Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שיטה לCulturing עוברי Published: September 21, 2013 doi: 10.3791/50649
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

Summary

אנו מתארים כאן פרוטוקול מתוקן לתרבות בקנה מידה גדולה של ג העוברי elegans תאים. עוברי ג elegans תאים בתרבית במבחנה באמצעות שיטה זו, מופיעים כדי לבדל ולשחזר את הביטוי של גנים באופן ספציפי בתא. טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מרקמות האחרות יכולות להיות מיושמות על ג elegans תאים בתרבית.

Abstract

סי אלגנס הוא מערכת מודל רבת עוצמה, שבו טכניקות גנטיות ומולקולריים הן ישימות בקלות. עד לאחרונה אם כי, טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים ובידוד של תאים מסוגים מסוימים, לא יכולים להיות מיושמות בג elegans. מגבלה זו הייתה בשל העובדה שרקמות מוגבלות בתוך ציפורן בלחץ שאינו מתעכל בקלות על ידי טיפול עם אנזימים ו / או חומרי ניקוי. בהתבסס על עבודה חלוצה מוקדם על ידי לרד בלום, כריסטנסן ועמיתים 1 פיתח שיטה חזקה לculturing ג elegans תאים עובריים בקנה מידה גדולה. ביצים מבודדות ממבוגרים הרה להולדת על ידי טיפול עם אקונומיקה / NaOH ולאחר מכן טופלו בchitinase כדי להסיר את קליפות הביצים. לאחר מכן תאים עובריים הם ניתקו על ידי pipetting הידני ומצופים על זכוכית מכוסה מצע בתקשורת מועשר בסרום. בתוך 24 שעות של תאי בידוד מתחיל להבחין על ידי שינוי מורפולוגיה ועל ידי הבעת marke תאים הספציפיrs. ג elegans תאים בתרבית בשיטה זו לשרוד עד 2 שבועות במבחנה והיה בשימוש במשך אלקטרו, immunochemical, והדמיה מנתח, כמו גם שהם כבר מסודרים ומשמשים לאפיון microarray.

Introduction

elegans Caenorhabditis (סי אלגנס) הוא אורגניזם מודל רב עוצמה לחקירת הבסיסים המולקולריים של תפקוד תאי, התמיינות, והתנהגות. בעוד הגנום, חילוף החומרים ומסלולי biosynthetic דומים לבעלי חוליות ", העקיבות הגנטיות והמולקולרית שלו הן הרבה יותר גדולות 2. בין יתרונותיה לגודלה ואנטומיה פשוטה, המחזור המהיר שלה חיים (3 ימים ב25 מעלות צלזיוס), תוחלת חיים קצרה (2 שבועות) ומספר רב של צאצאים (> 200) הם. בשל אופי hermaphroditic ומחזור חיים קצר, מניפולציות מולקולריות וגנטיות הן פשוט בג elegans, הכולל את הדור של בעלי חיים מהונדסים 3,4 והיישום של טכניקות עקומות למטה גן כגון התערבות RNA 5. ג גוף elegans וקליפת ביצה הם שקופים. לכן ניתן דמיינו תאים בקלות בשני המבוגרים והעובר באמצעות מיקרוסקופ רגיל. ב40 השנים האחרונות, ג elegans ג מחקר elegans כולל אוסף גדול של מוטציות, knockouts וtransgenics, תיאור מפורט של האנטומיה ופיתוח 6,7, כולל השחזור המלא של מערכת העצבים 8, ולחלוטין הגנום רצף אשר מבואר וזמין לכל הקהילה גם ( www.wormbase.com).

למרות יתרונות הרבים, חלקם גישות ניסיוניות כבר מאתגרות בג elegans. אלה כוללים את אלה שדורשים נגישות לקרום הפלזמה של התאים והבידוד של רקמות או סוגי תאים. ואכן C. רקמות elegans מוגבלות בתוך השלד שלה בלחץ ההידרוסטטי, שאינו מתעכל בקלות על ידי טיפול או בדטרגנטים האנזימטית. בסופו של 1990 מרים גודמן וג'נט ריצ'מונד חלוץ שיטות עבור קלטות אלקטרו של ג elegansנוירונים ותאי שריר באתר 9,10. בעוד שיטות אלו נתנו לנו תובנות חשובות עצבי ותפקוד שרירים in vivo, הם מאתגרים ותפוקה נמוכה. שיטות אלטרנטיביים ללמוד את תפקוד תא in vivo שפותחו, בעיקר בעיקר בסידן ההדמיה vivo באמצעות חיישני סידן מקודד גנטי כגון GCamP וCameleon 11-13. שיטות אלה אף, אינן מאפשרים שימוש בכלים תרופתיים משום שהם חלים על בעלי חי חיים בשלמותה.

הניסיון הראשון בג culturing תאי elegans במבחנה בקנה מידה גדולה נעשו על ידי לרד בלום במהלך תקופת ההכנה של עבודת הדוקטורט שלו 14. למרבה הצער, קשיים עם הידבקות לקויה של התאים למצע, התמיינות תאים עני והישרדות מנעו את הקמתו של הפרוטוקול בתחילת כשיטת תרבית תאים חזקה. בשנת 1995 אדגר ועמיתיו פרסמו נוהלכדי לחקור את חלוקת תא והמורפוגנזה ידי בידוד והתרבות של C אחד. elegans עוברי 15. תאים עובריים שהושגו על ידי עיכול של קליפות הביצים עם שילוב של טיפול אנזימטי וניתוק ידני, המשיכו להתרבות, לייצר עד ~ 500 תאים 15. בהמשך לכך, ליונג ועמיתים לעבודה בתרבית מספר קטן של לסטומרים ללמוד המורפוגנזה מעיים. הם הראו כי במבחנה blastomere E המבודדת אחד המיוצר בתאי מעיים מקוטבים שיצרו מבנה מקביל ללומן מעיים על ידי אינטראקציה אחד עם השני דרך צמתים adherens פסגת 16. Buechner ועמיתיו גם דיווחו בשיטה דומה לC culturing. elegans תאים עובריים במבחנה 17.

בהתבסס על עבודה מוקדמת זו, כריסטנסן ועמיתיו פיתחו פרוטוקול חזק עבור culturing C העוברי. elegans תאים במבחנה 1. הםהראה כי C המבודד. elegans תאים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים ולשמור על התכונות שיש להם in vivo, כולל הביטוי של סמנים ספציפיים בתא. כמה טכניקות שמאתגרות in vivo, יכולות להיות מיושמות על ג המבודד elegans תאים עובריים. אלה כוללים 1,18 19 אלקטרו, הדמיה וטכניקות immunochemical 20,21, כמו גם בידוד של סוגי תאים ספציפיים על ידי Cell-Activated פלורסנט מיון (FACS) לבניית ספריות cDNA תא ספציפי 22,23. ניתן ליישם טכניקות ג'ין מציאה כגון התערבות RNA (RNAi) בג בתרבית elegans תאי 1 ושיטת תיוג מטבולי רומן באמצעות Azido סוכר ככלי לגילוי גליקופרוטאין פותחו לאחרונה במבחנת ג בתרבית תאי elegans 24.

לסיכום, שיטת תרבית תאים מרחיבה את מערך oטכניקות ו שיכול להיות מיושמות על ג דגם elegans במאמץ לפענח את תפקוד גן בהקשר של האורגניזם חי. אנו מתארים כאן את הפרוטוקול לculturing ג elegans תאים עובריים במבחנה, המבוססת במידה רבה על הפרוטוקול שתואר לראשונה על ידי כריסטיאנסן ו1 עמיתים לעבודה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כוכביות (*) מצביעות על צעדים חדשים או שונה בהשוואה לכריסטנסן et al. 1

1. התקנת חומר

  1. הליך תרבית תאים דורש כמויות גדולות של ביצים מבודדות ממבוגרים הרה. לגדול ג elegans על 8P צלחות אגר זרע עם NA22 (זמין באמצעות ג elegans הגנטי Consortium - CGC) חיידקים לבודד כמויות גדולות של ביצים. בלוחות אלה הסכום של peptone משמש הוא 8 פעמים את הסכום שמשמש בדרך כלל לצלחות NGM. ריכוז peptone גבוה יותר מקיים את הצמיחה של חיידקים NA22 יעילות רב יותר, אשר בניגוד לOP50, לגדול בשכבות עבות.

8P צלחות מתכון:

להמס 3 גרם NaCl, 20 גרם bacto-peptone, 25 אגר גרם ב1 ליטר של מים סטריליים מזוקקים וחיטוי ל30 דקות. בואו מגניב הבינוני על 55 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להוסיף מיליליטר סטרילי מסונן-1 של כולסטרול (5 מ"ג / מיליליטר בEtOH), 1 מיליליטר של 1 MgCl 2, 1 מיליליטר של 4 MgSO ו25 מיליליטר של חיץ KP (המניה של 500 מיליליטר: 5 גרם K 2 HPO 4, 30 גרמו KH 2 PO 4, pH 6.00). יוצקים בינוני אגר נוזל לתוך 10 סנטימטר צלחות פטרי (25 מיליליטר / צלחת).

  1. למחרת להפיץ את פני השטח של כל צלחת אגר peptone מועשר השלם עם 1 מיליליטר של NA22 E. לילה בתרבית חיידק בתקשורת 2XYT (16 גרם Tryptone, תמצית שמרי 10 גרם, 5 גרם NaCl ב1 ליטר של מים סטריליים, pH 7.0) ב 37 ° C. חיידקים אלה מהווים מקור מזון בשפע שיהווה שכבה עבה התומכת בצמיחה של כמויות גדולות של מבוגרים הרה. השאר צלחות seeded לילה בטמפרטורת חדר, כדי לאפשר צמיחה של החיידקים. התהליך יכול להיות מואץ על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 4-5 שעות.
  2. העבר את החיות מורעבות ל8P צלחות שנזרעו. שטוף חיות מצלחת NGM מורעבת באמצעות 5-6 מיליליטר של חיץ או מים M9 ולהוסיף 1-2 מיליליטר של השעיה זו לכל צלחת 8P.
  3. לאפשר צמיחה והכפלה של בעלי החיים האנטil הצלחות מאוכלסות במפגש על ידי מבוגרים הרה.
  4. לבודד את הביצים הנדרשות להכנת ג elegans תאים עובריים, ממבוגרים הרה להולדת באמצעות 5-6 מיליליטר של תמיסת תמוגה.

מתכון פתרון תמוגה

5 מיליליטר של אקונומיקה טריות, 1.25 מיליליטר של 10 N NaOH ו18.5 מיליליטר של סטרילי H 2 O. תערובת זו חייבת להיות מוכנה טרי לפני כל שימוש.

  1. לשטוף את הביצים מבודדות ממבוגרים הרה להולדת באמצעות חיץ ביצה:

מתכון חיץ ביצה

118 mM NaCl, 48 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ MgCl 2, 25 HEPES מ"מ, 7.3 pH, mOsm 340 אוסמולריות.

  1. הסר את קליפת הביצה שמקיפה את הביצים על ידי טיפול עם chitinase. Chitinase הוא אנזים עם הפעילות הגבוהה ביותר ב-pH חומצי 25. ממיסים chitinase (Sigma, לקטלג לא. C6137) בpH חיץ הביצה 6.5 בריכוז סופי של 2 מ"ג / מיליליטר. אחסן את מניית chitinaseפתרון ב -20 מעלות צלזיוס ב 1 מיליליטר aliquots בצינורות חרוטי 15 מיליליטר סטרילי. ניתן לאחסן aliquots ב -20 ° C עד כמה חודשים.
  2. לגדול ג תאים בתרבית elegans על coverslips autoclaved (בקוטר מ"מ 12) מכוסה בקטיני בוטנים. ממיסים קטיני בוטנים במים סטריליים (0.5 מ"ג / מיליליטר). פתרון לקטיני בוטנים לא צריכים להיות מסונן או autoclaved. זה גם לא צריך להיות מטופלים עם אור האולטרה סגול. חנות 2 aliquots מיליליטר ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  3. בינוני מלא תרבית תאים (500 מיליליטר) מכיל L-15 מדיום תרבות 500 מיליליטר מGibco, 50 מיליליטר בסרום שור עוברי (חום מומת), 7.7 סוכרוז גרם (mOsm 45), 5 מיליליטר של 100 U / ml פניצילין ושל 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (2%). הבינוני המלאה לאחר מכן מסונן באמצעות מסנן נקבובית 0.20 מיקרומטר.

שים לב שיש לי חיץ הביצה ובינוני תרבות osmolarity של 340 ו345 mOsm בהתאמה. ואכן, בניגוד לתאי יונקים, ג יש תאי elegans osmolarity גבוה יחסיתשצריך להילקח בספירה בעת הכנת פתרונות שיבואו במגע ישיר עם קרום הפלזמה של התאים. המתכונים של חומרים כימיים אלה הותאמו להגיע osmolarity הרצוי, אשר נמדד באמצעות osmometer 1. אין זה הכרחי להשתמש osmometer אם המתכונים האלה אחריו בדיוק וטיפול משמש בהכנת חומרים כימיים אלה. עם זאת, יש להשתמש osmoter אם פתרונות אחרים צריכים להיות מוכנים, שמתכונים אינם מדווחים כאן או בכל אחד מהפרסומים המשתמשים בג elegans תאים בתרבית.

2. בידוד ביצה

  1. מומלץ להתחיל עם לפחות ארבעה 8P צלחות כדי לאסוף מספיק ביצים ל12 בארות של תאים בתרבית (ב24 גם צלחות).
  2. לפני שמתחיל עם ההליך להפשיר צינור אחד של פתרון מניות לקטינים בוטנים. הנח coverslips autoclaved בתחתית הבארות בצלחת 24 היטב ולהוסיף 200 μl של קטיני בוטנים לcoverslips. דגירה עבור שעה 1 או until התאים מוכנים להיות מצופה. להסיר לחלוטין את קטיני בוטנים ולשטוף את הבארות פעם אחת עם 1 מיליליטר של מים autoclaved סטרילי. הסרה מלאה של קטיני הבוטנים מcoverslips היא חיונית למניעת clumping תא.
  3. שטוף את המבוגרים הרה להולדת את הצלחות אגר באמצעות מים autoclaved סטרילי. אסוף את ההשעיה לשני צינור 50 מיליליטר חרוטי סטרילי. השאר את הצינורות על קרח לתקופה של עד 5 דקות, כדי לאפשר למשקעים של התולעים בחלק התחתון של הצינורות (*). הסר את המים עם טפטפת פלסטיק העברה ולהחליף אותו עם מים סטריליים autoclaved טריים. גלולה תולעים על ידי צנטריפוגה בטבלה העליונה ב XG 200 (~ 1,200 סל"ד) עבור 10 דקות (*). חזור על השלב אחרון זה לפחות 3.
  4. העבר את התולעים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי וגלולתם ב XG 200 (~ 1,200 סל"ד) עבור 10 דקות (*). אל תשתמש במהירות גבוהה יותר צנטריפוגה כדי למנוע איסוף החיידקים בחלק התחתון של הצינור גם כן. לפעמים אחרי centrifugations התולעים אינם pelleted לחלוטין. After כל לשטוף ולפני הסרת supernatant, למקם את הצינורות במשך 5 דקות על קרח. במצונן תולעי מים לזרז לחלק התחתון של הצינור.
  5. הסר את המים ומוסיף 5-6 מיליליטר של תמיסת תמוגה (ראה חומר להגדיר). רוק ההשעיה בעדינות במשך דקות 5-10 ולאחר מכן להתחיל ניטור תמוגה תולעת תחת סטראו כל דקות 2-3. ירידה של השעיה ניתן גם להציב על coverslip לבדיקה קלה יותר. זמן הדגירה משתנה בהתאם לטריות של אקונומיקה; לקנות בקבוקים קטנים של אקונומיקה ולפתוח בקבוק חדש בכל חודש.
  6. כאשר ~ 70-80% מתולעים lysed (10 דקות מתחילת הדגירה), לעצור את תגובת תמוגה ידי הוספת 9 מיליליטר של pH חיץ הביצה 7.3 (ראה חומר להגדיר). צנטריפוגה ההשעיה ב XG 200 (~ 1,200 סל"ד) עבור 10 דקות. מכאן ואילך יש לי מבער בונזן ב, על הספסל כדי למנוע זיהום מחדש של הביצים (*) זו.
  7. מוציא בזהירות את supernatant באמצעות פיפטה העברה פלסטיק סטרילית ולשטוף את הכדור 3-4x עם חיץ ביצה עד הפתרון הוא ברור. הקפד לערבב היטב גלולה במאגר הביציות בכל שטיפה.
  8. ביצים מופרדות מפגרי בעלי החיים באמצעות 30% תמיסת סוכרוז. Resuspend את הכדור ב 2 מיליליטר של חיץ סטרילי ביצה ולהוסיף 2 מיליליטר של 60% תמיסת סוכרוז (המניה בחיץ סטרילי ביצה). מערבבים היטב וצנטריפוגות במשך 20 דקות ב XG 200 (~ 1,200 סל"ד) (*).
  9. מוציאים בזהירות את הצינורות מצנטריפוגות. הביצים צפות בחלק העליון של הפתרון. שימוש pipettor P1000 וטיפים סטריליים, להעביר את כל הביצים לתוך צינור חרוטי מיליליטר 15 סטרילי טרי.
  10. הוסף 10 מיליליטר של חיץ סטרילי ביצה לצינור צנטריפוגות ב XG 200 (~ 1,200 סל"ד) עבור 10 דקות. חזור על לשטוף 3 x. ודא הביצים resuspended לחלוטין בחיץ הביצה במהלך כל שטיפה.

3. דיסוציאציה תאים עוברי

לנהל את השלבים הבאים של ההליך בתנאים סטריליים באמצעות זרימה למינרית. בעוד בעלי חייםשמלה על צלחות חיידקים, שטיפה והטיפול בפתרון תמוגה המכיל אקונומיקה צריכה לחסל את רוב אם לא כל החיידקים. וכך באמצעות ברדס למינרית בשלב זה של ההליך זה מונע זיהום חדש של ההשעיה הביצה.

  1. Resuspend ביצי pelleted ב 1 מיליליטר של 2 מ"ג / מיליליטר chitinase (המניה בpH ביצת חיץ 6.5 (*)) ולהעביר אותם לצינור סטרילי חדש 15 מיליליטר חרוטי. רוק הצינור ל10-30 דקות בטמפרטורת חדר. זמן הדגירה המדויק משתנה בהתאם לטריות של האנזים, ואת הטמפרטורה של החדר ולכן צריך להיות שנקבע לכל הכנה. מומלץ להתחיל מעקב הביצים תחת המיקרוסקופ תרבית תאים הפוך לאחר 10 דקות של דגירה. הערה: בניסיון שלנו, ה-pH הנמוך מגבירה את הפעילות האנזימטית chitinase. מסיבה זו אנו משתמשים חיץ ביצה בpH 6.5 לפזר chitinase (מתכון שדווח לעיל, שבו רמת חומציות מותאמת ל6.5 באמצעות NaOH).
  2. כאשר ~ 80% מקליפות הביצים מתעכלים על ידיטיפול chitinase (איורים 1 AB), גלולה הביצים על ידי צנטריפוגה ב900 XG (~ 2,500 סל"ד) במשך 3 דקות (*). שימוש pipettor P1000 וטיפים סטריליים, להסיר בזהירות את supernatant ולהוסיף 3 מיליליטר של L-15 בינוניים (*).
  3. מעביר את הביצים לתוך צלחת בקוטר 6 סנטימטר ובעדינות לנתק את התאים באמצעות מזרק סטרילי 10 מיליליטר מצויד במחט G 18. לפקח על מידת הניתוק על ידי הצבת ירידה של השעיה לתוך צלחת פטרי פלסטיק טרי ועל ידי הצגה מתחת למיקרוסקופ. לא לשאוב אוויר לתוך המזרק במהלך הליך זה, כדי למנוע תאים מזיקים. המשך הניתוק עד ~ 80% מהתאים הם ניתקו.
  4. סנן את ההשעיה באמצעות 5 מסנן Millipore מיקרומטר סטרילי. השעיות תא חייבת להיות מסוננות כדי להסיר גושי תא, ביצים לא מעוכלות וזחלים בקעו. סנן 4-5 מיליליטר נוסף של L-15 תקשורת טריות דרך המסנן כדי לשחזר את כל התאים. אל תשתמשו בכוח מופרז במהלך שלב הסינון כדי למנוע damaging המסנן ו / או התאים.

4. Culturing תאים

  1. גלולה התאים ניתקו על ידי צנטריפוגה ב900 XG (~ 2,500 סל"ד) במשך 3 דקות (*). שימוש pipettor P1000 וטיפים סטרילי להסיר בזהירות את כל supernatant. Resuspend תאי pelleted במדיום L-15 מלא וצלחת 1 מיליליטר / היטב. כמות בינונית הוסיף תלויה במספר 8P צלחות בשימוש, נקודת המפגש של התולעים על הצלחות, והסוג של ניסויים שיבוצעו בתאים. צפיפות התאים ניתן לקבוע באמצעות hemocytometer. עבור הקלטות תיקון מהדק ציפוי צפיפות של ~ 230,000 תאים / 2 סנטימטר הוא אופטימלי.
  2. שמור את צלחת 24 בארות במכל פלסטיק פלסטיק המכיל מגבות נייר רטובות, כדי למנוע אידוי של מדיום לתרבות. אחסן את המכל בחממה humidified על 20 מעלות צלזיוס, אוויר הסביבה.
  3. התאים הם בדרך כלל מוכנים לניסויים בתוך 24 שעות כאשר הבידול ומפורש מורפולוגייםיון של סמני ה-GFP הושלם. יכולים להישמר תאים בתרבית עד 2 שבועות, אבל הם בדרך כלל בריאים ביותר עד 7-9 ימים לאחר ציפוי. הבינוני צריך להיות מוחלף פעם ביום כדי לשמור על תאים בריאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C. elegans תאים בתרבית להבדיל ותא מפורש סמנים ספציפיים

כריסטנסן ועמיתים באמצעות מכתים trypan הכחול הוכיחו כי> 99% ג העוברי תאי elegans לשרוד את הליך הבידוד. ביום 9 ו22 לאחר ציפוי, 85% ו65% בהתאמה עדיין בחיים 1. ג העוברי המבודד תאי elegans חייבים לדבוק במצע על מנת לבדל. תאים שאינם מצליחים לדבוק גושי צורה ולא ברור אם הם ישרדו. התמיינות של התאים מתחילה 2-3 שעות לאחר ציפוי וממשיכה ל~ שעה 24. בתוך 24 שעות, תאים לקחת על מורפולוגיות ספציפיות. לכן, תאי עצב שולחים תהליכים 1,18-20, תאי שריר בצורת מבנים מוארכים כמו אצבע דומה לאלה שראו בvivo 1 ותאי תעלה יוצרים לום 17. תכונות המורפולוגיות במבחנה דומות להפליא לאלה in vivo. לדוגמא, <em> במבחנה נוירונים בתרבית ALM וPLM מגע (שזוהו על ידי ביטוי של Pmec-4 :: GFP) לפתח רק שני תהליכים עצביים עם אחד ארוכה יותר משני, כפי שהם עושים בvivo 1,20 (איור 2 א). הדבר מצביע על כך שלפחות חלק מהמנגנונים המולקולריים המניע את הבידול של ג תאי elegans הם תאים אוטונומיים ולכן יכולים להיות סכמו במבחנה.

ב-1990, שלפי החלוץ בשימוש בחלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) בג elegans לתייג סוגי תאים שבגן של העניין מתבטא 26. עבודה שנעשתה עד כה על ג בתרבית elegans תאים עובריים שתומכים בביטוי של ה-GFP בתאים מסוגים מסוימים יכול להיות סכם במבחנה 1,18-20,27 (איור 2 א). יתר על כן היחס של תאים המבטאים את ה-GFP במבחנה דומה ליחס שנמצא בגוף חי. לדוגמא, כתב homeodomain UNC-4הגן מתבטא ב13 הנוירונים מוטוריים בעובר בוגר (13 של 550 תאים 2.3%) 28,29. פוקס ועמיתיו, נספרו תאי ה-GFP UNC-4 :: בתרבות ובמצאו שהם 2% מהמספר הכולל של תאים 23. בדומה לכך, UNC-119, חלבון הדרוש לסחר בחלבון G 30, באו לידי ביטוי ברוב C. נוירונים elegans וכמה תאי שריר (76% מהתאים בזחל L1 יום 31). כריסטנסן ועמיתים דיווחו כי בתרבות UNC-119 ביטוי :: GFP נצפה ב74-76% מהתאים דומים לתאי עצב ותאי שריר 1. לבסוף, MEC-4, למקטע 2 + ערוץ mechanosensitive Na + / Ca זקוק למגע עדין 32 באו לידי ביטוי ב6 נוירונים מגע בבוגרים ג elegans. של ששת תאי עצב מגע אלה, ארבע (נדבות וPLMs) נגזרות embryonically. לפיכך 4 של 550 (0.7%) תאים עובריים צריכים להביע GFP תחת השליטה של אמרגן MEC-4. אכן, תאי עצב בculturדואר המבטא Pmec-4 :: ה-GFP מהווה ~ 0.5% מהמספר הכולל של תאים 18,20.

סמני חלבון ושינויי posttranslational שהם תא ספציפי יכולים להיות גם שנצפו במבחנה. לדוגמא, טובולין אלפא הוא acetylated רק במגע הנוירונים ב C. elegans 33. במבחנה, תהליכים של נוירונים מגע להכתים עם נוגדן שהועלה נגד acetylated-alpha-טובולין 20 (איור 2). נוירונים בתרבית מגע גם להביע רעיל המוטציה הערוץ MEC-4 (ד), הגורם למותם של הנוירונים מגע in vivo 34. ואכן, ה-GFP להביע נוירונים שהוכנו מMEC-4 (ד); pmec-4 :: זן GFP הוא תחילה בהווה בתרבות אבל אז להידרדר 20. חשוב לציין, לגעת נוירונים שהוכנו מMEC-4 (ד); pmec-4 :: ה-GFP להתנהג במבחנה באופן דומה לאופן שבו הם מתנהגים בגוף חי. לדוגמא, הם יכולים להינצל ממוות על ידי טיפול עםmiloride וdantrolene, שחוסך MEC-4 מגע הנוירונים (ד) מניוון in vivo 20,35. לסיכום, לא רק ג elegans תאים עובריים מורפולוגית דומה לתאי in vivo, אבל הם גם מבטאים סמנים ספציפיים תא ונמצאים באותו יחס שהם נמצאים בגוף חי. יחדיו, נתונים אלה תומכים בכך שג בתרבית תאי elegans מהווים מערכת טובה באופן כללי ללמוד תהליכים ביולוגיים הן ברמה התאית ומולקולרית.

ניתוח אלקטרו תיקון מהדק של ג בתרבית elegans תאים

טכניקת תיקון מהדק, אשר הוצגה על ידי Sakmann ונהר בשנתי השבעים למחקר של תעלות יונים פעילות מהתאים בבידוד או ברקמות יכולה להיות מיושמת על ג בתרבית תאי elegans 36. כריסטנסן ועמיתיו היו הראשון שחקר את תעלות יונים בג בתרבית תאי elegans באמצעותתיקון מהדק 1. מאז, K +, אניוני, וערוצים הלא סלקטיבי קטיוני (איורים 2 לספירה), כמו גם ערוצי מובילים תלויים דופאמין תוארו בג בתרבית elegans 1,18,19,37. מחקרים אלו קידמו את ההבנה שלנו של התפקיד של conductances היוני בפונקציה של ג elegans הנוירונים. יש כמה שינויים שצריכים להילקח בחשבון בעת שימוש בטכניקת מהדק התיקון להקליט פעילות ערוץ יון מג התרבית elegans תאים. שינויים אלה הם בעיקר רלוונטיים להקלטות תא כולו. ראשית, ג תאי elegans הם קטנים, לדוגמא, יש לי נוירונים בקוטר של 1-2 מיקרומטר. לפיכך, טפטפות הזכוכית צריכה להיות טיפ קטן (0.5 מיקרומטר). טיפים פיפטה קטנים להגדיל את התנגדות הכניסה, וכתוצאה מטעויות גירוי וצריבה. כדי להקל על בעיה זו, ניתן לבנות טפטפות יש טיפ קטן אבל קונוס רחב. גודמן וLockery פיתחו שיטה EMPloying לטש אש מצויד במשאבת אוויר בלחץ גבוה לטפטפות דפוס לצורה זו 38. שנית, בשל גודלו הקטן של התאים, לקבל גישת תא כולו באמצעות שאיבה לרוב גורמת לנזק לתא. הצלחה הרבה יותר גבוהה מושגת בדרך כלל על ידי יישום דחף מתח גבוה (zapping החשמלי) לתיקון של קרום מתחת לקצה פיפטה. התצורות האחרות של טכניקת מהדק תיקון (תא המצורף, מבפנים החוצה ומחוץ-out) הן פשוט לפנות לג elegans תאים בתרבית, עם השינוי היחיד שקצה פיפטה צריך להיות קטן כדי לקחת בחשבון את גודלו הקטן של ג elegans תאים. טכניקת התיקון המחוררת ידועה לשמצה יותר מפרכת וזמן רב יותר מאשר טכניקות מהדק תיקון אחרות. עם זאת, זה כבר מיושם בהצלחה בג תאי elegans ב39 אתרו, 40 וכך צריכים להיות ישימים בתרבות, כמו גם.

הדמיה סידןטכניקות מיושמות על ג תאים בתרבית elegans

התפקיד הפונקציונלי של 2 + ערוצי Ca מתח מגודרת (VGCC) בתאי עצב וגליה נחקר בג בתרבית elegans תאים על ידי הדמיה סידן 20, 21, 41. היישום של הדמיה סידן בתרבות אפשר את השימוש בפתרונות המכילים ריכוזים גבוהים של KCl כדי לגרום לשלילת קוטביות תא ושל חוסמי תעלות סידן להבחין בתרומתו סוגים שונים של ערוצים לזרימת סידן של. למשל, התרומה של Na + / Ca 2 + ערוץ חדיר MEC-4 (ד) לריכוז סידן תוך תאי נקבעה על ידי הדמיה סידן באמצעות YC2.12 Cameleon בנוכחות והיעדר אמילוריד חוסם ערוץ DEG / ENaC. ניסויים אלה הראו כי זרימת סידן אמילוריד רגיש קיימת בנוירונים מגע להביע MEC-4 (ד), אך לא בתאי עצב מגע מסוג בר. שימוש ionophore לpermeabilize הממברנה שללגעת נוירונים ולכייל Cameleon (3A דמויות ו-B), ביאנקי ועמיתיו קבעו גם כי ריכוז סידן חופשי בממוצע במגע נוירון הוא 200 ננומטר 20 (3C דמויות ו-D). באופן דומה, Frokjaer-ג'נסן ועמיתיו חקרו את תפקידה של VGCCs EGL-19 וUNC-36 בויסות זרימת סידן-Induced שלילת קוטביות בג elegans בתרבית תאי עצב mechanosensory להביע Cameleon 21. הם מצאו כי שלילת קוטביות של מגע נוירונים הנגרמים על ידי תאי K + בטווח שבין 20 מ"מ ו100 מ"מ, הביאה לעלייה של סידן תוך תאי נחשפה על ידי שינוי יחס YFP / CFP בין 17% ו70%. יתר על כן, ארעיים סידן הופחתו על ידי EGL-19 וUNC-36 מוטציות לירידה בתפקוד ולא התגלו בהעדר Ca תאי 2 + המצביע על כך VGCCs לשחק תפקיד מפתח ברגישות של ג elegans לגעת נוירונים 21.

סטאוט וParpura בחנו את התפקיד של Ca 2 ערוצי מתח מגודרת + EGL-19, המרכז לאמנות עכשווית-1 וUNC-2 בגליה נדן CEPsh של sensilla cephalic בתורם לזרימת סידן 41. דינמיקת סידן תוך תאי נותחו בתאי גלייה CEPsh תרבית מבעלי חיים מהונדסים שיתוף להביע mCherry האדום ניאון הסמן וCa 2 + GcaMP2.0 cytosolic פלואורסצנטי הירוק המחוון. ברוב המכריע של תאי גליה CEPsh, שלילת קוטביות קרום הנגרמת על ידי ריכוזים גבוהים של גידול תאי KCl מושרה של תאיים Ca 2 + כפי שדווחה על ידי עלייה בקרינת GcaMP2.0. יתר על כן, טיפול בחוסמי תעלות סידן Cd 2 + ו NEMA (nemadipine-) צמצמו באופן משמעותי הארעיים סידן. נתונים אלה תומכים בכך שעלייה תלויה המתח בסידן תוך תאי בתאי גליה CEPsh תלוי לפחות בחלקו על ערוצי סידן תלוי מתח. המחברים, ניתחו נוספים תאיים שינויי סידן בסוג L-EGL-1(ירידה של פונקציה),, P / Q, בעלי חיים 9rf T-סוג CCA-1 ו-N-R סוג ערוץ UNC-2 בנוקאאוט והגיע למסקנה שכל שלושת הסוגים של Ca 2 + ערוצים לתרום באופן משמעותי לדינמיקה סידן תוך תאי בתאי גליה אלה . לכן, מאז macroglia יונקים בוגר להגיב לשלילת קוטביות באמצעות שינויי VGCC תלויים ב2 + ריכוזי תאיים Ca, החוקרים מסכמים כי ג תאי גליה elegans CEPsh עשויים תפקודי דומים macroglia, האסטרוציטים, oligodendrocytes יונקים ותאים מבשר oligodendrocyte.

טכניקות אחרות החלים על ג בתרבית elegans תאים עובריים

סלולרי הקרינה המופעל מיון (FACS) כבר מיושם בהצלחה ג elegans תאים בתרבית כדי להעשיר תרבויות עם סוגי תאים מסוימים ו / או לבודד תאים לניתוח microarray 23,4243. השינוי העיקרי שהיה צריך להיות מוצגיםלשיטת תרבית תאים היה הסוג של מצע בשימוש. עמיתים מוזרים ונבדקו מצעים שונים כולל IV קולגן, פולי-L-ליזין, פיברונקטין וlaminin וקבעו כי פולי-L-ליזין הוא המצע הטוב ביותר 37. פולי-L-ליזין מקדם התמיינות תאים בדיוק כמו גם לקטינים בוטנים, אבל בניגוד לקטיני בוטנים מאפשר ניתוק של התאים מהמצע ללא נזק 36. מספר סוגים שונים של ג תאי elegans כבר מסודרים על ידי FACS, כוללים thermosensory, חוש הריח, מוטורי ונוירונים mechanosensory, וגליה 23,42 - 45. תיוג תא הושג על ידי ביטוי של כתבי ה-GFP וכולל, את יעילות המיון היא גבוהה עם בידוד של עד 90% מתאים-GFP שכותרתו 23.

השתקת גנים על ידי התערבות RNA (RNAi) ניתן להשיג בתרבות, כמו גם. כריסטנסן ועמיתיו הראו כי דגירה של תרבית-GFP-לבטאC. elegans נוירונים עם dsRNA נגד ה-GFP, הסתיים ברמה מופחתת באופן משמעותי של ביטוי GFP עם אפקט מקסימאלי 4 ימים לאחר תוספת של פעמיים תקועים RNA לתרבות 1. בדומה לכך, השי ועמיתיו השתמשו RNAi בתרבות על מנת להוכיח כי ג יש צורך elegans SID-1 למתווך את ההשפעה של dsRNA וסביר להניח שדרוש in vivo לתיווך דיפוזיה המערכתית של RNAi 46. לסיכום, RNAi שהיא אחת מהשיטות הנפוצות והיעילים ביותר להשתקת גנים בג ניתן ליישם elegans בתרבות. שיטה זו יכולה לשמש להשתקת גנים בנוקאאוט שלו הוא קטלני או מפריע לג elegans התפתחות תקינה.

איור 1
איור 1. ג elegans עוברים לפני ואחרי טיפול chitinase. (א) תצלום של ביצים לפני החשיפה לצ'יtinase. נקודות החצים כדי קליפת הביצה השקופה ושלמה המקיפה את עובר. (ב) ביצים שטופלו בchitinase 10 דקות. קליפות הביצים כבר מתעכלים והם כבר לא נראים לעין סביב העוברים. החיצים מצביעים על עוברים פי שלושה שוחררו מקליפת הביצה. הקופסה הכחולה מקיפה קבוצה של תאים שעדיין מחוברת אחד לשני.

איור 2
איור 2. ג מתורבת elegans לגעת הנוירונים. (א) מיקרוסקופ פלואורסצנטי של ג בתרבית elegans לגעת נוירונים להביע GFP תחת מגע MEC-4 (P MEC-4 :: GFP), סרגל קנה מידה אמרגן ספציפי 5 מיקרומטר. (ב) micrographs פלורסנט של נוירון מגע להביע MEC-4 :: ה-GFP P (פנל עליון), שהיה מוכתם עם נוגדן חד שבטי כנגד טובולין אלפא acetylated (Sigma), posttranslationaשינוי ליטר של טובולין אלפא המתרחש במגע נוירונים רק 33. דוגמא מעובד מתוך 20. (CE) של ערוצי mechanosensitive נרשמו בתאי עצב בתרבית מגע מסוג בר בתצורה המצורפת התא של טכניקת מהדק תיקון. יש ערוץ מוליכות של ~ 100 נ.ב. והיא נוכחת במגע נוירונים בודדים מMEC-4 בעלי החיים בנוקאאוט (MEC-4 (u253)) גם כן. נתונים אלה מצביעים על הערוץ הזה הוא לא ערוץ MEC 20. לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 3
איור 3. הערכה של ריכוז סידן תוך תאי החופשי בתאי עצב בתרבית מגע באמצעות Cameleon. () Pseudocolor תמונות של נוירונים בתרבית מגע להביע YC2.12 Cameleon ב0 מ"מ 2 + Ca (+ EGTA, שמאל ו) ב10 מ"מ Ca 2 + (מימין). בקנה מידה pseudocolor מוצג בצד הימין. (ב ') שינויי ניאון Cameleon נציג קשורים לשינויים בריכוז הסידן תוך תאי בתאי עצב מגע permeabilized. לפני ההקלטה, תאים הודגרו למשך 30 דקות בתמיסה המכילה סידן ionophore Br-A23187 (10 מיקרומטר) וריכוז מוגדר של סידן חופשי (250 ננומטר במקרה זה). Rotenone (10 מ"מ) ו2-deoxy-D-גלוקוז (1.8mm) היו גם להוסיף את הפתרון לחסימת משאבות פעילים. נוירון היה אז perfused עם תמיסה המכילה 0 מ"מ (+5 מ"מ EGTA) Ca 2 + ו10 מ"מ Ca 2 + כדי לקבוע את המינימום ושינויי יחס הקרינה מקסימאלי. (C) Cameleon כיול עקום מראה את התוצאות שהתקבלו 4-7 תאי הקרינה ששינויים הוערכו ב11 פתרונות סידן חופשי שונים. כל שינוי יחס היה מנורמל לשינוי היחס המקסימאלי עבור התא הבודד. (D) (ב '). יחס Cameleon נח בתאי עצב בתרבית היה מגע 22% ± 7 (n = 2, 18 תאים) של שינוי יחס מקסימאלי. על בסיס עקום הכיול מוצג ב( C) יחס זה מתאים לריכוז סידן חופשי של ~ 200 ננומטר. מעובד מתוך 20. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

סי אלגנס הוא אורגניזם מודל רב עוצמה לפענוח המסלולים הגנטיים מעורבים בפיתוח, התנהגות והזדקנות. הנוחות שלה נובעת בעיקר מההקלות שבה ניתן להשפיע מבחינה גנטית וממחזור החיים הקצר שלה. למרות הנוחות שלה, ג יש elegans מגבלותיו. ג תאי elegans הם זעירים ומוגבל בתוך ציפורן בלחץ המגבילה את היישום של שיטות הדורשות גישה ישירה לתאים, כגון טכניקות אלקטרו ותרופתיות, או בידוד של סוגי תאים ספציפיים, כגון פרופיל ביטוי גנים על ידי ניתוח microarray. ג שיטת תרבית תאי elegans כבר פתרון לרבים מהמגבלות של אורגניזם מודל זה.

בכתב יד זה אנו מתארים שיטה מעודכנת לבידוד וculturing ג העוברי elegans תאים בקנה מידה גדולה המבוססים על עבודה מוקדמת של כריסטנסן ועמיתיו 1. אנו also לדווח על תוצאות יציגים שפורסמו שהושגו תוך שימוש במגוון טכניקות כולל immunocytochemistry, אלקטרופיזיולוגיה וההדמיה סידן שקדמה את ההבנה של התהליכים הפיסיולוגיים ודרישות גנטיות תפקוד תא בסיסי בג elegans. עבודה שנעשתה עד כה על ג בתרבית elegans תאים תומך שהם מבדילים במבחנה, כמו שהם עושים בvivo משחזרים את הביטוי של סמנים ספציפיים תא 1,18-20,22,23,27,44. אמנם לא כל סוגי התאים היו מאופיינים בתרבות, גוף עבודות זה מצביע על כך ששיטת תרבית תאים מאפשרת המחקר של ג תאי elegans בבידוד, מבלי להתפשר על זהותם.

הפרוטוקול הוא פשוט וישים בקלות בכל מעבדה. דברים שצריך לזכור לculturing בהצלחה ג תאים עובריים elegans הם הבאים: 1) בעלי חיים חייבים להיות מסונכרנים, כך שרובם WILl להיות הרה להולדת מבוגרים בעת הליך תרבית תאים. החל תרבות התולעת מצלחת מורעבת הוא אפשרות טובה. 2) החיידקים משמשים לגידול ג elegans צריך להתבטל לפני תמוגה תולעת כדי למנוע זיהום של תרבית התאים. מומלץ כי כמויות גדולות של מים סטריליים משמשות לשטיפה ושבעלי החיים centrifuged בהציע (לא בגבוהה יותר) מהירות כדי להימנע ממשקעים של החיידקים גם כן. ואכן, בעוד שטיפול במאגר תמוגה המכיל אקונומיקה צריך לחסל חיידקים, החל מהשעיה של בעלי חיים יחסית חיידקים ללא מומלץ. 3) יש להתייחס לבעלי חיים עם אקונומיקה / NaOH עד ~ 80% מהם יש לשחרר את ביציהם. פעמים דגירה קצרות יותר וארוכות יותר להפחית את היעילות של התאוששות ביצה ולפגוע בביצים בהתאמה. 4) קליפת ביצת עיכול על ידי chitinase צריך להיות תחת פיקוח הדוק. יש להתחיל ניתוק ידני בעת ~ 80% מקליפות הביצים כבר מעוכלים. ארוך יותר וקצר יותר incubatפעמים יון הן תוצאה בנזק לתאים, עקב נזק ישיר של קרום הפלזמה על ידי האנזים והנזק שנגרם על ידי ניתוק ידני ממושך וקשה בניסיון לבודד תאים, בהתאמה. 5) תא סינון דרך מסנן 5 מיקרומטר לא צריך להיות בכפייה. אם המסנן מקבל סתומים, זה צריך להיות שונה עם אחד טרי, כדי למנוע נזק לתאים.

למרות שתאים עובריים בתרבית חוללו מהפכה בשדה במובנים רבים, הם לא תשובה לכל שאלה מדעית, ועדיין יש מגבלות. לדוגמא, הגנים מתבטאים בתרבות הם בעיקר עובריים שכן תאים מבודדים מעוברים. תאי subcellular לא יכולים להתפתח בצורה נכונה בתרבות. לדוגמא, הפיתוח והתחזוקה של cilia של תאי עצב תחושתיים amphid מסוימים, כגון AWA וAWC תלוי באינטראקציה עם גליה amphid, שהולך לאיבוד בתרבות 44. תאים מאבדים את שכניהם הטבעיים ולא עושים מבחינה פיזיולוגית relקשר evant תא אל התא. לדוגמא, זה לא ידוע אם תאי טופס צמתים הדוקים, חשמליים או סינפסות כימיות ואם הם עושים, אלה לא צפויים להיות עם השותפים הפיסיולוגיים שלהם. יתר על כן, תאים מצופה על מצע, לקטינים בוטנים אחד. המטריצה ​​תאית in vivo צפויה להיות תערובת מורכבת וקשה לשחזר של מולקולות רבות, כולל לקטינים בוטנים, laminin, קולגן, פיברונקטין. יתר על כן, מתמחה מטריצה ​​תאית אולי זקוקה לסוגים מסוימים של פונקציות תא. לדוגמא, ערוץ mechanosensitive מתבטא בתאי עצב מגע גוף ושהוקם על ידי MEC-4 ולא ניתן מגודרת MEC-10 יחידות משנה בתרבות 18, אבל יכול להיות מגודרת בקלות in vivo 47. זה סביר ביותר נובע מהעובדה שMEC-5 קולגן תאי בדרך כלל מיוצרים על ידי תאי שכנים תפר in vivo, הוא נעדר בתרבות 48. MEC-5, ביחד עם חלבונים תאיים מטריקס MEC-1 (aa 1999 ארוךחלבון עם תחום קוניץ מהסוג ושני תחומים EGF) וMEC-9 (834 aa חלבון ארוך שמכיל מספר תחומים קוניץ מהסוג, חוזר EGF ותחום חומצה גלוטמית עשירה) יש צורך בתחושת מגע והם חשבו לאגד לתחומים תאיים של מתחם ערוץ MEC ולהפעיל gating מתח על המתחם במהלך גירוי מכאני.

לסיכום, ג יכולים להיות מתורבת תאים עובריים elegans במבחנה והם מופיעים כדי לבדל את משחזרים את הביטוי של גנים ספציפיים בתא. הפרוטוקול לבידוד והתרבות של התאים הוא פשוט וניתן ליישום בכל מעבדה עם ניסיון מינימאלי בטכניקות תרבית תאים. בהתחשב במגבלות של שיטה זו, שיטת תרבית תאים יכולה להיות והוכיחה להיות טכניקה חזקה כאשר תאים ישירים יינגשו ו / או בידוד של סוגי תאים ספציפיים נדרשים. פרוטוקול לבידוד תאים מזחלים כבר גם פיתח לאחרונה (not שתואר כאן) 49. עניין נרחב בפיתוח שיטות משלימות עושה ג elegans מערכת אפילו יותר חזק עבור סופו של דבר להבנת הקשר בין תפקוד גן והתנהגות, פיתוח או הזדקנות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Bacto Peptone VWR International Inc. 90000-382
Difco Agar Granulated VWR International Inc. 90000-784
Bacto Tryptone VWR International Inc. 90000-284
Bacto Yeast Extract VWR International Inc. 90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid Invitrogen 11415-064
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16140-063
Penicillin-streptomycin Sigma P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus Sigma C6137-25UN
NA22 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center
Peanut Lectin Sigma L0881-10MG
Sucrose Sigma 57903-1KG
D-(+)Glucose Sigma 67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) Sigma E0396-25G
Hepes Sigma H3375-500G
Cholesterol
NaCl Sigma 57653-1KG
KCl Sigma P9333-500G
CaCl2 Sigma C1016-500G
MgCl2 Sigma M8266-100G
MgSO4 Sigma M2643-500 g
K2HPO4 Sigma P2222-500G
KH2PO4 Sigma P9791-500G
NaOH Sigma S8045-500G
KOH Sigma P1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips USA Scentific 1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped USA Scentific 1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector VWR International Inc. 89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond VWR International Inc. 53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile VWR International Inc. 14670-114
15 ml Conical Tube USA Scentific 1475-1611
50 ml Conical Tube USA Scentific 1500-1811
Sterile 18 gauge Needles Becton, Dickinson and Co. 305196
Sterile 10 ml Syringes Becton, Dickinson and Co. 305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size Corning 431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane VWR International Inc. 28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips VWR International Inc. 48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid Thomas scientific 6902A09
Dumont #5- Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Centrifuge 5702 Eppendorf 022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  6. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
  7. Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
  8. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
  9. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  10. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
  11. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
  12. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
  14. Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
  15. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
  16. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
  17. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
  18. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  19. Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
  20. Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
  21. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  22. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
  23. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
  24. Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
  25. Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
  26. Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
  27. Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
  28. Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
  29. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
  30. Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
  31. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  32. Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
  33. Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
  34. Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
  35. Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
  36. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  37. Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
  38. Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
  39. Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
  40. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
  41. Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
  42. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
  43. Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
  44. Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
  45. Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
  46. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
  47. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
  48. Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
  49. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 79 אאוקריוטים ביולוגי תופעות תא פיזיולוגי תופעות C. elegans תרבית תאים תאים עובריים
שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sangaletti, R., Bianchi, L. A Method … More

Sangaletti, R., Bianchi, L. A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells. J. Vis. Exp. (79), e50649, doi:10.3791/50649 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter