Summary
हम भ्रूण सी. के बड़े पैमाने पर संस्कृति के लिए यहां एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन कोशिकाओं एलिगेंस. भ्रूण सी. एलिगेंस इस पद्धति का उपयोग इन विट्रो में संवर्धित कोशिकाओं, एक सेल विशिष्ट तरीके में जीन की अभिव्यक्ति अंतर और पुनरावृत्ति दिखाई देते हैं. प्रत्यक्ष कोशिकाओं के लिए उपयोग या अन्य ऊतकों से विशेष प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव की आवश्यकता है कि तकनीक सी. पर लागू किया जा सकता है संवर्धित कोशिकाओं एलिगेंस.
Abstract
एलिगेंस आनुवंशिक और आणविक तकनीक आसानी से लागू कर रहे हैं, जिसमें एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली, है. अभी हाल तक, हालांकि, कोशिकाओं और विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव के लिए सीधी पहुँच की आवश्यकता है कि तकनीक, सी में लागू नहीं किया जा सकता है एलिगेंस. इस सीमा के ऊतकों आसानी से एंजाइम और / या डिटर्जेंट के साथ इलाज के द्वारा पच नहीं रहा है जो एक दबाव छल्ली भीतर ही सीमित हैं कि इस तथ्य के कारण किया गया था. ठाकुर ब्लूम, क्रिस्टेनसेन और 1 सी. संवर्धन के लिए एक मजबूत विधि विकसित सहयोगियों द्वारा प्रारंभिक अग्रणी काम के आधार पर बड़े पैमाने में भ्रूण कोशिकाओं एलिगेंस. अंडे ब्लीच / NaOH के साथ इलाज के द्वारा गर्भवती वयस्कों से अलग किया और बाद में अनावश्यक कार्य को दूर करने के chitinase के साथ व्यवहार कर रहे हैं. भ्रूण कोशिकाओं फिर पुस्तिका pipetting द्वारा अलग और सीरम समृद्ध मीडिया में सब्सट्रेट से ढके कांच पर चढ़ाया जाता है. अलगाव कोशिकाओं के 24 घंटे के भीतर आकृति विज्ञान बदलकर और सेल विशिष्ट marke व्यक्त करके अलग करने के लिए शुरूरुपये. सी. एलिगेंस इस पद्धति का उपयोग संवर्धित कोशिकाओं इन विट्रो में 2 सप्ताह के लिए जीवित रहते हैं और electrophysiological, immunochemical के लिए इस्तेमाल किया गया है, और वे क्रमबद्ध और माइक्रोएरे रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया गया है के रूप में इमेजिंग के रूप में अच्छी तरह से विश्लेषण करती है.
Introduction
Caenorhabditis एलिगेंस (सी एलिगेंस) सेलुलर समारोह, भेदभाव, और व्यवहार के आणविक ठिकानों की जांच के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव है. इसके जीनोम, चयापचय और biosynthetic रास्ते रीढ़ 'के समान हैं, इसके आनुवंशिक और आणविक शिक्षणीयता 2 तक अधिक से अधिक कर रहे हैं. अपने फायदे के अलावा इसका आकार और सरल शरीर रचना, अपनी तेजी से जीवन चक्र (25 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिन), कम जीवन अवधि (2 सप्ताह) और वंश की बड़ी संख्या (> 200) हैं. कारण इसकी उभयलिंगी प्रकृति और कम जीवन चक्र को, आणविक और आनुवंशिक जोड़तोड़ सी. में सीधा कर रहे हैं ट्रांसजेनिक जानवर 3,4 और ऐसे शाही सेना के हस्तक्षेप के रूप में 5 जीन दस्तक नीचे तकनीक के इस्तेमाल की पीढ़ी सहित एलिगेंस,. सी. एलिगेंस शरीर और खोल पारदर्शी हैं. इसलिए कोशिकाओं को आसानी से वयस्क और मानक माइक्रोस्कोपी का उपयोग भ्रूण दोनों में देखे जा सकते हैं. पिछले 40 वर्षों में, सी. एलिगेंस सी. के लिए अमूल्य संसाधन बनाया गया है म्यूटेंट, knockouts और ट्रांसजेनिक्स का एक बड़ा संग्रह, तंत्रिका तंत्र 8 से भरा पुनर्निर्माण सहित शरीर रचना और विकास 6,7 की एक विस्तृत विवरण, और अच्छी तरह से एनोटेट और पूरे समुदाय के लिए उपलब्ध है जो एक पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम (सहित एलिगेंस अनुसंधान www.wormbase.com ).
कई फायदे के बावजूद, कुछ प्रयोगात्मक दृष्टिकोण सी. में चुनौती देने के लिए किया गया है एलिगेंस. इन ऊतकों या सेल प्रकार की कोशिकाओं और अलगाव के प्लाज्मा झिल्ली तक पहुँच की आवश्यकता है कि लोगों में शामिल हैं. दरअसल सी. एलिगेंस ऊतकों आसानी एंजाइमी उपचार या डिटर्जेंट से पचता नहीं है जो अपने दबाव हीड्रास्टाटिक कंकाल, भीतर ही सीमित हैं. 1990 के दशक के अंत में मरियम गुडमैन और जेनेट रिचमंड सी. के electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए तरीके का बीड़ा उठाया एलिगेंससीटू 9,10 में न्यूरॉन्स और मांसपेशियों की कोशिकाओं. इन तरीकों हमें neuronal और इन विवो में पेशी समारोह में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि दे दी है, वे चुनौतीपूर्ण और कम throughput हैं. विवो में सेल समारोह का अध्ययन करने के लिए वैकल्पिक तरीकों ज़्यादातर विशेष रूप से इस तरह के GCamP और Cameleon 11-13 के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सेंसर का उपयोग विवो कैल्शियम इमेजिंग में विकसित किया गया था. वे अक्षुण्ण रहने वाले जानवरों पर लागू कर रहे हैं क्योंकि इन विधियों हालांकि, औषधीय उपकरणों के उपयोग की अनुमति नहीं है.
संवर्धन सेल्सियस पर पहला प्रयास बड़े पैमाने पर इन विट्रो में एलिगेंस कोशिकाओं अपनी पीएचडी थीसिस 14 की तैयारी के दौरान ठाकुर ब्लूम द्वारा किया गया था. दुर्भाग्य से, कठिनाइयों सब्सट्रेट करने के लिए कक्षों की गरीब आसंजन के साथ सामना करना पड़ा, गरीब सेल भेदभाव और अस्तित्व के एक मजबूत सेल संस्कृति पद्धति के रूप में इस प्रारंभिक प्रोटोकॉल की स्थापना को रोका. 1995 में एडगर और उनके सहयोगियों ने एक प्रक्रिया प्रकाशितएक सी के अलगाव और संस्कृति से कोशिका विभाजन और morphogenesis जांच करने के लिए. एलिगेंस 15 भ्रूण. एंजाइमी उपचार और मार्गदर्शन हदबंदी के संयोजन के साथ अनावश्यक कार्य की पाचन द्वारा प्राप्त भ्रूण कोशिकाओं, ~ 500 कोशिकाओं 15 तक उत्पादन, पैदा करना जारी रखा. बाद में, Leung और सहकर्मियों आंतों morphogenesis अध्ययन करने के लिए blastomeres की एक छोटी संख्या सुसंस्कृत. वे एक में इन विट्रो अलग ई प्रसूखण्ड शिखर adherens जंक्शनों 16 के माध्यम से एक दूसरे के साथ बातचीत से आंतों लुमेन के अनुरूप संरचना बनाए गए ध्रुवीकृत आंतों की कोशिकाओं का उत्पादन दिखाया. Buechner और उनके सहयोगियों ने भी संवर्धन सी के लिए एक समान विधि की सूचना दी. इन विट्रो 17 में भ्रूण कोशिकाओं एलिगेंस.
इस प्रारंभिक काम के आधार पर, क्रिस्टेनसेन और उनके सहयोगियों ने भ्रूण सी संवर्धन के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल विकसित की है. एलिगेंस विट्रो 1 में कोशिकाओं. वेकि पृथक सी दिखाया. एलिगेंस कोशिकाओं विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में अंतर और सेल विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति सहित वे विवो में अधिकारी है कि सुविधाओं, बनाए रख सकते हैं. विवो में चुनौती दे रहे हैं कि कई तकनीकों, पृथक सी. पर लागू किया जा सकता है भ्रूण कोशिकाओं एलिगेंस. ये electrophysiological 1,18 19, इमेजिंग, और immunochemical तकनीक 20,21, साथ ही सेल विशिष्ट सीडीएनए पुस्तकालयों 22,23 के निर्माण के लिए छंटनी (FACS) फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल द्वारा विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव में शामिल हैं. ऐसे शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) के रूप में जीन पछाड़ना तकनीक सुसंस्कृत सी. पर लागू किया जा सकता है एलिगेंस कोशिकाओं 1 और ग्लाइकोप्रोटीन की खोज के लिए एक उपकरण के रूप में azido चीनी का उपयोग कर एक उपन्यास चयापचय लेबलिंग विधि हाल ही में इन विट्रो सुसंस्कृत सी. के लिए विकसित किया गया है एलिगेंस कोशिकाओं 24.
अंत में, सेल संस्कृति विधि सरणी ओ फैलतासी. करने के लिए लागू किया जा सकता है कि एफ तकनीक एक जीवित जीव के संदर्भ में जीन समारोह को समझने के प्रयास में एलिगेंस मॉडल. हम सी. संवर्धन के लिए यहाँ प्रोटोकॉल का वर्णन मोटे तौर पर पहले ईसाई और उनके सहयोगियों ने 1 से वर्णित प्रोटोकॉल पर आधारित है जो इन विट्रो में भ्रूण कोशिकाओं एलिगेंस.
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Protocol
क्रिस्टेनसेन एट अल की तुलना में सितारे (*) नई या संशोधित कदम से संकेत मिलता है. 1
1. सामग्री सेटअप
- सेल संस्कृति प्रक्रिया गर्भवती वयस्कों से अलग अंडे की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता है. सी. बढ़ो अंडे की बड़ी मात्रा को अलग करने के बैक्टीरिया - एलिगेंस 8P अगर प्लेटों पर NA22 (CGC एलिगेंस जेनेटिक कंसोर्टियम के माध्यम से उपलब्ध है) के साथ वरीयता प्राप्त. इन प्लेटों में इस्तेमाल किया peptone की राशि सामान्य रूप से एन जी एम प्लेटों के लिए प्रयोग किया जाता है कि 8 गुना राशि है. उच्च peptone एकाग्रता OP50-मोटी परतों में विकसित करने के लिए जो विपरीत, और अधिक कुशलता से NA22 बैक्टीरिया की वृद्धि को बनाए.
8P प्लेटें नुस्खा:
3 जी NaCl, 20 ग्राम Bacto-Peptone, 30 मिनट के लिए बाँझ आसुत जल और आटोक्लेव का 1 एल में 25 ग्राम अगर भंग. 55 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम और फिर ठंडा 1 मिलीलीटर 1 से 2 MgCl कोलेस्ट्रॉल की बाँझ फ़िल्टर 1 मिलीलीटर (EtOH में 5 मिलीग्राम / एमएल), जोड़, 4 MgSO के 1 मिलीग्राम और केपी बफर (500 मिलीलीटर का जायजा: 5 ग्राम कश्मीर 2 4 HPO, 30 ग्राम के.एच. 2 पीओ 4, पीएच 6.00) के 25 एमएल. 10 सेमी पेट्री डिश (25 मिलीग्राम / प्लेट) में तरल अगर मध्यम डालो.
- अगले दिन NA22 ई. के 1 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक समृद्ध peptone अगर प्लेट की पूरी सतह का प्रसार 2XYT मीडिया (16 ग्राम tryptone, 10 ग्राम खमीर निकालने, बाँझ पानी, पीएच 7.0 से 1 एल में 5 ग्राम NaCl) 37 डिग्री सेल्सियस में कोली सुसंस्कृत रातोंरात ये जीवाणु गर्भवती वयस्कों की एक बड़ी मात्रा के विकास का समर्थन एक मोटी परत के रूप में होगा कि एक प्रचुर खाद्य स्रोत का गठन. जीवाणुओं के विकास को अनुमति देने के लिए रात भर कमरे के तापमान पर वरीयता प्राप्त प्लेटें छोड़ दें. प्रक्रिया में 4-5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा त्वरित किया जा सकता है.
- वरीयता प्राप्त 8P प्लेटों के भूखे जानवरों स्थानांतरण. 5-6 M9 बफर या पानी की मिलीलीटर का उपयोग कर एक भूखे एन जी एम थाली जानवरों से धो लें और प्रत्येक 8P प्लेट को इस निलंबन के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें.
- पशुओं के विकास और गुणा unt अनुमति देंआईएल प्लेटें गर्भवती वयस्कों द्वारा संगम पर बसा रहे हैं.
- सी. की तैयारी के लिए आवश्यक अंडे को अलग lysis समाधान की 5-6 मिलीलीटर का उपयोग सगर्भा वयस्कों से भ्रूण कोशिकाओं, एलिगेंस.
Lysis समाधान नुस्खा
ताजा ब्लीच के 5 एमएल, 10 एन NaOH के 1.25 मिलीग्राम और बाँझ एच 2 ओ के 18.5 मिलीलीटर इस मिश्रण से पहले प्रत्येक उपयोग करने के लिए नए सिरे से तैयार रहना चाहिए.
- अंडा बफर का उपयोग सगर्भा वयस्कों से अलग अंडे धो लें:
अंडा बफर नुस्खा
118 मिमी NaCl, 48 मिमी KCl, 2 मिमी 2 CaCl, 2 मिमी 2 MgCl, 25 मिमी HEPES, 7.3 पीएच, osmolarity 340 mOsm.
- Chitinase के साथ इलाज के द्वारा अंडे है कि चारों ओर खोल निकालें. Chitinase अम्लीय पीएच 25 पर उच्चतम गतिविधि के साथ एक एंजाइम है. 2 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में अंडा बफर पीएच 6.5 में chitinase (सिग्मा, कोई सूची. C6137) भंग. Chitinase शेयर की दुकानबाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में 1 एमएल aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान. Aliquots कुछ महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस ऊपर में संग्रहित किया जा सकता है.
- सी. बढ़ो मूंगफली लेक्टिन के साथ कवर autoclaved coverslips (12 मिमी व्यास) पर एलिगेंस संवर्धित कोशिकाओं. बाँझ पानी (0.5 मिलीग्राम / एमएल) में मूंगफली लेक्टिन भंग. मूंगफली लेक्टिन समाधान फ़िल्टर या autoclaved नहीं किया जाना चाहिए. यह भी यूवी प्रकाश के साथ इलाज करने की आवश्यकता नहीं है. अप करने के लिए 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर 2 मिलीलीटर aliquots.
- पूरा सेल संस्कृति माध्यम (500 मिलीलीटर) Gibco, 50 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (गर्मी निष्क्रिय), 7.7 जी सुक्रोज (45 mOsm), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन की और 100 ग्राम के 5 एमएल / से 500 मिलीग्राम एल 15 मध्यम संस्कृति शामिल एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (2%). पूरा मध्यम तो एक 0.20 सुक्ष्ममापी ताकना फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर किया जाता है.
अंडा बफर और संस्कृति के माध्यम क्रमशः 340 के परासारिता और 345 mOsm है कि ध्यान दें. दरअसल, स्तनधारी कोशिकाओं के विपरीत, सी. एलिगेंस कोशिकाओं को एक अपेक्षाकृत उच्च परासारिता हैकि कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली के साथ सीधे संपर्क में आ जाएगा कि समाधान की तैयारी कर जब गिनती में लिया जाना चाहिए. इन अभिकर्मकों के व्यंजनों एक osmometer 1 का उपयोग कर मापा गया था जो वांछित परासारिता, तक पहुँचने के लिए समायोजित किया गया. यह इन व्यंजनों वास्तव में पालन किया जाता है और देखभाल इन अभिकर्मकों तैयार करने में प्रयोग किया जाता है, तो एक osmometer उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है. अन्य समाधान जिसका व्यंजनों यहाँ रिपोर्ट नहीं कर रहे हैं या सी का उपयोग करने वाले प्रकाशनों में से किसी में, तैयार रहने की जरूरत हालांकि, अगर एक एक osmoter का उपयोग करना चाहिए संवर्धित कोशिकाओं एलिगेंस.
2. अंडा अलगाव
- यह (24 अच्छी तरह प्लेटें में) संवर्धित कोशिकाओं के 12 कुओं के लिए पर्याप्त अंडे एकत्रित करने के लिए कम से कम चार 8P प्लेटों के साथ शुरू करने की सिफारिश की है.
- प्रक्रिया के साथ शुरू करने से पहले मूंगफली लेक्टिन स्टॉक समाधान की एक ट्यूब पिघलना. 24 अच्छी तरह से थाली में कुओं के तल पर autoclaved coverslips प्लेस और coverslips को मूंगफली लेक्टिन के 200 μl जोड़ें. 1 घंटा या यू के लिए सेतेntil कोशिकाओं चढ़ाया होने के लिए तैयार हैं. पूरी तरह से मूंगफली लेक्टिन निकालें और बाँझ autoclaved पानी के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार कुओं धो लो. Coverslips से मूंगफली लेक्टिन की पूरी हटाने सेल clumping से बचने के लिए आवश्यक है.
- बाँझ autoclaved पानी का उपयोग अगर प्लेटों बंद सगर्भा वयस्कों धो लें. दो बाँझ शंक्वाकार 50 मिलीलीटर ट्यूब में निलंबन लीजिए. ट्यूब (*) के तल पर कीड़े की वर्षा की अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब छोड़ दें. एक हस्तांतरण प्लास्टिक विंदुक के साथ पानी निकालें और ताजा बाँझ autoclaved पानी के साथ बदलें. 200 XG 10 मिनट के लिए (~ 1200 आरपीएम) (*) पर टेबल टॉप centrifugation द्वारा कीड़े गोली. कम से कम 3 इस अंतिम चरण दोहराएँ.
- एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कीड़े हस्तांतरण और 200 XG 10 मिनट के लिए (~ 1200 आरपीएम) (*) पर उन्हें गोली. के रूप में अच्छी तरह से ट्यूब के नीचे बैक्टीरिया का संग्रह से बचने के लिए उच्च centrifugation गति का उपयोग न करें. कभी कभी centrifugations के बाद कीड़े पूरी तरह से pelleted नहीं कर रहे हैं. वायु सेनाआतंकवाद प्रत्येक धोने और हटाने से पहले सतह पर तैरनेवाला, बर्फ पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों रखें. ठंडा पानी कीड़े ट्यूब के नीचे करने के वेग.
- पानी निकालें और सेल समाधान की 5-6 मिलीलीटर जोड़ने (सामग्री की स्थापना देखें). 5-10 मिनट के लिए धीरे निलंबन रॉक और उसके बाद हर 2-3 मिनट stereomicroscope के तहत कीड़ा सेल की निगरानी शुरू करते हैं. निलंबन की एक बूंद भी आसान निरीक्षण के लिए एक coverslip पर रखा जा सकता है. ऊष्मायन समय ब्लीच की ताजगी पर निर्भर करता है, ब्लीच की छोटी बोतल खरीदते हैं और हर महीने एक नई बोतल खुली.
- ~ कीड़े के 70-80% (ऊष्मायन की शुरुआत से 10 मिनट) lysed रहे हैं, (सामग्री की स्थापना देखें) अंडा बफर पीएच 7.3 से 9 मिलीलीटर जोड़कर सेल प्रतिक्रिया बंद करो. 10 मिनट के लिए 200 XG (~ 1200 आरपीएम) पर निलंबन अपकेंद्रित्र. अंडे (*) की फिर से प्रदूषण को रोकने के बेंच पर पर एक लेम्प बर्नर है, पर इस बिंदु से.
- ध्यान से एक बाँझ प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला हटाने और गोली 3-4 धोनेसमाधान स्पष्ट है एक्स अंडा बफर के साथ जब तक. प्रत्येक धोने के दौरान अंडा बफर में गोली मिश्रण अच्छी तरह से करना सुनिश्चित करें.
- अंडे 30% sucrose के समाधान का उपयोग कर पशु शवों से अलग हो रहे हैं. बाँझ अंडे बफर के 2 मिलीलीटर में गोली Resuspend और 2 मिलीलीटर 60 से% sucrose के समाधान (बाँझ अंडे बफर में शेयर) जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और 200 XG (~ 1200 आरपीएम) (*) पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- ध्यान अपकेंद्रित्र से ट्यूबों निकालें. अंडे समाधान के शीर्ष पर चल रहे हैं. एक P1000 pipettor और बाँझ सुझावों का उपयोग करना, एक ताजा बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सभी अंडे स्थानांतरण.
- 10 मिनट के लिए 200 XG (~ 1200 आरपीएम) में ट्यूब और अपकेंद्रित्र को बाँझ अंडे बफर के 10 एमएल जोड़ें. धोने 3 एक्स दोहराएँ. अंडे पूरी तरह से प्रत्येक धोने के दौरान अंडा बफर में resuspended हैं सुनिश्चित करें.
3. भ्रूण कोशिकाओं हदबंदी
एक लामिना का प्रवाह हुड का उपयोग बाँझ शर्तों के तहत प्रक्रिया के अगले कदम का संचालन. जानवरों रहे हैंसभी बैक्टीरिया यदि नहीं, तो अधिकांश को समाप्त करना चाहिए बैक्टीरिया प्लेटें, washes और ब्लीच युक्त lysis समाधान के साथ इलाज पर गाउन. इस प्रकार की प्रक्रिया के इस मोड़ पर एक लामिना हुड का उपयोग अंडा निलंबन के नए संक्रमण से बचाता है.
- 2 मिलीग्राम / एमएल chitinase (अंडा बफर पीएच 6.5 (*) में शेयर) के 1 मिलीलीटर में pelleted अंडे Resuspend और एक नया बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण. कमरे के तापमान पर 10-30 मिनट के लिए ट्यूब रॉक. सटीक ऊष्मायन समय एंजाइम और कमरे के तापमान की ताजगी के अनुसार बदलता है और इसलिए प्रत्येक तैयारी के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए. यह ऊष्मायन के 10 मिनट के बाद एक औंधा सेल संस्कृति खुर्दबीन के नीचे अंडे की निगरानी शुरू करने की सिफारिश की है. नोट: हमारे अनुभव में, कम पीएच chitinase enzymatic गतिविधि बढ़ जाती है. इस कारण से हम chitinase (पीएच NaOH का उपयोग 6.5 निकाला जाता है, जहां ऊपर की सूचना नुस्खा,) को भंग करने के लिए पीएच 6.5 पर अंडे बफर का उपयोग करें.
- ~ अनावश्यक कार्य का 80% से पच जाता है जबchitinase उपचार (आंकड़े 1 एबी), 900 XG 3 मिनट के लिए (~ 2500 आरपीएम) (*) पर centrifugation द्वारा अंडे गोली. एक P1000 pipettor और बाँझ सुझावों का प्रयोग, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और एल 15 मध्यम के 3 मिलीलीटर (*) जोड़ने.
- एक 6 सेमी व्यास प्लेट में अंडे स्थानांतरण और धीरे से एक 18 जी सुई के साथ सुसज्जित एक 10 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज का उपयोग कोशिकाओं को अलग कर देना. एक ताजा प्लास्टिक पेट्री डिश में निलंबन की एक बूंद रखकर और खुर्दबीन के नीचे देखने के द्वारा पृथक्करण की डिग्री मॉनिटर. हानिकारक कोशिकाओं से बचने के लिए इस प्रक्रिया के दौरान सिरिंज में हवा महाप्राण मत करो. कोशिकाओं का 80% अलग हैं ~ जब तक हदबंदी जारी.
- एक बाँझ 5 माइक्रोन Millipore फिल्टर का उपयोग निलंबन तक. सेल निलंबन सेल clumps, पचाया अंडे और रची लार्वा को दूर करने के क्रम में फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए. सभी कोशिकाओं को ठीक करने के लिए फिल्टर के माध्यम से ताजा एल 15 मीडिया की अतिरिक्त 4-5 मिलीलीटर तक. दा से बचने के लिए निस्पंदन कदम के दौरान अत्यधिक बल का प्रयोग न करेंफिल्टर और / या कोशिकाओं maging.
4. संवर्धन कोशिकाओं
- 3 मिनट (*) के लिए 900 XG (~ 2500 आरपीएम) पर centrifugation द्वारा अलग कोशिकाओं गोली. एक P1000 pipettor और बाँझ सुझावों का प्रयोग सावधानी से सभी सतह पर तैरनेवाला हटायें. पूरा एल 15 मध्यम और प्लेट 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से में pelleted कोशिकाओं Resuspend. जोड़ा माध्यम की राशि का इस्तेमाल 8P प्लेटों की संख्या, प्लेटों पर कीड़े के संगम, और कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया जाएगा कि प्रयोगों के प्रकार पर निर्भर करता है. सेल घनत्व एक hemocytometer का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है. ~ 230000 कोशिकाओं / 2 सेमी इष्टतम है के घनत्व चढ़ाना पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए.
- संस्कृति के माध्यम से वाष्पीकरण से बचने के लिए गीला कागज तौलिए से युक्त एक प्लास्टिक Tupperware कंटेनर में 24 कुओं थाली रखें. 20 डिग्री सेल्सियस और परिवेशी वायु में एक humidified इनक्यूबेटर में कंटेनर स्टोर.
- कोशिकाओं आमतौर पर 24 घंटे के भीतर प्रयोगों के लिए तैयार कर रहे हैं जब रूपात्मक भेदभाव और एक्सप्रेसGFP मार्कर के आयन पूरा कर रहे हैं. कोशिकाओं के लिए 2 सप्ताह के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है लेकिन वे चढ़ाना के बाद आम तौर पर 7-9 दिनों के लिए सबसे स्वस्थ हैं. मध्यम स्वस्थ कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए एक बार एक दिन के लिए जगह की जरूरत है.
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Representative Results
सी. संवर्धित कोशिकाओं विशिष्ट मार्करों अंतर और एक्सप्रेस सेल एलिगेंस
क्रिस्टेनसेन और trypan नीले रंग धुंधला का उपयोग सहयोगियों ने दिखा दिया कि भ्रूण सी. के> 99% एलिगेंस कोशिकाओं अलगाव प्रक्रिया जीवित रहते हैं. सुबह 9 और चढ़ाना के बाद 22 में क्रमश: 85% और 65%, अभी भी 1 जिंदा हैं. पृथक भ्रूण सी. एलिगेंस कोशिकाओं को अलग करने के क्रम में एक सब्सट्रेट का पालन करना होगा. फार्म clumps पालन करने में विफल और यह वे जीवित स्पष्ट नहीं है कि कि कोशिकाओं. कोशिकाओं के भेदभाव चढ़ाना के बाद 2-3 घंटे शुरू होता है और ~ 24 घंटे के लिए जारी है. 24 घंटा के भीतर, कोशिकाओं विशिष्ट morphologies पर ले. इस प्रकार, न्यूरॉन्स प्रक्रियाओं 1,18-20 बाहर भेजने के लिए, मांसपेशियों की कोशिकाओं एक लुमेन 17 फार्म विवो 1 और नहर कोशिकाओं में देखा लोगों के लिए समान उंगली की तरह लम्बी संरचनाओं फार्म. इन विट्रो में रूपात्मक सुविधाओं विवो में लोगों को उल्लेखनीय समान हैं. उदाहरण के लिए, <उन्हें> इन विट्रो (Pmec-4 :: GFP की अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान) सुसंस्कृत एएलएम और पीएलएम स्पर्श न्यूरॉन्स वे विवो 1,20 (2A चित्रा) में कर के रूप में, अन्य की तुलना में एक लंबे समय तक साथ केवल दो neuronal प्रक्रियाओं का विकास. यह पता चलता है कि सी. के भेदभाव ड्राइव आणविक तंत्र है कि कम से कम कुछ एलिगेंस कोशिकाओं सेल स्वायत्त हैं और इस प्रकार इन विट्रो में recapitulated किया जा सकता है.
1990 में, Chalfie सी. में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के प्रयोग का बीड़ा उठाया ब्याज की एक जीन 26 व्यक्त की है जिसमें सेल प्रकार लेबल करने एलिगेंस. सुसंस्कृत सी. पर अब तक किए गए कार्य एलिगेंस भ्रूण कोशिकाओं विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में GFP की अभिव्यक्ति के लिए इन विट्रो 1,18-20,27 (2A चित्रा) में recapitulated किया जा सकता है कि समर्थन करता है. इसके अलावा इन विट्रो में GFP व्यक्त कि कोशिकाओं का अनुपात विवो में पाया अनुपात के समान है. उदाहरण के लिए, UNC-4 homeodomain रिपोर्टरजीन परिपक्व भ्रूण (13 550 की कोशिकाओं 2.3%) 28,29 में 13 मोटर न्यूरॉन्स में व्यक्त किया है. फॉक्स और उनके सहयोगियों, संस्कृति में UNC-4 :: GFP कोशिकाओं गिना और वे कोशिकाओं 23 की कुल संख्या के 2% हो पाया. इसी तरह, UNC-119, जी प्रोटीन की तस्करी 30 के लिए आवश्यक एक प्रोटीन, सबसे सी में व्यक्त किया है. न्यूरॉन्स और कुछ मांसपेशियों की कोशिकाओं (एल 1 लार्वा 31 में कोशिकाओं के 76%) एलिगेंस. क्रिस्टेनसेन और उनके सहयोगियों संस्कृति में UNC-119 :: GFP अभिव्यक्ति न्यूरॉन्स और मांसपेशियों की कोशिकाओं 1 जैसी कोशिकाओं की 74-76% में मनाया गया था की सूचना दी. अंत में, MEC-4, कोमल स्पर्श 32 के लिए आवश्यक एक mechanosensitive ना + / सीए 2 + चैनल सबयूनिट वयस्क सी में 6 स्पर्श न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है एलिगेंस. इन छह स्पर्श न्यूरॉन्स की, चार (दान और PLMs) embryonically प्राप्त कर रहे हैं. इस प्रकार 4 (0.7%) 550 से भ्रूण कोशिकाओं MEC-4 प्रमोटर के नियंत्रण में GFP व्यक्त करना चाहिए. दरअसल, संस्कृतियों में न्यूरॉन्सPmec -4 :: व्यक्त GFP कि ई कोशिकाओं 18,20 की कुल संख्या का ~ 0.5% का गठन.
प्रोटीन मार्कर और सेल विशिष्ट हैं कि posttranslational संशोधनों भी इन विट्रो में मनाया जा सकता है. उदाहरण के लिए, अल्फा ट्यूबिलिन ही सी. में स्पर्श न्यूरॉन्स में acetylated है एलिगेंस 33. इन विट्रो, स्पर्श न्यूरॉन्स की प्रक्रियाओं acetylated अल्फा-ट्यूबिलिन 20 (चित्रा 2 बी) के खिलाफ उठाया एक एंटीबॉडी के साथ दाग. संवर्धित स्पर्श न्यूरॉन्स भी विवो 34 में स्पर्श न्यूरॉन्स की मौत का कारण बनता है जो विषाक्त उत्परिवर्ती चैनल MEC-4 (डी), व्यक्त करते हैं. दरअसल, GFP एक MEC-4 (D) से तैयार न्यूरॉन्स व्यक्त; pmec-4 :: GFP तनाव शुरू में संस्कृति में मौजूद हैं लेकिन फिर 20 पतित. महत्वपूर्ण बात है, MEC-4 (D) से तैयार न्यूरॉन्स स्पर्श, pmec-4 :: GFP इसी वे विवो में कैसे व्यवहार करने के लिए इन विट्रो व्यवहार करते हैं. उदाहरण के लिए, वे के साथ इलाज के द्वारा मृत्यु से बचाया जा सकता है एकविवो 20,35 में अध: पतन से (घ) स्पर्श न्यूरॉन्स MEC-4 की जरूरत नहीं पड़ती कि miloride और Dantrolene,. समाप्त करने के लिए, न केवल सी. एलिगेंस भ्रूण कोशिकाओं आकृति विज्ञान vivo में कोशिकाओं जैसे लगते हैं, लेकिन वे भी सेल विशिष्ट मार्करों व्यक्त करते हैं और वे इन विवो में मौजूद हैं उसी अनुपात में मौजूद हैं. साथ में ले ली, इन आंकड़ों का समर्थन करने वाले सुसंस्कृत सी. एलिगेंस कोशिकाओं सेलुलर और आणविक स्तर पर दोनों जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक समग्र अच्छी व्यवस्था का गठन.
सुसंस्कृत सी. के पैच दबाना electrophysiological विश्लेषण एलिगेंस कोशिकाओं
अलगाव में या ऊतकों में कोशिकाओं से आयन चैनल गतिविधि के अध्ययन के लिए सत्तर के दशक में Sakmann और नेहर द्वारा शुरू की गई थी जो पैच दबाना तकनीक, सुसंस्कृत सी. करने के लिए लागू किया जा सकता है एलिगेंस कोशिकाओं 36. क्रिस्टेनसेन और उनके सहयोगियों सुसंस्कृत सी. में आयन चैनल का अध्ययन करने के लिए पहले किए गए का उपयोग एलिगेंस कोशिकाओंपैच दबाना 1. तब से, + K, anionic, और cationic गैर चयनात्मक चैनलों (आंकड़े 2 सीई), साथ ही डोपामाइन ट्रांसपोर्टरों पर निर्भर चैनलों सुसंस्कृत सी. में वर्णित किया गया है एलिगेंस 1,18,19,37. इन अध्ययनों सी. के समारोह में आयनिक conductances की भूमिका के बारे में हमारी समझ को उन्नत न्यूरॉन्स एलिगेंस. सुसंस्कृत सी. से आयन चैनल गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए पैच दबाना तकनीक का उपयोग करते समय विचार किया जाना चाहिए कि कुछ संशोधनों के होते हैं कोशिकाओं एलिगेंस. इन संशोधनों के पूरे सेल रिकॉर्डिंग करने के लिए ज्यादातर प्रासंगिक हैं. सबसे पहले, सी. एलिगेंस कोशिकाओं उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स 1-2 माइक्रोन की एक व्यास, छोटे हैं. इस प्रकार, कांच pipettes एक छोटी सी टिप (0.5 माइक्रोन) की आवश्यकता है. लघु विंदुक युक्तियाँ उत्तेजना और रिकॉर्डिंग त्रुटियों में जिसके परिणामस्वरूप, इनपुट प्रतिरोध वृद्धि हुई है. इस समस्या को कम करने के लिए, pipettes एक छोटी सी टिप लेकिन एक विस्तृत कोन है का निर्माण किया जा सकता है. गुडमैन और Lockery एक विधि ईएमपी विकसितइस आकार 38 मोल्डिंग pipettes के लिए एक उच्च दबाव हवा पंप से लैस एक आग पालिशगर loying. दूसरा, कारण कोशिकाओं के छोटे आकार के, सक्शन का उपयोग पूरे सेल पहुँच पाने आमतौर पर सेल को नुकसान में यह परिणाम है. बहुत अधिक सफलता आमतौर पर पिपेट की नोक के तहत झिल्ली के पैच करने के लिए एक उच्च वोल्टेज आवेग (इलेक्ट्रिकल zapping) को लागू करने से हासिल की है. पैच दबाना तकनीक की अन्य विन्यास (संलग्न सेल, बाहर के अंदर और बाहर बाहर) सी. करने के लिए लागू करने के लिए सीधा कर रहे हैं पिपेट की नोक खाते में सी. के छोटे आकार लेने के लिए छोटा किया जाना चाहिए कि केवल संशोधन के साथ, संवर्धित कोशिकाओं एलिगेंस कोशिकाओं एलिगेंस. छिद्रित पैच तकनीक कुख्यात अन्य पैच दबाना तकनीक की तुलना में काफ़ी अधिक श्रमसाध्य और समय है. हालांकि, यह सफलतापूर्वक सी. पर लागू किया गया है इस प्रकार एलिगेंस सीटू 39, 40 में कोशिकाओं और साथ ही संस्कृति में लागू किया जाना चाहिए.
कैल्शियम इमेजिंगतकनीक सी. के लिए आवेदन किया एलिगेंस संवर्धित कोशिकाओं
न्यूरॉन्स और glia में वोल्टेज gated सीए 2 + चैनल (VGCC) के कार्यात्मक भूमिका सुसंस्कृत सी. में जांच की गई है एलिगेंस कैल्शियम इमेजिंग 20, 21, 41 के द्वारा कोशिकाओं. संस्कृति में कैल्शियम इमेजिंग के आवेदन सेल विध्रुवण प्रेरित करने के लिए KCl की उच्च सांद्रता युक्त समाधान की और कैल्शियम चैनल ब्लॉकर्स का उपयोग कैल्शियम बाढ़ के लिए चैनलों के विभिन्न प्रकार के योगदान को विचार करने के लिए अनुमति दी गई है. उदाहरण के लिए, ना + / सीए intracellular कैल्शियम एकाग्रता के लिए 2 + पारगम्य MEC-4 (डी) चैनल का योगदान डिग्री / ENaC चैनल अवरोधक amiloride की उपस्थिति और अनुपस्थिति में Cameleon YC2.12 का उपयोग कैल्शियम इमेजिंग द्वारा निर्धारित किया गया था. उन प्रयोगों एक amiloride के प्रति संवेदनशील कैल्शियम बाढ़ MEC-4 (घ) नहीं, बल्कि जंगली प्रकार स्पर्श न्यूरॉन्स में व्यक्त स्पर्श न्यूरॉन्स में मौजूद है कि प्रदर्शन किया. झिल्ली की permeabilize करने ionophore का प्रयोगन्यूरॉन्स को छूने और Cameleon (आंकड़े 3 ए और बी) को जांचना, Bianchi और उनके सहयोगियों ने भी स्पर्श न्यूरॉन में औसत मुक्त कैल्शियम एकाग्रता 200 एनएम 20 (आंकड़े -3 सी और डी) निर्धारित किया है कि. इसी तरह, Frokjaer-जेन्सेन और उनके सहयोगियों सी. में विध्रुवण प्रेरित कैल्शियम बाढ़ को विनियमित करने में VGCCs EGL -19 और UNC-36 की भूमिका की जांच की एलिगेंस Cameleon 21 व्यक्त mechanosensory न्यूरॉन्स सुसंस्कृत. वे 20 मिमी और 100 मिमी के बीच एक सीमा में कोशिकी + K द्वारा प्रेरित स्पर्श न्यूरॉन्स के विध्रुवण, 17% और 70% के बीच YFP / पाकिस्तानी अनुपात परिवर्तन से पता चला intracellular कैल्शियम की वृद्धि के परिणामस्वरूप. इसके अलावा, कैल्शियम यात्रियों EGL -19 और UNC-36 घाटे में चल समारोह परिवर्तन से कम हो गई थी और VGCCs सी. के excitability में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, सुझाव है कि + कोशिकी 2 सीए के अभाव में नहीं पाया गया एलिगेंस न्यूरॉन्स 21 छूना.
मोटा और Parpura वोल्टेज gated सीए 2 + चैनलों EGL-19, सीसीए -1 और कैल्शियम बाढ़ 41 में योगदान करने में मस्तक sensilla की CEPsh म्यान glia में UNC -2 की भूमिका की जांच की. Intracellular कैल्शियम की गतिशीलता लाल फ्लोरोसेंट मार्कर mCherry और हरे रंग का फ्लोरोसेंट साइटोसोलिक सीए 2 + सूचक GcaMP2.0 सह व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवरों से सुसंस्कृत CEPsh glial कोशिकाओं में विश्लेषण किया गया. GcaMP2.0 प्रतिदीप्ति में वृद्धि से रिपोर्ट में CEPsh glial कोशिकाओं के बहुमत में, झिल्ली विध्रुवण intracellular सीए की KCl प्रेरित वृद्धि 2 + की उच्च बाह्य सांद्रता द्वारा प्रेरित किया. इसके अलावा, कैल्शियम चैनल ब्लॉकर्स CD 2 + और नेमा (nemadipine-ए) के साथ इलाज में काफी कैल्शियम यात्रियों को कम किया. इन आंकड़ों CEPsh glial कोशिकाओं में intracellular कैल्शियम में है कि वोल्टेज निर्भर वृद्धि का समर्थन वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल पर भाग में कम से कम निर्भर करता है. लेखकों, आगे एल प्रकार EGL-1 में intracellular कैल्शियम परिवर्तन का विश्लेषण9rf (समारोह की कमी), टी प्रकार सीसीए-1 और एन, पी / क्यू, आर प्रकार चैनल UNC-2 पीटकर जानवरों और सीए 2 + चैनलों के सभी तीन प्रकार इन glial कोशिकाओं में intracellular कैल्शियम की गतिशीलता में महत्वपूर्ण योगदान निष्कर्ष निकाला है कि . अपरिपक्व स्तनधारी macroglia intracellular सीए 2 + सांद्रता में VGCC निर्भर परिवर्तन के माध्यम से विध्रुवण का जवाब के बाद इस प्रकार,, लेखक निष्कर्ष है कि सी. एलिगेंस CEPsh glial कोशिकाओं कार्यात्मक स्तनधारी macroglia, astrocytes, oligodendrocytes और oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं समान हो सकता है.
सुसंस्कृत सी. पर लागू अन्य तकनीक एलिगेंस भ्रूण कोशिकाओं
प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) सफलतापूर्वक सी. करने के लिए लागू कर दिया गया है विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के साथ और / या माइक्रोएरे विश्लेषण 23,4243 के लिए कोशिकाओं को अलग संस्कृतियों को समृद्ध करने के लिए संवर्धित कोशिकाओं एलिगेंस. पेश किए जाने की जरूरत है कि प्रमुख संशोधनसेल संस्कृति विधि के लिए इस्तेमाल किया सब्सट्रेट के प्रकार था. अजीब बात है और उनके सहयोगियों ने कोलेजन चतुर्थ, पाली एल lysine, fibronectin और laminin सहित विभिन्न substrates परीक्षण किया और कहा कि पाली एल lysine सबसे अच्छा सब्सट्रेट 37 है की स्थापना की. पाली एल lysine बस के रूप में अच्छी तरह से मूंगफली लेक्टिन के रूप में सेल भेदभाव को बढ़ावा देता है, लेकिन मूंगफली लेक्टिन के विपरीत क्षति 36 बिना सब्सट्रेट से कोशिकाओं की टुकड़ी की अनुमति देता है. सी. के कई अलग अलग प्रकार 45 - एलिगेंस कोशिकाओं thermosensory, घ्राण, मोटर और mechanosensory न्यूरॉन्स और glia 23,42 सहित, FACS द्वारा हल किया गया है. सेल लेबलिंग GFP पत्रकारों की अभिव्यक्ति के द्वारा पूरा किया गया है और कुल मिलाकर, छँटाई दक्षता GFP लेबल कोशिकाओं 23 के ऊपर से 90% के अलगाव से अधिक है.
शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) द्वारा जीन मुंह बंद करने के साथ ही संस्कृति में प्राप्त किया जा सकता है. क्रिस्टेनसेन और उनके सहयोगियों ने पता चला है कि GFP-व्यक्त सुसंस्कृत की ऊष्मायनसी. 4 दिनों संस्कृति 1 के लिए डबल असहाय शाही सेना के अलावा के बाद एक अधिक से अधिक प्रभाव के साथ GFP अभिव्यक्ति की काफी कम स्तर के परिणामस्वरूप GFP के खिलाफ dsRNA साथ न्यूरॉन्स एलिगेंस. इसी तरह, Shih और उनके सहयोगियों का प्रदर्शन करने के लिए संस्कृति में आरएनएआई प्रयोग किया जाता है कि सेल्सियस एलिगेंस सिड -1 dsRNA का प्रभाव मध्यस्थता के लिए आवश्यक है और यह संभावना आरएनएआई 46 के प्रणालीगत प्रसार मध्यस्थता के लिए vivo में की जरूरत है. अंत में, सी. में जीन मुंह बंद करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया और प्रभावी तरीकों में से एक है जो आरएनएआई एलिगेंस संस्कृति में लागू किया जा सकता है. इस विधि जिसका पीटकर घातक है या सी. के साथ हस्तक्षेप मुंह बंद जीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सामान्य विकास एलिगेंस.
चित्रा 1. सी. एलिगेंस भ्रूण से पहले और chitinase उपचार के बाद. पूर्व ची के लिए जोखिम के लिए अंडे की (ए) तस्वीरtinase. तीर एक भ्रूण के आसपास के पारदर्शी और बरकरार eggshell. (बी) के अंडे 10 मिनट के लिए chitinase के साथ इलाज के लिए अंक. अनावश्यक कार्य से पचता है और भ्रूण के चारों ओर दिखाई नहीं रह गए हैं. तीर खोल से जारी तीन गुना भ्रूण को इंगित करें. नीले बॉक्स अभी भी एक दूसरे से जुड़े होते हैं कि कोशिकाओं का एक समूह के चारों ओर.
चित्रा 2. संवर्धित सी. एलिगेंस न्यूरॉन्स स्पर्श. सुसंस्कृत सी. (ए) फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ एलिगेंस स्पर्श विशिष्ट प्रमोटर MEC-4 (पी MEC-4 :: GFP) के पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन के तहत GFP व्यक्त न्यूरॉन्स को छूने. (बी) एक स्पर्श न्यूरॉन फ्लोरोसेंट micrographs पी MEC-4 :: GFP (ऊपरी पैनल) व्यक्त acetylated अल्फा ट्यूबिलिन (सिग्मा) के खिलाफ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दाग रहा था, जो एक posttranslationaकेवल 33 स्पर्श न्यूरॉन्स में होता है कि अल्फा ट्यूबिलिन के एल संशोधन. पैच दबाना तकनीक की सेल संलग्न विन्यास में जंगली प्रकार सुसंस्कृत स्पर्श न्यूरॉन्स में दर्ज mechanosensitive चैनलों के 20 से अनुकूलित. (सीई) उदाहरण. चैनल ~ 100 ps की एक प्रवाहकत्त्व है और यह MEC-4 पीटकर जानवर (MEC-4 (u253)) के रूप में अच्छी तरह से अलग स्पर्श न्यूरॉन्स में मौजूद है. ये आंकड़े इस चैनल MEC चैनल 20 नहीं है सुझाव देते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. Cameleon का उपयोग सुसंस्कृत स्पर्श न्यूरॉन्स में मुफ्त intracellular कैल्शियम एकाग्रता का आकलन. 0 मिमी सीए 2 + (में Cameleon YC2.12 व्यक्त सुसंस्कृत स्पर्श न्यूरॉन्स की (ए) pseudocolor छवियों+ EGTA, बाएं) और 10 मिमी CA में 2 + (दाएं). pseudocolor पैमाने अधिकार पर दिखाया गया है. एक permeabilized स्पर्श न्यूरॉन में intracellular कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन के साथ जुड़े (बी) के प्रतिनिधि Cameleon फ्लोरोसेंट परिवर्तन. पिछले रिकॉर्डिंग करने के लिए, कोशिकाओं में कैल्शियम ionophore BR-A23187 (10 माइक्रोन) और मुक्त कैल्शियम (इस मामले में 250 एनएम) के एक परिभाषित एकाग्रता युक्त समाधान में 30 मिनट के लिए incubated रहे थे. Rotenone (10 मिमी) और 2 डिओक्सी डी ग्लूकोज (1.8mm) भी सक्रिय पंप ब्लॉक का हल करने के लिए जोड़ा गया था. न्यूरॉन तब न्यूनतम और अधिकतम प्रतिदीप्ति अनुपात में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए 0 मिमी (5 मिमी EGTA) सीए 2 + और 10 मिमी सीए 2 + युक्त समाधान के साथ perfused किया गया था. 4-7 प्राप्त परिणामों दिखा (सी) Cameleon अंशांकन वक्र जिसका प्रतिदीप्ति परिवर्तन कोशिकाओं 11 विभिन्न मुक्त कैल्शियम समाधान में मूल्यांकन किया गया. प्रत्येक अनुपात परिवर्तन व्यक्ति सेल के लिए अधिक से अधिक अनुपात बदलने के लिए सामान्यीकृत किया गया था. (डी) (बी) में वर्णित के रूप में कम से कम और अधिक से अधिक Cameleon अनुपात में परिवर्तन तो स्थापित किए गए थे. सुसंस्कृत स्पर्श न्यूरॉन्स में आराम कर रही Cameleon अनुपात 22% था ± 7 (एन = 2, 18 कोशिकाओं) अधिकतम अनुपात बदलने की. (सी) में दिखाया गया अंशांकन वक्र के आधार पर इस अनुपात ~ 200 एनएम के एक मुक्त कैल्शियम एकाग्रता से मेल खाती है. 20 से अनुकूलित. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
एलिगेंस विकास, व्यवहार और बुढ़ापे में शामिल आनुवंशिक रास्ते गूढ़ रहस्य के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव है. अपनी सुविधा के लिए मुख्य रूप से यह आनुवंशिक रूप से छेड़छाड़ की जा सकती है जिसके साथ आसानी से और अपने छोटे से जीवन चक्र से उपजा है. अपनी सुविधा के बावजूद, सी. एलिगेंस की अपनी सीमाएं हैं. सी. एलिगेंस कोशिकाओं छोटे और ऐसे माइक्रोएरे विश्लेषण द्वारा जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के रूप में प्रत्यक्ष ऐसी electrophysiological और औषधीय तकनीक के रूप में कोशिकाओं के लिए उपयोग, या विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव की आवश्यकता है कि तरीकों के आवेदन को सीमित करता दबाव छल्ली भीतर तक ही सीमित हैं. सी. एलिगेंस सेल संस्कृति विधि इस मॉडल जीव की सीमाओं के कई लोगों के लिए एक समाधान कर दिया गया है.
इस पांडुलिपि में हम भ्रूण सी. अलग और संवर्धन के लिए एक अद्यतन विधि का वर्णन एलिगेंस बड़े पैमाने में कोशिकाओं क्रिस्टेनसेन से जल्दी काम पर आधारित है और उनके सहयोगियों ने 1. हम ए एल एसओ सी में शारीरिक प्रक्रियाओं और आनुवंशिक आवश्यकताओं अंतर्निहित सेल समारोह के बारे में हमारी समझ को उन्नत किया है कि immunocytochemistry, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और कैल्शियम इमेजिंग सहित विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर प्राप्त प्रकाशित प्रतिनिधि परिणाम की रिपोर्ट एलिगेंस. सुसंस्कृत सी. पर अब तक किए गए कार्य एलिगेंस कोशिकाओं वे सेल विशिष्ट मार्करों 1,18-20,22,23,27,44 की अभिव्यक्ति recapitulating vivo में कर के रूप में वे इन विट्रो में अंतर है कि समर्थन करता है. नहीं सभी प्रकार की कोशिकाओं संस्कृति में विशेषता किया गया है, जबकि काम के इस शरीर सेल संस्कृति विधि की अनुमति देता है पता चलता है कि सी का अध्ययन उनकी पहचान समझौता किए बिना अलगाव में एलिगेंस कोशिकाओं.
प्रोटोकॉल किसी भी प्रयोगशाला में सरल और आसानी से लागू है. सफलतापूर्वक सी. संवर्धन के लिए मन में रखा जाना चाहिए कि हालात एलिगेंस भ्रूण कोशिकाओं निम्नलिखित हैं: 1) पशु सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए उनमें से अधिकांश कि wil तोएल सेल संस्कृति प्रक्रिया के समय में वयस्कों गर्भवती हो. एक भूखे थाली से कीड़ा संस्कृति शुरू एक अच्छा विकल्प है. 2) बैक्टीरिया सी. विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया एलिगेंस सेल संस्कृति के संक्रमण से बचने के लिए पहले कीड़ा सेल को समाप्त करने की आवश्यकता. यह बाँझ पानी की बड़ी मात्रा washes के लिए उपयोग किया जाता है कि सिफारिश की है और जानवरों के रूप में अच्छी तरह से बैक्टीरिया की वर्षा से बचने के लिए गति (नहीं उच्च पर) सुझाव पर centrifuged रहे हैं. दरअसल, ब्लीच युक्त lysis बफर के साथ इलाज एक अपेक्षाकृत बैक्टीरिया मुक्त पशु निलंबन से शुरू, बैक्टीरिया को खत्म करना चाहिए, जबकि सिफारिश की है. उनमें से 80% अपने अंडे जारी किया है ~ जब तक 3) पशु ब्लीच / NaOH के साथ व्यवहार किया जाना चाहिए. छोटी और लंबी ऊष्मायन बार अंडा वसूली की दक्षता को कम करने और क्रमशः अंडे को नुकसान पहुंचा. 4) chitinase द्वारा Eggshell पाचन बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए. ~ अनावश्यक कार्य का 80% पच गया है जब मैनुअल हदबंदी शुरू किया जाना चाहिए. लंबे समय तक और कम incubatकारण क्रमशः, कोशिकाओं को अलग करने की कोशिश में लंबे समय तक और कठोर पुस्तिका हदबंदी की वजह से एंजाइम और नुकसान से प्लाज्मा झिल्ली का प्रत्यक्ष नुकसान के लिए सेल की क्षति, में आयन बार परिणाम दोनों. 5) 5 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सेल निस्पंदन मजबूर नहीं होना चाहिए. फिल्टर भरा हो जाता है, यह कोशिका क्षति से बचने के लिए एक ताजा एक साथ बदला जाना चाहिए.
सुसंस्कृत भ्रूण कोशिकाओं कई मायनों में क्षेत्र में क्रांति ला दी है कि इस तथ्य के बावजूद, वे हर वैज्ञानिक सवाल के जवाब नहीं हैं और अभी भी सीमाएं हैं. उदाहरण के लिए, संस्कृति में व्यक्त जीन कोशिकाओं भ्रूण से अलग कर रहे हैं क्योंकि अधिकतर भ्रूण हैं. Subcellular डिब्बों संस्कृति में सही ढंग से विकास नहीं हो सकता है. उदाहरण के लिए, ऐसे AWA और आंगनवाडी केंद्र के रूप में कुछ amphid संवेदी न्यूरॉन्स की सिलिया के विकास और रखरखाव संस्कृति 44 में ही बह जाता है amphid glia, साथ बातचीत पर निर्भर करते हैं. कोशिकाओं को उनके प्राकृतिक पड़ोसियों खोना और physiologically रिलायंस एनर्जी नहीं बनाते हैंevant सेल करने वाली सेल संपर्क. उदाहरण के लिए, यह कोशिकाओं विद्युत तंग जंक्शनों, या रासायनिक synapses रूप ज्ञात नहीं है कि और अगर वे करते हैं, ये उनकी शारीरिक भागीदारों के साथ होने की संभावना नहीं हैं. इसके अलावा, कोशिकाओं एक एकल सब्सट्रेट, मूंगफली लेक्टिन पर चढ़ाया जाता है. विवो में बाह्य मैट्रिक्स मूंगफली लेक्टिन, laminin, कोलेजन, और fibronectin सहित कई अणुओं की एक जटिल और पुन: पेश करने के लिए मुश्किल मिश्रण होने की संभावना है. इसके अलावा, हो सकता है सेल कार्यों के कुछ प्रकार के लिए आवश्यक बाह्य मैट्रिक्स विशेष. उदाहरण के लिए, mechanosensitive चैनल शरीर को छूने न्यूरॉन्स में व्यक्त की और MEC-4 द्वारा गठित और MEC-10 सब यूनिटों संस्कृति 18 में gated नहीं किया जा सकता, लेकिन तत्काल विवो 47 में gated किया जा सकता है. यह सबसे अधिक संभावना कोशिकी कोलेजन MEC-5 सामान्य रूप से विवो में सीवन कोशिकाओं पड़ोसी द्वारा उत्पादित, संस्कृति 48 में अनुपस्थित है कि इस तथ्य से उपजा है. MEC-5, एक साथ बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन MEC-1 के साथ लंबे समय (1999 ए.ए.एक Kunitz प्रकार डोमेन और दो EGF डोमेन) और कई Kunitz प्रकार डोमेन, EGF दोहराता है और एक glutamic एसिड युक्त डोमेन शामिल हैं जो MEC-9 (एक 834 ए.ए. लंबे प्रोटीन) के साथ प्रोटीन स्पर्श सनसनी के लिए आवश्यक हैं और बाध्य करने के लिए लगा रहे हैं MEC चैनल परिसर के बाह्य डोमेन के लिए और यांत्रिक उत्तेजना के दौरान परिसर पर तनाव gating डालती है.
निष्कर्ष निकालना, सी. एलिगेंस भ्रूण कोशिकाओं इन विट्रो में संवर्धित किया जा सकता है और वे सेल विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति recapitulating अंतर करने के लिए दिखाई देते हैं. कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल सरल है और सेल कल्चर तकनीक में कम से कम अनुभव के साथ किसी भी प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है. मन में इस तकनीक की सीमाओं असर, सेल संस्कृति तरीका हो सकता है और प्रत्यक्ष कोशिकाओं का उपयोग और / या विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव की जरूरत है जब एक शक्तिशाली तकनीक साबित हो गया है. लार्वा से कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल भी हाल ही में विकसित (एन गया हैओटी) यहां 49 में वर्णित है. पूरक के तरीकों के विकास में व्यापक हित सी. बना रही है अंततः जीन समारोह और व्यवहार, विकास या उम्र बढ़ने के बीच की कड़ी को समझने के लिए एक और भी अधिक शक्तिशाली प्रणाली एलिगेंस.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator | |||
References
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