Summary
ここでは、胚での大規模培養のための改訂されたプロトコルを記述細胞エレガンス 。胚でエレガンスこの方法を用いてインビトロで培養した細胞は、細胞特異的な様式で遺伝子の発現を区別し、反復するように見える。他の組織から特定 の細胞型の細胞または単離への直接アクセスを必要とする技術は、C.上に塗布することができる培養細胞エレガンス 。
Abstract
C.エレガンスは、遺伝的および分子技術を容易に適用可能な、強力なモデル系である。しかし最近まで、細胞及び特定の細胞型の単離に直接アクセスする必要の技術は、C.に適用できなかった虫 。この制限は、組織が容易に酵素及び/又は界面活性剤で処理することによって消化されない加圧されたキューティクル内に閉じ込められるという事実によるものであった。 1は Cを培養するための堅牢な方法を開発したレアードブルーム、クリステンセンらが先駆者の仕事に基づいて大規模に胚細胞エレガンス 。卵は、漂白/ NaOHで処理することによって妊娠成人から単離し、続いて卵の殻を除去するキチナーゼで処理される。胚細胞は、その後、手動ピペッティングにより分離し、血清富化培地中の基質で覆われたガラス上にプレーティングする。アイソレーション·セルの24時間以内に形態を変更することにより、および細胞特異的マルケを発現させることにより、分化し始めるRS。C.エレガンスこの方法を用いて培養した細胞は、 インビトロで 2週間まで生存し、電気生理学的、免疫のために使用されており、それらはソートされ、マイクロアレイプロファイリングのために使用されているような画像は、同様に解析する。
Introduction
線虫（Caenorhabditis elegans）（虫 ） は、細胞の機能、分化、および行動の分子基盤を調査するための強力なモデル生物である。そのゲノム、代謝および生合成経路は、脊椎動物'に似ていますが、その遺伝的および分子扱いやすには、2はるかに大きい。その利点の中でも、その大きさと単純な解剖学的構造、その迅速なライフサイクル（25℃で3日間）、短寿命（2週）および子孫の大多数（> 200）である。 、その雌雄同体自然と短いライフサイクルに、分子·遺伝子操作は、C言語で簡単ですトランスジェニック動物3,4、およびそのようなRNA干渉5のような遺伝子ノックダウン技術の適用の生成を含む線虫、C.虫体と卵の殻が透明です。従って細胞は、容易に標準的な顕微鏡を使用して、成体および胚の両方で可視化することができる。過去40年間で、C.虫 、C.のための非常に貴重なリソースを作成しました突然変異体、ノックアウトおよびトランスジェニックの大規模なコレクション、神経系8の完全復興を含む解剖学と開発6,7の詳細な説明、よく注釈付きやコミュニティ全体で使用可能な完全に配列ゲノム（含む虫研究 www.wormbase.com ）。
多くの利点にもかかわらず、いくつかの実験的アプローチは、C言語で挑戦してきた虫 。これらは、組織または細胞型の細胞および単離の原形質膜へのアクセス可能性を必要とするものが挙げられる。確かにC。虫の組織は簡単に酵素処理または界面活性剤によって消化されない、その加圧された流体静力学的骨格内に閉じ込められる。 1990年代の終わりに、ミリアム·グッドマンとジャネットリッチモンドでの電気生理学的記録のための方法を開拓した虫その場 9,10 の神経細胞や筋肉細胞。これらの方法は、生体内での神経や筋肉の機能に私たちに重要な洞察を与えたが、彼 らは挑戦的で低スループットである。 インビボで細胞機能を研究するための代替方法は、主に、特に、そのようなGCamPとカメレオン11-13として遺伝的にコードされたカルシウムセンサを用いてインビボカルシウムイメージングでは 、開発した。彼らは無傷で生きている動物に適用されるため、これらの方法は、しかし、薬理学的なツールの使用を許可していない。
培養にて最初の試み大規模な生体外での線虫細胞は、彼の博士論文14の調製時レアード·ブルームによって作られた。残念ながら、基板に対する細胞の接着不良で遭遇する困難は、貧弱な細胞分化および生存は、堅牢な細胞培養法として、この初期のプロトコルの確立を防止する。 1995年にエドガーらは手順を公表単一のCの単離および培養することによって細胞分裂と形態形成を調査する。虫は 15胚。酵素処理と手動解離の組み合わせで卵の殻の消化によって得られた胚細胞は、〜500のセル15までの生産、増殖し続けた。その後、レオンらは腸の形態形成を研究する割球数の少ない培養した。彼らは、1 試験管内孤立のE割球は、頂端接着結合16を介して互いに相互作用することにより、腸管腔に類似した構造を作成した偏腸細胞を生成することを示した。ブフナーらはまた、Cを培養するための同様の方法を報告した。試験管 17 内の胚細胞エレガンス 。
この初期の研究に基づいて、クリステンセンらは、胚のCを培養するための堅牢なプロトコルを開発した。試験管 1 で細胞エレガンス 。彼らその孤立したCが示された。虫細胞は、様々な細胞型に分化し、細胞特異的マーカーの発現を含め、それらがインビボで有する機能を維持することができる。 インビボで挑戦しているいくつかの技術は、単離されたC.上に塗布することができる胚細胞エレガンス 。これらは、電気生理学1,18 19、撮像、免疫化学的技法20,21、ならびに細胞特異的cDNAライブラリーの構築のため22,23（FACS）を蛍光活性化セルソーティングにより特定の細胞型の単離を含む。このようなRNA干渉（RNAi）などの遺伝子ノックダウン技術は、培養されたC.上に塗布することができる虫細胞1および糖タンパク質の発見のためのツールとしてアジド糖を用いて新規な代謝標識法は最近、 インビトロで培養C.ために開発されている虫の細胞24。
結論として、細胞培養法は、アレイを展開oをC.に適用することができるfの技法生体の文脈において遺伝子機能を解読するための努力においてエレガンスモデル 。ここではCを培養するためのプロトコルを記述大部分は最初のクリスチャンセンら1によって記述されたプロトコルに基づいており、in vitroで胚細胞を、 虫 。
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Protocol
クリステンセンらと比較して、アスタリスク（*）は、新規または変更されたステップを示している。1
1。素材のセットアップ
- 細胞培養手順が妊娠成人から単離された卵を大量に必要とする。 Cを育てる卵を大量に分離するために、細菌- エレガンス 8P寒天プレート上NA22（CGC 虫遺伝コンソーシアムを通じて利用可能）を播種。これらのプレートに用いられるペプトンの量は、通常、NGMプレートのために使用される8倍の量である。高いペプトン濃度が厚い層に成長するためにどの反しOP50-、より効率的NA22細菌の成長を支える。
8Pプレートレシピ：
3グラムのNaCl物、20gバクト - ペプトン、30分間の滅菌蒸留水を、オートクレーブ1L中25gの寒天を溶解する。 MgCl 2を 55℃で培地が冷えて、次にコレステロールの滅菌濾過した1ミリリットル（EtOH中5ミリグラム/ ml）を追加し、1の1ミリリットル、MgSO 4を1mlの緩衝液およびKP（500ミリリットルのストック：5gのK 2 HPO 4、30gのKH 2 PO 4、pHは6.00）を25ml。 10センチメートルペトリ皿（25ミリリットル/プレート）内に液体寒天培地を注ぐ。
- 翌日、NA22 E. 1mlの各富化ペプトン寒天プレートの表面全体に広がる2XYTメディア（16グラムトリプトン、10gの酵母エキス、滅菌水、pH7.0の1L中に5グラムのNaCl）、37℃で一晩培養した大腸菌中これらの細菌は妊娠成人の大量増殖を支持する厚い層を形成する豊富な食物源を構成している。細菌の増殖を可能にするために、室温で一晩播種したプレートを残す。プロセスは4-5時間37℃でインキュベートすることによって加速することができる。
- 播種8Pプレートに飢えた動物を転送します。 5-6 M9バッファーまたはmlの水を使用して飢えNGMプレートを動物に洗い落とし、各8Pプレートにこの懸濁液1〜2 mLを加え。
- 動物の成長および増殖をUNT許すILプレートは妊娠大人合流点に移入されます。
- Cの調製に必要な卵を隔離溶解溶液5-6ミリリットル用い妊娠成人からの胚細胞を、 エレガンス 。
溶解液のレシピ
新鮮なブリーチの5ミリリットル、10 N NaOHを1.25ミリリットル及び滅菌H 2 Oの18.5ミリリットルこの混合物は、それぞれを使用する前に新たに調製しなければならない。
- 卵の緩衝液を使用して妊娠成人から分離された卵を洗う。
卵バッファレシピ
118のNaCl、48のKCl、2mMのCaCl 2を 、2mMのMgCl 2、25mMのHepes、pH7.3の、オスモル濃度340ミリオスモル。
- キチナーゼで処理することにより、卵を取り囲んで卵殻を削除します。キチナーゼは酸性pH 25で最大活性を有する酵素である。 2 mg / mlの最終濃度卵緩衝液pH6.5中キチナーゼ（Sigma社、カタログ番号C6137）を溶解する。キチナーゼの在庫を保管無菌15ミリリットル中に1ミリリットルのアリコートで-20℃円錐管での解。アリコートを数ヶ月まで、-20℃までで保存することができる。
- Cを育てるピーナッツレクチンで覆われてオートクレーブしたカバーガラス（直径12mm）上の線虫の培養細胞。滅菌水（0.5 mg / ml）を中にピーナッツレクチンを溶かす。ピーナッツレクチン溶液を濾過またはオートクレーブ処理してはならない。また、UV光で処理する必要がない。最長6ヶ月間-20℃で保存2ミリリットルのアリコート。
- 完全な細胞培養培地（500ml）をGibco社50mlのウシ胎児血清（熱不活化）、7.7グラムのスクロース（45ミリオスモル）、100 U / mlのペニシリンおよび100μg/ml5mlの/から500ミリリットルL-15培地を含有するストレプトマイシン（2％）。完全培地を、次いで、0.20μmのポアフィルターを用いて濾過する。
卵液と培養液をそれぞれ340の浸透圧および345 mOsmであることに注意してください。実際に、哺乳動物細胞に反して、C.虫細胞が比較的高い浸透圧を持っているそれは、細胞の原形質膜と直接接触するソリューションを調製する場合、カウントに入れる必要がある。これらの試薬 のレシピは1浸透圧計を用いて測定した所望の容量オスモル濃度に達するように調整した。なお、これらのレシピは正確に従っているとの注意をこれらの試薬を調製する際に使用される場合、浸透圧計を使用する必要はない。他のソリューションは、そのレシピここで報告されていないか、またはCを使用するパブリケーションのいずれかで、準備する必要がある場合は、1がosmoterを使用する必要があります培養細胞エレガンス 。
2。卵の分離
- これは、（24ウェルプレート）で培養した細胞の12ウェルについて十分な卵を収集するために、少なくとも4 8Pプレートで始めることをお勧めします。
- 手順を開始する前にピーナッツレクチン原液の1のチューブを解凍する。 24ウェルプレートのウェルの底にオートクレーブしたカバーガラスを置き、カバーグラスにピーナツレクチンを200μlを加える。 1時間またはuインキュベート細胞ntilめっきされる準備ができている。完全にピーナッツレクチンを削除し、滅菌オートクレーブ処理水1mlで一度井戸を洗浄します。カバースリップからピーナッツレクチンの完全な除去は、細胞凝集を避けるために不可欠である。
- 無菌オートクレーブ処理水を用いた寒天平板から妊娠成人を洗ってください。 2の滅菌コニカル50ミリリットルチューブにサスペンションを収集します。チューブ（*）の一番下にあるワームの沈殿を可能にするために、最大5分間氷上でチューブを残す。転送プラスチックピペットを用いて水を除去し、新しい滅菌オートクレーブした水と交換してください。 10分（*）のための200 XG（〜1,200 rpm）で卓上型遠心分離によってペレットワーム。少なくとも3この最後の手順を繰り返します。
- 無菌15ミリリットルコニカルチューブにワームを転送し、200×gで10分間（〜1,200 RPM）（*）でそれらをペレット化。だけでなく、チューブの底に菌を収集避けるために、より高い遠心分離速度を使用しないでください。時々、遠心分離後にワームが完全にペレット化されていません。 AFTERは、各洗浄·除去する前に上清を、氷上で5分間チューブを配置します。冷水ワームズチューブの底に沈殿する。
- 水を除去し、溶解液5-6 mLを加え（素材のセットアップを参照してください）。 5〜10分間静かにサスペンションロックしてから2〜3分ごとに実体顕微鏡下でワームの溶解の監視を開始。懸濁液を一滴も容易に検査のためにカバースリップ上に配置することができる。インキュベーション時間は、漂白剤の鮮度が異なることもあり、漂白剤の小瓶を購入し、毎月新しいボトルを開きます。
- 〜ワームの70〜80％が（インキュベーションの開始から10分）を溶解している場合、（素材のセットアップを参照）卵液pH 7.3の9ミリリットルを追加することにより、溶解反応を停止させる。 10分間200×gで（〜1,200 rpm）で懸濁物を遠心分離する。この時点で、オンから卵（*）の再汚染を防止するためにベンチに、上のブンゼンバーナーを有する。
- 注意深く滅菌プラスチックトランスファーピペットを用いて上清を除去し、ペレットを洗浄3-4卵のバッファーでX溶液が透明になるまで。各洗浄中に卵のバッファにペレットをよく混ぜにしてください。
- 卵を30％ショ糖溶液を用いて動物の死体から分離される。無菌卵液2mlにペレットを再懸濁し、60％ショ糖溶液（無菌卵バッファの株式）の2ミリリットルを追加します。よく混ぜると200 XG（〜1,200 RPM）（*）で20分間遠心する。
- 慎重に遠心機からチューブを取り外します。卵は、溶液の上部に浮遊している。 P1000ピペッターおよび滅菌チップを使用して、新しい滅菌15ミリリットルコニカルチューブにすべての卵を移す。
- 10分間200×gで（〜1,200 rpm）で遠心チューブに無菌卵緩衝液10mlを追加します。洗浄を3×を繰り返します。卵は完全に洗浄中に卵の緩衝液に再懸濁していることを確認します。
3。胚細胞解離
層流フードを使用して無菌条件下で手順の次のステップを行っています。動物がいる間細菌プレート上でガウン、漂白剤を含む溶解液で洗浄および治療がないがほとんどすべての細菌を排除する必要があります。したがって手順のこの時点で層流フードを使用して卵懸濁液の新たな汚染を防止する。
- 再懸濁は、2 mg / mlのキチナーゼ（卵液pH 6.5（*）の株式）の1ミリリットル中に卵をペレット化し、新しい滅菌15ミリリットルコニカルチューブに転送。室温で10から30分間、チューブを揺する。正確なインキュベーション時間は、酵素と部屋の温度の鮮度に応じて変化するので、それぞれの調製物について決定されるべきである。これは、インキュベーションの10分後に反転し、細胞培養、顕微鏡下で卵の監視を開始することをお勧めします。注意：我々の経験では、低pHはキチナーゼ酵素活性を増加させる。このような理由から、我々はキチナーゼ（pHはNaOHを用いて6.5に調整した上で報告されたレシピを、）を溶解するためにpH6.5で卵のバッファを使用しています。
- 〜卵の殻の80％はで消化されるとキチナーゼ処理（ 図1-B）は 、900×gで3分間（〜2,500 RPM）（*）で遠心分離して卵をペレット化。 P1000ピペッターおよび滅菌チップを使用して、慎重に上清を除去し、L-15培地（*）の3ミリリットルを追加します。
- 直径6cmプレートに卵を移し、ゆっくりと18 Gの針を装備した10ミリリットルの無菌注射器を用いて細胞を解離する。新鮮なプラスチック製のシャーレにサスペンションのドロップを配置することにより、顕微鏡下で表示することにより、解離度を監視します。細胞の損傷を防ぐために、この手順の間、注射器内に空気を吸引しないでください。細胞の80％が解離して〜まで解離を継続する。
- 滅菌5μmのミリポアフィルターを用いて懸濁液をろ過する。細胞懸濁液は、細胞凝集塊、未消化の卵と孵化した幼虫を除去するためにフィルタリングされなければならない。すべての細胞を回収するためにフィルタを介して新鮮なL-15メディアのさらに4〜5ミリリットルフィルター。 DAを避けるために、濾過工程の間に無理な力を加えないでください。フィルタおよび/または細胞をmaging。
4。細胞を培養
- 3分（*）のために900 XG（〜2,500 rpm）で遠心分離により分離した細胞をペレット化。 P1000ピペッターおよび滅菌チップを使用すると、慎重にすべての上清を除去します。完全なL-15培地とプレート1ミリリットル/ウェルでペレット化した細胞を再懸濁します。添加培地の使用量は、8Pプレートの数、プレート上のワームの合流点、および細胞上で行われる実験の種類に依存する。細胞密度を、血球計数器を用いて決定することができる。 〜23万細胞の密度でプレーティングパッチクランプ記録のために個/ cm 2が最適である。
- 培地の蒸発を回避するために、湿ったペーパータオルを含むプラスチックタッパーウェア容器に24ウェルプレートを保持する。 20℃、周囲の空気の加湿インキュベーターで容器を保管してください。
- 際形態的分化と発現する細胞は、24時間以内に通常の実験のための準備ができているGFPマーカーのイオンが完了している。細胞は、最大2週間培養中に保持することができるが、それらは播種後、通常7〜9日までの最も健康である。媒体は、健康な細胞を維持するために一日一回交換する必要がある。
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Representative Results
C.は、培養細胞が分化し、細胞特異的マーカーを発現する線虫
トリパンブルー染色を用いてクリステンセンらは、胚での> 99％を示した虫細胞が単離手順を生き残る。 9日目と22めっき後、それぞれ85％と65％は、まだ1生きている。孤立した胚で虫細胞は、区別するために、基板に接着しなければならない。フォーム塊を接着する失敗し、それは彼らが生き残るかどうかは明らかではない細胞。細胞の分化は、めっき後2〜3時間を開始し、〜24時間続く。 24時間以内に、細胞は、特定の形態を取る。したがって、ニューロンはプロセス1,18-20を送り出す、筋細胞が内腔17を形成インビボ 1と管細胞において見られるものと同様の指のような細長い構造を形成する。 in vitroでの形態学的特徴は、 生体内でのものと非常に類似している。例えば、<EM> in vitroで培養し、ALMおよびPLMタッチ彼らは生体 1,20（ 図2A） でそうであるように（PMEC-4 :: GFPの発現によって識別される）ニューロンは、他よりも長い1のみ2の神経プロセスを開発。これは、C.の分化を駆動する分子メカニズムのうちの少なくともいくつかを示唆している虫細胞は細胞自律的であり、したがって、 インビトロでで要約することができる。
1990年代に、チャルフィーはCの緑色蛍光タンパク質（GFP）の使用を開拓目的の遺伝子は26発現される細胞型を標識するエレガンス 。培養されたCに、これまでに行われた作業エレガンス胚細胞特異的な細胞型におけるGFPの発現は、インビトロ 1,18-20,27（ 図2A） 内で要約することができることを支持する。さらに、インビトロで GFPを発現する細胞の割合は、 インビボで見出さ比と同様である。たとえば、UNC-4ホメオレポーター遺伝子は、成熟した胚（13 550のセル-2.3％）28,29中13運動ニューロンに発現している。フォックスらは、培養中のUNC-4 :: GFP細胞を数え、それらが細胞23の総数の2％であることがわかった。同様に、UNC-119、Gタンパク質トラフィッキング30に必要なタンパク質は、ほとんどのCで表される。ニューロンおよびいくつかの筋細胞（L1幼虫31中の細胞の76％） エレガンス 。クリステンセンらは、培養中UNC-119 :: GFPの発現が神経細胞や筋肉細胞1に似た細胞の74から76までパーセントで観察されたことを報告した。最後に、MEC-4、優しいタッチ32のために必要な機械受容のNa + / Ca 2 +のチャネルサブユニットは、成人で 6タッチニューロンで発現される虫 。これらの6つのタッチニューロンの、4（のALMおよびPLMは）は、胚由来である。このようにして、4の550（0.7％）、胚細胞は、MEC-4プロモーターの制御下でGFPを発現すべきである。実際、culturのニューロンPMEC-4 :: GFPを発現eは細胞18,20の総数の約0.5％を構成する。
タンパク質マーカーおよび細胞特異的である翻訳後修飾はまた、インビトロで観察することができる。たとえば、アルファチューブリンだけでタッチニューロンでアセチル化されている虫 33。 インビトロ 、タッチニューロンのプロセスは、アセチル-α-チューブリン20（ 図2B）に対する抗体で染色。培養されたタッチ·ニューロンはまた、生体内 34 でのタッチニューロンの死を引き起こす有毒な変異体チャネルMEC-4（D）を発現する。確かに、MEC-4（D）から調製された神経細胞をGFP発現; PMEC-4 :: GFP株を最初に培養物中に存在しているが、その後20縮退 。重要なのは、MEC-4（D）から調製した神経細胞を接触させます。PMEC-4 :: GFPは 、同様に、彼らは、生体内でどのように動作するかをin vitroで動作します。例えば、それらは、で処理することにより死から救出することができる生体 20,35 における変性からMEC-4（D）タッチニューロンを惜しみmilorideとダントロレン、。結論としてだけでなく、C.エレガンス胚細胞は、形態学的にインビボで細胞に似ているが、それらはまた、細胞特異的マーカーを発現し、それらがin vivoで存在するものと同じ割合で存在する。まとめると、これらのデータをサポートする培養されたC.虫細胞は、細胞および分子レベルでの両方の生物学的プロセスを研究するための全体的に良好なシステムを構成している。
培養されたCのパッチクランプ電気生理学的解析虫の細胞
単独でまたは組織中の細胞からのイオンチャネル活性の研究のために70年代ザクマンとネエルによって導入されたパッチクランプ技術は、培養されたC.に適用することができる虫の細胞36。クリステンセンらは、培養されたCのイオンチャネルを研究した最初の使用した線虫細胞パッチクランプ1。それ以来、K +、アニオン性、カチオン性及び非選択的チャネル（ 図2 CE）、ならびにドーパミン輸送体依存性チャネルは、培養されたC.に記載されている虫 1,18,19,37。これらの研究は、Cの関数内のイオンコンダクタンスの役割の理解を進めたニューロンエレガンス 。 C.培養からのイオンチャネル活性を記録するパッチクランプ技術を使用するときに考慮する必要があるいくつかの変更がある細胞エレガンス 。これらの変更は、全細胞記録に主に関連しています。まず、C.虫細胞 、例えば、ニューロンは1-2ミクロンの直径を有し、小さい。これにより、ガラスピペットは、小さなチップ（0.5μm）を持っている必要があります。小さなピペットチップは、刺激と記録誤差が生じ、入力抵抗を大きくしてください。この問題を軽減するために、ピペットチップは、小さなしかし広い円錐を有するように構成することができる。グッドマンとLockeryは、メソッドEMPを開発この形状38に成形ピペット用高圧空気ポンプを備えた火災研磨をloying。第二に、細胞の小さなサイズのために、吸引を使用して、全細胞のアクセスを獲得することは通常、細胞に損傷をもたらす。はるかに高い成功は、通常、ピペットの先端の下で、膜のパッチに高電圧インパルス（電気ザッピング）を適用することによって達成される。パッチクランプ技術（細胞取り付けられ、アウト内側と外側アウト）の他の構成はC.への適用が簡単であるピペットの先端を考慮にCの小さなサイズを取るために小さくすべきである唯一の変更で、培養細胞エレガンス細胞エレガンス 。穿孔パッチ技術は、悪名高い他のパッチクランプ技術よりも消費するより手間と時間です。しかしながら、正常C.上に適用されている虫細胞、その場 39、40 にあるので、同様に文化の中で適用可能であるべきである。
カルシウムイメージングCに適用される技術培養細胞エレガンス
ニューロンおよびグリアにおける電位依存性Ca 2 +チャネル（VGCC）の機能的役割は、培養されたC.検討されているカルシウムイメージング20、21、41で細胞エレガンス 。培養物中のカルシウムイメージングの適用は、細胞の脱分極を誘導するために高濃度のKClを含有する溶液のカルシウムチャネル遮断薬の使用は、カルシウム流入チャンネルの異なるタイプの寄与を識別することを可能にした。例えば、のNa + / Caの細胞内カルシウム濃度に対する2 +透過性MEC-4の（d）は、チャネルの寄与は、DEG / ENaCのチャネル遮断薬アミロライドの存在下および非存在下でカメレオンのYC2.12を用いたカルシウムイメージングにより決定した。これらの実験は、アミロライド感受性カルシウム流入は、MEC-4（d）にではなく、野生型タッチニューロンにおけるタッチを発現する神経細胞内に存在することを実証した。の膜を透過するイオノフォアを使用して神経細胞に触れるとカメレオン（ 図3AおよびB）を校正するために、ビアンキらは、タッチニューロンの平均遊離カルシウム濃度は200 nMで20（ 図3CおよびD）であることが判明しました。同様に、Frokjaer -ジェンセンらは、Cで脱分極誘発性カルシウム流入を調節するVGCCs EGL-19とUNC-36の役割を調べた虫はカメレオン21を表現する機械刺激ニューロンを培養した。彼らは、20mMと100mMの間の範囲内、細胞外K +によって誘発されるタッチニューロンの脱分極は、17％と70％との間のYFP / CFP比変化によって明らかに細胞内カルシウムの上昇をもたらしたことを見出した。また、カルシウムトランジェントは、EGL-19とのunc-36欠損機能変異によって減少しVGCCsはC.の興奮性に重要な役割を果たすことを示唆している細胞外Ca 2 +の非存在下で検出されなかった虫の神経細胞21をタッチします。
スタウトとParpuraはカルシウム流入41に貢献頭部感覚器のCEPsh鞘グリアにおける電位依存性Ca 2 +チャネルEGL-19、CCA-1およびUNC-2の役割を調べた。細胞内カルシウム動態は、赤色蛍光マーカーmCherryおよび緑色蛍光細胞質ゾルのCa 2 +指示薬GcaMP2.0を共発現するトランスジェニック動物由来の培養CEPshグリア細胞で分析した。 CEPshグリア細胞、GcaMP2.0蛍光の上昇によって報告された細胞内Ca 2 +の塩化カリウム誘導性増加の高い細胞外濃度によって誘発される膜の脱分極の大部分で。また、カルシウムチャネル遮断薬のCd 2 +およびNEMA（nemadipine-A）を用いた治療が大幅にカルシウムトランジェントを減少させた。これらのデータは、CEPshグリア細胞における細胞内カルシウムの上昇が電圧依存性電位依存性カルシウムチャネルに少なくとも部分的に依存することを支持する。著者らは、さらにL型EGL-1の細胞内カルシウムの変化を分析し9rf（機能の低下）、T型CCA-1、N、P / Q、R型チャネルのunc-2ノックアウト動物およびCa 2 +チャネルの3つのタイプは、これらのグリア細胞における細胞内カルシウム動態に有意に寄与すると結論。未熟哺乳類大膠細胞は細胞内Ca 2 +濃度のVGCC依存性の変化を経由して脱分極に応答するため、このように、著者らは、C.と結論虫 CEPshグリア細胞は、機能的には、哺乳類大膠細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞に似ていることがあります。
培養されたCに適用可能な他の技術虫胚細胞
（FACS）を蛍光活性化細胞ソーティングC.正常に適用されている特定の細胞型で培養物を富化する及び/又はマイクロアレイ分析23,4243ために細胞を単離するために培養細胞エレガンス 。導入されるために必要な主な変更細胞培養法に用いられる基板の種類であった。奇妙らは、コラーゲンIV、ポリ-L-リジン、フィブロネクチンおよびラミニンを含む様々な基質を試験し、ポリ-L-リジンは、最良の基板37であることを確立した。ポリ-L-リジンは、全く同じようにピーナッツレクチンなどの細胞分化を促進するが、ピーナッツレクチンとは逆に、損傷36なく基板からの細胞の剥離を可能にする。 C.いくつかの異なる種類の45 - エレガンス細胞はthermosensory、嗅覚、モータと機械刺激、ニューロン、およびグリア23,42を含め、FACSでソートされている。細胞標識は、GFPレポーターの発現によって達成されており、全体的な、選別効率をGFP標識細胞23の90％までの単離と高い。
RNA干渉（RNAi）による遺伝子サイレンシングは同様に培養で達成することができる。クリステンセンらはのインキュベーション培養し、GFPを発現することを示したC.は、GFPに対するdsRNAで神経細胞が4日間の文化1に二本鎖RNAを添加した後に最大効果でGFPの発現が有意に減少したレベルになった虫 。同様に、シーズーらは証明するために、培養中のRNAiを使用したことでエレガンス SID-1は、dsRNAの効果を媒介するために必要とされる、それは可能性のRNAi 46の全身拡散を媒介するためにインビボで必要とされる。結論として、Cの遺伝子サイレンシングのための最も使用されると効果的な方法の一つであるのRNAi エレガンスは、培養で適用することができる。この方法は、そのノックアウト致死的であるか、C.干渉するサイレンシング遺伝子を使用することができる正常な発達エレガンス 。
図1。 でキチナーゼ処理前後の線虫胚 。前カイへの暴露に卵の（A）の写真tinase。胚を取り巻く透明無傷の卵殻にある矢印をポイントします。10分間キチナーゼで処理された（B）の卵。 卵の殻は消化されず、胚中心に、もはや表示されてきた。矢印は、卵殻から放出された3倍の胚を指す。青いボックスは、まだ相互に結合しているセルのグループを取り囲んでいる。
図2。培養したC.タッチニューロンエレガンス 。培養されたCの （A）蛍光顕微鏡写真虫タッチ特異的プロモーターMEC-4（P MEC-4 :: GFP）、スケールバーは5μm下にGFPを発現する神経細胞をタッチします。（B）タッチニューロンの蛍光顕微鏡写真は、P MEC-4 :: GFP（上のパネル）を発現する、アセチル化アルファチューブリン（シグマ）に対するモノクローナル抗体で染色した、posttranslationaわずか33タッチニューロンで発生するアルファチューブリンのL修正。パッチクランプ法のセルに接続された構成では、野生型培養されたタッチニューロンに記録されている機械受容チャネルの20から適応。（CE）の例。チャネルは、約100ピコセコンドのコンダクタンスを有しており、MEC-4ノックアウト動物（MEC-4（u253））並びにから単離されたタッチニューロンに存在する。これらのデータは、このチャネルがMECチャンネル20ではありませんお勧めします。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図3。カメレオンを用いて培養タッチニューロンにおける自由な細胞内カルシウム濃度の推定。 0のCa 2 +（中カメレオンのYC2.12を発現する培養されたタッチニューロンの（A）擬似カラー画像+ EGTA、左）と10のCa 2 +（右）。擬似カラースケールが右側に表示されます。透過化タッチニューロンの細胞内カルシウム濃度の変化に関連した（B）代表カメレオン蛍光変化。記録の前に、細胞をカルシウムイオノフォアのBr-A23187（10μM）および遊離カルシウム（この場合は250 nM）での規定された濃度を含有する溶液中で30分間インキュベートした。ロテノン（10mM）および2 - デオキシ-D-グルコース（1.8mm）を、活性ポンプを遮断するように溶液に添加した。ニューロンは、最小および最大蛍光比の変化を決定するために、0 mMの（+5 mMのEGTA）のCa 2 +及び10mMのCa 2 +を含有する溶液で灌流した4-7から得られた結果を示す（C）カメレオン較正曲線その蛍光の変化の細胞を11の異なる遊離カルシウム溶液中で評価した。各比変化は、個々のセルのための最大比変化に対する正規化した。（D） （B）に記載のように最小と最大カメレオン比変更は、確立された。培養されたタッチニューロンにおける休止カメレオン比は、最大比変化の22％±7（n = 2の18細胞）であった。 （C）に示した検量線に基づいて、この比は、約200nMの遊離カルシウムの濃度に相当する。 20から適応。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
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Discussion
線虫は、開発、行動や老化に関与する遺伝的経路を解読するための強力なモデル生物である。その利便性は、主にそれが遺伝子操作することができる容易さから、その短いライフサイクルから生じる。その便利さにもかかわらず、C.虫には限界があります。 で虫細胞は、そのような小さな電気生理学的及び薬理学的技術、またはこのようなマイクロアレイ解析による遺伝子発現プロファイルのような特定の細胞型の単離のような細胞への直接アクセスを必要とする方法の適用を制限する加圧されたキューティクル内に閉じ込められている。 C.虫細胞培養法は、このモデル生物の制限の多くを解決するあった。
本稿では、我々は、胚Cを分離して培養するための更新された方法を記載しているクリステンセンら1によって初期の作品に基づいて大規模に虫細胞 。私たちALSO免疫細胞化学、電気生理学およびC.における細胞機能の基礎となる生理学的プロセスおよび遺伝的要件の理解を進めてきたカルシウムイメージングを含む様々な技術を用いて得られた代表的な公開された結果を報告する虫 。培養されたCに、これまでに行われた作業虫細胞 、それらがin vivoで細胞特異的マーカーの発現をrecapitulatingないように、それらがインビトロで分化することを支持する1,18-20,22,23,27,44。全ての細胞型は、培養において特徴付けられてきたが、仕事のこのボディは、細胞培養法は、C.の研究を可能にすることを示唆している自分のアイデンティティを損なうことなく、単独で細胞エレガンス 。
プロトコルは、シンプルでどんな実験室で容易に適用可能である。首尾での培養の際に留意する必要があるもの虫胚細胞は、以下の通りである：1）動物同期させる必要があり、それらの大半はウィルようlが、細胞培養手順の際に大人妊娠する。飢えたプレートからワームの文化を起動すると、適切なオプションです。 2）細菌はCを成長させるために使用エレガンスは、細胞培養物の汚染を避けるために前にウォーム溶解を排除する必要がある。これは、滅菌水、大量の洗浄のために使用することを推奨し、動物が同様に細菌の沈殿を避けるために、速度（高くないで）を提示で遠心分離される。確かに、漂白剤を含む溶解緩衝液を用いた治療は比較的無菌動物懸濁液から開始し、細菌を排除する必要があり、一方が推奨されます。 3）動物は、そのうちの80％が自分の卵をリリースしている〜になるまで漂白/ NaOHで処理する必要があります。短いおよび長いインキュベーション時間は、卵回収効率を低下させ、それぞれの卵を損傷する。 4）キチナーゼによる卵殻消化は綿密に監視する必要があります。卵の殻の約80％が消化されたときに手動解離が起動する必要があります。長短incubatにより、それぞれの細胞を単離する試みにおいて長時間過酷な手動及び解離によって生じる酵素と損傷による細胞膜の直接的な損傷に対する細胞損傷のイオン回の結果の両方。 5）5μmのフィルターを介して細胞濾過を強制すべきではありません。フィルタが詰まった場合、それは細胞の損傷を避けるために新しいものに変更されるべきである。
培養された胚細胞は、多くの点で、フィールドに革命をもたらしているという事実にもかかわらず、彼らはすべての科学的な質問には答えていない、まだ限界がある。細胞は、胚から単離されているので、例えば、培養物中で発現される遺伝子は、主に胚である。細胞内コンパートメントは、文化の中で正しく発達しないことがあります。例えば、このようなAWAやAWCなどの特定amphid感覚ニューロンの繊毛の開発と保守を、培養44で失われamphidグリア、との相互作用に依存しています。細胞は、その自然な隣人を失い、生理的にRELことはありませんエバント細胞間の接点。例えば、細胞は、電気的密着結合、又は化学的シナプスを形成するかどうかは知られておらず、彼らが行う場合、これらは、それらの生理学的パートナーとなりやすいものではない。さらに、細胞は、単一の基板、ピーナッツレクチン上でプレーティングする。 インビボでの細胞外マトリックスは、ピーナッツレクチン、ラミニン、コラーゲン、およびフィブロネクチンを含む多くの分子の混合物を再現するための複雑かつ困難である可能性が高い。また、多分細胞機能の特定の種類に必要な細胞外マトリックスを特化。例えば、機械受容チャネルはボディタッチニューロンに発現し、MEC-4によって形成され、MEC-10のサブユニットは、文化18でゲートさすることはできませんが、容易に生体内 47 にゲートさすることができます。これは、おそらく、細胞外コラーゲンMEC-5 インビボで通常シーム隣接細胞によって産生さは、培養48には存在しないという事実から生じる。 MEC-5、一緒になって、細胞外マトリックスタンパク質MEC-1（1999アミノ酸長クニッツ型ドメインと2 EGFドメインを持つタンパク質）およびMEC-9（834アミノ酸長、いくつかのクニッツ型ドメインを含むタンパク質、EGF繰り返しおよびグルタミン酸リッチドメイン）は、タッチの感覚のために必要とされており、結合すると考えられているMECチャネル複合体の細胞外ドメインに及び機械的刺激の間に複合体に張力をゲーティング発揮する。
締結する、C.エレガンス胚細胞をインビトロで培養することができ、それらは、細胞特異的遺伝子の発現をrecapitulating分化するように見える。細胞の単離および培養のためのプロトコルは単純であり、細胞培養技術における最小の経験を持つ任意の実験室で適用することができる。を念頭に、この技術の限界、細胞培養法はあることができ、直接細胞にアクセスおよび/または特定の細胞型の単離が必要な場合に強力な技術であることが証明されている。幼虫から細胞を単離するためのプロトコルは、最近開発されている（nは49）ここで説明するOT。補完的な方法の開発に広く関心がCを作っている最終的には、遺伝子の機能と動作、開発や老化との間のリンクを理解するための、より強力なシステムエレガンス 。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator | |||
References
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