Summary
Vi beskriver her en revideret protokol for storstilet kultur embryonale C. elegans celler. Embryonale C. elegans celler dyrket in vitro ved hjælp af denne metode synes at differentiere og rekapitulere ekspression af gener i en celle-specifik måde. Teknikker, der kræver direkte adgang til cellerne eller isolering af specifikke celletyper fra andre væv, kan anvendes på C. elegans dyrkede celler.
Abstract
C. elegans er en kraftfuld model system, hvor genetiske og molekylære teknikker er let anvendelig. Indtil for nylig selv, teknikker, der kræver direkte adgang til celler og isolering af bestemte celletyper, ikke kunne anvendes i C. elegans. Denne begrænsning skyldes det faktum, at væv er begrænset inden for en tryksat kutikula, som ikke er let fordøjeligt ved behandling med enzymer og / eller detergenter. Baseret på tidlig pioner arbejde af Laird Bloom, Christensen og kolleger 1 udviklet en robust metode til dyrkning af C. elegans embryonale celler i stor skala. Æggene isoleres fra gravide voksne ved behandling med blegemiddel / NaOH og efterfølgende behandlet med chitinase at fjerne æggeskaller. Embryonale celler dissocieres derefter ved manuel pipettering og udpladet på substrat-dækket glas i serum-berigede medier. Indenfor 24 timer isolation celler begynder at differentiere ved at ændre morfologi og ved at udtrykke celle specifikke markers. C. elegans celler dyrket under anvendelse af denne metode overleve op 2 uger in vitro og er blevet anvendt til elektrofysiologisk, immunkemiske og billedbehandling analyser såvel som de er blevet sorteret og anvendes til microarray profilering.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en kraftig model organisme til at undersøge de molekylære grundlag for cellulær funktion, differentiering og adfærd. Mens dens genom, metaboliske og biosynteseveje ligner hvirveldyr ', dets genetiske og molekylær medgørlighed er langt større 2. Blandt dens fordele er dens størrelse og enkel anatomi, dets hurtige livscyklus (3 dage ved 25 ° C), kort levetid (2 dage) og store antal afkom (> 200). På grund af sin hermafroditiske natur og kort levetid, molekylære og genetiske manipulationer er ligetil i C. elegans, herunder produktion af transgene dyr 3,4 og anvendelse af gen-knock-down teknikker såsom RNA-interferens 5.. C. elegans krop og æggeskal er gennemsigtige. Derfor celler kan let visualiseres i både voksen og foster ved hjælp af standard-mikroskopi. I de sidste 40 år, C. elegans C. elegans forskning, herunder en stor samling af mutanter, knockouts og transgene, en detaljeret beskrivelse af anatomi og udvikling 6,7, herunder den fulde genopbygning af nervesystemet 8, og et helt genom, som er godt kommenteret og til rådighed for hele samfundet ( www.wormbase.com ).
På trods af de mange fordele, har nogle eksperimentelle metoder været udfordrende i C. elegans. Disse omfatter dem, der kræver adgang til plasmamembranen af cellerne og isolering af væv eller celletyper. Faktisk C. elegans væv findes inden for dets tryk hydrostatisk skelet, som ikke er let fordøjeligt ved enzymatisk behandling eller rengøringsmidler. I slutningen af 1990'erne Miriam Goodman og Janet Richmond banebrydende metoder til elektrofysiologiske optagelser af C. elegansneuroner og muskelceller situ 9,10. Mens disse metoder gav os et vigtigt indblik i neuronal og muskel funktion in vivo, er de udfordrende og lave gennemløb. Var blevet udviklet alternative metoder til at studere celle funktion in vivo, for det meste især in vivo calcium imaging med genetisk indkodede calcium sensorer såsom GCamP og Cameleon 11-13. Disse metoder dog ikke tillade brug af farmakologiske værktøjer, fordi de anvendes på intakte levende dyr.
Det første forsøg på dyrkning C. elegans celler in vitro i stor skala blev lavet af Laird Bloom under udarbejdelsen af sin ph.d.-afhandling 14. Desværre stødt på vanskeligheder med dårlig vedhæftning af cellerne til underlaget, dårlig celledifferentiering og overlevelse forhindrede etableringen af denne tidlige protokol som en robust cellekultur metode. I 1995 offentliggjorde Edgar og kolleger en procedureat undersøge celledeling og morfogenese ved isolering og dyrkning af en enkelt C. elegans embryoner 15. Embryonale celler opnået ved spaltning af æggeskaller med en kombination af enzymatisk behandling og manuel dissociation fortsat proliferere producere op til ~ 500 celler 15. Efterfølgende Leung og medarbejdere dyrkes et lille antal blastomeres at studere tarm-morfogenese. De viste, at en in vitro isolerede E blastomer produceret polariserede tarmceller, der skabte en struktur analog med tarmlumen ved at interagere med hinanden via apikale adherens junctions 16. Buechner og kolleger også rapporteret om en lignende metode til dyrkning C. elegans embryonale celler in vitro 17.
Baseret på dette tidlige arbejde, Christensen og kolleger udviklet en robust protokol til dyrkning embryonale C. elegans celler in vitro 1. Deviste, at isolerede C. elegans celler kan differentiere til forskellige celletyper og vedligeholde de funktioner, som de besidder i vivo, herunder afgivelse af celle-specifikke markører. Adskillige teknikker, der udfordrer in vivo, kan anvendes på isolerede C. elegans embryonale celler. Heriblandt elektrofysiologisk 1,18 19, billedbehandling og immunokemiske teknikker 20,21, samt isolering af specifikke celletyper fluorescerende cellesortering (FACS) til opførelse af cellespecifikke cDNA-biblioteker 22,23. Gene Knockdown teknikker såsom RNA-interferens (RNAi) kan anvendes på dyrkede C. elegans celler 1 og en hidtil ukendt metabolisk mærkning under anvendelse azido-sukker som et redskab til glycoprotein opdagelse er for nylig blevet udviklet til in vitro dyrket C. elegans celler 24.
Afslutningsvis cellekultur metode udvider array of teknikker, der kan anvendes på C. elegans model i et forsøg på at dechifrere genfunktion i forbindelse med en levende organisme. Vi beskriver her protokollen for dyrkning af C. elegans embryonale celler in vitro, hvilket stort set er baseret på protokol først beskrevet af Christiansen og kolleger 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Stjerne (*) angiver nye eller ændrede skridt i forhold til Christensen et al. 1.
1.. Materiale Setup
- Proceduren for cellekultur kræver store mængder af æg isoleret fra gravide voksne. Grow C. elegans på 8P agarplader podet med NA22 (tilgængelig via C. elegans Genetic Consortium - CGC) bakterier til at isolere store mængder af æg. I disse plader mængden af pepton anvendes er 8 gange den mængde, der normalt anvendes til NGM plader. Den højere koncentration peptone opretholder væksten af NA22 bakterier mere effektivt, hvilket i modsætning til OP50-, vokser i tykke lag.
8P plader opskrift:
Opløses 3 g NaCI, 20 g Bacto-pepton, 25 g agar i 1 L af sterilt destilleret vand og autoklaveres i 30 minutter. Lad mediet afkøles ved 55 ° C og derefter tilføje sterilfiltreret 1 ml cholesterol (5 mg / ml i EtOH), 1 ml 1 MgCl2, 1 ml MgSO4 og 25 ml KP buffer (lager på 500 ml: 5 g K 2 HPO 4, 30 g KH 2 PO 4, pH 6,00). Hæld flydende agar medium i 10 cm petriskåle (25 ml / plade).
- Den næste dag fordelt på hele overfladen af hver beriget peptonagar plade med 1 ml NA22 E. coli dyrket natten over i 2xYT medium (16 g trypton, 10 g gærekstrakt, 5 g NaCl i 1 liter sterilt vand, pH 7,0) ved 37 ° C. Disse bakterier udgør en rigelig mad kilde, som vil danne et tykt lag støtte væksten af store mængder gravide voksne. Efterlad podede plader natten over ved stuetemperatur for at tillade vækst af bakterier. Processen kan fremskyndes ved inkubering ved 37 ° C i 4-5 timer.
- Overfør sultede dyr podet 8P plader. Vask dyr fra en udsultet NGM pladen ved hjælp af 5-6 ml M9 buffer eller vand og tilsæt 1-2 ml af denne suspension til hver 8P plade.
- Tillad vækst og formering af de dyr, UNTil pladerne er befolket ved sammenløbet af gravide voksne.
- Isoler æg, der kræves til fremstilling af C. elegans embryonale celler, fra gravide voksne bruger 5-6 ml lyseopløsning.
Lyseopløsning opskrift
5 ml frisk blegemiddel, 1,25 ml 10 N NaOH og 18,5 ml sterilt H 2 O. Denne blanding må være forberedt frisk før hver brug.
- Vask æg isoleret fra gravide voksne at bruge æg buffer:
Egg buffer opskrift
118 mM NaCI, 48 mM KCI, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolaritet 340 mOsm.
- Fjern æggeskallen, der omgiver æggene ved behandling med chitinase. Chitinase er et enzym med aktiviteten størst ved sur pH-værdi 25. Opløs chitinase (Sigma, katalog nr.. C6137) i æg pH 6,5 til en slutkoncentration på 2 mg / ml. Opbevar chitinase lageropløsning ved -20 ° C i 1 ml portioner i sterile 15 ml koniske rør. Aliquots kan opbevares ved -20 ° C op til et par måneder.
- Grow C. elegans dyrkede celler på autoklaverede dækglas (diameter 12 mm), dækket med peanut lektin. Jordnøddeolie lectin opløses i sterilt vand (0,5 mg / ml). Peanut lektin Opløsningen må ikke filtreres eller autoklaveres. Det behøver heller ikke at blive behandlet med UV-lys. Store 2 ml portioner ved -20 ° C i op til 6 måneder.
- Komplet celledyrkningsmedium (500 ml) indeholder 500 ml L-15 dyrkningsmedium fra Gibco, 50 ml føtalt bovint serum (varmeinaktiveret), 7,7 g saccharose (45 mOsm), 5 ml 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin (2%). Det komplette medium filtreres derefter under anvendelse af en 0,20 um porefilter.
Bemærk, at ægget buffer og dyrkningsmediet har osmolaritet på 340 og 345 mOsm hhv. I modsætning til pattedyrsceller C. elegans celler har en relativt høj osmolaritetder skal tages i tæller, når de udarbejder løsninger, der kommer i direkte berøring med plasmamembranen af cellerne. Opskrifterne af disse reagenser blev indstillet til at nå den ønskede osmolaritet, som blev målt ved hjælp af et osmometer 1. Det er ikke nødvendigt at bruge en osmometer hvis disse opskrifter følges nøjagtigt og pleje er anvendt i udarbejdelsen af disse reagenser. Dog bør man bruge en Osmoter hvis andre løsninger skal være forberedt, hvis opskrifter er ikke rapporteret her eller i nogen af de publikationer, der bruger C. elegans dyrkede celler.
2. Egg Isolation
- Det anbefales at begynde med mindst fire 8P plader at indsamle nok æg til 12 brønde af dyrkede celler (i 24-brønds plader).
- Før du starter med den procedure tø et rør af peanut lektin stamopløsning. Placer autoklaverede dækglas i bunden af brøndene i en plade med 24 brønde, og der tilsættes 200 pi peanut lectin til dækglassene. Der inkuberes i 1 time eller until cellerne er klar til at blive belagt. Fjern fuldstændigt peanut lectin og vask brøndene en gang med 1 ml sterilt autoklaveret vand. Fuldstændig fjernelse af jordnøddeolie lectin fra dækglassene er afgørende for at undgå celle sammenklumpning.
- Vask af den gravide voksne fra agarpladerne hjælp sterilt autoklaveret vand. Opsaml suspensionen i to sterile konisk 50 ml rør. Lad rørene på is i op til 5 minutter for at tillade udfældning af orme i bunden af rørene (*). Fjern vandet med en overførsel plastpipette og erstatte det med frisk sterilt autoklaveret vand. Pelletere orme ved table-top centrifugering ved 200 xg (~ 1.200 rpm) i 10 minutter (*). Gentag dette sidste trin på mindst 3.
- Overfør orme i et sterilt 15 ml konisk rør og pelletere dem ved 200 xg (~ 1200 rpm) i 10 minutter (*). Brug ikke højere centrifugering hastighed for at undgå opsamling af bakterierne ved bunden af røret samt. Nogle gange efter centrifugeringer orme er ikke helt pelleteret. After hver vask og før fjernelse supernatanten placere rørene i 5 min på is. I køleanlæg orme udfældes til bunden af røret.
- Fjern vand og tilsæt 5-6 ml lysis opløsning (se Material oprettet). Rock suspensionen forsigtigt i 5-10 minutter, og derefter begynde at overvåge orm lysis under stereomikroskop hver 2-3 min. En dråbe suspension kan også placeres på et dækglas nemmere inspektion. Inkubationstiden varierer afhængigt af friskhed blegemiddel, købe små flasker blegemiddel og åbne en ny flaske hver måned.
- Når ~ 70-80% af ormene lyseret (10 minutter fra begyndelsen af inkubation), stop lysis reaktionen ved tilsætning af 9 ml æg puffer pH 7,3 (se Materiale defineret). Centrifugér suspensionen ved 200 xg (~ 1200 rpm) i 10 min. Fra dette punkt på en bunsenbrænder på, på bænken til at forhindre en ny forurening af æg (*).
- Fjern forsigtigt supernatanten ved hjælp af en steril plastik overførselspipette og vask pellet 3-4x med æg buffer, indtil opløsningen er klar. Sørg for at blande pillen godt i ægget buffer under hver vask.
- Æg er adskilt fra de døde dyr ved hjælp af 30% saccharoseopløsning. Pellet resuspenderes i 2 ml steril æg buffer, og der tilsættes 2 ml af 60% saccharoseopløsning (bestand i steril æg buffer). Bland godt og centrifugeres i 20 min ved 200 xg (~ 1.200 rpm) (*).
- Fjern forsigtigt rørene fra centrifugen. Æggene er flydende på toppen af opløsningen. Ved hjælp af en P1000 pipettor og sterile tips, overføre alle æg i en frisk sterile 15 ml konisk rør.
- Tilsæt 10 ml sterilt æg buffer til røret og centrifuger ved 200 xg (~ 1.200 rpm) i 10 min. Gentag vask 3 x. Sørg for, at æggene er helt resuspenderes i ægget buffer under hver vask.
3. Embryonale celler Dissociation
Gennemføre de næste skridt i proceduren under sterile forhold ved hjælp af en laminar flow hætte. Mens dyrenekjole på bakterier plader, de vasker og behandlingen med lysis opløsning indeholdende blegemiddel bør fjerne de fleste, hvis ikke alle bakterier. Således ved hjælp af en laminar hætte på dette tidspunkt i proceduren forhindrer ny forurening af ægget suspension.
- Resuspender pelleterede æg i 1 ml 2 mg / ml kitinase (bestand i æg buffer pH 6,5 (*)), og overføre dem til en ny steril 15 ml konisk rør. Rock røret i 10-30 minutter ved stuetemperatur. Den nøjagtige inkubationstid skifter ifølge friskhed enzymet og temperaturen i rummet, og derfor bør bestemmes for hvert præparat. Det anbefales at påbegynde overvågning af æg under en omvendt celle-kultur mikroskop efter 10 minutters inkubation. Bemærk: vores erfaring, lav pH øger chitinase enzymatiske aktivitet. Derfor bruger vi æg buffer ved pH 6,5 for at opløse chitinase (opskrift rapporteret ovenfor, hvor pH justeres til 6,5 under anvendelse af NaOH).
- Når ~ 80% af æggeskaller spaltes afchitinase behandling (figur 1 AB), pelletering æggene ved centrifugering ved 900 xg (~ 2500 rpm) i 3 minutter (*). Ved hjælp af en P1000 pipettor og sterile tips, fjernes forsigtigt supernatanten og tilsæt 3 ml L-15 medium (*).
- Overfør æggene i en 6 cm i diameter plade og forsigtigt dissociere celler under anvendelse af en 10 ml steril sprøjte udstyret med en 18 G nål. Overvåg dissociationsgraden ved at placere en dråbe af suspensionen i en frisk plastik petriskål og ved at se under mikroskop. Aspirér ikke luft ind i sprøjten under denne procedure for at undgå skadelige celler. Fortsæt dissociationen til ~ 80% af cellerne dissocieres.
- Filtreres suspensionen ved anvendelse af en steril 5 um Millipore-filter. Cellesuspensioner skal filtreres for at fjerne celleklumper, ufordøjede æg og udklækkede larver. Filter yderligere 4-5 ml frisk L-15 medier gennem filteret til at inddrive alle cellerne. Brug ikke overdreven kraft under filtreringen skridt for at undgå damaging filteret og / eller cellerne.
4.. Dyrkning af celler
- Pelleter dissocierede celler ved centrifugering ved 900 xg (~ 2500 rpm) i 3 minutter (*). Ved hjælp af en P1000 pipettor og sterile tips forsigtigt fjerne al supernatanten. Gensuspendér pelleterede celler i komplet L-15 medium og plade 1 ml / godt. Mængden af mediet tilsættes, afhænger af antallet af 8P plader anvendes, sammenløbet af orme på pladerne, og den type forsøg, der vil blive udført på cellerne. Cellen tæthed kan bestemmes ved hjælp af et hæmocytometer. For patch-clamp optagelser udpladningsdensitet på ~ 230.000 celler / cm 2 er optimal.
- Hold 24 brønde pladen i en plastik Tupperware beholder indeholdende våd papirservietter for at undgå fordampning af dyrkningsmedium. Opbevares i beholderen i en befugtet inkubator ved 20 ° C og omgivende luft.
- Cellerne er normalt klar til forsøgene inden for 24 timer, når den morfologiske differentiering og udtrykkeligion af GFP markører er færdig. Celler kan holdes i kultur i op til 2 uger, men de er som regel mest sunde op til 7-9 dage efter plating. Mediet skal udskiftes en gang om dagen for at opretholde sunde celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. elegans dyrkede celler differentiere og udtrykke celle specifikke markører
Christensen og kolleger ved hjælp af trypanblå farvning viste, at> 99% af embryonale C. elegans celler overlever isolation procedure. På dag 9 og 22 efter galvanisering, 85% og 65%, henholdsvis er stadig i live 1. Isoleret embryonale C. elegans celler skal overholde et substrat for at differentiere. Celler, der undlader at overholde danne klumper, og det ikke er klart, om de overlever. Differentiering af cellerne begynder 2-3 timer efter plating og fortsætter i ~ 24 timer. Indenfor 24 timer, celler tage på specifikke morfologier. Således neuroner sende processer 1,18-20 muskelceller danner finger-lignende aflange strukturer svarende til dem, der ses in vivo 1 og kanalen celler danner et hulrum 17. De morfologiske funktioner in vitro er bemærkelsesværdigt lig dem i vivo. For eksempel <em> in vitro dyrkede ALM og PLM touch-neuroner (identificeret ved ekspression af Pmec-4 :: GFP) udvikle kun to neuronale processer med én længere end andre, som de gør i vivo 1,20 (figur 2A). Dette antyder, at i det mindste nogle af de molekylære mekanismer, der driver differentiering C. elegans celler er celle-selvstændig og dermed kan blive gentaget vitro.
I 1990'erne, Chalfie pioner i brugen af grønt fluorescerende protein (GFP) i C. elegans at mærke celletyper, hvor et gen af interesse udtrykkes 26. Hidtidige arbejde på dyrkede C. elegans embryonale celler understøtter, at udtryk af GFP i bestemte celletyper kan blive gentaget vitro 1,18-20,27 (figur 2A). Desuden er forholdet mellem celler, der udtrykker GFP in vitro svarer til forholdet fundet in vivo. For eksempel homeodomænet unc-4 reportergen er udtrykt i 13 motoriske neuroner i moden embryo (13 af 550 celler-2,3%) 28,29. Fox og kolleger, tælles unc-4 :: GFP-celler i kultur og fundet, at de er 2% af det totale antal celler 23. Tilsvarende UNC-119, et protein, der kræves for G-protein handel 30 udtrykkes i de fleste C. elegans neuroner og nogle muskel-celler (76% af cellerne i L1 larve 31). Christensen og kolleger rapporterede, at i kultur UNC-119 :: GFP-ekspression blev observeret i 74-76% af cellerne ligner neuroner og muskelceller 1. Endelig MEC-4, en mekanosensitive Na + / Ca2 +-kanal-underenhed er nødvendig for blid berøring 32 udtrykkes i 6 touch-neuroner i voksne C. elegans. Af disse seks touch-neuroner, der er fire (almisse og PLMS) embryonically afledt. Således 4 af 550 (0,7%) embryonale celler skal udtrykke GFP under kontrol af mec-4-promotoren. Faktisk neuroner i kultue, der udtrykker Pmec-4 :: GFP udgør ~ 0,5% af det samlede antal celler 18,20.
Protein markører og posttranslationelle modifikationer, som er cellespecifik kan også observeret in vitro. For eksempel er alfa tubulin acetyleret kun i touch-neuroner i C. elegans 33.. In vitro processer touch-neuroner pletten med et antistof rejst mod acetyleret-alpha-tubulin 20 (figur 2B). Kulturperler touch-neuroner udtrykker også det giftige mutant kanal MEC-4 (d), som forårsager død touch neuroner in vivo 34. Faktisk GFP udtrykkende neuroner fremstillet af en mec-4 (d) pmec-4 :: GFP-stamme er oprindeligt til stede i kulturen, men derefter degenerere 20. Vigtigere er det, skal du trykke på neuroner fremstillet af mec-4 (d); pmec-4 :: GFP opfører in vitro på samme måde, de opfører sig in vivo. For eksempel kan de blive reddet fra døden ved behandling med enmiloride og dantrolen, der skåner mec-4 (d) touch-neuroner fra degeneration in vivo 20,35. Til slut, ikke kun C. elegans embryonale celler morfologisk ligner celler in vivo, men også udtrykke cellespecifikke markører og er til stede i samme omfang de er til stede in vivo. Tilsammen understøtter disse data, at dyrket C. elegans celler udgør et samlet godt system til at studere biologiske processer både på det cellulære og molekylære niveau.
Patch-clamp elektrofysiologisk analyse af dyrkede C. elegans celler
Plasteret-clamp teknik, som blev introduceret af Sakmann og Neher i halvfjerdserne for studiet af ionkanaler aktivitet fra celler i isolation eller i væv kan anvendes til dyrkede C. elegans celler 36. Christensen og kolleger var de første til at studere ionkanaler i dyrkede C. elegans celler under anvendelse afpatch-clamp 1. Siden da har K +, anioniske og kationiske ikke-selektive kanaler (fig. 2 CE), såvel som dopamin transportører afhængige kanaler er beskrevet i dyrkede C. elegans 1,18,19,37. Disse undersøgelser avancerede vores forståelse af den rolle af ioniske konduktanser i funktionen af C. elegans neuroner. Der er nogle få ændringer, der skal tages i betragtning ved anvendelse af patch clamp-teknikken til at optage ionkanalaktivitet fra dyrket C. elegans celler. Disse ændringer er for det meste relevante for helcelleproteiner optagelser. Først C. elegans celler er små, for eksempel neuroner har en diameter på 1-2 um. Behøver således glaspipetter at have en lille spids (0,5 um). Små pipettespidser øger input modstand, hvilket resulterer i stimulation og optagelse fejl. For at afhjælpe dette problem, kan pipetter konstrueres til at have et lille tip, men en bred kegle. Goodman og Lockery udviklet en metode employing en brand poler udstyret med en højtryks-luft pumpe til støbning pipetter til denne form 38.. For det andet, på grund af den lille størrelse af cellerne, få hel celle adgang ved hjælp af sug normalt resulterer i skader på cellen. Meget højere succesrate opnås sædvanligvis ved at anvende en høj spændingsimpuls (elektrisk kanalskift) til plaster på membranen under spidsen af pipetten. De andre konfigurationer af patch-clamp-teknik (celle fastgjort vrangen ud og uden-out) er ligetil at anvende til C. elegans dyrkede celler, med den eneste ændring, at spidsen af pipetten skal være lille for at tage hensyn til den lille størrelse af C. elegans celler. Den perforerede patch teknik er notorisk mere omstændelig og tidskrævende end andre patch-clamp teknikker. Det har imidlertid med held været anvendt på C. elegans celler i situ 39, 40 og bør derfor være gældende i kultur så godt.
Calcium imagingteknikker, der anvendes til C. elegans dyrkede celler
Den funktionelle rolle af spændingsåbnede Ca 2 + kanaler (VGCC) i neuroner og glia er blevet undersøgt i dyrkede C. elegans celler ved calcium imaging 20, 21, 41.. Anvendelsen af calcium billeddannelse i kultur har tilladt anvendelsen af opløsninger indeholdende høje koncentrationer af KCI til at inducere celle depolarisering og calciumkanalblokkere at skelne bidrag til de forskellige typer af kanaler til calciumindstrømning. For eksempel blev bidraget af Na + / Ca2 + gennemtrængelig MEC-4 (d) kanal til den intracellulære calciumkoncentration bestemmes af calcium imaging hjælp cameleon YC2.12 i nærvær og fravær af DEG / ENAC kanalblokker amilorid. Disse eksperimenter viste, at en amilorid-følsomme calciumindløb er til stede i touch-neuroner udtrykker MEC-4 (d), men ikke i vildtype touch-neuroner. Brug ionophor at permeabilisere membranenrøre neuroner og at kalibrere cameleon (figur 3A og B), Bianchi og kolleger også fastslået, at den gennemsnitlige frie calciumkoncentration i kontakt neuron 200 nM 20 (figur 3C og D). Tilsvarende Frøkjær-Jensen og kolleger undersøgte rolle VGCCs EGL-19 og UNC-36 i regulering af depolarisering-induceret calciumindstrømning i C. elegans dyrket mechanosensory neuroner udtrykker Cameleon 21. De fandt, at depolarisering af touch-neuroner induceret af ekstracellulær K + i et interval mellem 20 mm og 100 mm, resulterede i stigning i intracellulært calcium afsløret af YFP / CFP forholdet skift mellem 17% og 70%. Desuden blev calcium transienter reduceret med EGL-19 og UNC-36 tab-funktion mutationer og blev ikke påvist i fravær af ekstracellulær Ca2 + tyder på, at VGCCs spille en central rolle i ophidselse af C. elegans røre neuroner 21.
Stout og Parpura undersøgte rolle spændingsåbnede Ca 2 + kanaler EGL-19, CCA-1 og UNC-2 i CEPsh kappe glia af cephalica sensilla i at bidrage til calciumindløb 41.. Intracellulær calcium dynamik blev analyseret CEPsh gliale celler dyrket fra transgene dyr co-udtrykkende den røde fluorescerende markør mCherry og grønt fluorescerende cytosolisk Ca2 +-indikator GcaMP2.0. I de fleste af de CEPsh gliaceller membran depolarisering induceret af høje ekstracellulære koncentrationer af KCI-induceret stigning af intracellulær Ca2 +, som rapporteret af stigningen i GcaMP2.0 fluorescens. Desuden behandling med calcium kanaler blokkere Cd 2 + og NEMA (nemadipine-A) reducerede signifikant calcium transienter. Disse data understøtter, at spændingen afhængig stigning i intracellulær calcium i CEPsh gliaceller afhænger i det mindste delvis på spændingsafhængige calciumkanaler. Forfatterne, analyseres yderligere intracellulære calcium ændringer i L-typen EGL-19RF (reduktion af funktion), T-typen CCA-1 og N, P / Q, R-type kanal UNC-2 knockout dyr og konkluderede, at alle tre typer af Ca 2 + kanaler bidrager væsentligt til intracellulære calcium dynamik i disse gliaceller . Således da umodne pattedyr macroglia reagere på depolarisering via VGCC-afhængige ændringer i intracellulære Ca2 +-koncentrationer, konkluderer forfatterne, at C. elegans CEPsh gliaceller kan ligner funktionelt pattedyr macroglia, astrocytter, oligodendrocytter og oligodendrocyt precursorceller.
Andre teknikker, der gælder for dyrkede C. elegans embryonale celler
Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) er blevet anvendt med succes til C. elegans dyrkede celler til at berige kulturer med specifikke celletyper og / eller til at isolere celler til microarray analyse 23,4243. Den største ændring, der er nødvendig for at blive indførttil cellekulturen metode var den type anvendte substrat. Strange og kolleger testede forskellige substrater, herunder collagen IV, poly-L-lysin, fibronectin og laminin og konstaterede, at poly-L-lysin er det bedste substrat 37. Poly-L-lysin fremmer celledifferentiering lige så godt som peanut lectin, men i modsætning til peanut lectin tillader frigørelse af cellerne fra substratet uden skader 36. Flere forskellige typer af C. elegans celler er blevet sorteret ved FACS, herunder thermosensory, olfaktoriske, motor og mechanosensory neuroner og glia 23,42 - 45. Cell mærkning er opnået ved ekspression af GFP journalister og samlet, sortering effektiviteten er høj med isolation på op til 90% af GFP-mærkede celler 23.
Gendæmpning af RNA-interferens (RNAi) kan opnås i kulturen så godt. Christensen og kolleger viste, at inkubation af GFP-udtrykkende dyrketC. elegans neuroner med dsRNA mod GFP resulterede i markant reduceret niveau af GFP-ekspression med en maksimal virkning 4 dage efter tilsætning af dobbeltstrenget RNA til kulturen 1. Tilsvarende Shih og kolleger, der anvendes RNAi i kultur til at vise, at C. elegans SID-1 er nødvendig for at mediere virkningerne af dsRNA, og det er sandsynligt behov vivo til mediering systemisk diffusion af RNAi 46. Afslutningsvis RNAi som er en af de mest anvendte og effektive metoder til gen-nedregulering i C. elegans kan anvendes i kultur. Denne metode kan anvendes til dæmpende gener, hvis knockout er dødelig eller griber C. elegans normal udvikling.
Figur 1. C. elegans embryoner før og efter chitinase behandling. (A) Fotografi af æg før eksponering for chitinase. Pilen peger på de transparente og intakte æggeskal omgiver et foster. (B) Æg behandlet med chitinase i 10 min. De æggeskaller er blevet fordøjet og ikke længere er synlige omkring embryoner. Pilene peger på tre-fold embryoner frigivet fra æggeskallen. Den blå kasse omgiver en gruppe af celler, der stadig er fastgjort til hinanden.
Figur 2. Kulturperler C. elegans røre neuroner. (A) Fluorescerende mikrograf af dyrket C. elegans røre neuroner udtrykker GFP under touch-specifikke promotor mec-4 (P mec-4 :: GFP), skala bar 5 um. (B) Fluorescerende micrographs af en touch neuron udtrykker P mec-4 :: GFP (øverste panel) som blev farvet med et monoklonalt antistof mod acetylerede alfa tubulin (Sigma), en posttranslational modifikation af alfa tubulin, der forekommer i touch-neuroner kun 33. Tilpasset fra 20.. (CE) Eksempel på mekanosensitive kanaler optaget i vildtype dyrkede touch-neuroner i celle-attached konfiguration af patch clamp teknik. Kanalen har en ledningsevne på ~ 100 hk, og det er til stede i touch-neuroner isoleret fra mec-4 knockout dyr (mec-4 (u253)) samt. Disse data tyder på denne kanal ikke er den MEC kanalen 20. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Estimering af fri intracellulær calciumkoncentration i dyrkede touch-neuroner bruger Cameleon. (A) pseudo billeder af dyrkede touch-neuroner udtrykker Cameleon YC2.12 i 0 mM Ca2 + (+ EGTA, venstre) og 10 mM Ca2 + (højre). Den pseudo-skalaen er vist til højre. (B) Repræsentant Cameleon fluorescerende ændringer i forbindelse med ændringer i intracellulær calciumkoncentration i en permeabiliserede touch-neuron. Før optagelse blev celler inkuberet i 30 minutter i en opløsning indeholdende calciumionophor Br A23187 (10 uM) og en defineret koncentration af frit calcium (250 nM i dette tilfælde). Rotenon (10 mM) og 2-deoxy-D-glucose (1,8 mm) blev også tilsat til opløsningen for at blokere aktive pumper. Neuron blev derefter perfunderet med en opløsning indeholdende 0 mM (5 mM EGTA) Ca2 + og 10 mM Ca2 + til at bestemme den minimale og den maksimale fluorescens gearskift. (C) Cameleon kalibreringskurve viser resultater opnået 4-7 celler, hvis fluorescens ændringer blev evalueret i 11 forskellige fri calcium løsninger. Hver forholdet ændring blev normaliseret til det maksimale forholdet forandring for den enkelte celle. (D) (B). Den hvilende Cameleon forholdet i dyrkede touch-neuroner var 22% ± 7 (n = 2, 18 celler) af den maksimale forhold forandring. Baseret på kalibreringskurven vist i (C) dette forhold svarer til en fri calciumkoncentration på ~ 200 nM. Tilpasset fra 20.. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans er en kraftfuld model organisme til at dechifrere de genetiske pathways involveret i udvikling, adfærd og aldring. Dens bekvemmelighed stammer primært fra den lethed, hvormed det kan være genetisk manipuleret, og fra sin korte levetid. På trods af sin bekvemmelighed, C. elegans har sine begrænsninger. C. elegans celler er lille og begrænset inden for en tryksat kutikula, som begrænser anvendelsen af metoder, som kræver direkte adgang til cellerne, såsom elektrofysiologiske og farmakologiske teknikker eller isolering af specifikke celletyper, såsom genekspression profil ved microarray analyse. C. elegans cellekultur metode har været en løsning på mange af de begrænsninger af denne model organisme.
I dette manuskript beskriver vi en opdateret metode til isolering og dyrkning af embryonale C. elegans celler i stor skala baseret på tidlige arbejde af Christensen og kolleger 1.. Vi also rapport offentliggjort repræsentative resultater opnået ved hjælp af forskellige teknikker, herunder immuncytokemi, elektrofysiologi og calcium imaging, der har avancerede vores forståelse af de fysiologiske processer og genetiske krav underliggende celle funktion i C. elegans. Hidtidige arbejde på dyrkede C. elegans celler understøtter, at de differentiere in vitro, som de gør i vivo opridset udtryk for celle specifikke markører 1,18-20,22,23,27,44. Selv om ikke alle celletyper er blevet karakteriseret i kultur dette organ arbejde tyder på, at cellekulturen fremgangsmåde tillader undersøgelse C. elegans celler i isolation uden at kompromittere deres identitet.
Protokollen er enkel og let anvendelig på alle laboratorier. Ting, der skal holdes i tankerne for en vellykket dyrkning af C. elegans embryonale celler er følgende: 1) Dyr skal synkroniseres, så de fleste af dem Will blive drægtige voksne på det tidspunkt af proceduren cellekultur. Start ormen kultur fra en udsultet plade er en god mulighed. 2) De bakterier der anvendes til at dyrke C. elegans skal fjernes før orm lysis at undgå forurening af cellekulturen. Det anbefales, at store volumener af sterilt vand anvendes til vask, og at dyr centrifugeres ved den foreslåede (ikke højere) hastighed for at undgå udfældning af bakterier samt. Faktisk, mens behandling med lysepuffer indeholdende blegemiddel at fjerne bakterier, der starter fra en relativt bakteriefrit dyr suspension anbefales. 3) Dyr skal behandles med blegemiddel / NaOH, indtil ~ 80% af dem har udgivet deres æg. Kortere og længere inkubationstider reducere effektiviteten af æg genopretning og beskadige æggene hhv. 4) Eggshell fordøjelse af chitinase bør overvåges nøje. Manuel dissociation skal startes, når ~ 80% af æggeskaller blevet fordøjet. Længere og kortere incubation gange både resultere cellebeskadigelse, på grund af direkte beskadigelse af plasmamembranen ved hjælp af enzymet og skader forårsaget af langvarig og hårdere manuel dissociation i forsøget på at isolere celler. 5) Cell filtrering gennem 5 mm filter skal ikke tvinges. Hvis filteret bliver tilstoppet, skal den skiftes med en frisk at undgå skader celle.
Trods det faktum, at dyrkede embryonale celler har revolutioneret området på mange måder, er de ikke svaret på alle videnskabelige spørgsmål og stadig har deres begrænsninger. For eksempel udtrykte gener i kultur er for det meste embryonale da celler isoleres fra embryoer. Subcellulære rum kan ikke udvikle sig rigtigt i kultur. For eksempel udvikling og vedligeholdelse af cilia af visse amphid sensoriske neuroner såsom AWA og AWC afhænge af samspillet med amphid glia, som er gået tabt i kultur 44. Celler mister deres naturlige naboer og ikke gør fysiologisk relvante celle-til-celle-kontakter. For eksempel vides det ikke, om celler danner stramme vejkryds, elektriske eller kemiske synapser og hvis de gør, disse er ikke sandsynligt, at være sammen med deres fysiologiske partnere. Desuden er celler udpladet på et enkelt substrat, jordnøddeolie lectin. Sandsynligvis vil være en kompliceret og vanskelig at reproducere blanding af mange molekyler, herunder peanut lectin, laminin, collagen og fibronectin den ekstracellulære matrix in vivo. Desuden specialiseret ekstracellulær matrix måske nødvendige for visse typer af celle funktioner. For eksempel mekanosensitive kanal udtrykt i kroppens touch-neuroner og dannes af MEC-4 og MEC-10-underenheder kan ikke gated i kultur 18, men kan let gated in vivo 47. Det mest sandsynlige stammer fra det faktum, at ekstracellulære collagen MEC-5 normalt produceres af nabolandet søm celler in vivo, er fraværende i kultur 48. MEC-5 sammen med ekstracellulære matrix proteiner MEC-1 (en 1999 aa langprotein med et Kunitz-typen domæne og to EGF domæner) og MEC-9 (et 834 aa langt protein, som indeholder flere af Kunitz-type domæner, EGF repeats og en glutaminsyre-rige domæne) er nødvendige for fornemmelse ved berøring og menes at binde til de ekstracellulære domæner af MEC kanal kompleks og udøve gating spænding på komplekset under mekanisk stimulering.
Til slut, C. elegans embryonale celler kan dyrkes in vitro, og de synes at differentiere opridset ekspression af celle-specifikke gener. Protokollen til isolering og dyrkning af cellerne er ligetil og kan anvendes i alle laboratorier med minimal erfaring i cellekultur-teknikker. I betragtning af de begrænsninger i denne teknik, kan cellekulturen fremgangsmåde være, og har vist sig at være en kraftfuld teknik, når direkte celler adgang til og / eller isolering af specifikke celletyper er nødvendige. En protokol til at isolere celler fra larver er også for nylig udviklet (not beskrevet her) 49. Udbredt interesse i udvikling af komplementære metoder gør C. elegans en endnu mere kraftfuld system for i sidste ende at forstå sammenhængen mellem genfunktion og adfærd, udvikling eller aldring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator | |||
References
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
- Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
- Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
- Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
- Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
- Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
- Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
- Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
- Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
- Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
- Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
- Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
- Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
- Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
- Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
- Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
- Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
- Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
- Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
- Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
- Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
- Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
- Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
- Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
- Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
- O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
- Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).
