Summary
Wir beschreiben hier eine überarbeitete Protokoll für die groß angelegte Kultur von embryonalen C. elegans-Zellen. Embryonale C. elegans in vitro kultivierte Zellen unter Verwendung dieses Verfahrens scheinen in einer zellspezifischen Weise zu differenzieren und zu rekapitulieren, die Expression von Genen. Techniken, die direkten Zugriff auf die Zellen oder Isolierung von spezifischen Zelltypen aus den anderen Geweben erfordern kann auf C angewendet werden elegans kultivierten Zellen.
Abstract
C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellsystem, in der genetischen und molekularen Techniken sind leicht anwendbar. Bis vor kurzem aber Techniken, die direkten Zugang zu den Zellen und Isolierung von spezifischen Zelltypen benötigen, konnten nicht in C angewendet werden elegans. Diese Beschränkung resultiert aus der Tatsache, dass Gewebe in einem unter Druck Kutikula, die nicht leicht durch die Behandlung mit Enzymen und / oder Detergenzien aufgeschlossen wird beschränkt. Basierend auf frühen Pionierarbeit von Laird Bloom, Christensen und Kollegen entwickelten ein ein robustes Verfahren für die Kultivierung von C. elegans embryonalen Zellen in großem Maßstab. Die Eier werden von schwangeren Erwachsenen durch Behandlung mit Bleichmittel / NaOH isoliert und anschließend mit Chitinase behandelt, um die Eierschalen zu entfernen. Embryonale Zellen werden dann durch manuelles Pipettieren dissoziiert und auf das Substrat beschichtete Glas im Serum angereicherten Medien ausplattiert. Innerhalb von 24 Stunden von Isolationszellen beginnen, indem Morphologie und durch zellspezifische marke ausdrücken unterscheidenrs. C elegans Zellen mit dieser Methode kultiviert überleben bis 2 Wochen in vitro und haben für elektrophysiologische, immun verwendet, und Bildanalysen sowie wurden sie sortiert und für die Microarray-Profiling eingesetzt.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist ein leistungsfähiges Modellorganismus für die Untersuchung der molekularen Grundlagen der zellulären Funktion, Differenzierung und Verhalten. Während sein Genom, Stoffwechsel-und Biosynthesewege ähnlich Wirbeltiere "sind, sind die genetischen und molekularen Lenkbarkeit weit größer 2. Einer der Vorteile sind seine Größe und einfache Anatomie, seiner schnellen Lebenszyklus (3 Tage bei 25 ° C), kurze Lebensdauer (2 Wochen) und große Anzahl von Nachkommen (> 200). Aufgrund seiner Zwitter Natur und kurzen Lebenszyklus, sind molekulare und genetische Manipulationen einfach in C. elegans, einschließlich der Erzeugung von transgenen Tieren 3,4 und die Anwendung der Gen-Knock-down-Verfahren, wie RNA-Interferenz-5. C elegans Körper und Eierschale sind transparent. Daher Zellen leicht sowohl in der Erwachsenen-und der Embryo mit Standard-Mikroskopie sichtbar gemacht werden. In den letzten 40 Jahren hat sich die C. elegans C erstellt elegans Forschung, darunter eine große Sammlung von Mutanten, Knockouts und Transgenen, eine detaillierte Beschreibung der Anatomie und Entwicklung 6,7, einschließlich der vollständigen Rekonstruktion des Nervensystems 8, und ein Genom vollständig sequenziert, die gut kommentierten und verfügbar für die ganze Gemeinde ( www.wormbase.com ).
Trotz der zahlreichen Vorteile, haben einige experimentelle Ansätze in C. Herausforderung worden elegans. Dazu gehören diejenigen, die Zugang zu der Plasmamembran der Zellen und Isolierung von Geweben oder Zelltypen erforderlich. Tatsächlich C. elegans Gewebe in seinem hydrostatischen Druck Skelett, das nicht leicht durch enzymatische Behandlung oder Detergenzien aufgeschlossen wird beschränkt. Am Ende der 1990er Jahre Miriam Goodman und Janet Richmond Pionier Methoden zur elektrophysiologischen Ableitungen von C. elegansNeuronen und Muskelzellen in situ 9,10. Während diese Verfahren gab uns wichtige Einblicke in die neuronalen und Muskelfunktion in vivo, sie sind anspruchsvoll und geringem Durchsatz. Alternative Methoden, um die Zellfunktion in vivo zu untersuchen entwickelt worden, meist vor allem in vivo Calcium Imaging mit genetisch kodierte Kalzium-Sensoren wie GCamP und came 11-13. Diese Methoden aber nicht die Verwendung von pharmakologischen Tools ermöglichen, weil sie auf intakten lebenden Tieren angewendet.
Der erste Versuch Kultivierung C. elegans-Zellen in vitro in großem Maßstab wurde von Laird Bloom während der Vorbereitung seiner Doktorarbeit 14 gemacht. Leider mit schlechter Adhäsion der Zellen an das Substrat auf Schwierigkeiten gestoßen, schlechte Zelldifferenzierung und das Überleben verhindert die Einrichtung dieser frühen Protokoll als robuste Zellkulturverfahren. Im Jahr 1995 Edgar und Kollegen veröffentlichten eine ProzedurZellteilung und Morphogenese durch Isolierung und Kultur von einer einzigen C zu untersuchen. elegans Embryonen 15. Embryonale Zellen durch Verdau der Eierschalen mit einer Kombination aus enzymatischer Behandlung und manuelle Dissoziation erhalten, weiter zu vermehren, produzieren bis zu ~ 500 Zellen 15. Anschließend Leung und Mitarbeiter kultiviert eine kleine Anzahl von Blastomeren Darm Morphogenese studieren. Sie zeigten, dass eine in vitro isolierten E Blastomere hergestellt polarisierten Darmzellen, die eine analoge Struktur des Darmlumens durch Wechselwirkung miteinander durch apikalen Adhärenzverbindungen 16 angelegt. Büchner und Kollegen auch ein ähnliches Verfahren für die Kultivierung C. elegans embryonalen Zellen in vitro 17.
Basierend auf dieser frühen Arbeit Tensen und Kollegen entwickelt einen robusten Protokoll zur Kultivierung von embryonalen C. elegans-Zellen in vitro 1. Siezeigten, dass isolierte C. elegans-Zellen können in verschiedene Zelltypen zu differenzieren und Aufrechterhaltung der Funktionen, die sie in vivo besitzen, einschließlich der Expression von zellspezifische Marker. Verschiedene Techniken, die in vivo eine Herausforderung sind, können auf isolierte C angewendet werden elegans embryonalen Zellen. Diese umfassen elektro 1,18 19, Bildgebung und immunchemische Techniken 20,21, sowie die Isolierung von spezifischen Zelltypen durch Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) für den Aufbau von Zell-spezifische cDNA-Bibliotheken 22,23. Gen-Knockdown-Techniken wie RNA-Interferenz (RNAi) auf kultivierte C angewendet werden elegans-Zellen 1 und ein neuartiges Verfahren unter Verwendung von metabolischer Markierung Azido-Zucker als Werkzeug für Glykoprotein Entdeckung wurde kürzlich für die in vitro kultiviert C entwickelt elegans Zellen 24.
Im Ergebnis dehnt sich das Zellkulturverfahren der Anordnung of Techniken, die dem C angewendet werden können elegans-Modell in dem Bemühen, Gen-Funktion in Zusammenhang mit einem lebenden Organismus zu entschlüsseln. Wir beschreiben hier das Protokoll für die Kultivierung von C. elegans embryonalen Zellen in vitro, die weitgehend auf dem Protokoll zuerst von Christiansen und Kollegen 1 beschrieben basiert.
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Protocol
Sternchen (*) zeigen an neuen oder modifizierten Schritten im Vergleich zu Christensen et al. 1
1. Material Einstellungs
- Das Zellkulturverfahren erfordert große Mengen an Eiern von schwangeren Erwachsenen isoliert. Wachsen C. elegans auf Agar-Platten ausgesät 8P mit NA22 (durch C. elegans Genetic Consortium - CGC) Bakterien, um große Mengen von Eiern zu isolieren. In diesen Platten die Menge Pepton verwendet wird, ist 8-mal der Betrag, der normalerweise für die NGM-Platten verwendet. Je höher Peptonkonzentration trägt das Wachstum von Bakterien NA22 effizienter, was gegen OP50-, wachsen in dicken Schichten.
8P Platten Rezept:
Man löst 3 g NaCl, 20 g Bacto-Pepton, 25 g Agar in 1 l sterilem destilliertem Wasser und Autoklaven für 30 min. Lassen Sie das Medium kühl bei 55 ° C und fügen Sie dann steril filtriert 1 ml Cholesterin (5 mg / ml in EtOH), 1 ml 1 MgCl 21 ml MgSO 4 und 25 ml KP-Puffer (Lager von 500 ml: 5 g K 2 HPO 4, 30 g KH 2 PO 4, pH-Wert 6,00). Gießen flüssigen Agar-Medium in 10 cm Petrischalen (25 ml / Platte).
- Der nächste Tag verteilt die ganze Oberfläche jeder bereichert Pepton-Agar-Platte mit 1 ml NA22 E. coli über Nacht in 2XYT-Medien (16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl in 1 l sterilem Wasser, pH 7,0) bei 37 ° C. Diese Bakterien bilden eine reiche Nahrungsquelle, die eine dicke Schicht, die das Wachstum von großen Mengen von schwangeren Erwachsenen bilden. Lassen beimpften Platten über Nacht bei Raumtemperatur, um das Wachstum der Bakterien zu ermöglichen. Das Verfahren kann durch Inkubation bei 37 ° C für 4-5 h beschleunigt werden.
- Übertragen Sie verhungerten Tiere geimpft 8P Platten. Waschen Sie weg von einer ausgehungerten Tiere NGM Platte mit 5-6 ml M9-Puffer oder Wasser und fügen Sie 1-2 ml dieser Suspension auf jeden 8P Platte.
- Ermöglichen Wachstum und die Vermehrung der Tiere until die Platten bei Zusammenfluss von schwangeren Erwachsenen bevölkert.
- Isolierung der für die Herstellung von C benötigt Eier elegans embryonalen Zellen, von der schwangeren Erwachsenen mit 5-6 ml Lyse-Lösung.
Die Lyse-Lösung Rezept
5 ml frischem Bleichmittel, 1,25 ml 10 N NaOH und 18,5 ml sterilem H 2 O. Diese Mischung muss frisch zubereitet vor jedem Einsatz werden.
- Waschen Sie die Eier von schwangeren Erwachsenen mit Ei Puffer isoliert:
Egg Puffer Rezept
118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 25 mM Hepes, pH 7,3 Osmolarität 340 mOsm.
- Entfernen Sie die Eierschale, die die Eier umgibt, durch Behandlung mit Chitinase. Chitinase ist ein Enzym mit der höchsten Aktivität bei sauren pH-25. Auflösen Chitinase (Sigma, Katalog-Nr. C6137) in Ei-Puffer pH 6,5 auf eine Endkonzentration von 2 mg / ml. Bewahren Sie die Chitinase LagerLösung bei -20 ° C in 1 ml Aliquots in sterilen 15 ml konischen Röhrchen. Aliquots bei -20 ° C bis zu einigen Monaten gelagert werden.
- Wachsen C. elegans kultivierten Zellen auf Deckgläser autoklaviert (12 mm Durchmesser) mit Erdnuss-Lektin bedeckt. Auflösen Erdnuß-Lectin in sterilem Wasser (0,5 mg / ml). Peanut Lektin-Lösung sollte nicht gefiltert oder autoklaviert werden. Es ist auch nicht brauchen, um mit UV-Licht behandelt werden. Speicher 2 ml Aliquots bei -20 ° C für bis zu 6 Monate.
- Kompletten Zellkulturmedium (500 ml) enthält 500 ml L-15-Kulturmediums von Gibco, 50 ml fötales Rinderserum (hitzeinaktiviert), 7,7 g Saccharose (45 mOsm), 5 ml 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (2%). Das komplette Medium wird dann unter Verwendung eines 0,20 &mgr; m Porenfilter filtriert.
Beachten Sie, dass das Ei-Puffer und das Kulturmedium haben Osmolarität von 340 bis 345 mOsm auf. Denn im Gegensatz zu Säugerzellen, C. elegans-Zellen weisen eine relativ hohe Osmolaritätdass muss in Zahl bei der Herstellung von Lösungen, die in direktem Kontakt mit der Plasmamembran der Zellen kommen genommen wird. Die Rezepte dieser Reagenzien wurden angepasst, um die gewünschte Osmolarität, die mit einem Osmometer 1 gemessen wurde, zu erreichen. Es ist nicht notwendig, einen Osmometer verwenden, wenn diese Rezepte genau befolgt und Sorgfalt bei der Herstellung dieser Reagenzien verwendet. Allerdings sollte man eine Osmoter verwenden, wenn andere Lösungen müssen darauf vorbereitet sein, deren Rezepte werden hier nicht gemeldet oder in einer der Publikationen, die C verwenden elegans kultivierten Zellen.
2. Egg Isolation
- Es wird empfohlen, mit mindestens vier 8P Platten beginnen, um genug Eier für 12 Vertiefungen von kultivierten Zellen zu sammeln (in 24-Well-Platten).
- Bevor Sie mit dem Verfahren aufzutauen eine Tube Lektin Erdnuss-Stammlösung. Platzieren autoklaviert Deck am Boden der Vertiefungen in einer Platte mit 24 Vertiefungen und mit 200 ul Erdnuß-Lectin auf die Deckgläser. Inkubation für 1 h oder until die Zellen bereit sind, beschichtet werden. Komplett entfernen die Erdnuss Lektin und waschen Sie die Vertiefungen einmal mit 1 ml sterilem Wasser autoklaviert. Vollständige Entfernung des Erdnuß-Lectin aus den Deck ist wichtig zur Vermeidung Zellverklumpung.
- Von den Agar-Platten mit sterilen autoklaviertem Wasser waschen schwangeren Erwachsenen. Sammeln Sie die Suspension in zwei sterile 50 ml konischen Röhrchen. Lassen Sie die Röhrchen auf Eis für 5 min zur Ausfällung der Schnecken am Boden der Rohre (*) zu ermöglichen. Entfernen Sie das Wasser mit einem Transfer Plastikpipette und ersetzen Sie es mit frischen steril autoklaviert Wasser. Pellet Würmer durch Tisch-Zentrifugation bei 200 xg (~ 1.200 rpm) für 10 min (*). Wiederholen letzten Schritt mindestens 3 ist.
- Übertragen Würmer in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen und pelle sie bei 200 × g (~ 1200 rpm) für 10 min (*). Höhere Zentrifugationsgeschwindigkeit nicht verwenden, um zu vermeiden das Sammeln der Bakterien an der Unterseite des Rohres als auch. Manchmal nach Zentrifugierungen die Würmer nicht vollständig pelletiert. After jeweils waschen und vor dem Entfernen der Überstand, legen Sie die Röhrchen für 5 min auf Eis. In gekühltem Wasser Würmer auszufällen zum Boden des Röhrchens.
- Entfernen Sie das Wasser und geben Sie 5-6 ml Lyse-Lösung (siehe Material einrichten). Rock the Federung sanft für 5-10 min und dann beginnen die Überwachung Wurm Lyse unter dem Stereomikroskop alle 2-3 min. Ein Tropfen der Suspension kann auch auf ein Deckglas für eine einfachere Überprüfung platziert werden. Die Inkubationszeit variiert abhängig von der Frische der Bleichmittel, kaufen kleine Flaschen Bleichmittel, und öffnen Sie eine neue Flasche jeden Monat.
- Wenn ~ 70-80% der Würmer werden lysiert (10 min von Beginn der Inkubation), stoppen Sie die Lyse-Reaktion durch Zugabe von 9 ml Ei-Puffer pH 7.3 (siehe Material einrichten). Zentrifugieren Sie die Suspension bei 200 xg (~ 1.200 rpm) für 10 min. Von diesem Punkt an eine Bunsenbrenner auf, die auf der Bank, um eine erneute Verunreinigung der Eier (*) zu verhindern.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer sterilen Plastiktransferpipette und waschen das Pellet 3-4x mit Ei Puffer, bis die Lösung klar ist. Stellen Sie sicher, um das Pellet auch in der Eierpuffer während jeder Wäsche mischen.
- Die Eier werden von den Tierkörpern unter Verwendung von 30% Saccharose-Lösung getrennt. Das Pellet in 2 ml steriler Ei-Puffer und 2 ml 60% Saccharose-Lösung (Lager in sterile Ei-Puffer). Gut mischen und zentrifugieren für 20 min bei 200 xg (~ 1.200 rpm) (*).
- Die Röhren vorsichtig aus der Zentrifuge zu entfernen. Die Eier sind an der Oberseite der Lösung schweben. Mit einer Pipette und P1000 sterile Spitzen, übertragen alle Eier in ein frisches steriles 15 ml konischen Röhrchen.
- 10 ml sterile Puffer Ei mit dem Rohr und Zentrifuge bei 200 × g (~ 1200 rpm) für 10 min. Wiederholen Sie den Wasch 3 x. Sicherzustellen, dass die Eier vollständig in das Ei während jedes Waschpuffer resuspendiert.
3. Embryonic Cells Dissoziation
Führen Sie die nächsten Schritte des Verfahrens unter sterilen Bedingungen mit einem Steril. Während Tiere sindKleid auf Bakterienplatten, der Waschungen und der Behandlung mit der Lyse-Lösung mit Bleichmittel sollten die meisten, wenn nicht zu eliminieren alle Bakterien. Somit eine Laminar-Abzugshaube an diesem Punkt des Verfahrens verhindert, dass neue Verunreinigung der Eiersuspension.
- Resuspendieren pelletiert Eier in 1 ml 2 mg / ml Chitinase (Lager in Ei-Puffer pH 6.5 (*)) und übertragen sie auf eine neue sterile 15 ml konischen Röhrchen. Rock das Rohr für 10-30 min bei Raumtemperatur. Die genaue Inkubationszeit ändert sich entsprechend der Frische des Enzyms und der Temperatur des Raums und ist daher für jede Präparation bestimmt werden. Es wird empfohlen, die Überwachung der Eier unter einem Umkehrmikroskop die Zellkultur nach 10 min Inkubation zu starten. Hinweis: in unserer Erfahrung, erhöht niedrigen pH-Wert die Chitinase enzymatische Aktivität. Aus diesem Grund verwenden wir Ei-Puffer bei pH 6,5 bis Chitinase (Rezept oben berichtet, in der pH-Wert auf 6,5 mit NaOH) aufzulösen.
- Bei ~ 80% der Eierschalen durch die verdauteChitinase-Behandlung (Fig. 1 AB), pelletieren Sie die Eier durch Zentrifugation bei 900 × g (~ 2500 rpm) für 3 min (*). Mit einer Pipette und P1000 sterile Spitzen, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und 3 ml L-15-Medium (*).
- Übertragen Sie die Eier in eine Platte Durchmesser 6 cm und sanft distanzieren die Zellen mit einem 10 ml sterile Spritze mit einer 18 G-Nadel ausgestattet. Überwachen Sie den Grad der Dissoziation, indem ein Tropfen der Suspension in eine frische Petrischale aus Kunststoff und durch Betrachtung unter dem Mikroskop. Während dieses Vorgangs Luft in die Spritze anzusaugen nicht zu schädlichen Zellen zu vermeiden. Weiterhin die Dissoziation bis ~ 80% der Zellen dissoziiert.
- Filtern Sie die Suspension mit einer sterilen 5 um Millipore-Filter. Zellsuspensionen werden müssen, um Zellklumpen, unverdaute Eier und geschlüpften Larven entfernen gefiltert werden. Filter zusätzliche 4-5 ml frischem L-15-Medien durch den Filter, um alle Zellen zu erholen. Während des Filtrationsschritt Verwenden Sie nicht zu viel Kraft zu vermeiden, daMaging den Filter und / oder die Zellen.
4. Kultivieren von Zellen
- Pellet die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation bei 900 × g (~ 2500 rpm) für 3 min (*). Mit einem P1000 Pipette und sterilen Spitzen sorgfältig entfernen Sie alle den Überstand. Resuspendieren der pelletierten Zellen in komplette L-15-Medium und der Platte 1 ml / well. Die Menge des dem Medium zugesetzt wird, hängt von der Anzahl der 8P-Platten verwendet, die Mündung der Würmer auf den Platten, und die Art von Experimenten, die von den Zellen durchgeführt wird. Die Zelldichte kann unter Verwendung einer Zählkammer bestimmt. Für Patch-Clamp-Aufnahmen Beschichtungs-Dichte von ~ 230.000 Zellen / cm 2 ist optimal.
- Halten Sie die 24 Vertiefungen in einer Kunststoffplatte Tupperware-Behälter, nasse Handtücher um die Verdampfung des Kulturmediums zu vermeiden. Speicherung der Behälter in einem befeuchteten Inkubator bei 20 ° C und der Umgebungsluft.
- Die Zellen sind in der Regel bereit, für die Experimente innerhalb von 24 Stunden, wenn die morphologische Differenzierung und ExpressIon der GFP-Marker sind abgeschlossen. Zellen in Kultur für bis zu 2 Wochen aufbewahrt werden, aber sie sind in der Regel die meisten gesunden bis zu 7-9 Tage nach der Plattierung. Das Medium muss einmal täglich an gesunden Zellen aufrechtzuerhalten ersetzt werden.
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Representative Results
C. elegans kultivierten Zellen zu differenzieren und Express-Zell-spezifische Marker
Christensen und Kollegen mit Trypanblaufärbung gezeigt, dass> 99% der embryonalen C. elegans Zellen überleben die Isolierungsverfahren. Am Tag 9 und 22 nach dem Plattieren, 85% und 65%, bzw. 1 sind noch am Leben. Isoliert embryonalen C. elegans-Zellen müssen auf ein Substrat, um zu unterscheiden haften. Zellen, die Klumpen bilden nicht einhalten und es ist nicht klar, ob sie überleben. Differenzierung der Zellen beginnt 2-3 Stunden nach dem Ausstreichen und weiter für ungefähr 24 Stunden. Innerhalb von 24 h, Zellen nehmen auf bestimmte Morphologien. So senden Prozesse 1,18-20 Neuronen, Muskelzellen bilden Finger-wie ähnlich denen, die in-vivo-1 und Kanal-Zellen gesehen längliche Strukturen bilden ein Lumen 17. Die morphologischen Eigenschaften in vitro sind bemerkenswert ähnlich denen, die in vivo. Z. B. <em> in vitro kultiviert ALM und PLM-Touch-Neuronen (durch Expression Pmec-4 :: GFP identifiziert) entwickeln sich nur zwei neuronale Prozesse mit einer länger als andere, da sie in vivo 1,20 (2A) zu tun. Dies legt nahe, dass zumindest einige der molekularen Mechanismen, die die Differenzierung von Laufwerk C elegans Zellen zellautonome und kann somit in vitro rekapituliert werden.
In den 1990er Jahren Pionier Chalfie die Verwendung von Green Fluorescent Protein (GFP) in C. elegans Zelltypen, in denen ein Gen von Interesse exprimiert wird 26 kennzeichnen. Arbeit so weit auf kultivierte C durchgeführt elegans embryonalen Zellen unterstützt, dass die Expression von GFP in spezifischen Zelltypen in vitro 1,18-20,27 (2A) rekapituliert werden. Darüber hinaus ist das Verhältnis von Zellen, die GFP exprimieren in vitro ist ähnlich zu dem Verhältnis in vivo gefunden. Zum Beispiel, unc-4 homeodomain ReporterGen in 13 Motorneuronen in reifen Embryo (13 von 550 Zellen-2,3%) 28,29 ausgedrückt. Fuchs und Kollegen, gezählt unc-4 :: GFP-Zellen in Kultur und gefunden, daß sie 2% der Gesamtzahl der Zellen 23. Ebenso UNC-119, ein Protein für G-Protein Handel 30 erforderlich ist, wird in den meisten C ausgedrückt. elegans Neuronen und einigen Muskelzellen (76% der Zellen in der L1-Larven 31). Christensen und Kollegen berichtet, dass in der Kultur unc-119 :: GFP-Expression wurde in 74-76% der Zellen ähnelt Neuronen und Muskelzellen 1 beobachtet. Schließlich MEC-4, ein mechanosensitive Na + / Ca 2 +-Kanal-Untereinheit für sanfte Berührung 32 benötigt wird, in 6 Touch Nervenzellen im erwachsenen C ausgedrückt elegans. Von diesen sechs Touch-Neuronen sind vier (ALMS und PLMs) embryonal abgeleitet. Somit 4 von 550 (0,7%) Embryonalzellen sollte GFP unter der Kontrolle des MEC-4-Promotor exprimieren. Tatsächlich Neuronen in culture, die Pmec-4 :: GFP exprimieren bilden ~ 0,5% der Gesamtzahl der Zellen 18,20.
Proteinmarker und posttranslationale Modifikationen, die zellspezifisch sind, können auch in vitro beobachtet werden. Zum Beispiel wird alpha-Tubulin nur in Kontakt zu Neuronen in C. acetyliert elegans 33. In vitro Prozesse der Neuronen Touch Fleck mit einem Antikörper gegen acetyliertes Tubulin-alpha-20 (Abbildung 2B) angehoben. Kultivierte Touch Neuronen auch Ausdruck der toxischen mutierten Kanal MEC-4 (d), die den Tod der Nervenzellen in vivo Touch 34 verursacht. Tatsächlich GFP-exprimierenden Neuronen aus einer mec-4 (d) hergestellt werden; Pmec-4 :: GFP Stammes sind zunächst in der Kultur vorhanden, aber dann degenerieren 20. Wichtig ist, berühren Neuronen aus mec-4 (d) hergestellt werden; Pmec-4 :: GFP verhalten sich in vitro ähnlich wie sie in vivo zu verhalten. Zum Beispiel können sie aus dem Tod durch Behandlung mit gerettet werden einmiloride und Dantrolen, die mec-4 Ersatzteile (d) Touch-Neuronen aus Degeneration in vivo 20,35. Zum Schluss nicht nur C. elegans embryonalen Zellen ähneln morphologisch Zellen in vivo, aber sie zellspezifische Marker exprimieren und auch im gleichen Verhältnis sie in vivo vorhanden sind, vorhanden sind. Zusammengenommen stützen diese Daten, dass kultivierte C. elegans Zellen bilden eine insgesamt gute System, um biologische Prozesse sowohl auf zellulärer und molekularer Ebene zu studieren.
Patch-Clamp elektrophysiologische Analyse von kultivierten C. elegans Zellen
Die Patch-Clamp-Technik, die von Sakmann und Neher in den siebziger Jahren für die Untersuchung der Aktivität von Ionenkanälen aus Zellen isoliert oder in Gewebe eingebracht wurde, kann zu kultivierten C angewendet werden elegans 36 Zellen. Christensen und seine Kollegen waren die ersten, Ionenkanäle in kultivierten C. studieren elegans Zellen mit HilfePatch-Clamp-1. Seitdem haben K +, anionische und kationische Nicht-selektive Kanäle (Fig. 2 CE) sowie Dopamin-Transporter-abhängigen Kanäle in kultivierten C beschrieben elegans 1,18,19,37. Diese Studien zu unserem Verständnis der Rolle der ionischen Leitfähigkeiten in der Funktion C elegans Neuronen. Es gibt ein paar Modifikationen, die berücksichtigt werden müssen bei der Verwendung des Patch-Clamp-Technik, um Ionenkanalaktivität von kultivierten C aufzeichnen elegans-Zellen. Diese Modifikationen sind meist relevanten Gesamtzellaufzeichnungen. Erstens, C. elegans-Zellen sind klein, haben beispielsweise Neuronen einen Durchmesser von 1-2 um. So müssen Glaspipetten, eine kleine Spitze (0,5 um) haben. Kleine Pipettenspitzen erhöhen den Eingangswiderstand, was zu einer Stimulation und Aufzeichnungsfehler. Um dieses Problem zu lindern, können Pipetten konstruiert, um ein kleines Trinkgeld, aber eine breite Kegel haben werden. Goodman und Lockery eine Methode entwickelt, employing ein Feuer Polierer mit einer Hochdruck-Luftpumpe für Form Pipetten auf diese Form 38 ausgestattet. Zweitens, aufgrund der geringen Größe der Zellen, ganzen Zellen gewinnt Zugriff mittels Saugwirkung führt üblicherweise zu einer Beschädigung der Zelle. Viel höhere Erfolgs wird gewöhnlich durch Anlegen eines Hochspannungsimpulses (Elektro Zappen) an den Patch-Membran unter der Spitze der Pipette erreicht. Die anderen Konfigurationen der Patch-Clamp-Technik (Zelle angebracht ist, von innen nach außen und von außen-out) sind einfach zu anzuwenden C. elegans kultivierten Zellen, mit der Änderung, die nur die Spitze der Pipette sollte klein sein, unter Berücksichtigung der geringen Größe der C erfolgen elegans-Zellen. Die perforierte Patch Technik notorisch mühsamer und zeitaufwendiger als andere Patch-Clamp-Techniken. Aber es wurde erfolgreich auf C angewendet elegans-Zellen in situ 39, 40 und somit sollte auch in Kultur anwendbar.
Kalzium-ImagingTechniken C angewendet elegans kultivierten Zellen
Die funktionelle Bedeutung von spannungsabhängigen Ca 2 +-Kanäle (VGCC) in Neuronen und Gliazellen in kultivierten C untersucht elegans-Zellen durch Calcium Imaging 20, 21, 41. Die Anwendung von Calcium-Bildgebung in Kultur erlaubt die Verwendung von Lösungen mit hohen Konzentrationen an KCl zu Zelle Depolarisation induziert und der Calciumkanalblocker, um den Beitrag der unterschiedlichen Arten von Kanälen zu Calcium-Einstrom zu erkennen. Zum Beispiel wurde der Beitrag der Na + / Ca 2 + durchlässig MEC-4 (d) Kette, die die intrazelluläre Calciumkonzentration von Calcium-Imaging unter Verwendung von Chamäleon-YC2.12 in Gegenwart und Abwesenheit der DEG / ENaC-Kanalblocker Amilorid bestimmt. Diese Experimente zeigten, dass ein Amilorid-sensitiven Calcium-Einstrom in Kontakt zu Neuronen, MEC-4 (d), aber nicht in Wildtyp-Touch-Neuronen vorhanden ist. Verwendung von Ionophoren, die Membran der Permeabilisierungberühren Neuronen und Cameleon (3A und B) zu kalibrieren, Bianchi und Kollegen auch festgestellt, dass die mittlere freie Calcium-Konzentration in Kontakt Neuron 200 nM 20 (3C und D). Ebenso Frøkjær-Jensen und seine Kollegen untersuchten die Rolle von VGCCs EGL-19 und UNC-36 bei der Regulierung der Depolarisation induzierte Calcium-Einstrom in C. elegans kultiviert mechanosensorischen Neuronen came 21 abzugeben. Sie fanden, daß die Depolarisation der Neuronen durch Berührung extrazellulären K + in einem Bereich zwischen 20 mM und 100 mM induziert, führte Anstieg der intrazellulären Calcium von YFP / CFP Verhältnisänderung zwischen 17% und 70% ergab. Darüber hinaus wurden Kalzium-Transienten von egl-19 und unc-36 Verlust-function Mutationen reduziert und waren nicht in der Abwesenheit von extrazellulärer Ca 2 + nachgewiesen darauf hindeutet, dass VGCCs spielen eine Schlüsselrolle bei der Erregbarkeit von C. elegans Neuronen 21 berühren.
Stout und Parpura untersucht die Rolle von spannungsabhängigen Ca 2 +-Kanäle EGL-19, CCA-1 und UNC-2 in CEPsh Mantel Glia des Kopfsensillen Beitrag zur Calcium-Einstrom 41. Die intrazelluläre Kalziumdynamik wurden in CEPsh kultivierten Gliazellen aus transgenen Tieren Co-Expression des rot fluoreszierenden Marker mCherry und das grün fluoreszierende zytosolischen Ca 2 +-Indikator GcaMP2.0 analysiert. In der Mehrzahl der CEPsh Gliazellen Membrandepolarisierung durch hohe extrazelluläre Konzentrationen von KCl induzierte Anstieg der intrazellulären Ca 2 +-induzierte durch Anstieg der Fluoreszenz GcaMP2.0 berichtet. Darüber hinaus führte die Behandlung mit Calcium-Kanäle Blocker Cd 2 + und NEMA (nemadipine-A) deutlich reduziert die Calcium-Transienten. Diese Daten belegen, dass die spannungsabhängigen Anstieg der intrazellulären Calcium in CEPsh Gliazellen hängt zumindest teilweise von spannungsabhängigen Calciumkanälen. Die Autoren, weitere Änderungen im intrazellulären Calcium-L-Typ-1 analysiert egl9RF (Reduktion der Funktion), cca-1 und N, P / Q-, Kanal-unc-2-Knockout-Tieren und dem Schluss, dass alle drei Arten von Ca 2 +-Kanäle tragen wesentlich zur intrazellulären Calcium-Dynamik in diesen Gliazellen T-Typ-R-Typ . Da somit unreifen Säuger Makroglia antworten Depolarisation über VGCC abhängigen Veränderungen der intrazellulären Ca 2 +-Konzentrationen, schließen die Autoren, dass C. elegans CEPsh Gliazellen funktionell ähnlich Säugetier Makroglia, Astrozyten, Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen.
Andere Techniken für kultivierten C. elegans embryonalen Zellen
Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) wurde erfolgreich angewendet C. elegans-kultivierten Zellen zu Kulturen, die mit spezifischen Zelltypen und / oder die Zellen für Microarray-Analyse 23,4243 isolieren bereichern. Die Hauptmodifikation, die eingeführt werden musstendem Zellkulturverfahren war die Art des verwendeten Substrats. Seltsame und Kollegen prüften verschiedene Substrate einschließlich Kollagen IV, Poly-L-Lysin, Fibronektin und Laminin und nachgewiesen, dass Poly-L-Lysin ist das beste Substrat 37. Poly-L-Lysin fördert die Zelldifferenzierung ebenso wie Erdnuß-Lectin, aber im Gegensatz zu Erdnuß-Lectin ermöglicht Ablösung der Zellen vom Substrat 36 ohne Beschädigung. Mehrere verschiedene Arten von C. elegans Zellen durch FACS sortiert worden, darunter thermosensory-, Geruchs-, Motor-und mechanosensorischen Neuronen und Glia 23,42 - 45. Markierung von Zellen durch die Expression von GFP-Reporter durchgeführt worden, und insgesamt ist die Sortenreinheit bei hohen Isolierung von bis zu 90% der GFP-markierten Zellen 23.
Gen-Silencing durch RNA-Interferenz (RNAi) in Kultur ebenso erreicht werden. Christensen und Kollegen zeigten, dass die Inkubation von GFP-exprimierenden kultiviertenC. elegans Neuronen mit dsRNA gegen GFP in deutlich reduzierten Niveau der GFP-Expression mit einer maximalen Wirkung 4 Tage nach Zugabe von doppelsträngiger RNA zur Kultur 1. Ebenso Shih und Kollegen verwendeten RNAi in der Kultur zu zeigen, dass die C elegans SID-1 ist für die Vermittlung der Wirkung von dsRNA erforderlich und es ist wahrscheinlich in vivo für die Vermittlung systemischen Verbreitung von RNAi 46 benötigt. Abschließend RNAi, die eine der am meisten verwendeten und effektive Methoden zur Gen-Silencing in C ist elegans in Kultur angewendet werden. Dieses Verfahren könnte für die Abschaltung von Genen, deren Knockout ist tödlich oder stört C eingesetzt werden elegans normale Entwicklung.
1. C elegans Embryonen vor und nach der Behandlung Chitinase. (A) Foto von Eiern vor der Belichtung mit chitinase. Der Pfeil zeigt auf den transparenten und intakte Eierschale umgibt einen Embryo. (B) Eier mit Chitinase für 10 Minuten behandelt. Die Eierschalen wurden verdaut werden und nicht mehr um die Embryonen sichtbar. Die Pfeile zeigen auf das Dreifache Embryos aus der Eierschale veröffentlicht. Die blaue Box umgibt eine Gruppe von Zellen, die noch miteinander verbunden sind.
2. Kultivierte C. elegans berühren Neuronen. (A) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von kultivierten C. elegans berühren Neuronen, die GFP unter der Berührung spezifischen Promotors mec-4 (P mec-4 :: GFP), Maßstab 5 um. (B) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von einem Touch-exprimierenden Neuronen P mec-4 :: GFP (oben), die mit einem monoklonalen Antikörper gegen acetyliertes Tubulin alpha (Sigma) gefärbt wurde, wurde eine posttranslational Änderung von Alpha-Tubulin, die in Kontakt zu Neuronen nur 33 auftritt. Ab 20 angepasst. (CE) Beispiel mechanosensitive Kanäle in Wildtyp-kultivierten Touch-Neuronen in der Cell-Attached-Konfiguration der Patch-Clamp-Technik aufgezeichnet. Der Kanal hat einen Leitwert von ~ 100 ps und es in Kontakt zu Neuronen aus mec-4-Knockout-Tieren (mec-4 (U253)) sowie isoliert vorhanden ist. Diese Daten deuten darauf hin, dieser Kanal ist nicht der MEC Kanal 20. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
3. Die Einschätzung der freien intrazellulären Calciumkonzentration in kultivierten Neuronen mit Touch-Chamäleon. (A) Pseudo Bilder von kultivierten Neuronen Touch came YC2.12 ausdrückt in 0 mM Ca 2 + (+ EGTA, links) und in 10 mM Ca 2 + (rechts). Die Pseudo Skala ist auf der rechten Seite angezeigt. (B) Vertreter cameFluoreszenzÄnderungen mit Veränderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration in einer permeabilisierten Touch Neuron verbunden. Vor der Aufzeichnung wurden die Zellen für 30 min in einer Lösung, die Calcium Ionophor A23187-Br (10 &mgr; M) und einer definierten Konzentration an freiem Kalzium (250 nm in diesem Fall) inkubiert. Rotenon (10 mM) und 2-Desoxy-D-Glukose (1,8 mM) wurden zu der Lösung gegeben, um aktiven Pumpen blockieren. Das Neuron wurde dann mit einer Lösung enthaltend 0 mM (+ 5 mM EGTA), Ca 2 + und 10 mM Ca 2 +, um die minimale und maximale Fluoreszenzverhältnisänderungen bestimmen perfundiert. (C) Cameeichkurve, die 4-7 erhaltenen Ergebnisse Zellen, deren Fluoreszenzänderungen wurden in 11 verschiedenen freien Calcium-Lösungen evaluiert. Jeder Übersetzungsänderung zu der Maximalverhältnis-Änderung für die einzelne Zelle normalisiert. (D) (B) beschrieben hergestellt. Die Ruhecame Verhältnis in kultivierten Neuronen Touch 22% ± 7 (n = 2, 18 Zellen) der maximalen Verhältnisänderung. Basierend auf der Kalibrierungskurve (C) gezeigt, ist dieses Verhältnis entspricht einer freien Kalziumkonzentration von ~ 200 nM. Ab 20 angepasst. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellorganismus für die Entschlüsselung der genetischen Pfade in der Entwicklung, Verhalten und Alterung beteiligt. Seine Bequemlichkeit liegt vor allem in der Leichtigkeit, mit der sie genetisch manipuliert werden können und von seiner kurzen Lebenszyklus. Trotz seiner Bequemlichkeit, C. elegans hat seine Grenzen. C elegans-Zellen sind klein und in einem unter Druck Cuticula, die die Anwendung von Verfahren, die direkten Zugriff auf die Zellen, wie elektrophysiologischen und pharmakologischen Techniken oder Isolierung von spezifischen Zelltypen, wie z. B. das Gen-Expressionsprofil von Mikroarray-Analyse erfordern begrenzt beschränkt. Die C. elegans Zellkulturverfahren wurde eine Lösung für viele der Einschränkungen des Modellorganismus.
In dieser Handschrift beschreiben wir eine aktualisierte Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von embryonalen C. elegans Zellen in großem Maßstab auf frühe Arbeiten auf Basis von Christensen und Kollegen ein. Wir ALSo Bericht veröffentlicht mit einer Vielzahl von Techniken, einschließlich Immunzytochemie, Elektrophysiologie und Kalzium-Imaging, die unser Verständnis der physiologischen Prozesse und Anforderungen zugrunde liegende genetische Zell-Funktion in C fortgeschritten sind repräsentative Ergebnisse zu erhalten elegans. Arbeit so weit auf kultivierte C durchgeführt elegans Zellen unterstützt, dass sie differenzieren in vitro wie sie in vivo rekapituliert die Expression von zellspezifische Marker 1,18-20,22,23,27,44. Während nicht alle Zelltypen in Kultur charakterisiert dieses Werk nahe, dass die Zellkulturverfahren ermöglicht die Studie von C. elegans Zellen isoliert, ohne ihre Identität zu gefährden.
Das Protokoll ist einfach und leicht anwendbar in jedem Labor. Dinge, die zu beachten für die erfolgreiche Kultivierung C gehalten werden müssen, elegans embryonalen Zellen sind die folgenden: 1) Die Tiere müssen synchronisiert werden, so daß die Mehrheit von ihnen bekl Erwachsene bei der der Zellkulturverfahren trächtig werden. Starten des Wurm Kultur aus einer verhungert Platte ist eine gute Option. 2) Die Bakterien verwendet, um C wachsen elegans müssen vor dem Schnecken Lyse eliminiert werden, um eine Kontamination der Zellkultur verhindern. Es wird empfohlen, dass große Volumina von sterilem Wasser für die Waschschritte verwendet wird und dass Tiere am vorgeschlagen (nicht bei höheren) Drehzahl zentrifugiert, um die Ausfällung der Bakterien als auch zu vermeiden. Tatsächlich, während die Behandlung mit dem Bleichmittel enthaltenden Lysepuffer sollten Bakterien zu beseitigen, ausgehend von einem relativ keimfreie Tier Suspension empfohlen. 3) Die Tiere sollten mit Bleichmittel / NaOH behandelt werden, bis ~ 80% von ihnen haben ihre Eier veröffentlicht. Kürzere und längere Inkubationszeiten reduzieren den Wirkungsgrad von Ei-Rückgewinnung und die Eier bzw. beschädigen. 4) Eierschale Verdauung durch Chitinase sollten genau überwacht werden. Hand Dissoziation begonnen werden sollte, wenn ca. 80% der Eierschalen wurden verdaut werden. Längere und kürzere INCUBATIonenzeiten führen beide Zellschaden, durch direkte Schädigung der Plasmamembran durch das Enzym und Schäden durch längere und härtere manuelle Dissoziation in dem Versuch, die Zellen zu isolieren, die jeweils verursacht werden. 5) Zell Filtration durch das 5-um-Filter sollten nicht gezwungen werden. Wenn der Filter verstopft ist, sollte sie durch eine neue Zelle geändert werden, um Beschädigungen zu vermeiden.
Trotz der Tatsache, dass die kultivierten embryonalen Zellen haben das Feld in vielerlei Hinsicht revolutioniert, sie sind nicht die Antwort für jede wissenschaftliche Frage und haben immer noch Einschränkungen. Beispielsweise sind die in Kultur exprimierte Gene meist embryonalen da Zellen aus Embryos isoliert. Subzellulären möglicherweise nicht richtig in der Kultur zu entwickeln. Beispielsweise die Entwicklung und Wartung der Zilien bestimmter amphid sensorischen Neuronen wie AWA AWC und hängen von der Wechselwirkung mit amphid Gliazellen, die in der Kultur 44 verloren geht. Die Zellen verlieren ihre natürliche Nachbarn und nicht physiologisch rel machenvanten Zell-zu-Zell-Kontakten. Zum Beispiel ist es nicht bekannt, ob Zellen bilden feste Verbindungen, elektrische oder chemische Synapsen und wenn sie es tun, sind diese nicht geeignet, mit ihrer physiologischen Partner. Ferner werden die Zellen auf einem einzelnen Substrat, Erdnuß-Lectin plattiert. Die extrazelluläre Matrix in vivo wahrscheinlich ein komplexer und schwierig zu reproduzieren Mischung aus vielen Molekülen, einschließlich Erdnuß-Lectin, Laminin, Kollagen und Fibronektin sein. Außerdem spezialisierten extrazellulären Matrix, möglicherweise für bestimmte Arten von Zellfunktionen benötigt werden. Zum Beispiel äußerte die mechanosensitive Kanal im Körper Touch Neuronen und von MEC-4 gebildet und MEC-10-Untereinheiten können nicht in der Kultur 18 blendet werden, kann aber ohne weiteres in vivo 47 blendet werden. Dies rührt wahrscheinlich von der Tatsache, dass die extrazelluläre Kollagen MEC-5 normalerweise von benachbarten Naht Zellen in vivo erzeugt wird, ist in der Kultur 48 fehlt. MEC-5 zusammen mit extrazellulären Matrixproteinen MEC-1 (aa 1999 eine langProtein mit einer Kunitz-Typ-Domäne und zwei EGF-Domänen) und MEC-9 (ein 834 aa langen Protein, das mehrere Kunitz-Typ-Domänen, EGF-Wiederholungen und Glutaminsäure-reiche Domäne enthält) für Touch-Sensation benötigt und sind gedacht, um zu binden den extrazellulären Domänen des MEC-Kanal-Komplex und üben Spannung auf die Gating-Komplex während der mechanischen Stimulation.
Zum Schluss, C. elegans embryonalen Zellen können in vitro kultiviert werden, und sie zu unterscheiden rekapituliert die Expression von zellspezifischen Gene scheinen. Das Protokoll für die Isolierung und Kultur der Zellen ist einfach und kann in jedem Labor mit minimaler Erfahrung in Zellkulturtechniken anzuwenden. In Anbetracht der Einschränkungen dieser Technik kann der Zellkulturverfahren und hat sich als ein leistungsfähiges Verfahren, wenn direkter Zugang Zellen und / oder Isolierung von spezifischen Zelltypen erforderlich sind. Ein Protokoll für die Isolierung von Zellen aus Larven wurde auch kürzlich entwickelte (not hier beschrieben) 49. Die weit verbreitete Interesse an der Entwicklung von ergänzenden Methoden macht C. elegans eine noch leistungsfähigere System letztlich das Verständnis für den Zusammenhang zwischen Gen-Funktion und Verhalten, die Entwicklung oder die Alterung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator | |||
References
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
- Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
- Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
- Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
- Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
- Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
- Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
- Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
- Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
- Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
- Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
- Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
- Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
- Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
- Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
- Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
- Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
- Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
- Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
- Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
- Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
- Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
- Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
- Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
- Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
- O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
- Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).
