Summary
Descriviamo qui un protocollo riveduto per la cultura su larga scala di embrionale C. elegans cellule. Embryonic C. elegans cellule coltivate in vitro utilizzando questo metodo, sembrano differenziare e ricapitolare l'espressione di geni in maniera specifica cella. Tecniche che richiedono l'accesso diretto alle cellule o l'isolamento di specifici tipi cellulari da altri tessuti possono essere applicati su C. elegans cellule in coltura.
Abstract
C. elegans è un potente sistema modello, in cui le tecniche genetiche e molecolari sono facilmente applicabili. Fino a poco tempo però, tecniche che richiedono l'accesso diretto alle cellule e isolamento di specifici tipi cellulari, potrebbero non essere applicate in C. elegans. Questa limitazione è dovuta al fatto che i tessuti sono confinati all'interno di una cuticola pressurizzato che non è facilmente digeribile mediante trattamento con enzimi e / o detergenti. Basata su lavoro di pioniere da Laird Bloom, Christensen e colleghi 1 sviluppato un metodo affidabile per la coltura di C. elegans cellule embrionali in larga scala. Le uova sono isolati dagli adulti gravide mediante trattamento con candeggina / NaOH e successivamente trattati con chitinase per rimuovere i gusci d'uovo. Le cellule embrionali sono poi dissociate da pipettaggio manuale e piastrati su substrato di vetro ricoperto nei media siero arricchito. Entro 24 ore di celle di isolamento cominciare a differenziare cambiando la morfologia ed esprimendo cellule marke specificars. C. elegans cellule coltivate utilizzando questo metodo sopravvivono superiore 2 settimane in vitro e sono stati utilizzati per elettrofisiologica, immunochimici, imaging analisi così come sono state filtrate e utilizzati per microarray profiling.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un potente organismo modello per studiare le basi molecolari della funzione cellulare, differenziamento, e il comportamento. Mentre il suo genoma, vie metaboliche e biosintetiche sono simili ai vertebrati ', la sua trattabilità genetica e molecolare sono di gran lunga maggiore 2. Tra i suoi vantaggi sono la sua dimensione e semplice anatomia, il suo rapido ciclo di vita (3 giorni a 25 ° C), di breve durata (2 settimane) e il gran numero di figli (> 200). Grazie alla sua natura ermafrodita e breve ciclo di vita, manipolazioni molecolari e genetici sono semplici in C. elegans, compresa la generazione di animali transgenici 3,4 e l'applicazione di tecniche di gene irrisori come RNA interference 5. C. corpo elegans e guscio d'uovo sono trasparenti. Pertanto cellule possono essere facilmente visualizzati sia l'adulto e l'embrione utilizzando microscopia standard. Negli ultimi 40 anni, il C. elegans C. ricerca elegans cui una grande raccolta di mutanti, ko e transgenici, una descrizione dettagliata di anatomia e sviluppo 6,7, compresa la completa ricostruzione del sistema nervoso 8, e un genoma completamente sequenziato che è ben annotato e disponibile per tutta la comunità ( www.wormbase.com ).
Nonostante i numerosi vantaggi, alcuni approcci sperimentali sono stati difficili in C. elegans. Questi includono quelli che richiedono l'accessibilità alla membrana plasmatica delle cellule e l'isolamento di tessuti o tipi cellulari. Infatti C. tessuti elegans sono confinate all'interno della sua pressione scheletro idrostatico, che non è facilmente digerito dal trattamento enzimatico o detergenti. Alla fine degli anni 1990 Miriam Goodman e Janet Richmond pionieri metodi di registrazioni elettrofisiologiche di C. elegansneuroni e cellule muscolari in situ 9,10. Mentre questi metodi ci ha dato importanti intuizioni neuronale e la funzione muscolare in vivo, sono impegnativi e bassa velocità. Erano stati sviluppati metodi alternativi per studiare la funzione delle cellule in vivo, per lo più in particolare nel calcio di imaging in vivo utilizzando sensori di calcio geneticamente codificato come GCamP e cameleon 11-13. Questi metodi, però, non consentono l'utilizzo di strumenti farmacologici poiché applicati su animali viventi intatti.
Il primo tentativo di coltura C. elegans cellule in vitro in grande scala è stata fatta da Laird Bloom durante la preparazione della sua tesi di dottorato di ricerca 14. Purtroppo, le difficoltà incontrate con scarsa adesione delle cellule al substrato, la differenziazione cellulare e la sopravvivenza povero impedito la creazione di questo protocollo presto come metodo di coltura cellulare robusto. Nel 1995 Edgar e colleghi hanno pubblicato una proceduraper indagare la divisione cellulare e la morfogenesi da isolamento e la coltura di una singola C. elegans embrioni 15. Cellule embrionali ottenuti per digestione dei gusci d'uovo con una combinazione di trattamento enzimatico e dissociazione manuale, hanno continuato a proliferare, producendo fino a ~ 500 celle 15. Successivamente, Leung e collaboratori hanno coltivato un piccolo numero di blastomeri di studiare morfogenesi intestinale. Essi hanno dimostrato che uno vitro isolato E blastomere prodotta in cellule intestinali polarizzate che ha creato una struttura analoga a lume intestinale interagendo tra loro attraverso adherens apicali svincoli 16. Buechner e colleghi hanno anche segnalato un metodo simile per la coltura C. elegans cellule embrionali in vitro 17.
Sulla base di questo primo lavoro, Christensen e colleghi hanno sviluppato un protocollo robusto per la coltura embrionale C. elegans cellule in vitro 1. Essiha dimostrato che isolato C. elegans cellule possono differenziarsi in vari tipi di cellule e preservare le caratteristiche che possiedono in vivo, compresa l'espressione di marcatori cellula-specifici. Diverse tecniche che sono impegnativi in vivo, possono essere applicati su isolato C. elegans cellule embrionali. Questi includono elettrofisiologico 1,18 19, imaging e tecniche immunochimiche 20,21, così come l'isolamento di specifici tipi cellulari da cellule fluorescenti-Activated (FACS) per la costruzione di librerie di cDNA cellula-specifici 22,23. Gene knockdown tecniche come RNA interference (RNAi) possono essere applicati su coltura C. elegans celle 1 e un metodo di marcatura metabolica romanzo utilizzando Azido zucchero come strumento per la scoperta glicoproteina è stato recentemente sviluppato per C. coltivate in vitro elegans cellule 24.
In conclusione, il metodo di coltura cellulare espande la matrice of tecniche che possono essere applicate al C. modello elegans nel tentativo di decifrare funzione genica nel contesto di un organismo vivente. Descriviamo qui il protocollo per la coltura di C. elegans cellule embrionali in vitro, che è in gran parte basata sul protocollo prima descritto da Christiansen e colleghi 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Asterischi (*) indicano passaggi nuovi o modificati rispetto alla Christensen et al. 1
1. Setup materiale
- La procedura di coltura cellulare richiede grandi quantità di uova isolato dagli adulti gravide. Crescere C. elegans su 8P piastre di agar seminato con NA22 (disponibile attraverso il C. elegans Consorzio genetica - CGC) batteri per isolare grandi quantità di uova. In queste tavole la quantità di peptone usata è 8 volte l'importo che viene normalmente utilizzato per piastre NGM. La concentrazione peptone superiore sostiene la crescita di batteri NA22 più efficiente, che contrariamente a OP50-, crescere in strati spessi.
8P piatti ricetta:
Sciogliere 3 g di NaCl, 20 g Bacto-Peptone, 25 g di agar in 1 L di acqua distillata sterile e autoclave per 30 min. Lasciare il mezzo raffreddare a 55 ° C e poi aggiungere filtrata sterile 1 ml di colesterolo (5 mg / ml in EtOH), 1 ml di 1 MgCl 2, 1 ml di MgSO4 e 25 ml di tampone KP (Stock di 500 ml: 5 g K 2 HPO 4, 30 g di KH 2 PO 4, pH 6,00). Versare agar liquido in 10 centimetri piastre di Petri (25 ml / piastra).
- Il giorno successivo sviluppa l'intera superficie di ciascuna piastra di agar peptone arricchito con 1 ml di NA22 E. coli overnight coltivate in mezzi 2xYT (16 g di triptone, estratto di lievito 10 g, 5 g di NaCl in 1 L di acqua sterile, pH 7,0) a 37 ° C. Questi batteri costituiscono una fonte di cibo abbondante che formerà uno strato spesso sostenere la crescita di grandi quantità di adulti gravide. Lasciare le piastre seminate notte a temperatura ambiente per consentire la crescita dei batteri. Il processo può essere accelerato mediante incubazione a 37 ° C per 4-5 ore.
- Di trasferire gli animali affamati per seminate 8P piatti. Lavare gli animali fuori un piatto NGM affamato con 5-6 ml di tampone M9 o acqua e aggiungere 1-2 ml di questa sospensione di ogni piatto 8P.
- Consentire la crescita e la moltiplicazione degli animali untIL le piastre sono popolati a confluenza dagli adulti gravide.
- Isolare le uova necessarie per la preparazione di C. elegans cellule embrionali, dagli adulti gravide con 5-6 ml di soluzione di lisi.
Soluzione di lisi ricetta
5 ml di Fresh Bleach, 1,25 ml di NaOH 10 N e 18,5 ml di H 2 O. sterile Questa miscela deve essere preparata fresca prima di ogni utilizzo.
- Lavare le uova isolate dagli adulti gravide con tampone uovo:
Tampone Egg ricetta
118 mM NaCl, KCl 48 mM, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolarità 340 mOsm.
- Rimuovere il guscio che circonda le uova per trattamento con chitinasi. Chitinasi è un enzima con attività massima a pH acido 25. Sciogliere chitinasi (Sigma, catalogo n. C6137) in uovo tampone pH 6,5 ad una concentrazione finale di 2 mg / ml. Conservare il chitinasi magazzinosoluzione a -20 ° C in aliquote da 1 ml a 15 ml provette coniche sterili. Aliquote possono essere conservati a -20 ° C fino a pochi mesi.
- Crescere C. cellule in coltura elegans su vetrini in autoclave (diametro 12 mm) rivestiti di arachidi lectina. Sciogliere arachidi lectina in acqua sterile (0,5 mg / ml). Soluzione lectina Peanut non deve essere filtrata o in autoclave. Inoltre non deve essere trattato con luce UV. Negozio 2 ml aliquote a -20 ° C per 6 mesi.
- Mezzo completo di coltura cellulare (500 ml) contiene 500 ml L-15 terreno di coltura da Gibco, 50 ml di siero fetale bovino (inattivato con il calore), 7,7 g di saccarosio (45 mOsm), 5 ml di 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (2%). Il terreno completo viene quindi filtrato usando un filtro pori 0.20 micron.
Si noti che il buffer uovo e il mezzo di coltura hanno rispettivamente osmolarità di 340 e 345 mOsm. Infatti, contrariamente a cellule di mammifero, C. cellule elegans hanno una relativamente alta osmolaritàche deve essere preso in conteggio quando la preparazione di soluzioni che entreranno in contatto diretto con la membrana plasmatica delle cellule. Le ricette di questi reagenti sono stati adeguati per raggiungere l'osmolarità desiderato, che è stata misurata utilizzando un osmometer 1. Non è necessario usare un osmometer se queste ricette sono seguite esattamente e cura viene utilizzato nella preparazione di questi reagenti. Tuttavia, si dovrebbe utilizzare un Osmoter se altre soluzioni devono essere preparate, le cui ricette non sono riportati qui o in una delle pubblicazioni che utilizzano C. elegans cellule in coltura.
2. Isolamento Egg
- Si consiglia di iniziare con almeno quattro 8P piastre per raccogliere abbastanza uova per 12 pozzetti di cellule in coltura (in piastre da 24 pozzetti).
- Prima di iniziare la procedura di scongelare un tubo di arachidi lectina soluzione stock. Posizionare coprioggetti autoclave al fondo dei pozzetti in una piastra da 24 pozzetti e aggiungere 200 ml di arachidi lectina alle lamelle. Incubare per 1 ora o di uino le cellule sono pronte per essere placcato. Rimuovere completamente i lectina di arachidi e lavare i pozzetti una volta con 1 ml di acqua sterile autoclave. La rimozione completa della lectina arachidi dalle coprioggetti essenziali per evitare aggregazione delle cellule.
- Lavare il numero di adulti gravide al largo delle piastre di agar con acqua autoclave sterile. Raccogliere la sospensione in due sterile conica tubo da 50 ml. Lasciare le provette in ghiaccio per 5 minuti per consentire la precipitazione dei vermi nella parte inferiore dei tubi (*). Rimuovere l'acqua con una pipetta di trasferimento di plastica e sostituirla con acqua fresca autoclave sterile. Pellet worm da tavolo centrifugazione a 200 g (circa 1200 rpm) per 10 minuti (*). Ripetere quest'ultimo passaggio almeno 3.
- Trasferire vermi in un tubo da 15 ml sterile e pellet a 200 g (circa 1200 rpm) per 10 min (*). Non utilizzare maggiore velocità di centrifugazione per evitare di raccogliere i batteri nella parte inferiore del tubo pure. A volte, dopo centrifugazioni i vermi non sono completamente pellet. After ogni lavaggio e prima del ritiro il surnatante, posizionare le provette per 5 minuti in ghiaccio. In refrigerata vermi acqua precipitano sul fondo della provetta.
- Rimuovere l'acqua e aggiungere 5-6 ml di soluzione di lisi (vedi Material istituito). Rock the sospensione delicatamente per 5-10 minuti e poi iniziare il monitoraggio verme lisi con lo stereomicroscopio ogni 2-3 min. Una goccia di sospensione può essere posizionato anche su un vetrino per ispezioni. Il tempo di incubazione varia a seconda della freschezza della candeggina; acquistare piccole bottiglie di candeggina e aprire una nuova bottiglia ogni mese.
- Quando ~ 70-80% di vermi vengono lisate (10 min dall'inizio dell'incubazione), arrestare la reazione di lisi aggiungendo 9 ml di tampone a pH 7.3 uovo (vedi Materiale impostato). Centrifugare la sospensione a 200 g (circa 1200 rpm) per 10 min. Da questo punto in un becco Bunsen su, sul banco per impedire la contaminazione delle uova (*).
- Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta di trasferimento sterile in plastica e lavare il pellet 3-4x con tampone uovo fino a quando la soluzione è limpida. Assicurarsi di mescolare il bene pellet nel buffer uovo durante ogni lavaggio.
- Le uova sono separate dalle carcasse animali usando la soluzione di saccarosio al 30%. Risospendere il pellet in 2 ml di tampone sterile uovo e aggiungere la soluzione di saccarosio 2 ml di 60% (magazzino in tampone uovo sterile). Mescolare bene e centrifugare per 20 minuti a 200 g (circa 1200 rpm) (*).
- Rimuovere con cautela le provette dalla centrifuga. Le uova sono galleggianti nella parte superiore della soluzione. Usando una pipetta P1000 e punte sterili, trasferire tutte le uova in un tubo conico freschi 15 ml sterili.
- Aggiungere 10 ml di tampone sterile uovo al tubo e centrifugare a 200 xg (~ 1.200 rpm) per 10 min. Ripetere il lavaggio 3 x. Assicurarsi che le uova sono completamente risospese in buffer uovo durante ogni lavaggio.
3. Cellule embrionali Dissociazione
Condurre le fasi successive della procedura in condizioni sterili utilizzando una cappa a flusso laminare. Mentre gli animali sonocamice su batteri lastre, i lavaggi e il trattamento con la soluzione di lisi contenente candeggina dovrebbe eliminare la maggior parte se non tutti i batteri. Quindi, usando una cappa laminare a questo punto del procedimento impedisce nuova contaminazione della sospensione uovo.
- Risospendere uova pellet in 1 ml di 2 mg / ml chitinasi (magazzino in uovo tampone a pH 6.5 (*)) e trasferirli in un nuovo tubo da 15 ml sterile. Muovere la provetta per 10-30 minuti a temperatura ambiente. Il tempo esatto di incubazione varia a seconda della freschezza dell'enzima e la temperatura della stanza e dovrebbe quindi essere determinata per ogni preparazione. Si raccomanda di iniziare a monitorare le uova sotto un microscopio coltura cellulare invertita dopo 10 min di incubazione. Nota: nella nostra esperienza, basso pH aumenta l'attività enzimatica chitinasi. Per questo motivo utilizziamo tampone di uovo a pH 6,5 per sciogliere chitinasi (ricetta sopra riportato, dove il pH è regolato a 6,5 con NaOH).
- Quando ~ 80% dei gusci d'uovo sono digeriti daltrattamento chitinasi (Figure 1 AB), agglomerare le uova per centrifugazione a 900 xg (~ 2.500 rpm) per 3 minuti (*). Usando una pipetta P1000 e punte sterili, rimuovere con attenzione il surnatante e aggiungere 3 ml di L-15 (*).
- Trasferire le uova in un piatto del diametro di 6 cm ed dissociare delicatamente le cellule utilizzando una siringa da 10 ml sterile dotata di un ago G 18. Monitorare il grado di dissociazione mettendo una goccia di sospensione in una piastra di Petri di plastica fresco e visualizzazione al microscopio. Non aspirare aria nella siringa durante questa procedura per evitare di danneggiare le cellule. Continuare la dissociazione fino al ~ 80% delle cellule sono dissociato.
- Filtrare la sospensione con una sterile 5 micron filtro Millipore. Le sospensioni cellulari devono essere filtrati per eliminare grumi di cellule, uova non digeriti e larve schiuse. Filtrare supplementari 4-5 ml di fresco L-15 media attraverso il filtro di recuperare tutte le cellule. Non esercitare una forza eccessiva durante la fase di filtrazione per evitare daMaging del filtro e / o le cellule.
4. Coltura di cellule
- Agglomerare le cellule dissociate mediante centrifugazione a 900 xg (~ 2.500 rpm) per 3 minuti (*). Usando una pipetta P1000 e punte sterili rimuovere con attenzione tutto il surnatante. Risospendere le cellule in pellet completo L-15 e la piastra 1 ml / pozzetto. La quantità del mezzo aggiunto dipende dal numero di piastre 8P utilizzato, la confluenza dei vermi sulle piastre, e il tipo di esperimenti che verranno eseguiti sulle cellule. La densità delle cellule può essere determinata utilizzando un emocitometro. Per le registrazioni di patch-clamp placcatura densità di circa 230.000 cellule / cm 2 è ottimale.
- Mantenere la piastra 24 pozzetti in un contenitore Tupperware di plastica contenente asciugamani di carta bagnati per evitare l'evaporazione del terreno di coltura. Conservare il contenitore in un incubatore umidificato a 20 ° C e l'aria ambiente.
- Le cellule sono di solito pronti per gli esperimenti entro 24 ore quando la differenziazione morfologica ed espressoione di marcatori GFP sono completi. Le celle possono essere tenuti in coltura per un massimo di 2 settimane, ma di solito sono più sani fino a 7-9 giorni dopo la placcatura. Il mezzo deve essere sostituito una volta al giorno per mantenere le cellule sane.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. elegans cellule in coltura e differenziare cellule espresso marcatori specifici
Christensen e colleghi utilizzando trypan colorazione blu hanno dimostrato che il> 99% dei embrionale C. cellule elegans sopravvivono alla procedura di isolamento. Al giorno 9 e 22 dopo la placcatura, 85% e 65%, rispettivamente, sono ancora vivi 1. Isolato embrionale C. cellule elegans devono aderire ad un substrato al fine di differenziare. Le cellule che non riescono ad aderire forma grumi e non è chiaro se sopravvivono. Differenziazione delle cellule inizia 2-3 ore dopo la placcatura e continua per ~ 24 hr. Entro 24 ore, le cellule assumono morfologie specifiche. Così, i neuroni inviano processi 1,18-20, cellule muscolari formano strutture allungate simili a dita simili a quelli visti in vivo 1 e cellule canale formare un lume 17. Le caratteristiche morfologiche in vitro sono molto simili a quelli in vivo. Ad esempio, <em> in vitro colture di neuroni tocco ALM e PLM (individuate dalla espressione di PMEC-4 :: GFP) si sviluppano solo due processi neuronali con una più lunga rispetto agli altri, come fanno in vivo 1,20 (Figura 2A). Questo suggerisce che almeno alcuni dei meccanismi molecolari che guidano la differenziazione di C. elegans cellule sono cellule autonome e quindi possono essere ricapitolati in vitro.
Nel 1990, Chalfie aperto la strada all'uso di Green Fluorescent Protein (GFP) in C. elegans di etichettare tipi di cellule in cui un gene di interesse è espressa 26. Il lavoro fatto finora sul colta C. elegans cellule embrionali sostiene che l'espressione di GFP in specifici tipi cellulari può essere riassunta in vitro 1,18-20,27 (Figura 2A). Inoltre il rapporto tra cellule che esprimono GFP in vitro è simile al rapporto presenti in vivo. Ad esempio, unc-4 homeodomain giornalistagene è espresso in 13 motoneuroni embrione maturo (13 su 550 cellule 2,3%) 28,29. Fox e colleghi, contate :: cellule GFP UNC-4 nella cultura e ha scoperto che sono il 2% del numero totale delle cellule 23. Allo stesso modo, UNC-119, una proteina necessaria per la proteina G traffico 30, è espresso in più c. elegans neuroni e alcune cellule muscolari (76% delle cellule nel larva L1 31). Christensen e colleghi hanno riportato che nella cultura unc-119 espressione :: GFP è stata osservata nel 74-76% delle cellule simili a neuroni e cellule muscolari 1. Infine, MEC-4, un meccanosensibili Na + / Ca 2 + subunità del canale necessario per il tocco delicato 32 si esprime in 6 neuroni tocco dell'adulto C. elegans. Di questi sei neuroni touch, quattro (ALMS e PLMs) sono embrionalmente derivati. Così 4 su 550 (0,7%) cellule embrionali dovrebbero esprimere GFP sotto il controllo del promotore mec-4. Infatti, i neuroni culture che esprimono PMEC-4 :: GFP costituiscono ~ 0,5% del numero totale di cellule 18,20.
Marcatori proteici e modifiche post-traduzionali che sono cellule-specifiche possono essere osservati anche in vitro. Ad esempio, alfa tubulina è acetilata solo nei neuroni tocco in C. elegans 33. In vitro, processi di neuroni tocco macchia con un anticorpo sollevata contro acetilato-alfa-tubulina 20 (Figura 2B). Neuroni tocco in coltura esprimono anche il tossico mutante canale MEC-4 (d), che causa la morte dei neuroni tocco in vivo 34. Infatti, GFP che esprimono i neuroni ottenuti da un mec-4 (d); PMEC-4 :: ceppo GFP sono inizialmente presente nella coltura ma poi degenerare 20. Importante, toccare neuroni preparati con mec-4 (d); PMEC-4 :: GFP comportarsi in vitro simile a come si comportano in vivo. Ad esempio, possono essere salvati dalla morte per trattamento con unmiloride e dantrolene, che non risparmia mec-4 (d) tocco i neuroni dalla degenerazione in vivo 20,35. Per concludere, non solo C. elegans cellule embrionali morfologicamente assomigliano cellule in vivo, ma esprimono anche marcatori cellulari specifici e sono presenti nella stessa proporzione sono presenti in vivo. Presi insieme, questi dati sostengono che colta C. cellule elegans costituiscono un buon sistema globale per studiare i processi biologici sia a livello cellulare e molecolare.
Patch-clamp analisi elettrofisiologiche di coltura C. elegans cellule
La tecnica patch-clamp, introdotto dal Sakmann e Neher negli anni Settanta per lo studio dell'attività canali ionici da cellule isolatamente o tessuti può essere applicato a coltura C. elegans celle 36. Christensen ei suoi colleghi sono stati i primi a studiare i canali ionici in coltura C. cellule elegans utilizzandopatch-clamp 1. Da allora, K +, anionici, cationici e canali non selettivi (figure 2 CE), nonché della dopamina trasportatori-dipendenti canali sono stati descritti in colture di C. elegans 1,18,19,37. Questi studi avanzati la nostra comprensione del ruolo delle conduttanze ioniche nella funzione di C. elegans neuroni. Ci sono alcune modifiche che devono essere considerati quando si utilizza la tecnica di patch clamp per registrare l'attività del canale ionico di coltura C. elegans cellule. Queste modifiche sono per lo più pertinenti a cellula intera registrazioni. Primo, C. cellule elegans sono piccole, per esempio, i neuroni hanno un diametro di 1-2 micron. Così, pipette di vetro devono avere una piccola mancia (0,5 micron). Ha piccole pipette aumentano la resistenza di ingresso, con errori di stimolazione e registrazione. Per alleviare questo problema, pipette possono essere costruite in modo da avere una piccola punta ma un ampio cono. Goodman e Lockery sviluppato un metodo employing un lucidatore fuoco dotato di pompa di aria ad alta pressione per pipette stampaggio a questa forma 38. In secondo luogo, a causa delle ridotte dimensioni delle celle, accedere a cellula intera aspi solito provoca danni alla cella. Molto più alto successo viene ottenuto applicando un impulso ad alta tensione (zapping elettrico) al cerotto di membrana sotto la punta della pipetta. Le altre configurazioni della tecnica del patch clamp (cellulare attaccato, inside-out e outside-out) sono semplici da applicare C. elegans cellule in coltura, con l'unica modifica che la punta della pipetta deve essere piccolo per tener conto delle dimensioni di C. elegans cellule. La tecnica del patch perforato è notoriamente più laborioso e richiede tempo rispetto ad altre tecniche di patch clamp. Tuttavia, è stato applicato con successo su C. cellule elegans in situ 39, 40 e quindi dovrebbero essere applicabili nella cultura come bene.
Calcio Imagingle tecniche applicate a C. cellule in coltura elegans
Il ruolo funzionale del voltaggio-dipendenti di Ca 2 + canali (VGCC) nei neuroni e glia è stato studiato in coltura C. elegans cellule di calcio per immagini 20, 21, 41. L'applicazione di calcium imaging in coltura ha permesso l'uso di soluzioni contenenti alte concentrazioni di KCl per indurre depolarizzazione delle cellule e dei calcio-antagonisti discernere il contributo di diversi tipi di canali di ingresso di calcio. Ad esempio, il contributo di Na + / Ca 2 + permeabile MEC-4 (d) canale alla concentrazione di calcio intracellulare è stata determinata mediante calcium imaging utilizzando cameleon YC2.12 in presenza e assenza della DEG / dell'ENaC bloccante dei canali amiloride. Tali esperimenti hanno dimostrato che un calcio afflusso amiloride-sensibile è presente nei neuroni esprimenti tocco MEC-4 (d), ma non in wild type tocco neuroni. Utilizzo ionoforo per permeabilize membrana ditoccare i neuroni e per calibrare cameleon (Figure 3A e B), Bianchi e colleghi hanno anche stabilito che la concentrazione media di calcio gratis in contatto neurone è 200 Nm 20 (Figure 3C e D). Allo stesso modo, Frøkjær-Jensen e colleghi hanno studiato il ruolo della VGCC EGL-19 e UNC-36 nella regolazione depolarizzazione indotta da calcio afflusso in C. elegans colture di neuroni che esprimono mechanosensory cameleon 21. Essi hanno scoperto che depolarizzazione dei neuroni tattili indotte da K + extracellulare in un intervallo tra 20 mM e 100 mM, portato ad aumento del calcio intracellulare rivelata da YFP / CFP variazione di rapporto tra il 17% e il 70%. Inoltre, transienti di calcio sono stati ridotti di EGL-19 e unc-36 mutazioni di perdita di funzione e non sono stati rilevati in assenza di Ca 2 + extracellulare suggerendo che VGCC gioca un ruolo chiave nella eccitabilità di C. elegans toccare i neuroni 21.
Stout e Parpura esaminato il ruolo di voltaggio-dipendenti Ca 2 + canali EGL-19, CCA-1 e UNC-2 in CEPsh guaina glia del sensilli cefalica nel contribuire al flusso di calcio 41. Dinamica del calcio intracellulare sono stati analizzati in CEPsh cellule gliali in coltura provenienti da animali transgenici co-esprimono il rosso fluorescente mCherry marcatore e il citosolico fluorescente Ca 2 + indicatore GcaMP2.0 verde. Nella maggior parte delle cellule gliali CEPsh, depolarizzazione della membrana indotta da alte concentrazioni extracellulari di KCl aumento indotto di Ca2 + intracellulare come riportato da aumento GcaMP2.0 fluorescenza. Inoltre, il trattamento con bloccanti dei canali del calcio Cd 2 + e NEMA (nemadipine-A) ha ridotto in modo significativo i transienti di calcio. Questi dati confermano che la tensione dipendente aumento del calcio intracellulare in cellule gliali CEPsh dipende almeno in parte sui canali del calcio voltaggio-dipendenti. Gli autori, inoltre analizzati i cambiamenti intracellulari di calcio in L-type EGL-19RF (riduzione della funzione), T-tipo CCA-1 e N, P / Q, R-tipo di canale unc-2 animali knockout e ha concluso che tutti e tre i tipi di Ca 2 + canali contribuiscono in modo significativo alle dinamiche di calcio intracellulare in queste cellule gliali . Così, dal macroglia mammiferi immaturi rispondono alla depolarizzazione mediante modifiche VGCC-dipendenti intracellulare Ca 2 + concentrazioni, gli autori concludono che C. cellule gliali elegans CEPsh possono funzionalmente assomigliare macroglia mammiferi, astrociti, oligodendrociti e le cellule precursori degli oligodendrociti.
Altre tecniche applicabili ai colta C. elegans cellule embrionali
Fluorescence-Activated cell sorting (FACS) è stato applicato con successo a C. elegans cellule in coltura per arricchire culture con specifici tipi cellulari e / o per isolare le cellule per l'analisi microarray 23,4243. La modifica principale che doveva essere introdottoal metodo di coltura cellulare era il tipo di substrato usato. Colleghi strane e testati differenti substrati compresi collagene IV, poli-L-lisina, fibronectina e laminina e stabilito che poli-L-lisina è il miglior substrato 37. Poli-L-lisina favorisce la differenziazione cellulare altrettanto bene come arachidi lectina, ma contrariamente alle arachidi lectina permette distacco delle cellule dal substrato senza danni 36. Diversi tipi di C. cellule elegans sono stati ordinati da FACS, tra cui thermosensory, olfattiva, motore e neuroni mechanosensory, e glia 23,42 - 45. L'etichettatura cella è stata compiuta da espressione di giornalisti GFP e in generale, l'efficienza di smistamento è alto con isolamento fino al 90% delle cellule GFP-etichettata 23.
Silenziamento genico da RNA interference (RNAi) può essere realizzato in cultura. Christensen e colleghi hanno dimostrato che l'incubazione di GFP che esprimono coltaC. elegans neuroni con dsRNA contro GFP provocato significativamente ridotto livello di espressione GFP con un effetto massimo 4 giorni dopo aggiunta di RNA a doppio filamento alla cultura 1. Allo stesso modo, Shih e colleghi hanno usato RNAi in cultura per dimostrare che il C. elegans SID-1 è necessaria per mediare l'effetto di dsRNA ed è probabilmente necessaria in vivo per mediare diffusione sistemica di RNAi 46. In conclusione, RNAi che è uno dei metodi più usati ed efficaci per il silenziamento genico in C. elegans possono essere applicati in coltura. Questo metodo può essere utilizzato per geni silenziatori cui knockout è letale o interferisce con C. elegans sviluppo normale.
Figura 1. C. elegans embrioni prima e dopo il trattamento chitinasi. (A) Fotografia di uova prima dell'esposizione a chitinase. La freccia indica il guscio trasparente e intatte che circondano un embrione. (B) le uova trattati con chitinase per 10 min. I gusci d'uovo sono stati digeriti e non sono più visibili attorno agli embrioni. Le frecce indicano embrioni triplice rilasciati dal guscio d'uovo. La scatola blu circonda un gruppo di cellule che sono ancora attaccati l'uno all'altro.
Figura 2. Colta C. elegans toccare i neuroni. (A) al microscopio a fluorescenza di coltura C. elegans toccare i neuroni che esprimono GFP sotto il tocco promotore specifico mec-4 (P mec-4 :: GFP), bar scala a 5 micron. (B) microscopio a fluorescenza di un tocco neurone che esprime P mec-4 :: GFP (pannello superiore), che è stato colorato con un anticorpo monoclonale contro acetilata tubulina alfa (Sigma), un posttranslational modifica di tubulina alfa che si verifica in tocco neuroni solo 33. Adattato da 20. (CE) Esempio di canali mechanosensitive registrati nel wild type colture di neuroni toccare nella configurazione cell-attached della tecnica di patch clamp. Il canale ha una conduttanza di ~ 100 ps ed è presente in tocco neuroni isolati da mec-4 animali knockout (mec-4 (u253)) pure. Questi dati suggeriscono che questo canale non è il canale MEC 20. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Stima della concentrazione di calcio libero intracellulare in neuroni in coltura di contatto con cameleon. (A) PseudoColor immagini di neuroni tocco in coltura che esprimono cameleon YC2.12 a 0 mM Ca 2 + (+ EGTA, a sinistra) e in 10 mM Ca 2 + (a destra). La scala pseudocolore viene mostrato sulla destra. (B) cameleon rappresentativa modifiche fluorescenti associati a cambiamenti nella concentrazione intracellulare di calcio in un tocco neurone permeabilizzate. Prima della registrazione, le cellule sono state incubate per 30 min in una soluzione contenente il calcio ionoforo Br-A23187 (10 mM) e una concentrazione definita di calcio libero (250 nM in questo caso). Rotenone (10 mm) e 2-deossi-D-glucosio (1.8mm) sono stati aggiunti alla soluzione per bloccare le pompe attive. Il neurone è stato poi perfusi con una soluzione contenente 0 mM (+5 mM EGTA) Ca 2 + e 10 mM Ca 2 + per determinare il rapporto cambia fluorescenza massimi e minimi. (C) Cameleon curva di calibrazione che mostra i risultati ottenuti 4-7 celle di cui fluorescenza cambiamenti sono stati valutati in 11 diverse soluzioni di calcio libero. Ogni variazione di rapporto è stata normalizzata per la variazione di rapporto massimo per la singola cella. (D) (B). Il rapporto cameleon riposo in neuroni in coltura tocco era del 22% ± 7 (n = 2, 18 cellule) di variazione di rapporto massimo. Sulla base della curva di calibrazione mostrato in (C) tale rapporto corrisponde ad una concentrazione di calcio libero di ~ 200 nM. Adattato da 20. Clicca qui per ingrandire la figura .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans è un potente organismo modello per decifrare i meccanismi genetici coinvolti nello sviluppo, il comportamento e l'invecchiamento. La sua convenienza deriva principalmente dalla facilità con cui può essere geneticamente manipolato e dal suo ciclo di vita breve. Nonostante la sua convenienza, C. elegans ha i suoi limiti. C. elegans cellule sono minuscole e confinato all'interno di una cuticola pressurizzata che limita l'applicazione di metodi che richiedono l'accesso diretto alle cellule, come le tecniche elettrofisiologiche e farmacologiche, o l'isolamento di specifici tipi cellulari, quali il profilo di espressione genica mediante analisi microarray. La C. Metodo di coltura cellulare elegans è una soluzione a molte delle limitazioni di questo organismo modello.
In questo manoscritto si descrive un metodo aggiornato per isolare e coltura embrionale C. elegans cellule in larga scala basati sul lavoro giovanile di Christensen e colleghi 1. Noi also riportare i risultati rappresentativi pubblicati ottenuti utilizzando una varietà di tecniche tra cui immunocitochimica, elettrofisiologia e di imaging di calcio che hanno avanzato la nostra comprensione dei processi fisiologici e requisiti genetici funzione delle cellule di base in C. elegans. Il lavoro fatto finora sul colta C. elegans cellule sostiene che si differenziano in vitro come fanno in vivo ricapitolare l'espressione di marcatori specifici delle cellule 1,18-20,22,23,27,44. Mentre non tutti i tipi di cellule sono stati caratterizzati in coltura, questo corpo di lavoro suggerisce che il metodo di coltura cellulare permette lo studio di C. cellule elegans in isolamento senza compromettere la loro identità.
Il protocollo è semplice e facilmente applicabile in qualsiasi laboratorio. Cose che devono essere tenuti in considerazione per la coltura con successo C. cellule embrionali elegans sono i seguenti: 1) Gli animali devono essere sincronizzati in modo che la maggior parte di essi will essere gravido adulti al momento della procedura di coltura cellulare. Avvio della cultura verme da una piastra affamato è una buona opzione. 2) I batteri usati per coltivare C. elegans devono essere eliminati prima della verme lisi per evitare la contaminazione della coltura cellulare. Si raccomanda di grandi volumi di acqua sterile sono utilizzati per le lavaggi e che gli animali vengono centrifugati Allo suggerito (non superiore a) velocità di evitare la precipitazione dei batteri pure. Infatti, mentre il trattamento con il tampone di lisi contenente candeggina dovrebbe eliminare batteri, a partire da una sospensione animale relativamente priva di batteri è raccomandato. 3) Gli animali devono essere trattati con candeggina / NaOH fino al ~ 80% di loro hanno rilasciato le loro uova. Tempi di incubazione più brevi e più ridurre l'efficacia del recupero uovo e danneggiano le uova rispettivamente. 4) guscio d'uovo digestione chitinase devono essere attentamente monitorati. Dissociazione manuale dovrebbe essere iniziato quando ~ 80% dei gusci d'uovo è stato digerito. Più lungo e più corto incubatvolte ioni sia risultato nel danno cellulare, a causa di danni diretta della membrana plasmatica dall'enzima e danni causati da prolungata e più dura dissociazione manuale nel tentativo di isolare le cellule, rispettivamente. 5) filtrazione cellulare attraverso il filtro 5 micron non deve essere forzato. Se il filtro è intasato, dovrebbe essere cambiato con uno nuovo per evitare danni cellulari.
Nonostante il fatto che le cellule embrionali in coltura hanno rivoluzionato il campo in molti modi, non sono la risposta per ogni questione scientifica ed ancora hanno dei limiti. Ad esempio, i geni espressi in coltura sono principalmente da cellule embrionali sono isolate da embrioni. Compartimenti cellulari non possono svilupparsi correttamente nella cultura. Ad esempio, lo sviluppo e il mantenimento delle ciglia di certi neuroni sensoriali amphid come AWA e AWC dipendono dall'interazione con glia amphid, che si perde nella cultura 44. Cellule perdono i loro vicini naturali e non fanno fisiologicamente relcellula-cellula contatti Evant. Ad esempio, non è noto se cellule formano giunzioni strette, sinapsi chimici o elettrici e se lo fanno, questi non sono suscettibili di essere con i loro partner fisiologici. Inoltre, le cellule vengono piastrate su un singolo substrato, arachidi lectina. La matrice extracellulare in vivo è probabilmente una miscela complessa e difficilmente riproducibili di molte molecole tra cui arachidi lectina, laminina, collagene e fibronectina. Inoltre, specializzata matrice extracellulare forse necessario per alcuni tipi di funzioni cellulari. Per esempio, il canale meccanosensibili espresso in corpo tocco neuroni e formata da MEC-4 e MEC-10 subunità non può essere sorvegliato in cultura 18, ma può essere facilmente gated in vivo 47. Questo probabilmente deriva dal fatto che il collagene extracellulare MEC-5 normalmente prodotta da cellule vicine cucitura in vivo, è assente nella cultura 48. MEC-5, insieme a proteine della matrice extracellulare MEC-1 (un aa 1999 lungoproteina con un dominio di Kunitz del tipo e due domini EGF) e MEC-9 (a 834 aa proteina lunga che contiene diversi domini Kunitz tipo, ripetizioni EGF e un dominio ricco di acido glutammico) sono necessari per la sensazione tattile e si pensa di impegnare ai domini extracellulari del complesso canale MEC e di esercitare gating tensione sul complesso durante la stimolazione meccanica.
Per concludere, C. cellule embrionali elegans possono essere coltivate in vitro e sembrano differenziarsi ricapitolare l'espressione di geni specifici delle cellule. Il protocollo per l'isolamento e la coltura delle cellule è semplice e può essere applicato in qualsiasi laboratorio con minima esperienza in tecniche di coltura cellulare. Tenendo presenti i limiti di questa tecnica, il metodo di coltura cellulare può essere e ha dimostrato di essere una tecnica potente quando cellule accesso diretto e / o isolamento di specifici tipi cellulari sono necessari. Un protocollo per isolare le cellule di larve è stato recentemente sviluppato (not descritto qui) 49. Diffuso interesse per lo sviluppo di metodi complementari sta facendo C. elegans un sistema ancora più potente per la definitiva comprensione del legame tra funzione del gene e il comportamento, lo sviluppo o l'invecchiamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator | |||
References
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
- Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
- Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
- Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
- Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
- Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
- Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
- Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
- Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
- Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
- Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
- Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
- Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
- Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
- Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
- Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
- Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
- Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
- Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
- Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
- Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
- Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
- Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
- Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
- Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
- O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
- Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).
