلايا التي كشفت عنها YFP / CFP تغير النسبة بين 17٪ و 70٪. علاوة على ذلك، تم تخفيض العابرين الكالسيوم عن طريق جي-19-36 UNC والطفرات فقدان وظيفة، ولم تكتشف في غياب خارج الخلية كا 2 + مما يدل على أن VGCCs تلعب دورا رئيسيا في استثارة C. ايليجانس لمس الخلايا العصبية 21.

درست شجاع وParpura دور الجهد بوابات الكالسيوم 2 + قنوات EGL-19، CCA-1-2 وUNC في CEPsh غمد الدبقية من الشعيرات رأسي في المساهمة في تدفق الكالسيوم 41. وقد تم تحليل ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا الدبقية CEPsh مثقف من الحيوانات المعدلة وراثيا شارك في التعبير عن أحمر فلوري mCherry علامة والفلورية الخضراء عصاري خلوي كا 2 + GcaMP2.0 المؤشر. في الغالبية العظمى من الخلايا الدبقية CEPsh، الاستقطاب الناجم عن غشاء الخلية تركيزات عالية من الزيادة التي يسببها بوكل من الكالسيوم داخل الخلايا 2 + كما ذكرت من قبل ارتفاع GcaMP2.0 مضان. وعلاوة على ذلك، والمعاملة مع قنوات الكالسيوم حاصرات الكادميوم 2 + ونيما (nemadipine-A) إلى خفض كبير في العابرين الكالسيوم. دعم هذه البيانات التي تعتمد الجهد ارتفاع في الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا الدبقية CEPsh يعتمد جزئيا على الأقل على قنوات الكالسيوم الجهد بوابات. المؤلفين، مزيد من تحليل التغيرات الكالسيوم داخل الخلايا في نوع L-EGL-19rf (الحد من وظيفة)، T-نوع CCA-1 و N، P / Q، R-نوع القناة UNC-2 الحيوانات خروج المغلوب وخلصت إلى أن جميع الأنواع الثلاثة من كا 2 + قنوات تساهم بشكل كبير في ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا في هذه الخلايا الدبقية . وهكذا، منذ الدبق الكبروي الثدييات غير ناضجة الرد على الاستقطاب عبر التغييرات VGCC التي تعتمد في الكالسيوم داخل الخلايا 2 + تركيز، وخلص الباحثون أن C. الخلايا الدبقية ايليجانس CEPsh قد تشبه وظيفيا الدبق الكبروي الثدييات، النجمية، وخلايا قليلة التغصن دبقية قليلة التغصن السلائف.

غيرها من التقنيات المطبقة على مثقف C. ايليجانس الخلايا الجنينية

مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) وقد تم تطبيقه بنجاح على C. ايليجانس الخلايا المستزرعة في إثراء الثقافات مع أنواع معينة من الخلايا و / أو لعزل الخلايا لتحليل ميكروأري 23،4243. التعديل الرئيسية التي تحتاج إلى عرضإلى طريقة زراعة الخلايا كان نوع الركيزة المستخدمة. الزملاء غريبة واختبارها ركائز مختلفة بما في ذلك الكولاجين الرابع، بولي-L-يسين، وفبرونيكتين laminin وأنشأ أن بولي-L-يسين هو أفضل الركيزة 37. بولي-L-يسين يعزز تمايز الخلايا فقط، وكذلك الفول السوداني كتين، ولكن خلافا لكتين الفول السوداني يسمح مفرزة من الخلايا من الركيزة دون ضرر 36. عدة أنواع مختلفة من C. وقد تم فرز الخلايا ايليجانس بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية، بما في ذلك thermosensory، حاسة الشم، والخلايا العصبية الحركية ميكانيكية حسية، والدبقية 23،42 - 45. تم إنجازه ووضع العلامات الخلية عن طريق التعبير عن GFP صحفيين والشاملة، وكفاءة عالية الفرز مع العزلة تصل إلى 90٪ من الخلايا GFP المسمى 23.

جين إسكات بواسطة تدخل الحمض النووي الريبي (رني) لا يمكن أن يتحقق في الثقافة كذلك. أظهرت كريستنسن وزملاؤه ان حضانة، معربا عن GFP مثقفC. ايليجانس الخلايا العصبية مع الرنا المزدوج الجديلة ضد GFP أدى إلى انخفاض كبير في مستوى التعبير GFP مع وجود تأثير القصوى بعد 4 أيام إضافة RNA المزدوج تقطعت بهم السبل للثقافة 1. وبالمثل، شيه وزملاؤه استخدام رني في الثقافة لإثبات أن C. وهناك حاجة ايليجانس SID-1 للوساطة تأثير الرنا المزدوج الجديلة وأنه من المرجح حاجة في الجسم الحي للوساطة في نشر النظامية من رني 46. في الختام، رني التي تعد واحدة من الطرق الأكثر استخداما وفعالة لإسكات الجينات في C. ايليجانس يمكن تطبيقها في الثقافة. هذه الطريقة يمكن أن تستخدم لإسكات الجينات التي بالضربة القاضية قاتلة أو يتداخل مع C. ايليجانس التطور الطبيعي.

الشكل 1
الشكل 1. C. ايليجانس الأجنة قبل وبعد العلاج كيتيناز. (A) صورة من البيض قبل التعرض لتشيtinase. نقاط السهم إلى قشر البيض شفافة وسليمة المحيطة الجنين. (B) بيض تعامل مع كيتيناز لمدة 10 دقيقة. تم هضمها على قشر البيض والتي لم تعد مرئية حول الأجنة. تشير الأسهم إلى الأجنة ثلاثة أضعاف صدر من قشر البيض. المربع الأزرق يحيط مجموعة من الخلايا التي لا تزال تعلق على بعضها البعض.

الرقم 2
الشكل 2. مثقف C. ايليجانس لمس الخلايا العصبية. (أ) صورة مجهرية نيون للمثقف C. ايليجانس لمس الخلايا العصبية معربا عن GFP تحت المروج مسة معينة MEC-4 (P-MEC 4 :: GFP)، بار نطاق 5 ميكرون (B) الميكروسكوب نيون من الخلايا العصبية التي تعمل باللمس معربا P MEC-4 :: GFP (اللوحة العليا)، والتي كانت ملطخة مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد تويولين ألفا الأسيتيل (سيغما)، وهو posttranslationaل تعديل تويولين ألفا التي تحدث في الخلايا العصبية التي تعمل باللمس 33 فقط. مقتبس من 20. (CE) مثال من القنوات mechanosensitive سجلت في البرية من نوع الخلايا العصبية التي تعمل باللمس مثقف في تكوين الخلية المرفقة من تقنية المشبك التصحيح. القناة لديها تصرف من ~ 100 PS وكان موجودا في الخلايا العصبية التي تعمل باللمس معزولة عن MEC-4 الحيوانات خروج المغلوب (MEC-4 (u253)) كذلك. وتشير هذه البيانات هذه القناة ليست قناة MEC 20. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 3
الرقم 3. تقدير تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الحرة في الخلايا العصبية التي تعمل باللمس مثقف باستخدام CAMELEON. (A) Pseudocolor الصور من الخلايا العصبية التي تعمل باللمس مثقف التعبير عن CAMELEON YC2.12 في 0 ملي كا 2 + (+ EGTA، يسار) وفي 10 ملي كا 2 + (يمين). يظهر على نطاق وpseudocolor على اليمين. (B) CAMELEON الممثل التغييرات الفلورسنت المرتبطة بالتغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العصبية التي تعمل باللمس permeabilized. قبل التسجيل، وحضنت الخلايا لمدة 30 دقيقة في محلول يحتوي على الكالسيوم حامل الأيون BR-A23187 (10 ميكرومتر) وتركيز محددة من الكالسيوم الحرة (250 نانومتر في هذه الحالة). أضيفت روتنون (10 ملم) و 2-ديوكسي-D-غلوكوز (1.8MM) أيضا أن الحل لمنع مضخات نشطة. ثم perfused الخلايا العصبية مع محلول يحتوي على 0 ملم (+5 ملي EGTA) كا 2 + و 10 ملي كا 2 + لتحديد الحد الأدنى والحد الأقصى مضان التغييرات نسبة (C) كمليون معايرة تبين النتائج التي تم الحصول عليها 4-7 منحنى وجرى تقييم الخلايا التي التغييرات مضان في 11 حلولا مختلفة الحرة الكالسيوم. تم تطبيع كل تغيير نسبة إلى تغير نسبة القصوى للخلية الفردية. (D) (B). كانت نسبة CAMELEON يستريح في الخلايا العصبية التي تعمل باللمس مثقف 22٪ ± 7 (ن = 2، 18 خلايا) من نسبة القصوى التغيير. استنادا إلى منحنى المعايرة هو مبين في (C) هذه النسبة يتوافق مع التركيز الخالي من الكالسيوم ~ 200 نانومتر. مقتبس من 20. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. ايليجانس هو كائن نموذج فك رموز قوية لمسارات الجينية التي تساهم في التنمية والسلوك والشيخوخة. يلائمها ينبع في المقام الأول من السهولة التي يمكن التلاعب بها وراثيا ومن دورة حياة قصيرة. على الرغم يلائمها، C. ايليجانس لها حدودها. C. الخلايا ايليجانس ضئيلة ومحصورة ضمن بشرة الضغط التي تحد من تطبيق الأساليب التي تتطلب الوصول المباشر إلى الخلايا، مثل تقنيات الكهربية والدوائية، أو العزلة من أنواع معينة من الخلايا، مثل الشخصى الجينات التعبير من خلال تحليل ميكروأري. وC. وقد ايليجانس طريقة زراعة الخلايا حلا للعديد من القيود المفروضة على هذا النموذج الحي.

في هذا المخطوط وصفنا طريقة محدثة لعزل وزراعة الجنينية C. ايليجانس الخلايا في نطاق واسع الزملاء 1 على أساس العمل في وقت مبكر عن طريق كريستنسن و. نحن المرضس تقرير نتائج ممثل نشرت الحصول عليها باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات بما في ذلك كيمياء سيتولوجية مناعية، الكهربية والتصوير الكالسيوم التي تقدمت فهمنا من العمليات الفسيولوجية ومتطلبات الوراثية وظيفة الخلية الأساسية في C. ايليجانس. العمل المنجز حتى الآن على مثقف C. ايليجانس الخلايا يدعم أنها تفرق في المختبر كما يفعلون في الجسم الحي تلخص التعبير عن علامات معينة من الخلايا 1،18-20،22،23،27،44. في حين اتسمت ليس كل أنواع الخلايا في الثقافة، هذه الهيئة من العمل تشير إلى أن طريقة زراعة الخلايا يسمح للدراسة C. الخلايا ايليجانس في العزلة دون المساس بهويتهم.

بروتوكول بسيطة وقابلة للتطبيق بسهولة في أي مختبر. الأشياء التي تحتاج إلى أن يوضع في الاعتبار لزراعة C. بنجاح الخلايا الجنينية ايليجانس هي التالية: 1) يجب أن الحيوانات متزامنة بحيث فيل الغالبية منهمأن حامل ل البالغين في وقت الإجراء ثقافة الخلية. بدءا ثقافة دودة من لوحة جوعا هو خيار جيد. 2) والبكتيريا المستخدمة لزراعة C. تحتاج ايليجانس ليتم القضاء قبل دودة تحلل لتجنب التلوث من ثقافة الخلية. فمن المستحسن أن كميات كبيرة من الماء المعقم وتستخدم ليغسل والتي طرد الحيوانات في اقترحت (وليس في أعلى) سرعة لتجنب ترسيب البكتيريا كذلك. في الواقع، في حين أن العلاج مع تحلل العازلة التي تحتوي على مواد التبييض يجب القضاء على البكتيريا، بدءا من تعليق الحيوانية خالية من البكتيريا نسبيا ويوصى. 3) ينبغي أن يعامل الحيوانات مع التبييض / هيدروكسيد الصوديوم حتى ~ سراح 80٪ منهم بيضها. مرات الحضانة أقصر وأطول يقلل من كفاءة استرداد البيض وتلف البيض على التوالي. 4) ينبغي رصد قشر البيض الهضم من خلال كيتيناز عن كثب. يجب أن تبدأ دليل التفكك عندما ~ تم هضمها 80٪ من البيض. أطول وأقصر incubatمرات أيون سواء نتيجة في تلف الخلايا، وذلك بسبب الأضرار المباشرة للغشاء البلازما بواسطة انزيم والأضرار التي تسببها لفترات طويلة وأقسى تفارق دليل في محاولة لعزل الخلايا، على التوالي. 5) لا يجب أن يجبر الترشيح خلية من خلال فلتر 5 ميكرون. إذا كان يحصل انسداد الفلتر، فإنه يجب تغيير بأخرى جديدة لتجنب تلف الخلايا.

على الرغم من حقيقة أن الخلايا الجنينية مثقف أحدثت ثورة في حقل في نواح كثيرة، فهي ليست الإجابة عن كل سؤال العلمية والتي لا تزال القيود. على سبيل المثال، والجينات التي أعرب عنها في الثقافة هي في الغالب منذ الجنينية خلايا معزولة من الأجنة. مقصورات التحت خلوية قد لا بشكل صحيح في تطوير الثقافة. على سبيل المثال، وتطوير وصيانة أهداب بعض الخلايا العصبية الحسية amphid مثل عوا والائتلاف المناهض للحرب تعتمد على التفاعل مع الخلايا الدبقية amphid، الذي خسر في الثقافة 44. الخلايا تفقد جيرانهم والطبيعية لا تجعل يختلط الناحية الفسيولوجيةevant خلية الى خلية الاتصالات. على سبيل المثال، فإنه ليس من المعروف ما إذا كانت الخلايا تشكل منعطفات ضيقة أو كهربائية أو كيميائية نقاط الاشتباك العصبي وإذا فعلوا ذلك، هذه ليست من المحتمل أن يكون مع شركائها الفسيولوجية. علاوة على ذلك، ومطلي الخلايا على ركيزة واحدة، والفول السوداني كتين. المصفوفة خارج الخلية في الجسم الحي من المرجح أن يكون خليط معقد ويصعب استنساخها من العديد من الجزيئات بما في ذلك كتين الفول السوداني، laminin، والكولاجين، وفبرونيكتين. وعلاوة على ذلك، المتخصصة المصفوفة خارج الخلية المطلوبة ربما لأنواع معينة من وظائف الخلية. على سبيل المثال، أعربت قناة mechanosensitive في الجسم الخلايا العصبية التي تعمل باللمس والتي شكلتها MEC-4 و MEC-10 مفارز لا يمكن بوابات في الثقافة 18، ولكن يمكن بسهولة بوابات في الجسم الحي 47. هذا على الأرجح ينبع من حقيقة أن الكولاجين خارج الخلية MEC-5 تنتج عادة من قبل خلايا التماس المجاورة في الجسم الحي، غائب في الثقافة 48. MEC-5، جنبا إلى جنب مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية MEC-1 (أ أ أ 1999 طويلوهناك حاجة إلى البروتين مع مجال Kunitz من نوع واثنين من المجالات صندوق تعديل العولمة الأوروبي) وMEC-9 (أ 834 أأ البروتين الطويل الذي يحتوي على العديد من المجالات Kunitz من نوع، يكرر صندوق تعديل العولمة الأوروبي والمجال حمض الجلوتاميك الغنية) لإحساس اللمس ويعتقد أن ربط إلى المجالات خارج الخلية من مجمع قناة MEC وبذل النابضة التوتر على المجمع خلال التحفيز الميكانيكي.

على أن تبرم، C. الخلايا الجنينية ايليجانس يمكن تربيتها في المختبر، ويبدو أنها تفرق تلخص التعبير عن جينات معينة من الخلايا. بروتوكول للعزلة وثقافة من الخلايا غير واضحة ويمكن تطبيقها في أي مختبر مع خبرة ضئيلة في مجال تقنيات زراعة الخلايا. مع الأخذ في الاعتبار القيود المفروضة على هذه التقنية، يمكن أن تكون طريقة زراعة الخلايا وثبت أن تقنية قوية عند وصول الخلايا مباشرة و / أو هناك حاجة لعزل أنواع معينة من الخلايا. وقد بروتوكول لعزل الخلايا من اليرقات أيضا وضعت مؤخرا (نوصف التمديد هنا) 49. اهتمام واسع النطاق في تطوير أساليب مكملة تبذل C. ايليجانس نظام أكثر قوة في نهاية المطاف لفهم الصلة بين وظيفة الجين والسلوك، وتطوير أو الشيخوخة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Bacto Peptone VWR International Inc. 90000-382
Difco Agar Granulated VWR International Inc. 90000-784
Bacto Tryptone VWR International Inc. 90000-284
Bacto Yeast Extract VWR International Inc. 90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid Invitrogen 11415-064
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16140-063
Penicillin-streptomycin Sigma P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus Sigma C6137-25UN
NA22 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center
Peanut Lectin Sigma L0881-10MG
Sucrose Sigma 57903-1KG
D-(+)Glucose Sigma 67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) Sigma E0396-25G
Hepes Sigma H3375-500G
Cholesterol
NaCl Sigma 57653-1KG
KCl Sigma P9333-500G
CaCl2 Sigma C1016-500G
MgCl2 Sigma M8266-100G
MgSO4 Sigma M2643-500 g
K2HPO4 Sigma P2222-500G
KH2PO4 Sigma P9791-500G
NaOH Sigma S8045-500G
KOH Sigma P1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips USA Scentific 1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped USA Scentific 1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector VWR International Inc. 89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond VWR International Inc. 53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile VWR International Inc. 14670-114
15 ml Conical Tube USA Scentific 1475-1611
50 ml Conical Tube USA Scentific 1500-1811
Sterile 18 gauge Needles Becton, Dickinson and Co. 305196
Sterile 10 ml Syringes Becton, Dickinson and Co. 305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size Corning 431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane VWR International Inc. 28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips VWR International Inc. 48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid Thomas scientific 6902A09
Dumont #5- Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Centrifuge 5702 Eppendorf 022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  6. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
  7. Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
  8. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
  9. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  10. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
  11. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
  12. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
  14. Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
  15. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
  16. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
  17. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
  18. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  19. Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
  20. Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
  21. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  22. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
  23. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
  24. Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
  25. Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
  26. Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
  27. Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
  28. Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
  29. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
  30. Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
  31. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  32. Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
  33. Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
  34. Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
  35. Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
  36. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  37. Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
  38. Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
  39. Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
  40. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
  41. Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
  42. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
  43. Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
  44. Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
  45. Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
  46. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
  47. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
  48. Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
  49. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 79، Eukaryota والبيولوجية الظواهر، خلية الفسيولوجية الظواهر، C. ايليجانس، زراعة الخلايا، والخلايا الجنينية
منهج في التثقيف الجنينية<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; خلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sangaletti, R., Bianchi, L. A Method … More

Sangaletti, R., Bianchi, L. A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells. J. Vis. Exp. (79), e50649, doi:10.3791/50649 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter