Summary
Nous décrivons ici un protocole révisé pour la culture à grande échelle de l'embryon C. elegans cellules. Embryonnaire C. elegans cellules cultivées in vitro à l'aide de cette méthode, semblent différencier récapituler et l'expression de gènes d'une manière spécifique de la cellule. Les techniques qui nécessitent un accès direct à des cellules ou à l'isolement de types de cellules spécifiques à partir d'autres tissus peuvent être appliquées sur C. elegans cellules cultivées.
Abstract
C. elegans est un puissant système de modèle, dans lequel des techniques génétiques et moléculaires sont facilement applicables. Jusqu'à récemment, cependant, les techniques qui nécessitent un accès direct à des cellules et l'isolement de types cellulaires spécifiques, ne pouvaient pas être appliquées dans C. elegans. Cette limitation est due au fait que les tissus sont confinés à l'intérieur d'une cuticule sous pression qui n'est pas facilement digéré par traitement avec des enzymes et / ou des détergents. Basé sur les premiers travaux de pionnier par Laird Bloom, Christensen et ses collègues 1 développé une méthode robuste pour la culture de C. elegans cellules embryonnaires à grande échelle. Les oeufs sont isolés des adultes gravides par traitement avec l'eau de Javel / NaOH et ensuite traitées avec chitinase pour enlever les coquilles. Les cellules embryonnaires sont alors dissociées par pipetage manuel et étalées sur substrat de verre recouvert dans les médias de sérum enrichi. Dans les 24 heures de cellules d'isolement commencer à se différencier en changeant la morphologie et en exprimant Marke spécifique de cellulers. C. elegans cellules cultivées en utilisant cette méthode survivre jusqu'à deux semaines in vitro et ont été utilisés pour électrophysiologique, immunochimique, et l'imagerie des analyses aussi bien qu'ils ont été triés et utilisés pour microarray profilage.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme modèle puissant pour l'étude des bases moléculaires de la fonction cellulaire, la différenciation et le comportement. Alors que son génome, les voies métaboliques et biosynthétiques sont similaires chez les vertébrés », sa traçabilité génétique et moléculaire sont beaucoup plus 2. Parmi ses avantages sont sa taille et simple anatomie, son cycle de vie rapide (3 jours à 25 ° C), durée de vie courte (2 semaines) et un grand nombre de descendants (> 200). En raison de sa nature hermaphrodite et cycle de vie court, les manipulations génétiques et moléculaires sont simples dans C. elegans, y compris la génération d'animaux transgéniques 3,4 et l'application de techniques de knock-down gènes tels que l'ARN interférence 5. C. corps et la coquille elegans sont transparents. Par conséquent les cellules peuvent être facilement visualisés à la fois l'adulte et l'embryon au microscope standard. Au cours des 40 dernières années, le C. elegans C. recherche elegans notamment une grande collection de mutants, KO et transgéniques, une description détaillée de l'anatomie et de développement 6,7, y compris la reconstruction complète du système nerveux 8, et un génome entièrement séquencé qui est bien annoté et disponible à toute la communauté ( www.wormbase.com ).
Malgré les nombreux avantages, certaines approches expérimentales ont été difficiles en C. elegans. Ceux-ci comprennent ceux qui nécessitent l'accès à la membrane plasmique des cellules et l'isolement des tissus ou types cellulaires. En effet C. elegans tissus sont confinés à l'intérieur de son squelette hydrostatique sous pression, qui n'est pas facilement digéré par traitement enzymatique ou détergents. À la fin de 1990 Miriam Goodman et Janet Richmond pionnier des méthodes pour les enregistrements électrophysiologiques C. elegansles neurones et les cellules musculaires in situ 9,10. Bien que ces méthodes nous ont donné des informations importantes sur neuronale et la fonction musculaire in vivo, ils sont difficiles et à faible débit. Des méthodes alternatives pour étudier la fonction des cellules in vivo ont été développés, notamment dans la plupart imagerie calcique in vivo en utilisant des capteurs de calcium génétiquement codés comme GCamP et cameleon 11-13. Ces méthodes cependant, ne permettent pas l'utilisation d'outils pharmacologiques parce qu'ils sont appliqués sur des animaux vivants intacts.
La première tentative de culture C. cellules elegans in vitro à grande échelle a été faite par Laird Bloom lors de la préparation de sa thèse de doctorat 14. Malheureusement, les difficultés rencontrées avec une mauvaise adhérence des cellules sur le substrat, la différenciation cellulaire et la survie médiocre ont empêché la mise en place de ce protocole rapide comme un procédé de culture cellulaire robuste. En 1995, Edgar et ses collègues ont publié une procédurepour enquêter sur la division cellulaire et de la morphogenèse par l'isolement et la culture d'un seul C. elegans embryons 15. Les cellules embryonnaires obtenues par digestion des coquilles d'œufs avec une combinaison de traitement enzymatique et la dissociation d'emploi, ont continué à proliférer, produisant jusqu'à ~ 500 cellules 15. Par la suite, Leung et collègues cultivées un petit nombre de blastomères d'étudier la morphogenèse intestinale. Ils ont montré que in vitro une blastomère isolé E produite cellules intestinales polarisées qui ont créé une structure analogue à celle de la lumière intestinale par l'interaction avec l'autre à travers les jonctions adhérentes apical 16. Buechner et ses collègues ont également fait état d'une méthode similaire pour la culture C. elegans cellules embryonnaires in vitro 17.
Sur la base de ces premiers travaux, Christensen et ses collègues ont développé un protocole robuste pour la culture embryonnaire C. elegans cellules in vitro 1. Ilsa montré que C isolé. elegans cellules peuvent se différencier en différents types de cellules et de maintenir les caractéristiques qu'ils possèdent in vivo, y compris l'expression de marqueurs spécifiques des cellules. Plusieurs techniques qui sont difficiles in vivo, peuvent être appliqués sur isolé C. elegans cellules embryonnaires. Il s'agit notamment de 1,18 19 électrophysiologique, l'imagerie et les techniques immunochimiques 20,21, ainsi que l'isolement de types de cellules spécifiques par cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour la construction de banques d'ADNc spécifiques de cellules 22,23. techniques de knock-down de gènes tels que l'ARN interférence (ARNi) peuvent être appliqués sur cultivées C. elegans cellules 1 et une méthode de marquage métabolique roman utilisant azido-sucre comme un outil pour la découverte de la glycoprotéine a été récemment développé pour in vitro en culture C. elegans cellules 24.
En conclusion, le procédé de culture de cellules élargit la gamme of techniques qui peuvent être appliquées à l'C. modèle elegans dans un effort pour déchiffrer la fonction des gènes dans le contexte d'un organisme vivant. Nous décrivons ici le protocole pour la culture de C. elegans cellules embryonnaires in vitro, qui est en grande partie basée sur le premier protocole décrit par Christiansen et ses collègues 1.
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Protocol
Les astérisques (*) indiquent des étapes nouvelles ou modifiées par rapport à Christensen et al. Une
Une. Matériel d'installation
- Le mode opératoire de culture cellulaire nécessite de grandes quantités d'oeufs isolés des adultes gravides. Cultivez C. elegans sur 8P plaques de gélose ensemencée avec NA22 (disponible sur le C. elegans Consortium génétique - CGC) des bactéries à isoler de grandes quantités d'œufs. Dans ces plaques la quantité de peptone utilisée est 8 fois le montant qui est normalement utilisé pour les plaques NGM. La concentration de peptone supérieur soutient la croissance des bactéries NA22 plus efficace, qui, contrairement à OP50, grandir en couches épaisses.
8P plaques recette:
Dissoudre 3 g de NaCl, 20 g de Bacto-peptone, 25 g d'agar dans 1 litre d'eau distillée stérile et autoclave pendant 30 min. Laisser refroidir le milieu à 55 ° C puis ajouter stérile filtrés 1 ml de cholestérol (5 mg / ml dans de l'éthanol), 1 ml de 1 MgCl2, 1 ml de MgSO 4 et 25 ml de tampon KP (stock de 500 ml: 5 g de K 2 HPO 4, 30 g de KH 2 PO 4, pH 6,00). Verser le milieu de gélose de liquide dans des boîtes de Pétri de 10 cm (25 ml / plaque).
- Le jour suivant, réparties sur toute la surface de chaque plaque de gélose peptone enrichi avec 1 ml de NA22 E. coli cultivées pendant une nuit dans un milieu YT 2x (16 g de tryptone, 10 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl dans 1 litre d'eau stérile, pH 7,0) à 37 ° C. Ces bactéries constituent une source de nourriture abondante qui formera une couche épaisse de soutenir la croissance de grandes quantités d'adultes gravides. Laisser plaques ensemencées pendant une nuit à température ambiante pour permettre la croissance de la bactérie. Le procédé peut être accélérée par incubation à 37 ° C pendant 4-5 h.
- Transfert animaux affamés à ensemencées 8P plaques. Lavez les animaux dans une assiette NGM affamés utilisant 5-6 ml de tampon M9 ou de l'eau et ajouter 1-2 ml de cette suspension à chaque plaque 8P.
- Permettre la croissance et la multiplication des animaux untIL les plaques sont remplis au confluent des adultes gravides.
- Isoler les œufs nécessaires à la préparation de C. elegans, à partir de cellules embryonnaires adultes gravides à l'aide de 5-6 ml de solution de lyse.
solution de lyse recette
5 ml d'eau de Javel, frais de 1,25 ml de NaOH 10 N et 18,5 ml de H 2 O. stérile Ce mélange doit être préparée avant chaque utilisation.
- Lavez les oeufs isolés des adultes gravides en utilisant un tampon d'oeuf:
recette de tampon Egg
118 mM de NaCl, 48 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolarité de 340 mOsm.
- Retirer la coquille qui entoure les œufs par traitement avec chitinase. Chitinase est une enzyme avec une activité plus élevée à pH acide 25. Dissoudre chitinase (Sigma, catalogue no. C6137) dans le tampon pH 6,5 oeuf à une concentration finale de 2 mg / ml. Rangez la chitinase actionssolution à -20 ° C en aliquotes de 1 ml dans des tubes coniques de 15 ml stériles. Des aliquotes peuvent être stockées à -20 ° C jusqu'à quelques mois.
- Cultivez C. elegans cellules cultivées sur des lamelles couvre-autoclavées (diamètre 12 mm) recouverte d'arachide lectine. Dissoudre la lectine d'arachide dans de l'eau stérile (0,5 mg / ml). solution de lectine d'arachide ne doit pas être filtré ou autoclave. Il ne nécessite aussi être traités avec de la lumière UV. Magasin aliquotes de 2 ml à -20 ° C pour un maximum de 6 mois.
- Complete milieu de culture de cellules (500 ml) contient 500 ml de milieu L-15 de culture à partir de Gibco, à 50 ml de sérum bovin fœtal (inactivé par la chaleur), 7,7 g de saccharose (45 mOsm), 5 ml de 100 U / ml de pénicilline et de 100 pg / ml de streptomycine (2%). Le milieu complet est ensuite filtré en utilisant un filtre à pores de 0,20 um.
On notera que la mémoire tampon d'oeuf et le milieu de culture ont une osmolarité de 340 mOsm et 345 respectivement. En effet, contrairement aux cellules de mammifères, C. cellules elegans ont un niveau relativement élevé osmolaritéqui doit être pris en compte lors de la préparation des solutions qui vont venir en contact direct avec la membrane plasmique des cellules. Les recettes de ces réactifs ont été ajustés pour atteindre l'osmolarité souhaitée, qui a été mesurée à l'aide d'un osmomètre 1. Il n'est pas nécessaire d'utiliser un osmomètre si ces recettes sont suivies à la lettre et les soins sont utilisés dans la préparation de ces réactifs. Cependant, il faut utiliser un Osmoter si d'autres solutions doivent être préparés, dont les recettes ne sont pas signalés ici ou dans l'une des publications qui utilisent C. elegans cellules cultivées.
2. Isolation des oeufs
- Il est recommandé de commencer avec au moins quatre 8P plaques de recueillir suffisamment d'œufs pour 12 puits de cellules cultivées (dans des plaques à 24 puits).
- Avant de commencer la procédure décongeler un tube de solution arachide lectine du stock. Placer les lamelles autoclave au fond des puits dans une plaque à 24 puits et ajouter 200 ul de la lectine d'arachide pour les lamelles. Incuber pendant 1 heure ou uusqu'à les cellules sont prêtes à être plaqué. Supprimer complètement la lectine d'arachide et laver les puits une fois avec 1 ml d'eau stérile autoclave. L'élimination complète de la lectine d'arachide à partir des lamelles couvre-objet est essentielle pour éviter l'agglutination des cellules.
- Laver les adultes gravides hors les plaques d'agar avec de l'eau stérile à l'autoclave. Recueillir la suspension en deux tube conique stérile de 50 ml. Laisser les tubes sur de la glace pendant jusqu'à 5 minutes pour permettre la précipitation des vers à la partie inférieure des tubes (*). Retirer l'eau avec une pipette de transfert en plastique et la remplacer avec de l'eau stérile frais autoclave. Pellet vers par table centrifugation à 200 xg (~ 1200 rpm) pendant 10 min (*). Répétez cette dernière étape au moins 3.
- Transfert vers dans un tube de 15 ml conique stérile et un culot eux à 200 xg (~ 1200 rpm) pendant 10 min (*). Ne pas utiliser de plus grande vitesse de centrifugation pour éviter de recueillir des bactéries au fond du tube aussi bien. Parfois, après centrifugations les vers ne sont pas complètement culot. After chaque lavage et avant le retrait du surnageant, placer les tubes pendant 5 min sur la glace. Dans les vers de l'eau glacée pour précipiter le fond du tube.
- Retirer l'eau et ajouter 5-6 ml de solution de lyse (voir Matériel mis en place). Basculez la suspension doucement pendant 5-10 minutes et ensuite commencer à surveiller ver lyse au microscope stéréoscopique chaque 2-3 min. Une goutte de suspension peut aussi être placée sur une lamelle couvre-objet pour faciliter l'inspection. Le temps d'incubation varie en fonction de la fraîcheur de l'eau de Javel; acheter de petites bouteilles d'eau de Javel et d'ouvrir une nouvelle bouteille chaque mois.
- Lorsque ~ 70-80% de vers sont lysées (10 min à partir du début de l'incubation), arrêter la réaction de lyse en ajoutant 9 ml d'oeuf tampon pH 7,3 (voir Matériel mis en place). Centrifuger la suspension à 200 xg (~ 1200 rpm) pendant 10 min. De ce point sur un bec Bunsen sur, sur le banc pour éviter la recontamination des oeufs (*).
- Retirez délicatement le surnageant à l'aide d'un transfert en plastique pipette stérile et laver le culot 3-4x avec un tampon d'oeuf jusqu'à ce que la solution est claire. Assurez-vous de mélanger le bien de granulés dans la mémoire tampon de l'œuf au cours de chaque cycle de lavage.
- Les oeufs sont séparés des carcasses d'animaux en utilisant une solution de saccharose à 30%. Remettre en suspension le culot dans 2 ml de tampon d'oeuf stérile et ajouter une solution de saccharose à 2 ml de 60% (dans du tampon de magasin d'oeuf stérile). Bien mélanger et centrifuger pendant 20 min à 200 xg (~ 1200 rpm) (*).
- Retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse. Les œufs flottent à la surface de la solution. Aide d'une pipette P1000 et embouts stériles, transférer tous les oeufs dans un tube conique de 15 ml stériles frais.
- Ajouter 10 ml de tampon d'oeuf stérile au tube et centrifuger à 200 x g (~ 1200 tpm) pendant 10 min. Répétez le lavage 3 x. Assurez-vous que les oeufs sont complètement remis en suspension dans le tampon d'oeufs pendant chaque cycle de lavage.
3. La dissociation des cellules embryonnaires
Effectuer les étapes suivantes de la procédure en conditions stériles sous une hotte à flux laminaire. Alors que les animaux sontrobe de bactéries plaques, les lavages et le traitement avec la solution de lyse contenant l'eau de Javel devrait éliminer la plupart sinon toutes les bactéries. Ainsi, à l'aide d'une hotte laminaire à ce stade de la procédure empêche une nouvelle contamination de la suspension d'oeuf.
- Reprendre oeufs culot dans 1 ml de 2 mg / ml chitinase (stock tampon dans l'oeuf un pH de 6,5 (*)) et de les transférer à un nouveau tube de 15 ml conique stérile. Basculez le tube pour 10-30 min à température ambiante. Le temps d'incubation exacte varie en fonction de la fraîcheur de l'enzyme et de la température de la pièce et doit donc être déterminée pour chaque préparation. Il est recommandé de commencer à surveiller les œufs sous un microscope de culture cellulaire inversée après 10 min d'incubation. Remarque: dans notre expérience, un pH faible augmente l'activité enzymatique de la chitinase. Pour cette raison, on utilise un tampon d'oeuf à pH 6,5 pour dissoudre chitinase (recette indiquée ci-dessus, où le pH est ajusté à 6,5 avec du NaOH).
- Lorsque ~ 80% des coquilles d'oeufs sont digérés par l'traitement de la chitinase (Figures 1 AB), les oeufs culot par centrifugation à 900 x g (~ 2500 tpm) pendant 3 min (*). Aide d'une pipette P1000 et embouts stériles, retirer délicatement le surnageant et ajouter 3 ml de milieu L-15 (*).
- Transférer les oeufs dans une plaque de 6 cm de diamètre et de dissocier les cellules doucement à l'aide d'une seringue stérile de 10 ml équipée d'une aiguille 18 G. Surveiller le degré de dissociation en plaçant une goutte de suspension dans une boîte de Petri en matière plastique douce et par la visualisation au microscope. Ne pas aspirer de l'air dans la seringue au cours de cette procédure pour éviter d'endommager les cellules. Continuer jusqu'à ce que la dissociation ~ 80% des cellules sont dissociées.
- Filtrer la suspension en utilisant un 5 um filtre Millipore stérile. Les suspensions cellulaires doivent être filtrés afin d'éliminer les grumeaux de cellules, les œufs non digérés et larves écloses. Filtrer 4-5 ml supplémentaires de frais L-15 médias à travers le filtre pour récupérer toutes les cellules. Ne pas utiliser une force excessive lors de l'étape de filtration pour éviter damaging le filtre et / ou les cellules.
4. La culture de cellules
- Pellet les cellules dissociées par centrifugation à 900 x g (~ 2500 tpm) pendant 3 min (*). Aide d'une pipette P1000 et embouts stériles enlevez soigneusement tout le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans complet milieu L-15 et la plaque 1 ml / puits. La quantité de milieu ajoutée est fonction du nombre de plaques utilisées 8P, la confluence des vers sur les plaques, et le type d'expériences qui seront effectuées sur les cellules. La densité cellulaire peut être déterminée en utilisant un hématimètre. Pour les enregistrements de patch-clamp de placage de densité de ~ 230 000 cellules / cm 2 est optimal.
- Conservez la plaque de 24 puits dans un récipient en plastique contenant Tupperware serviettes en papier humide pour éviter l'évaporation de milieu de culture. Stocker le récipient dans un incubateur humidifié à 20 ° C et l'air ambiant.
- Les cellules sont généralement prêt pour les expériences dans les 24 h lorsque la différenciation morphologique et expression de marqueurs de la GFP sont terminées. Les cellules peuvent être maintenues en culture pendant 2 semaines, mais ils sont généralement plus sain jusqu'à 7-9 jours après placage. Le milieu doit être remplacé une fois par jour pour maintenir les cellules saines.
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Representative Results
C. elegans cellules cultivées se différencient et cellules expriment des marqueurs spécifiques
Christensen et ses collègues à l'aide de la coloration au bleu trypan démontré que> 99% des embryonnaire C. elegans cellules survivent à la procédure d'isolement. Au jour 9 et 22 après l'étalement, 85% et 65%, respectivement, sont encore vivantes 1. Isolé embryonnaire C. cellules elegans doivent adhérer à un substrat afin de différencier. Les cellules qui ne parviennent pas à respecter forme des touffes et il n'est pas clair si ils survivent. Différenciation des cellules commence 2-3 heures après étalement et se poursuit pendant ~ 24 heures. Dans les 24 heures, les cellules prennent morphologies spécifiques. Ainsi, les neurones envoient des procédés 1,18-20, les cellules musculaires allongées forment des structures en forme de doigts semblables à ceux observés in vivo des cellules 1 et le canal forment une lumière 17. Les caractéristiques morphologiques in vitro sont remarquablement semblables à celles in vivo. Par exemple, <em> in vitro des neurones tactiles ALM et PLM culture (identifiés par l'expression de Pmec-4 :: gfp) se développent seulement deux processus neuronaux avec un plus que l'autre, comme ils le font in vivo 1,20 (figure 2A). Ceci suggère que certaines au moins des mécanismes moléculaires qui conduisent différenciation de C. elegans cellules sont des cellules autonomes, et donc peuvent être récapitulés in vitro.
Dans les années 1990, Chalfie pionnier de l'utilisation de la protéine fluorescente verte (GFP) en C. elegans pour étiqueter des types de cellules dans lesquelles un gène d'intérêt est exprimé 26. Le travail effectué jusqu'ici sur cultivées C. elegans cellules embryonnaires qui soutient l'expression de la GFP dans des types cellulaires spécifiques peut être récapitulé 1,18-20,27 in vitro (Figure 2A). En outre, le rapport des cellules qui expriment la GFP in vitro est similaire au rapport trouvé in vivo. Par exemple, UNC-4 homéodomaine journalistegène est exprimé dans 13 neurones moteurs dans l'embryon mature (13 550 cellules-2.3%) 28,29. Fox et ses collègues, ont été comptabilisés :: cellules GFP unc-4 dans la culture et a constaté qu'ils sont de 2% du nombre total de cellules 23. De même, UNC-119, une protéine nécessaire à la protéine G trafic 30, est exprimé dans la plupart des C. elegans neurones et des cellules musculaires (76% des cellules dans la larve L1 31). Christensen et ses collègues ont rapporté que, dans la culture unc-119 :: GFP expression a été observée chez 74 à 76% des cellules ressemblant à des neurones et les cellules musculaires 1. Enfin, MEC-4, une sous-unité de canal 2 + Na + / Ca mécanosensible nécessaire pour toucher doux 32 est exprimé dans les neurones 6 tactiles chez l'adulte C. elegans. Parmi ces six neurones tactiles, quatre (ALMS et MLP) sont embryonnaire dérivés. Ainsi de 4 550 (0,7%) des cellules embryonnaires doivent exprimer la GFP sous le contrôle du promoteur mec-4. En effet, les neurones culture qui expriment Pmec-4 :: GFP constitue environ 0,5% du nombre total de cellules 18,20.
Les marqueurs protéiques et les modifications post-traductionnelles qui sont des cellules spécifiques peuvent également être observés in vitro. Par exemple, l'alpha tubuline acétylée uniquement dans les neurones tactiles en C. elegans 33. In vitro, les procédés de neurones tactiles se colorent avec un anticorps dirigé contre acétylé-alpha-tubuline 20 (figure 2B). Neurones tactiles culture expriment également toxique mutant canal MEC-4 (d), ce qui provoque la mort des neurones tactiles in vivo 34. En effet, les neurones exprimant la GFP préparés à partir d'un mec-4 (d); PMEC-4 :: souche GFP sont initialement présents dans la culture, mais alors dégénère 20. Fait important, les neurones toucher préparés à partir de mec-4 (d); PMEC-4 :: GFP se comportent in vitro de manière similaire à la manière dont ils se comportent in vivo. Par exemple, ils peuvent être sauvées de la mort par traitement avec unmiloride et dantrolène, qui n'épargne mec-4 (d) les neurones tactiles de la dégénérescence in vivo 20,35. Pour conclure, non seulement C. elegans cellules embryonnaires ressemblent morphologiquement des cellules in vivo, mais elles expriment également des marqueurs spécifiques des cellules et sont présents dans la même proportion, ils sont présents in vivo. Prises ensemble, ces données confirment que cultivé C. cellules elegans constituent un bon système global pour étudier les processus biologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire.
Patch-clamp analyse électrophysiologique de culture C. elegans cellules
La technique de patch-clamp, qui a été introduit par Sakmann et Neher dans les années soixante-dix pour l'étude de l'activité des canaux ioniques de cellules dans l'isolement ou dans les tissus peut être appliqué à de culture C. elegans cellules 36. Christensen et ses collègues ont été les premiers à étudier les canaux ioniques dans cultivée C. cellules elegans utilisantpatch-clamp 1. Depuis lors, K +, anioniques, et des canaux cationiques non sélectifs (figures 2 CE), ainsi que des transporteurs de la dopamine-dépendants canaux ont été décrits dans cultivée C. elegans 1,18,19,37. Ces études avancées de notre compréhension du rôle des conductances ioniques dans la fonction de C. elegans neurones. Il ya quelques modifications qui doivent être pris en considération lors de l'utilisation de la technique de patch-clamp pour enregistrer l'activité de canal ionique de culture C. elegans cellules. Ces modifications sont surtout pertinentes pour les enregistrements de cellules entières. Tout d'abord, C. elegans cellules sont de petite taille, par exemple, les neurones ont un diamètre de 1-2 um. Ainsi, des pipettes en verre doivent avoir une petite pointe (0,5 um). Conseils de petites pipettes augmentent la résistance d'entrée, qui entraîne des erreurs de stimulation et d'enregistrement. Pour pallier ce problème, pipettes peuvent être construit pour avoir un petit bout, mais un large cône. Goodman et Lockery développé une méthode employing un polisseur d'incendie équipé d'une pompe à air haute pression pour les pipettes de moulage à cette forme 38. Deuxièmement, en raison de la petite taille des cellules, l'accès à cellules entières en utilisant une aspiration se traduit généralement par des dégâts à la cellule. Réussite beaucoup plus élevé est généralement obtenue en appliquant une impulsion de haute tension (zapping électrique) pour le patch de membrane sous la pointe de la pipette. Les autres configurations de la technique de patch-clamp (cellule attachée, à l'envers et à l'extérieur de départ) sont faciles à appliquer à C. elegans cellules en culture, avec la seule modification que la pointe de la pipette doit être petite pour tenir compte de la petite taille de C. elegans cellules. La technique du patch perforé est notoirement plus laborieuse et prend du temps que d'autres techniques de patch-clamp. Cependant, elle a été appliquée avec succès sur C. elegans cellules in situ 39, 40 et donc devraient être applicables dans la culture.
Imagerie calciquetechniques appliquées à C. cellules cultivées elegans
Le rôle fonctionnel de voltage-dépendants Ca 2 + canaux (CCAGV) dans les neurones et les cellules gliales a été étudié dans des cultures de C. elegans cellules par imagerie calcique 20, 21, 41. L'application de l'imagerie de calcium dans la culture a permis l'utilisation de solutions contenant des concentrations élevées de KCl pour induire une dépolarisation cellulaire et de blocage des canaux calciques de discerner la contribution de différents types de canaux à l'influx de calcium. Par exemple, la contribution de la Na + / Ca 2 + perméable MEC-4 (d) le canal de la concentration intracellulaire de calcium a été déterminée en utilisant l'imagerie de calcium caméléon YC2.12 en présence et en absence de la DEG / ENaC bloqueur de canaux amiloride. Ces expériences ont démontré que l'afflux de calcium sensibles à l'amiloride est présent dans les neurones exprimant tactiles MEC-4 (d), mais non dans les neurones tactiles de type sauvage. Utilisation de l'ionophore pour perméabiliser la membrane d'toucher les neurones et à calibrer cameleon (figures 3A et B), Bianchi et ses collègues ont également déterminé que la concentration moyenne de calcium libre en contact neurone est de 200 nM 20 (figures 3C et D). De même, Frøkjær-Jensen et ses collègues ont étudié le rôle de VGCCs EGL-19 et UNC-36 dans la régulation de l'influx de calcium induit par la dépolarisation en C. elegans cultivé neurones mécano exprimant cameleon 21. Ils ont constaté que la dépolarisation des neurones tactiles induites par K + extracellulaire dans une plage comprise entre 20 mM et 100 mM, a donné lieu à montée de calcium intracellulaire révélée par YFP / CFP changement de rapport entre 17% et 70%. En outre, les transitoires de calcium ont été réduits par EGL-19 et unc-36 mutations perte de fonction et n'ont pas été détectées en l'absence de Ca 2 + extracellulaire suggérant que VGCCs jouent un rôle clé dans l'excitabilité de C. elegans toucher les neurones 21.
Stout et Parpura examiné le rôle de voltage-dépendants canaux Ca 2 + EGL de 19, l'ACC-1 et UNC-2 dans les cellules gliales CEPsh gaine du sensilles céphaliques à contribuer à l'afflux de calcium 41. Dynamique de calcium intracellulaire ont été analysés dans CEPsh cellules gliales en culture provenant d'animaux transgéniques co-exprimant le rouge mCherry de marqueur fluorescent et le vert fluorescent Ca 2 + cytosolique indicateur GcaMP2.0. Dans la majorité des cellules gliales CEPsh, la dépolarisation membranaire induite par des concentrations extracellulaires élevées de l'augmentation induite par KCl de concentration intracellulaire de Ca 2 + tel que rapporté par augmentation de la fluorescence de GcaMP2.0. En outre, le traitement par canaux calciques bloquants Cd 2 + et Néma (némadipine-A) a réduit de façon significative les transitoires calciques. Ces données confirment que la hausse de tension dépendant du calcium intracellulaire dans les cellules gliales CEPsh dépend au moins en partie sur les canaux calciques voltage-dépendants. Les auteurs, en outre analysé les changements de calcium intracellulaire dans de type L egl-19RF (réduction de la fonction), de type T cca-1 et N, P / Q, R-type canal unc-2 animaux knock-out et a conclu que les trois types de canaux Ca 2 + contribuent de manière significative à la dynamique du calcium intracellulaire dans ces cellules gliales . Ainsi, depuis macroglie mammifères immatures répondent à dépolarisation par des changements VGCC-dépendants de Ca 2 + des concentrations intracellulaires, les auteurs concluent que C. cellules gliales elegans CEPsh peuvent ressembler fonctionnellement macroglie mammifères, les astrocytes, les oligodendrocytes et les cellules précurseurs d'oligodendrocytes.
D'autres techniques applicables à la culture de C. elegans cellules embryonnaires
cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été appliquée avec succès à C. elegans cellules cultivées à enrichir les cultures avec des types cellulaires spécifiques et / ou d'isoler des cellules pour l'analyse des microréseaux 23,4243. La principale modification qui devait être mis en placele procédé de culture cellulaire était du type de substrat utilisé. Collègues étranges et tester différents substrats, y compris le collagène IV, la poly-L-lysine, la fibronectine et la laminine et ont établi que la poly-L-lysine est le meilleur substrat 37. Poly-L-lysine favorise la différenciation des cellules aussi bien que la lectine d'arachide, mais contrairement à la lectine d'arachide permet le détachement des cellules à partir du substrat 36 sans dommage. Plusieurs types différents de C. cellules elegans ont été triées par FACS, y compris thermosensory, olfactif, le moteur et les neurones mécano, et les cellules gliales 23,42 - 45. marquage des cellules a été réalisée par expression de la GFP et reporters globale, l'efficacité de tri est élevée avec l'isolement d'au plus 90% de cellules GFP-étiqueté 23.
Gene silencing par interférence ARN (ARNi) peut être obtenue dans la culture. Christensen et ses collègues ont montré que l'incubation de la GFP exprimant cultureC. elegans neurones avec ARNdb contre GFP conduit à un niveau réduit de manière significative l'expression de GFP avec un effet maximum 4 jours après l'addition de l'ARN double brin à la culture 1. De même, Shih et ses collègues ont utilisé l'ARNi dans la culture de démontrer que le C. elegans SID-1 est nécessaire pour la médiation de l'effet de l'ARN double brin et il est probable nécessaire in vivo pour la médiation diffusion systémique de l'ARNi 46. En conclusion, l'ARNi qui est l'une des méthodes les plus utilisées et efficaces pour l'inactivation de gène dans C. elegans peuvent être appliquées à la culture. Cette méthode pourrait être utilisée pour les gènes silencieux dont KO est létale ou interfère avec C. elegans développement normal.
Figure 1. C. elegans embryons avant et après traitement de la chitinase. (A) Photographie d'œufs avant l'exposition au chitinase. Les pointes de flèches à la coquille transparente et intactes entourant un embryon. (B) Les œufs traités avec chitinase pendant 10 min. Les coquilles d'œufs ont été digéré et ne sont plus visibles autour des embryons. Les flèches indiquent les embryons triples libérés de la coquille. La boîte bleue entoure un groupe de cellules qui sont encore attachés les uns aux autres.
Figure 2. Cultivées C. elegans toucher les neurones. (A) micrographie fluorescent de culture C. elegans toucher les neurones exprimant la GFP sous le contact promoteur spécifique mec-4 (P mec-4 :: GFP), la barre d'échelle 5 um. (B) au microscope fluorescent d'un neurone tactile exprimant P mec-4 :: GFP (panneau supérieur), qui a été coloré avec un anticorps monoclonal contre la tubuline acétylée alpha (Sigma), un posttranslational modification de l'alpha tubuline qui se produit dans les neurones tactiles seulement 33. Adapté de 20. (CE) Exemple de canaux mécanosensibles enregistrées dans les neurones de type sauvage tactiles cultivées dans la configuration cellule attachée de la technique de patch-clamp. Le canal a une conductance de ~ 100 pS et il est présent dans des neurones isolés à partir tactiles mec-4 animaux knock-out (mec-4 (u253)) ainsi. Ces données suggèrent que cette voie n'est pas la voie MEC 20. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Estimation de la concentration de calcium intracellulaire libre dans les neurones en culture à l'aide de cameleon tactiles. (A) pseudo-images de neurones tactiles culture exprimant cameleon YC2.12 à 0 mM de Ca 2 + (+ EGTA, à gauche) et en mM Ca 2 + 10 (à droite). L'échelle de pseudo est affiché sur la droite. (B) cameleon Représentant changements fluorescents associés aux changements dans la concentration de calcium intracellulaire dans un neurone perméabilisée contact. Avant l'enregistrement, les cellules ont été incubées pendant 30 min dans une solution contenant le ionophore calcique A23187-Br (10 pM) et une concentration définie de calcium libre (250 nM dans ce cas). La roténone (10 mM) et du 2-désoxy-D-glucose (1,8 mm) ont également été ajoutés à la solution pour bloquer les pompes actives. Le neurone a ensuite été perfusé avec une solution contenant 0 mM (5 mM d'EGTA) Ca 2 + et 10 mM de Ca 2 + pour déterminer le minimum et le rapport des changements de fluorescence maximale (C). Cameleon courbe d'étalonnage montrant les résultats obtenus 4-7 cellules dont les variations de fluorescence ont été évalués dans 11 solutions de calcium libre différentes. Chaque changement de rapport a été étalonnée par rapport à la variation de rapport maximal de la cellule individuelle. (D) (B). Le rapport en caméléon reposant dans des neurones en culture de contact était de 22% ± 7 (n = 2, 18) de cellules maximal de changement de rapport. Sur la base de la courbe d'étalonnage représentée en (C), ce rapport correspond à une concentration de calcium libre de ~ 200 nM. Adapté de 20. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
C. elegans est un organisme modèle puissant pour déchiffrer les voies génétiques impliqués dans le développement, le comportement et le vieillissement. Sa commodité provient principalement de la facilité avec laquelle il peut être manipulé génétiquement et de son cycle de vie court. Malgré sa commodité, C. elegans a ses limites. C. cellules elegans sont minuscules et confinée à l'intérieur d'une cuticule sous pression qui limite l'application des procédés qui nécessitent un accès direct à des cellules, telles que des techniques électrophysiologiques et pharmacologiques, ou l'isolement de types de cellules spécifiques, telles que le profil d'expression du gène par analyse par microréseau. Le C. elegans méthode de culture cellulaire a été une solution à la plupart des limitations de cet organisme modèle.
Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode de mise à jour pour l'isolement et la culture embryonnaire C. elegans cellules à grande échelle basées sur le travail tôt par Christensen et ses collègues 1. Nous also rendre compte des résultats représentatifs publiés obtenus en utilisant une variété de techniques, y compris immunocytochimie, électrophysiologie et d'imagerie calcique qui ont fait progresser notre compréhension des processus physiologiques et génétiques exigences fonction de cellule sous-jacente dans C. elegans. Le travail effectué jusqu'ici sur cultivées C. elegans cellules soutient qu'ils se différencient in vitro comme ils le font en récapitulant vivo l'expression de marqueurs spécifiques des cellules 1,18-20,22,23,27,44. Bien que tous les types de cellules non ont été caractérisés dans la culture, ce corps de travail suggère que la méthode de culture cellulaire permet l'étude de C. cellules elegans dans l'isolement, sans compromettre leur identité.
Le protocole est simple et facilement applicable dans n'importe quel laboratoire. Les choses qui doivent être gardés à l'esprit pour la culture de succès C. cellules embryonnaires elegans sont les suivantes: 1) Les animaux doivent être synchronisés de sorte que la majorité d'entre eux will être gravides adultes au moment de la procédure de culture cellulaire. Démarrage de la culture du ver à partir d'une plaque de faim est une bonne option. 2) Les bactéries utilisées pour cultiver C. elegans doivent être éliminées avant la lyse vis sans fin pour éviter la contamination de la culture cellulaire. Il est recommandé que de grands volumes d'eau stérile sont utilisés pour les lavages, et que les animaux sont centrifugés à l'suggérée (pas supérieur à) la vitesse pour éviter la précipitation des bactéries aussi bien. En effet, alors que le traitement avec le tampon de lyse contenant un agent de blanchiment doit éliminer les bactéries, à partir d'une suspension de l'animal relativement exempte de bactéries est recommandée. 3) Les animaux doivent être traités avec l'eau de Javel / NaOH jusqu'à ~ 80% d'entre eux ont publié leurs œufs. Court et à long temps d'incubation de réduire l'efficacité de la récupération de l'oeuf et endommagent les œufs respectivement. 4) Coquille digestion par chitinase doit être étroitement surveillée. Dissociation manuel devrait être commencé quand environ 80% des coquilles d'œufs ont été digérés. Plus courte et incubatfois d'ions à la fois en raison des dommages aux cellules, en raison de dommages directs de la membrane plasmique par l'enzyme et les dommages causés par la dissociation manuel prolongé et sévère dans la tentative d'isoler les cellules, respectivement. 5) la filtration des cellules à travers le filtre de 5 um ne devrait pas être forcé. Si le filtre est bouché, il doit être remplacé par une nouvelle pour éviter des dommages aux cellules.
Malgré le fait que les cellules embryonnaires cultivées ont révolutionné le domaine à bien des égards, ils ne sont pas la réponse à toutes les questions scientifiques et encore des limites. Par exemple, les gènes exprimés dans une culture embryonnaire sont pour la plupart puisque les cellules sont isolées à partir d'embryons. Compartiments sous-cellulaires peuvent pas se développer correctement dans la culture. Par exemple, le développement et l'entretien des cils de certains neurones sensoriels tels que amphid AWA AWC et dépendent de l'interaction avec les cellules gliales amphid, qui est perdue dans la culture 44. Les cellules perdent leurs voisins naturels et ne font pas physiologiquement relnentes de cellule à cellule contacts. Par exemple, on ne sait pas si les cellules forment des jonctions serrées, électriques ou synapses chimiques et s'ils le font, ce ne sont pas susceptibles d'être avec leurs partenaires physiologiques. En outre, les cellules sont étalées sur un substrat unique, la lectine d'arachide. La matrice extracellulaire in vivo est susceptible d'être un mélange complexe et difficile à reproduire de nombreuses molécules dont la lectine d'arachide, de la laminine, le collagène, la fibronectine et. En outre, spécialisée matrice extracellulaire peut-être nécessaire pour certains types de fonctions cellulaires. Par exemple, le canal mécanosensible exprimé dans les neurones de contact du corps et formée par MEC-4 et MEC-10 sous-unités ne peut pas être déclenché en culture 18, mais peut être facilement fermée 47 in vivo. Cela provient probablement du fait que le collagène extracellulaire MEC-5 normalement produite par les cellules voisines de couture in vivo, est absente dans la culture 48. MEC-5, conjointement avec des protéines de la matrice extracellulaire MEC-1 (aa une longue 1999protéine avec un domaine de type Kunitz et deux domaines EGF) et MEC-9 (un 834 aa longue protéine qui contient plusieurs domaines de type Kunitz, répétitions EGF et un domaine riche en acide glutamique) sont nécessaires pour la sensation tactile et on pense à lier les domaines extracellulaires de la chaîne complexe de MEC et d'exercer une tension gating sur le complexe au cours de la stimulation mécanique.
Pour conclure, C. elegans cellules embryonnaires peuvent être cultivées in vitro et ils apparaissent à différencier récapitulant l'expression de gènes spécifiques des cellules. Le protocole pour l'isolement et la culture des cellules est simple et peut être appliqué dans n'importe quel laboratoire avec un minimum d'expérience dans les techniques de culture de cellules. Ayant à l'esprit les limites de cette technique, la méthode de culture cellulaire peut être et s'est avéré être une technique puissante lorsque les cellules accès direct et / ou l'isolement de types cellulaires spécifiques sont nécessaires. Un protocole pour l'isolement de cellules à partir de larves a été également récemment mis au point (not décrit ici) 49. L'intérêt général pour le développement de méthodes complémentaires apporte C. elegans un système encore plus puissant pour comprendre finalement le lien entre la fonction des gènes et le comportement, le développement ou le vieillissement.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator | |||
References
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