Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Een methode voor het kweken van embryonale Published: September 21, 2013 doi: 10.3791/50649
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

Summary

We beschrijven hier een herziene protocol voor grootschalige kweek van embryonale C. elegans cellen. Embryonale C. elegans cellen gekweekt in vitro gebruik van deze methode, blijken differentiëren en herhalen de expressie van genen in een celspecifieke wijze. Technieken die directe toegang tot de cellen of isolatie van specifieke celtypen van andere weefsels vereisen, kunnen worden toegepast C. elegans gekweekte cellen.

Abstract

C. elegans is een krachtig modelsysteem, waarin de genetische en moleculaire technieken zijn eenvoudig toepasbaar. Tot voor kort echter technieken die directe toegang tot cellen en isolatie van specifieke celtypen vereisen, kunnen niet worden toegepast in C. elegans. Deze beperking is te wijten aan het feit dat de weefsels worden ingesloten in een onder druk cuticula die niet gemakkelijk verteerd door behandeling met enzymen en / of reinigingsmiddelen. Gebaseerd op vroege pionierswerk door Laird Bloom, Christensen en collega's 1 ontwikkelde een robuuste methode voor het kweken van C. elegans embryonale cellen op grote schaal. Eieren worden geïsoleerd van zwangere volwassenen door behandeling met bleekwater / NaOH en vervolgens behandeld met chitinase om de eierschalen te verwijderen. Embryonale cellen worden vervolgens gedissocieerd door handmatig pipetteren en uitgeplaat op substraat bedekt glas in serum verrijkte media. Binnen 24 uur van isolatie cellen beginnen te differentiëren door het veranderen van de morfologie en expressie celspecifieke Markers. C. elegans cellen gekweekt met deze methode overleven gedurende 2 weken in vitro en zijn gebruikt voor elektrofysiologische, immunochemische, en imaging analyses als ze zijn gesorteerd en gebruikt voor microarray profilering.

Introduction

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een krachtige modelorganisme voor het onderzoek naar de moleculaire basis van cellulaire functie, differentiatie, en gedrag. Terwijl het genoom, metabolische en biosynthetische routes lijken op gewervelde dieren, de genetische en moleculaire volgzaamheid veel groter 2. Onder de voordelen zijn de grootte en simpele anatomie, de snelle levenscyclus (3 dagen bij 25 ° C), korte levensduur (2 weken) en een groot aantal nakomelingen (> 200). Door zijn tweeslachtig karakter en de korte levenscyclus, moleculaire en genetische manipulaties zijn eenvoudig in C. elegans, inclusief de ontwikkeling van transgene dieren 3,4 en de toepassing van gen knock-down technieken zoals RNA interferentie 5. C. elegans lichaam en eierschaal transparant. Daarom cellen kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd in zowel de volwassenen en het embryo met standaard microscopie. In de afgelopen 40 jaar, de C. elegans C. elegans onderzoek met inbegrip van een grote verzameling van mutanten, knockouts en transgenics, een gedetailleerde beschrijving van de anatomie en ontwikkeling 6,7, inclusief de volledige reconstructie van het zenuwstelsel 8, en een volledig gesequenced genoom die goed geannoteerd en ter beschikking van de hele gemeenschap ( www.wormbase.com ).

Ondanks de vele voordelen, hebben sommige experimentele benaderingen uitdagend in C. elegans. Deze omvatten degenen die toegang vereisen het plasmamembraan van de cellen en isolatie van weefsels of celtypen. Inderdaad C. elegans weefsels worden beperkt binnen haar onder druk hydrostatisch skelet, die niet gemakkelijk wordt verteerd door enzymatische behandeling of detergenten. Aan het einde van de jaren 1990 Miriam Goodman en Janet Richmond pionier methoden voor elektrofysiologische opnames van C. elegansneuronen en spiercellen in situ 9,10. Hoewel deze methoden gaf ons belangrijke inzichten in neuronale en spierfunctie in vivo, ze zijn uitdagend en lage doorvoersnelheid. Alternatieve methoden voor celfunctie studeren in vivo waren ontwikkeld, vooral met name in vivo calcium beeldvorming met behulp van genetisch gecodeerd calcium sensoren zoals GCamP en cameleon 11-13. Deze methoden echter niet het gebruik van farmacologische hulpmiddelen staan ​​omdat ze worden toegepast op intacte levende dieren.

De eerste poging tot het kweken van C. elegans cellen in vitro op grote schaal werd gemaakt door Laird Bloom tijdens de voorbereiding van zijn proefschrift 14. Helaas, moeilijkheden met slechte hechting van de cellen aan het substraat, slechte celdifferentiatie en overleving verhinderde de invoering van deze vroege protocol als een robuust celkweekwerkwijze. In 1995 Edgar en collega's een procedure gepubliceerdtot celdeling en morfogenese onderzoeken door isolatie en de cultuur van een enkele C. elegans embryo 15. Embryonale cellen verkregen door digestie van de eierschalen met een combinatie van enzymatische behandeling en handmatige dissociatie, bleven prolifereren, produceren tot ~ 500 cellen 15. Vervolgens Leung en collega's gekweekt een kleine aantallen blastomeres intestinale morfogenese bestuderen. Zij toonden aan dat een in vitro geïsoleerde E blastomeer geproduceerd gepolariseerde darmcellen die een structuur analoog aan de darmlumen door interactie met elkaar via apicale contactplaatsen 16. Buechner en collega's rapporteerden ook een soortgelijke methode voor het kweken C. elegans embryonale cellen in vitro 17.

Op basis van dit vroege werk, Christensen en collega's ontwikkelden een robuust protocol voor het kweken van embryonale C. elegans cellen in vitro 1. Zetoonde aan dat geïsoleerde C. elegans cellen kunnen differentiëren in verschillende celtypes en de functies die zij bezitten in vivo en het uiten van celspecifieke markers handhaven. Verschillende technieken die uitdagend in vivo kan worden toegepast op geïsoleerde C. elegans embryonale cellen. Deze omvatten elektrofysiologische 1,18 19, weergave en immunochemische technieken 20,21, en ​​isolatie van specifieke celtypes TL-Activated Cell Sorting (FACS) voor de bouw van cel-specifieke cDNA-bibliotheken 22,23. Gene knockdown technieken zoals RNA interferentie (RNAi) kan worden aangebracht op gekweekte C. elegans cellen 1 en een nieuwe metabolische labeling met gebruik Azido-suiker als een instrument voor glycoproteïne ontdekking recent ontwikkeld in vitro gekweekte C. elegans cellen 24.

Tenslotte breidt de celkweek methode matrix of technieken die kunnen worden toegepast op de C. elegans model in een poging om genfunctie ontcijferen in de context van een levend organisme. We beschrijven hier het protocol voor het kweken van C. elegans embryonale cellen in vitro, die grotendeels is gebaseerd op het protocol eerst beschreven door Christiansen en collega 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sterretjes (*) geven aan nieuwe of gewijzigde stappen opzichte Christensen et al. 1.

1. Material Setup

  1. De celkweek procedure vereist grote hoeveelheden eieren geïsoleerd van zwangere volwassenen. Groeien C. elegans 8P op agarplaten geënt met NA22 (beschikbaar via het C. elegans Genetische Consortium - CGC) bacteriën grote hoeveelheden eieren isoleren. In deze platen de hoeveelheid pepton gebruikte 8 keer de hoeveelheid die gewoonlijk wordt gebruikt voor NGM platen. Hoe hoger pepton concentratie ondersteunt de groei van NA22 bacteriën efficiënter, die in strijd zijn OP50-, groeien in dikke lagen.

8P platen recept:

Los 3 g NaCl, 20 g Bacto-pepton, 25 g agar in 1 liter steriel gedestilleerd water en autoclaaf gedurende 30 minuten. Laat het medium afkoelen bij 55 ° C en voeg vervolgens steriel gefiltreerd 1 ml van cholesterol (5 mg / ml in EtOH), 1 ml 1 MgCl2, 1 ml MgSO4 en 25 ml KP buffer (voorraad van 500 ml: 5 g K 2 HPO 4, 30 g KH 2 PO 4, pH 6,00). Giet vloeibaar agar medium in 10 cm petrischalen (25 ml / plaat).

  1. De volgende dag verspreid het gehele oppervlak van elke verrijkt pepton agar plaat met 1 ml van NA22 E. coli nacht gekweekt in 2XYT medium (16 g trypton, 10 g gistextract, 5 g NaCl in 1 liter steriel water, pH 7,0) bij 37 ° C. Deze bacteriën vormen een rijke bron van voedsel met een dikke laag ondersteunen van de groei van grote hoeveelheden zwangere volwassenen vormen. Voeg gezaaide plaatjes gedurende een nacht bij kamertemperatuur om de groei van de bacteriën mogelijk. Het proces kan worden versneld door incubatie bij 37 ° C gedurende 4-5 uur.
  2. Transfer uitgehongerde dieren gezaaid 8P platen. Wassen dieren uit een uitgehongerde NGM plaat met behulp van 5-6 ml M9 buffer of water en voeg 1-2 ml van deze suspensie aan elk 8P plaat.
  3. Laat de groei en vermenigvuldiging van de dieren until de platen worden bevolkt bij samenloop door zwangere volwassenen.
  4. Isoleer het nodig is voor de voorbereiding van C. eieren elegans embryonale cellen, uit zwangere volwassenen met 5-6 ml lysis-oplossing.

Lysis-recept

5 ml Fresh Bleach, 1,25 ml 10 N NaOH en 18,5 ml van de steriele H 2 O. Dit mengsel moet vers voor elk gebruik worden bereid.

  1. Was de eieren geïsoleerd van zwangere volwassenen met behulp van ei-buffer:

Ei buffer recept

118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolariteit 340 mOsm.

  1. Verwijder de eierschaal dat de eieren omgeeft door behandeling met chitinase. Chitinase is een enzym met de hoogste activiteit bij zure pH 25. Los chitinase (Sigma, catalogusnummer. C6137) in ei-buffer pH 6,5 tot een eindconcentratie van 2 mg / ml. Bewaar de chitinase voorraadoplossing bij -20 ° C in 1 ml porties in steriele 15 ml conische buizen. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot enkele maanden.
  2. Groeien C. elegans gekweekte cellen op geautoclaveerd dekglaasjes (12 mm diameter), bedekt met pinda lectine. Los pinda lectine in steriel water (0,5 mg / ml). Peanut lectine oplossing mag niet worden gefilterd of geautoclaveerd. Het hoeft ook niet te worden behandeld met UV-licht. WINKEL 2 ml porties bij -20 ° C maximaal 6 maanden.
  3. Volledige celkweekmedium (500 ml) bevat 500 ml L-15 kweekmedium Gibco, 50 ml foetaal runderserum (hitte geïnactiveerd), 7,7 g sucrose (45 mOsm), 5 ml 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine (2%). De compleet medium wordt vervolgens gefilterd met behulp van een 0,20 um porie filter.

Merk op dat het ei buffer en het kweekmedium hebben osmolariteit van 340 en 345 mOsm respectievelijk. In tegenstelling tot zoogdiercellen C. elegans cellen een relatief hoge osmolariteitdie moet in telling worden gehouden bij het bereiden van oplossingen die in direct contact met het plasmamembraan van de cellen komt. De recepten van deze reagentia werden aangepast om de gewenste osmolariteit, die werd gemeten met een osmometer 1 bereikt. Het is niet noodzakelijk een osmometer gebruiken als deze recepten precies worden gevolgd en zorg wordt gebruikt bij het bereiden van deze reagentia. Echter, men moet een Osmoter gebruiken als andere oplossingen moeten worden voorbereid, waarvan de recepten zijn hier niet vermeld of in een van de publicaties die C. gebruiken elegans gekweekte cellen.

2. Ei Isolatie

  1. Het wordt aanbevolen om te beginnen met minstens vier 8P platen voldoende eieren te verzamelen voor 12 putjes van gekweekte cellen (in 24-well platen).
  2. Voordat u begint met de procedure ontdooien een buis van pinda lectine voorraad oplossing. Plaats geautoclaveerd dekglaasjes onder aan de putten in een 24-wells plaat en voeg 200 ul pinda lectine op de dekglaasjes. Incubeer gedurende 1 uur of Until de cellen zijn klaar om te worden verzilverd. Verwijder volledig de pinda lectine en was de putten eenmaal met 1 ml steriel geautoclaveerd water. Volledige verwijdering van de pinda lectine van de dekglaasjes essentieel voor het vermijden cel klonteren.
  3. Was de zwangere volwassenen uit de agar platen met behulp van steriele geautoclaveerd water. Verzamel de schorsing in twee steriele conische 50 ml tube. Laat de buizen op ijs gedurende 5 minuten tot precipitatie van de wormen mogelijk onderaan de buizen (*). Verwijder het water met een transfer plastic pipet en vervang het met vers steriel geautoclaveerd water. Pellet wormen door tafelblad centrifugatie bij 200 xg (~ 1200 rpm) gedurende 10 minuten (*). Herhaal deze laatste stap tenminste 3.
  4. Breng wormen in een steriele 15 ml conische buis en pellet ze op 200 xg (~ 1200 rpm) gedurende 10 min (*). Gebruik hogere centrifugeersnelheid niet om de bacteriën te voorkomen verzamelen op de bodem van de buis ook. Soms na centrifugeren de wormen niet volledig afgedraaid. After elk wassen en vóór verwijdering van de bovenstaande vloeistof, plaats de buizen gedurende 5 minuten op ijs. In gekoeld water precipiteren wormen naar de bodem van de buis.
  5. Verwijder het water en voeg 5-6 ml lysisoplossing (zie Material ingesteld). Rock de schorsing zachtjes gedurende 5-10 minuten en dan beginnen de controle worm lysis onder de stereomicroscoop om de 2-3 minuten. Een daling van de schorsing kan ook op een dekglaasje worden geplaatst voor een makkelijker inspectie. De incubatietijd varieert afhankelijk van de versheid van het bleekmiddel, koop kleine flesjes van bleekwater en open een nieuwe fles elke maand.
  6. Wanneer ~ 70-80% van de wormen worden gelyseerd (10 min vanaf het begin van de incubatie), stop de lysis reactie door toevoeging van 9 ml ei buffer pH 7,3 (zie Material ingesteld). Centrifugeer de suspensie bij 200 xg (~ 1200 rpm) gedurende 10 minuten. Vanaf dit punt een Bunsen brander, op de bank om nieuwe verontreiniging van de eieren (*) voorkomen.
  7. Verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van een steriele plastic overdracht pipet en was het pellet 3-4x met ei buffergeheugen totdat de oplossing helder is. Zorg ervoor dat u de pellet goed te mengen in het ei buffer tijdens elke wasbeurt.
  8. Eieren worden gescheiden van de kadavers met 30% sucrose oplossing. Resuspendeer de pellet in 2 ml steriele ei buffer en voeg 2 ml 60% sucrose-oplossing (voorraad in steriele ei buffer). Meng goed en centrifugeer 20 min bij 200 xg (~ 1200 rpm) (*).
  9. Verwijder voorzichtig de buizen uit de centrifuge. De eieren zweven boven de oplossing. Met behulp van een P1000 pipet en steriele tips, de overdracht van alle eieren in een nieuwe steriele 15 ml conische buis.
  10. Voeg 10 ml steriel ei buffer aan de buis en centrifugeer bij 200 xg (~ 1200 rpm) gedurende 10 minuten. Herhaal het wassen 3 x. Zorg ervoor dat de eieren worden volledig opnieuw gesuspendeerd in het ei buffer tijdens elke wasbeurt.

3. Embryonale cellen Dissociatie

Gaan met de volgende stappen van de procedure onder steriele omstandigheden met behulp van een laminaire stroming kap. Hoewel dierentoga bacteriën op platen, wast en de behandeling met lysis oplossing die bleekmiddel meeste onschadelijk maken indien niet alle bacteriën. Aldus gebruik van een laminaire kap op dit punt van de procedure verhindert nieuwe verontreiniging van het ei suspensie.

  1. Resuspendeer afgedraaid eieren in 1 ml 2 mg / ml chitinase (voorraad in ei-buffer pH 6,5 (*)) en overbrengen naar een nieuwe steriele 15 ml conische buis. Rock de buis gedurende 10-30 minuten bij kamertemperatuur. De exacte incubatietijd verandert al naar gelang de versheid van het enzym en de temperatuur van de kamer en moet daarom worden bepaald voor elke bereiding. Het wordt aanbevolen om te beginnen bewaken de eieren onder een omgekeerde microscoop celcultuur na 10 minuten incubatie. Opmerking: in onze ervaring, lage pH verhoogt de chitinase enzymatische activiteit. Daarom gebruiken we ei buffer bij pH 6,5 tot chitinase (recept hierboven vermeld, waarbij de pH wordt ingesteld op 6,5 met NaOH) opgelost.
  2. Bij ~ 80% van de eierschalen worden verteerd door dechitinase behandeling (Figuren 1 AB), pellet de eieren door centrifugatie bij 900 xg (~ 2500 rpm) gedurende 3 min (*). Met behulp van een P1000 pipet en steriele tips, verwijder voorzichtig de supernatant en voeg 3 ml L-15-medium (*).
  3. Breng de eieren in een 6 cm diameter plaat en zachtjes distantiëren de cellen met behulp van een 10 ml steriele spuit met een 18 G naald. Controleer de dissociatiegraad door een druppel van suspensie in een nieuwe plastic petrischaal en het bekijken onder de microscoop. Geen lucht aan te zuigen in de spuit tijdens deze procedure om schade aan de cellen te voorkomen. Verdere dissociatie tot ~ 80% van de cellen gedissocieerd.
  4. Filter de schorsing met een steriele 5 micrometer Millipore filter. Celsuspensies worden gefilterd om celklonten, onverteerd eitjes en larven te verwijderen. Filter additionele 4-5 ml vers L-15 medium door het filter naar alle cellen herstellen. Niet te veel kracht te gebruiken tijdens de filtratie stap om da te voorkomenmaging het filter en / of de cellen.

4. Kweken Cellen

  1. Pellet de gedissocieerde cellen door centrifugatie bij 900 xg (~ 2500 rpm) gedurende 3 min (*). Met behulp van een P1000 pipet en steriele tips verwijder zorgvuldig alle supernatant. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in volledige L-15-medium en plaat 1 ml / putje. De hoeveelheid toegevoegde medium afhankelijk van het aantal gebruikte platen 8P, de samenvloeiing van de wormen op de platen en het soort experimenten die worden uitgevoerd op de cellen. De celdichtheid worden bepaald met een hemocytometer. Voor patch-clamp opnames plating dichtheid van ~ 230.000 cellen / cm 2 is optimaal.
  2. Houd de 24 wells plaat in een plastic Tupperware container met natte papieren handdoeken om verdamping van kweekmedium te voorkomen. Bewaar de container in een bevochtigde incubator bij 20 ° C en lucht.
  3. De cellen zijn meestal klaar voor de experimenten binnen 24 uur wanneer de morfologische differentiatie en uitdrukkelijkeion van GFP markers compleet. Cellen kunnen in kweek worden gehouden binnen 2 weken, maar ze zijn meestal meest gezonde tot 7-9 dagen na uitplaten. Het medium moet eenmaal daags worden vervangen om gezonde cellen te behouden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C. elegans gekweekte cellen differentiëren en uitdrukkelijke cel specifieke markers

Christensen en collega's met behulp van trypan blauw kleuring toonde aan dat> 99% van de embryonale C. elegans cellen overleven de isolatie procedure. Op dag 9 en 22 na plateren, 85% en 65%, respectievelijk nog in leven 1. Geïsoleerde embryonale C. elegans cellen moeten hechten aan een substraat om te differentiëren. Cellen die niet aan de vorm klonten houden en het is niet duidelijk of ze overleven. Differentiatie van de cellen begint 2-3 uur na plating en blijft voor ~ 24 uur. Binnen 24 uur, cellen nemen inzake specifieke morfologie. Aldus neuronen sturen processen 1,18-20 spiercellen vormen langwerpige structuren vingervormig vergelijkbaar met die waargenomen in vivo 1 en kanaal cellen vormen een lumen 17. De morfologische kenmerken in vitro opmerkelijk overeen met die in vivo. Bijvoorbeeld <em> in vitro gekweekte ALM en PLM aanraking neuronen (geïdentificeerd door expressie van Pmec-4 :: GFP) ontwikkelen slechts twee neuronale processen met een langer dan de andere, zoals ze doen in vivo 1,20 (Figuur 2A). Dit suggereert dat ten minste enkele van de moleculaire mechanismen die differentiatie van C. rijden elegans cellen cel-autonome dus worden samengevat in vitro.

In de jaren 1990, Chalfie pionier in het gebruik van Green Fluorescent Protein (GFP) in C. elegans celtypen waarin een gen van belang tot expressie 26 label. Werk tot nu toe gedaan op gekweekte C. elegans embryonale cellen ondersteunt dat de expressie van GFP in specifieke celtypen kunnen worden samengevat in vitro 1,18-20,27 (Figuur 2A). Bovendien is de verhouding van cellen die GFP tot expressie in vitro is vergelijkbaar met de verhouding in vivo. Bijvoorbeeld, unc-4 homeodomein reportergen wordt uitgedrukt in 13 motorische neuronen in de volwassen embryo (13 van 550 cellen-2.3%) 28,29. Fox en collega telde unc-4 :: GFP-cellen in kweek en vonden dat zij 2% van het totale aantal cellen 23. Evenzo UNC-119, een proteïne noodzakelijk voor G proteïne handel 30 wordt uitgedrukt in de meeste C. elegans neuronen en aantal spiercellen (76% van de cellen in de L1 larve 31). Christensen en collega's rapporteerden dat cultuur unc-119 :: GFP-expressie werd waargenomen in 74-76% van de cellen lijken neuronen en spiercellen 1. Tenslotte MEC-4, een mechanosensitive Na + / Ca2 + kanaal subeenheid nodig voor zachte aanraking 32 wordt uitgedrukt in 6 keer neuronen in de volwassen C. elegans. Van deze zes aanraking neuronen worden vier (ALMS en PLMs) embryonaal afgeleid. Aldus 4 van 550 (0,7%) embryonale cellen GFP tot expressie moet onder de controle van de mec-4-promoter. Inderdaad neuronen in cule dat Pmec-4 :: GFP expressie vormen -0,5% van het totale aantal cellen 18,20.

Eiwittellers en posttranslationele modificaties die celspecifieke zijn kunnen ook worden waargenomen in vitro. Bijvoorbeeld, alfa tubuline geacetyleerd alleen horen neuronen in C. elegans 33. In vitro werkwijzen aanraking neuronen kleuren met een antilichaam opgewekt tegen-geacetyleerde alfa-tubuline 20 (figuur 2B). Gekweekte aanraking neuronen ook uiten de toxische mutant kanaal MEC-4 (d), die de dood van het touch neuronen in vivo 34 veroorzaakt. Inderdaad, GFP tot expressie neuronen bereid uit een mec-4 (d); pmec-4 :: GFP-stam zijn oorspronkelijk aanwezig in de cultuur, maar dan ontaarden 20. Belangrijk is, raakt neuronen bereid uit mec-4 (d); pmec-4 :: GFP gedragen in vitro vergelijkbaar met hoe ze zich gedragen in vivo. Zo kunnen ze worden gered van de dood door behandeling met eenmiloride en dantroleen, dat mec-4 onderdelen (d) touch neuronen van degeneratie in vivo 20,35. Tot slot, niet alleen C. elegans embryonale cellen morfologisch lijken op cellen in vivo, maar ook cel-specifieke markers te uiten en aanwezig in dezelfde verhouding zij aanwezig zijn in vivo zijn. Tezamen bieden deze gegevens ondersteunen dat gekweekte C. elegans cellen vormen een algemeen goed systeem om biologische processen te bestuderen, zowel op cellulair en moleculair niveau.

Patch-clamp elektrofysiologische analyse van gekweekte C. elegans cellen

De patch-clamp techniek geïntroduceerd door Neher en Sakmann in de jaren zeventig voor de studie van ionenkanalen activiteit van cellen op zich of in weefsels kunnen worden toegepast op gekweekte C. elegans cellen 36. Christensen en collega's waren de eersten die ionkanalen in gekweekte C. bestuderen elegans cellen met behulppatch-clamp 1. Sindsdien hebben K +, anionische, kationische en niet-selectieve kanalen (figuren 2 CE), alsmede dopaminetransporters-afhankelijke kanalen zijn beschreven in gekweekte C. elegans 1,18,19,37. Deze studies ons begrip van de rol van ionische geleiding in de functie van C. elegans neuronen. Er zijn een paar wijzigingen die moeten worden overwogen wanneer u de patch clamp techniek om ionkanaalactiviteit opnemen van gekweekte C. elegans cellen. Deze wijzigingen zijn vooral relevant voor gehele cellen opnamen. Ten eerste, C. elegans cellen zijn klein, bijvoorbeeld neuronen hebben een diameter van 1-2 urn. Daarom moet glazen pipetten om een ​​kleine fooi (0,5 micrometer) hebben. Kleine pipet tips verhogen de input weerstand, leidt tot het stimuleren en opname fouten. Om dit probleem te verzachten, kan pipetten worden geconstrueerd om een ​​kleine fooi, maar een brede kegel hebben. Goodman en Lockery ontwikkelde een methode employing een brand polijstmachine uitgerust met een hoge-druk lucht pomp voor het vormen pipetten om deze vorm 38. Ten tweede, vanwege de kleine grootte van de cellen, toegang verkrijgen gehele cel met afzuiging resulteert meestal in schade aan de cel. Veel hogere succes wordt meestal bereikt door een hoge spanning impuls (elektrisch zappen) het stukje membraan onder de punt van de pipet. De andere configuraties van de patch clamp techniek (cell bevestigd, inside-out en outside-out) zijn eenvoudig toe te passen op C. elegans gekweekte cellen, met als enige modificatie dat de punt van de pipet klein te zijn om rekening te houden met de kleine omvang van C. elegans cellen. De geperforeerde patch techniek is notoir meer arbeidsintensief en tijdrovend dan andere patch clamp technieken. Er is echter met succes toegepast C. elegans cellen in situ 39, 40 en dus moet in de cultuur van toepassing kan zijn.

Calcium beeldvormingtoegepast voor C. elegans gekweekte cellen

De functionele rol van spanningsafhankelijke Ca 2 + kanalen (VACK) in neuronen en gliacellen is onderzocht in gekweekte C. elegans cellen door calcium beeldvorming 20, 21, 41. De toepassing van calcium beeldvorming in cultuur kon de toepassing van oplossingen met hoge concentraties KCl naar cel depolarisatie induceren en calciumantagonisten de bijdrage van verschillende kanalen calcium influx onderscheiden. Bijvoorbeeld, de bijdrage van Na + / Ca2 + doorlaatbare MEC-4 (d) kanaal naar de intracellulaire calciumconcentratie werd bepaald door calcium beeldvorming met kameleon YC2.12 in de aanwezigheid en afwezigheid van het DEG / ENaC channel blocker amiloride. Die experimenten toonden aan dat een amiloride-gevoelige calciuminflux aanwezig in aanraking neuronen die MEC-4 (d), maar niet in het wild type contact neuronen is. Gebruik ionofoor het membraan van permeabilizeRaak neuronen en Cameleon (Figuren 3A en B) te kalibreren, Bianchi en collega's ook bepaald dat de gemiddelde vrije calciumconcentratie in contact neuron is 200 nM 20 (Figuren 3C en D). Evenzo Frokjaer-Jensen en collega's onderzochten de rol van VGCCs EGL-19 en UNC-36 in het reguleren van depolarisatie-geïnduceerde calciuminflux in C. elegans gekweekt mechanosensorische neuronen die cameleon 21. Zij vonden dat depolarisatie van aanraking neuronen geïnduceerd door extracellulaire K + in een bereik tussen 20 mM en 100 mM resulteerde in toename van intracellulair calcium onthuld door YFP / CFP verhouding verandering tussen 17% en 70%. Bovendien werden calcium transiënten verminderd egl-19 en unc-36 verlies-functie mutaties en werden niet gedetecteerd in de afwezigheid van extracellulair Ca2 + suggereert dat VGCCs spelen een belangrijke rol in exciteerbaarheid C. elegans raken neuronen 21.

Stout en Parpura onderzocht de rol van spanningsafhankelijke Ca 2 + kanalen EGL-19, CCA-1 en UNC-2 in CEPsh schede glia van de cephalica sensilla bij te dragen aan calciuminstroom 41. Intracellulair calcium dynamiek werden geanalyseerd in CEPsh gliacellen gekweekt uit transgene dieren co-uiting van de rode fluorescerende marker mCherry en de groene fluorescerende cytosolische Ca 2 +-indicator GcaMP2.0. In de meeste CEPsh gliacellen, membraan depolarisatie geïnduceerd door hoge extracellulaire KCl geïnduceerde toename van intracellulair Ca2 + gerapporteerd door stijging GcaMP2.0 fluorescentie. Bovendien is de behandeling met calciumblokkers Cd 2 + en NEMA (nemadipine-A) verminderde significant de calcium transiënten. Deze gegevens ondersteunen dat spanningsafhankelijke toename van intracellulair calcium in CEPsh gliacellen hangt ten minste gedeeltelijk op spanningsafhankelijke calciumkanalen. De auteurs verder intracellulair calcium veranderingen in L-type EGL-1 geanalyseerd9RF (vermindering van de functie), T-type ca-1 en N, P / Q, R-kanaal type UNC-2 knockout dieren en geconcludeerd dat alle drie soorten van Ca 2 + kanalen aanzienlijk bijdragen aan intracellulair calcium dynamiek in deze gliacellen . Hieruit volgt dat vanaf onvolwassen zoogdieren macroglia reageren op depolarisatie via VACK-afhankelijke veranderingen in intracellulaire Ca 2 +-concentraties, de auteurs concluderen dat C. elegans CEPsh gliacellen kan functioneel lijken zoogdieren macroglia, astrocyten, oligodendrocyten en oligodendrocyt voorloper cellen.

Andere technieken voor gekweekte C. elegans embryonale cellen

Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is met succes toegepast op C. elegans gekweekte cellen te kweken met specifieke celtypen en / of cellen te isoleren voor microarray analyse 23,4243 verrijken. De belangrijkste wijziging die moeten worden ingevoerdde celkweek werkwijze was het soort substraat. Vreemd en collega's testten verschillende substraten zoals collageen IV, poly-L-lysine, fibronectine en laminine en vastgesteld dat poly-L-lysine is het beste substraat 37. Poly-L-lysine bevordert celdifferentiatie net als pinda lectine, maar in tegenstelling tot pinda lectine kan loskomen van de cellen van het substraat zonder schade 36. Verschillende soorten C. elegans cellen zijn gesorteerd door FACS, waaronder thermosensory, olfactorische, motor en mechanosensorische neuronen en gliacellen 23,42 - 45. Cell etikettering bewerkstelligd door expressie van GFP reporters en in het algemeen de sorteerefficiëntie is hoog met isolatie van maximaal 90% van GFP gemerkte cellen 23.

Gene silencing door RNA interferentie (RNAi) kan op cultuur. Christensen en collega's bleek dat incubatie van GFP-expressie gekweektC. elegans neuronen met dsRNA tegen GFP resulteerde in een significant verminderde mate van GFP expressie met een maximaal effect 4 dagen na toevoeging van dubbelstrengs RNA aan de cultuur 1. Evenzo Shih en collega's gebruikte RNAi in de cultuur aan te tonen dat de C. elegans SID-1 is nodig voor de regulering van de effecten van dsRNA en het is waarschijnlijk nodig in vivo te mediëren systemische verspreiding van RNAi 46. Concluderend RNAi een van de meest gebruikte en effectieve methoden voor gen-silencing in C. elegans kan worden toegepast in de cultuur. Deze methode kan worden gebruikt voor silencing genen waarvan knockout letaal of interfereert met C. elegans normale ontwikkeling.

Figuur 1
Figuur 1. C. elegans embryo's voor en na behandeling chitinase. (A) Foto eieren voorafgaand aan blootstelling aan chitinase. De pijl wijst naar het transparante en intacte eierschaal rondom een embryo. (B) Eieren behandeld met chitinase gedurende 10 minuten. De eierschalen werden verteerd en zijn niet langer zichtbaar in het embryo. De pijlen wijzen tot drievoudig embryo vrijgelaten uit de eierschaal. De blauwe doos omringt een groep cellen die nog aan elkaar.

Figuur 2
Figuur 2. Gekweekte C. elegans raken neuronen. (A) TL microfoto van gekweekte C. elegans raken neuronen die GFP onder de aanraking specifieke promotor mec-4 (P mec-4 :: GFP), schaal bar 5 micrometer. (B) TL microfoto van een touch neuron waarin P mec-4 :: GFP (bovenste paneel), die werd gekleurd met een monoklonaal antilichaam tegen geacetyleerde alfa tubuline (Sigma), een posttranslational wijziging van alfa tubuline die optreedt in contact neuronen slechts 33. Aangepast van 20. (CE) Voorbeeld van mechanosensitive kanalen opgenomen in wild type gekweekte tintje neuronen in de cel bevestigd configuratie van de patch-clamp techniek. Het kanaal heeft een geleiding van ~ 100 pk en het aanwezig is in contact neuronen geïsoleerd van mec-4 knockout dieren (mec-4 (u253)) ook is. Deze gegevens suggereren dat dit kanaal is niet de MEC kanaal 20. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3
Figuur 3. Schatting van de vrije intracellulaire calciumconcentratie in gekweekte contact neuronen met behulp van cameleon. (A) pseudocolor beelden van gekweekte aanraking neuronen die cameleon YC2.12 in 0 mM Ca 2 + (+ EGTA, links) en 10 mM Ca 2 + (rechts). De pseudocolor schaal wordt weergegeven aan de rechterkant. (B) Vertegenwoordiger cameleon fluorescerende veranderingen die gepaard gaan met veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie in een gepermeabiliseerde aanraking neuron. Voorafgaand aan de opname werden de cellen gedurende 30 min in een oplossing die calcium ionofoor A23187-Br (10 uM) en een gedefinieerde concentratie vrij calcium (250 nM in dit geval). Rotenon (10 mM) en 2-deoxy-D-glucose (1,8 mm) werden toegevoegd aan de oplossing actief pompen blokkeren. De neuron werd geperfuseerd met een oplossing die 0 mM (5 mM EGTA) Ca2 + en 10 mM Ca2 + de minimale en maximale fluorescentieverhouding veranderingen bepalen. (C) Cameleon kalibratiekromme die de verkregen resultaten 4-7 cellen waarvan fluorescentieveranderingen bestudeerd in 11 verschillende vrij calcium oplossingen. Elke verhouding verandering werd genormaliseerd om de maximale verhouding verandering voor de individuele cel. (D) (B). De rust cameleon verhouding in gekweekte neuronen contact was 22% ± 7 (n = 2, 18 cellen) van de maximale verhouding veranderen. Op basis van de ijklijn weergegeven in (C) Deze verhouding komt overeen met een vrije calciumconcentratie van ~ 200 nM. Aangepast van 20. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans is een krachtige modelorganisme voor het ontcijferen van de genetische wegen betrokken bij de ontwikkeling, het gedrag en veroudering. Het gemak is voornamelijk het gevolg van het gemak waarmee het genetisch gemanipuleerd kan worden en uit zijn korte levenscyclus. Ondanks het gemak, C. elegans heeft zijn beperkingen. C. elegans cellen zijn klein en ingesloten in een onder druk cuticula dat de toepassing van methoden die directe toegang tot de cellen, zoals elektrofysiologische en farmacologische technieken of isolatie van specifieke celtypen, zoals het gen-expressieprofiel door microarray analyse vereisen beperkt. De C. elegans celkweek methode een oplossing voor veel van de beperkingen van dit modelorganisme geweest.

In dit manuscript beschrijven we een bijgewerkte werkwijze voor het isoleren en kweken van embryonale C. elegans cellen in grootschalige gebaseerd op vroeg werk van Christensen en collega's 1. We ALSo verslag gepubliceerd representatieve resultaten verkregen met verschillende technieken, waaronder immunocytochemie, elektrofysiologie en calcium beeldvorming die ons begrip van de fysiologische processen en genetische eisen onderliggende cel van C. elegans. Werk tot nu toe gedaan op gekweekte C. elegans cellen ondersteunt dat ze differentiëren in vitro als in vivo recapituleren de expressie van cel-specifieke markers 1,18-20,22,23,27,44. Hoewel niet alle celtypen zijn gekarakteriseerd in cultuur, dit lichaam van werk suggereert dat de celkweek methode maakt het mogelijk de studie van C. elegans cellen geïsoleerd zonder hun identiteit te compromitteren.

Het protocol is eenvoudig en gemakkelijk toepasbaar in elk laboratorium. Dingen die moeten in gedachten worden gehouden voor het succesvol kweken van C. elegans embryonale cellen zijn de volgende: 1) De dieren mogen worden gesynchroniseerd, zodat de meerderheid van hen zull worden gravid volwassenen tijde van de celkweek procedure. Vanaf de worm cultuur van een uitgehongerd plaat is een goede optie. 2) De gebruikte bacteriën te kweken C. elegans moeten worden verwijderd vóór worm lysis om verontreiniging van de celkweek te voorkomen. Aanbevolen wordt dat grote hoeveelheden steriel water worden gebruikt voor het wassen en dieren gecentrifugeerd bij de voorgestelde (niet hoger) snelheid neerslaan van de bacteriën te voorkomen ook. Inderdaad, terwijl behandeling met de lysisbuffer bevattende bleek bacterieculturen elimineren, uitgaande van een relatief bacterievrij dier suspensie wordt aanbevolen. 3) De dieren moeten worden behandeld met bleekmiddel / NaOH tot ~ 80% van hen hun eieren hebben vrijgegeven. Kortere en langere incubatietijd verminderen de efficiëntie van ei herstel en respectievelijk beschadiging van de eieren. 4) Eierschaal spijsvertering door chitinase moeten nauwgezet worden gecontroleerd. Handmatige dissociatie moet worden gestart wanneer ~ 80% van de eierschalen is verteerd. Langere en kortere incubation keer zowel leiden tot celbeschadiging, door directe beschadiging van de plasmamembraan door het enzym en schade door langdurige en hardere handmatige dissociatie in de poging om de cellen te isoleren, respectievelijk. 5) Mobiele filtratie door de 5 micrometer filter moet niet worden gedwongen. Als het filter verstopt raakt, moet deze worden vervangen door een nieuwe om celbeschadiging voorkomen.

Ondanks het feit dat gekweekte embryonale cellen hebben een revolutie in het gebied op vele manieren, ze zijn niet het antwoord voor elke wetenschappelijke vraag en nog steeds beperkingen. Bijvoorbeeld, de genen die in kweek zijn meestal embryonale omdat cellen geïsoleerd uit embryo. Subcellulaire compartimenten mogelijk niet goed ontwikkelen in de cultuur. Bijvoorbeeld, de ontwikkeling en het onderhoud van de cilia van bepaalde amphid sensorische neuronen zoals AWA en AWC afhankelijk van de interactie met amphid glia, die is verloren in cultuur 44. Cellen verliezen hun natuurlijke buren en geen fysiologisch rel makenvante cel-cel contacten. Zo is het niet bekend of cellen vormen tight junctions, elektrische of chemische synapsen en als zij, deze niet waarschijnlijk hun fysiologische partners. Bovendien zijn cellen op een enkel substraat, pinda lectine. De extracellulaire matrix in vivo waarschijnlijk een complexe en moeilijk te reproduceren mengsel van veel moleculen zoals pinda lectine, laminine, collageen en fibronectine zijn. Bovendien gespecialiseerde extracellulaire matrix misschien nodig voor bepaalde celfuncties. Bijvoorbeeld, de mechanosensitive kanaal uitgedrukt in lichaam contact neuronen en gevormd door MEC-4 en MEC-10 subeenheden niet afgesloten in kweek 18, maar kan gemakkelijk worden afgesloten in vivo 47. Dit stamt waarschijnlijk uit het feit dat extracellulaire collageen MEC-5 gewoonlijk door naburige naad cellen in vivo, afwezig in kweek 48. MEC-5, met extracellulaire matrixeiwitten MEC-1 (een lange aa 1999eiwit met een Kunitz-achtige domein en twee EGF-domeinen) en MEC-9 (een 834 aa lange eiwit dat verschillende Kunitz-achtige domeinen, EGF herhalingen en een glutaminezuur-rijke domein bevat) zijn nodig voor touch sensatie en worden verondersteld te binden de extracellulaire domeinen van de MEC kanaal complex en oefenen gating spanning op het complex bij mechanische stimulatie.

Tot slot, C. elegans embryonale cellen kunnen in vitro worden gekweekt en ze lijken te differentiëren indient de expressie van celspecifieke genen. Het protocol voor het kweken van de cellen is eenvoudig en kan in elk laboratorium met minimale ervaring in celkweek technieken worden toegepast. Rekening houdend met de beperkingen van deze techniek, kan de celkweek methode en heeft zich bewezen als een krachtige techniek zijn als directe cellen toegang tot en / of isolatie van specifieke celtypen nodig. Een protocol voor het isoleren van cellen van larven is ook recent ontwikkelde (not beschreven hier) 49. Veel belanghebbenden bij de ontwikkeling van complementaire methoden maakt C. elegans een nog krachtiger voor uiteindelijk begrip van de relatie tussen genen en gedrag, ontwikkeling of veroudering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Bacto Peptone VWR International Inc. 90000-382
Difco Agar Granulated VWR International Inc. 90000-784
Bacto Tryptone VWR International Inc. 90000-284
Bacto Yeast Extract VWR International Inc. 90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid Invitrogen 11415-064
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16140-063
Penicillin-streptomycin Sigma P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus Sigma C6137-25UN
NA22 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center
Peanut Lectin Sigma L0881-10MG
Sucrose Sigma 57903-1KG
D-(+)Glucose Sigma 67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) Sigma E0396-25G
Hepes Sigma H3375-500G
Cholesterol
NaCl Sigma 57653-1KG
KCl Sigma P9333-500G
CaCl2 Sigma C1016-500G
MgCl2 Sigma M8266-100G
MgSO4 Sigma M2643-500 g
K2HPO4 Sigma P2222-500G
KH2PO4 Sigma P9791-500G
NaOH Sigma S8045-500G
KOH Sigma P1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips USA Scentific 1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped USA Scentific 1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector VWR International Inc. 89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond VWR International Inc. 53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile VWR International Inc. 14670-114
15 ml Conical Tube USA Scentific 1475-1611
50 ml Conical Tube USA Scentific 1500-1811
Sterile 18 gauge Needles Becton, Dickinson and Co. 305196
Sterile 10 ml Syringes Becton, Dickinson and Co. 305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size Corning 431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane VWR International Inc. 28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips VWR International Inc. 48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid Thomas scientific 6902A09
Dumont #5- Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Centrifuge 5702 Eppendorf 022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  6. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
  7. Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
  8. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
  9. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  10. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
  11. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
  12. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
  14. Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
  15. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
  16. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
  17. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
  18. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  19. Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
  20. Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
  21. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  22. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
  23. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
  24. Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
  25. Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
  26. Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
  27. Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
  28. Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
  29. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
  30. Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
  31. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  32. Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
  33. Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
  34. Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
  35. Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
  36. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  37. Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
  38. Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
  39. Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
  40. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
  41. Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
  42. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
  43. Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
  44. Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
  45. Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
  46. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
  47. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
  48. Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
  49. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).

Tags

Developmental Biology Eukaryota biologische verschijnselen Cell Fysiologie C. elegans celkweek embryonale cellen
Een methode voor het kweken van embryonale<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sangaletti, R., Bianchi, L. A Method … More

Sangaletti, R., Bianchi, L. A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells. J. Vis. Exp. (79), e50649, doi:10.3791/50649 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter