Summary
우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.
Abstract
C. elegans의 유전 및 분자 기술에 쉽게 적용되는 강력한 모델 시스템이다. 최근까지, 비록 세포와 특정 세포 유형의 분리에 대한 직접 액세스를 요구하는 기술은, C.에 적용 할 수 없었다 엘레. 이 제한은 조직이 쉽게 효소 및 / 또는 세제로 처리하여 분해되지 않은 가압 표피 내에 국한된다는 사실 때문이었다. 레어드 꽃, 크리스텐슨과 1 C.을 배양하기위한 강력한 방법을 개발 동료에 의해 초기 개척자의 작업을 바탕으로 큰 규모의 배아 세포 엘레 간스. 계란은 표백제 / NaOH로 처리하여 임신하는 성인에서 분리하고 이후에 달걀 껍질을 제거하는 키틴으로 처리됩니다. 배아 세포는 다음 수동 피펫에 의해 해리와 혈청 풍부한 미디어 기판 덮인 유리에 도금되어있다. 아이솔레이션 셀 24 시간 이내에 형태를 변화시킴으로써 세포를 발현하는 특정 마르크 의해 구별하기 시작할RS. C. 엘레이 방법을 사용하여 배양 된 세포는 체외에서 2 주까지 생존 및 전기 생리학, 면역에 사용 된, 그들은 정렬 및 마이크로 어레이 프로파일에 사용 된 같은 영상도 분석한다.
Introduction
예쁜 꼬마 선충 (C. elegans의)는 세포 기능 분화 및 동작의 분자 기초를 조사하기위한 강력한 모델 생물이다. 게놈, 신진 대사와 생합성 경로는 척추 동물과 유사하지만, 유전 및 분자 온순함 2 훨씬 크다. 장점 중의 크기와 간단한 해부학, 급속한 수명주기 (25 ° C에서의 3 일), 짧은 수명 (2 개월)과 자손의 많은 수 (> 200)이다. 그것의 자웅 동체 자연과 짧은 수명주기에, 분자 및 유전자 조작은 C로 간단합니다 형질 전환 동물 3,4와 같은 RNA 간섭과 같은 5 유전자 녹다운 기술의 애플리케이션의 생성 등의 elegans. C. 엘레 몸 껍질은 투명합니다. 따라서 세포는 쉽게 성인 및 표준 현미경을 사용하여 난자에 시각화 될 수있다. 지난 40 년 동안, C. 엘레 C.를위한 귀중한 자원을 만들었습니다 돌연변이, 녹아웃 및 형질 전환의 큰 컬렉션, 신경계 (8)의 전체 복원 등의 해부학과 개발 6,7에 대한 자세한 설명, 잘 주석과 공동체 전체에 사용할 수있는 완전히 시퀀스 게놈 (포함 엘레 조사 www.wormbase.com ).
많은 장점에도 불구하고, 몇 가지 실험 방법은 C에 도전 한 엘레. 이러한 조직 또는 세포 유형의 세포 및 아이솔레이션의 원형질막에 액세스를 필요로하는 것들을 포함한다. 실제로 C. 엘레 조직은 쉽게 효소 처리 또는 세제에 의해 소화되지 않는 그 압력 수압 골격 내에 국한된다. 1990 년대 말에 미리 암 굿맨과 자넷 리치먼드 C.의 전기 생리학 녹음하는 방법을 개척 엘레현장 9,10에있는 신경 세포와 근육 세포. 이러한 방법은 우리에게 신경 및 생체 내에서 근육의 기능에 중요한 통찰력을 준 반면, 도전과 낮은 처리량이다. 생체 내에서 세포의 기능을 연구하는 다른 방법은 대부분, 특히 같은 GCamP과 카멜레온 11-13로 유전자 인코딩 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징, 개발했다. 그들이 그대로 살아있는 동물에 적용되기 때문에 이러한 방법은 그러나, 약리학 적 도구의 사용을 허용하지 않는다.
배양 C.의 첫 번째 시도 대규모 체외에서 elegans의 세포는 자신의 박사 학위 논문 (14)의 준비 기간 동안 레어 꽃에 의해 만들어졌다. 불행히도, 어려움이 기판에 세포 접착 불량으로 발생한 불량 세포 분화 및 생존은 강력한 세포 배양 방법으로 초기 프로토콜의 설립을 방지. 1995 년 에드가와 동료 절차를 출판단일 C의 분리 및 배양 세포 분열 형태 형성을 알아보고자 하였다. 엘레 15 배아. 효소 처리 및 수동 해리의 조합으로 달걀 껍질의 소화하여 얻은 배아 세포는 ~ 500 세포를 15까지 생산, 증식을 계속했다. 그 후, 양조위와 동료 장 형태 형성을 연구하는 할구의 작은 숫자를 배양. 그들은 하나의 체외 격리 E의 할구가 혀끝있는 adherens 접속점 (16)를 통해 서로 상호 작용에 의해 장 루멘과 유사한 구조를 만든 편광 장 세포를 생산 것을 보여 주었다. Buechner와 동료는 또한 배양 C에 대한 유사한 방법을보고했다. 관내 17 배아 세포 엘레 간스.
초기 작업을 바탕으로, 크리와 동료 배아 C를 배양하기위한 강력한 프로토콜을 개발했다. 엘레 체외 1 세포. 그들그 고립 C를 보였다. 엘레 세포는 다양한 세포 유형으로 분화 및 세포 특정 마커의 발현을 포함하여 그들은 생체 내에서 소유 기능을 유지할 수있다. 생체 내에서 도전하고 몇 가지 기술, 절연 C.에 적용 할 수 있습니다 배아 세포 엘레 간스. 이러한 전기 생리학 1,18 19, 이미징 및 면역 화학적 방법 (20, 21)뿐만 아니라, 세포의 특정의 cDNA 라이브러리 (22, 23)의 건설 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 특정 세포 유형의 격리 (가) 있습니다. 이러한 RNA 간섭 (RNAi의)와 같은 유전자 녹다운 (knockdown) 기술은 배양 된 C.에 적용 할 수 있습니다 엘레 셀 1 및 당 단백질 발견을위한 도구로서 아지 설탕을 사용한 신규 한 대사 표지 방법은 최근 체외 배양 C. 개발되었다 엘레 세포 24.
결론적으로, 세포 배양 방법은 어레이 O를 앞서C.에 적용 할 수있는 F 기법 살아있는 유기체의 컨텍스트에서 유전자 기능을 해독하기위한 노력의 elegans 모델. 우리는 C.를 배양 여기 프로토콜을 설명 주로 첫 번째 크리스티안와 동료 1에 기술 된 프로토콜을 기반으로 체외에서 배아 세포 엘레 간스.
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Protocol
크리스텐슨 등과 비교하여 별표 (*)는 신규 또는 수정 된 단계를 나타냅니다. 1
1. 재질 설정
- 세포 배양 과정은 임신하는 인원수로부터 격리 계란 대량을 요구한다. C. 성장한다 계란의 대량 분리하는 박테리아 - 엘레 8P 한천 플레이트에 NA22 (CGC C. elegans의 유전 컨소시엄을 통해 사용 가능)과 시드. 이 판에 사용 펩톤의 양은 일반적으로 NGM 플레이트에 사용되는 8 배의 양입니다. 높은 펩톤 농도 OP50가-두꺼운 층 성장에 반대되는,보다 효율적 NA22 박테리아의 성장을 유지한다.
8P 접시 조리법 :
3g 염화나트륨, 20g 박토 - 펩톤, 30 분간 멸균 및 오토 클레이브의 1 L에 25g의 한천을 녹인다. 55 ° C에서 매체의 열이 식도록 한 후 1 ㎖ 1 MgCl2를 콜레스테롤의 멸균 여과 1 ㎖ (EtOH를 5 ㎎ / ㎖)을 추가,, 망초 1 ㎖ 및 KP 버퍼 (500 ㎖의 재고 : 5g의 K 2 HPO 4, 30g의 KH 2 PO 4, 산도 6.00) 25 ㎖. 10cm 배양 접시 (25 ㎖ / 플레이트)에 액체 한천 배지를 붓는다.
- 다음날 NA22 E. 1 ㎖로 농축 각 펩톤 한천 판의 표면 전체에 확산 2XYT 미디어 (16g 트립 톤, 10g의 효모 추출물, 멸균, 산도 7.0의 1 L에 5g의 NaCl) 37 ° C에서의 대장균 밤새 배양 이러한 박테리아는 임신하는 인원수 다량의 성장을지지하는 두꺼운 층을 형성 할 것이다 풍부한 음식 소스를 구성한다. 박테리아의 성장을 할 수 있도록 실온에서 하룻밤 시드 판을 둡니다. 이 과정은 4 ~ 5 시간 동안 37 ° C에서 배양에 의해 가속 될 수있다.
- 시드 8P 접시에 굶주린 동물을 전송합니다. 5-6 M9 버퍼 또는 ㎖의 물을 사용하여 굶주린 NGM 플레이트를 동물을 씻어 각 8P 판에 현탁액의 1-2 ML을 추가합니다.
- 동물의 성장과 증식이 UNT 허용일리노이 플레이트를 임신하는 성인에 의해 합류에 채워집니다.
- C.의 제조에 필요한 달걀을 분리 용해 액의 5-6 ML을 사용하여 임신하는 성인의 배아 세포를, 엘레.
용해 액 레시피
신선한 표백제의 5 ㎖, 10 N NaOH를 1.25 ㎖의 멸균 H 2 O의 18.5 ML 이 혼합물을 사용하기 전에 매번 신선한 준비해야합니다.
- 계란 버퍼를 사용하여 임신하는 성인으로부터 격리 계란을 세척 :
계란 버퍼 레시피
118 밀리미터의 NaCl, 48 mM의 KCl을, 2 MM의 염화칼슘, 2 mM의 MgCl2를, 25 mM의 헤 페스, pH가 7.3, 삼투압이 340 mOsm.
- 키틴으로 처리하여 계란을 둘러싼 껍질을 제거합니다. 키티 나제는 산성 pH 25에서 가장 높은 활성을 가진 효소이다. 2 ㎎ / ㎖의 최종 농도 달걀 버퍼 pH를 6.5로 키티 나제 (시그마, 카탈로그 없음. C6137)을 녹인다. 키티 나제 주식을 저장멸균 15 ML 원뿔 튜브에 1 ㎖ 분량 씩 -20 ° C에서 솔루션을 제공합니다. 분취 량은 몇 개월 -20 ° C의 최대 저장할 수 있습니다.
- C. 성장한다 땅콩 렉틴으로 덮여 멸균 커버 슬립 (12mm 직경)에 elegans의 배양 세포. 멸균 (0.5 ㎎ / ㎖)에 땅콩 렉틴을 녹입니다. 땅콩 렉틴 용액을 여과 또는 멸균 할 수 없습니다. 또한 UV 광으로 처리 될 필요가 없다. 최대 6 개월 -20 ° C에서 보관 2 ㎖ 씩 분주.
- 완전한 세포 배양 배지 (500 ml)을 깁코, 50 ㎖ 태아 혈청 (열 불 활성화), 19.5 g의 수 크로스 (45 mOsm), 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg 5 ㎖ /부터 500 ㎖ L-15 배지가 포함 ml의 스트렙토 마이신 (2 %). 완전 배지는 다음 0.20 μm의 기공 필터를 사용하여 필터링된다.
계란 버퍼와 배지를 각각 340의 삼투압이 345 mOsm을 가지고 있습니다. 실제로, 포유 동물 세포에 반대, C. 엘레 세포는 비교적 높은 삼투압을 가지고즉, 세포의 세포막과 직접 접촉 할 수있는 솔루션을 준비 할 때 카운트 고려 될 필요가있다. 이러한 시약의 조리법 osmometer 하나를 사용하여 측정 하였다 원하는 삼투압에 도달하도록 조절 하였다. 이들 레시피를 정확히 따르는 손질 이들 시약의 제조에 사용되는 경우 osmometer를 사용할 필요가 없다. 다른 솔루션은 그 조리법 여기에보고되지 않습니다 또는 C를 사용하는 게시의 경우에, 준비해야하는 경우, 하나는 osmoter를 사용한다 배양 된 세포 엘레 간스.
2. 계란 격리
- 그것은 (24 - 웰 플레이트에서) 배양 된 세포의 12 우물에 충분한 계란을 수집하기 위해 적어도 네 8P 플레이트로 시작하는 것이 좋습니다.
- 절차를 시작하기 전에 땅콩 렉틴 원액 한 튜브를 해동. 24 웰 플레이트의 우물의 바닥에 멸균 커버 슬립을 놓고 커버 슬립에 땅콩 렉틴의 200 μl를 추가합니다. 1 시간 또는 u 품다그리로 갈때 세포는 도금 될 준비가 된 것입니다. 완전히 땅콩 렉틴을 제거하고 멸균 멸균 물 1 ㎖로 한 우물을 씻어. 커버 슬립의 땅콩 렉틴의 완전한 제거는 세포의 응집을 방지하는 데 필수적이다.
- 멸균 멸균 물을 사용하여 한천 플레이트 떨어져 임신하는 성인을 씻으십시오. 두 멸균 원뿔 50 ML 튜브로 현탁액을 수집합니다. 튜브 (*)의 하단에있는 벌레의 강수량을 할 수 있도록 최대 5 분 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요. 전송 플라스틱 피펫으로 물을 제거하고 신선한 멸균 멸균 물을 교체합니다. 200 XG 10 분 (~ 1,200 RPM) (*)에서 테이블 탑 원심 분리하여 웜 펠렛. 적어도 3이 마지막 단계를 반복합니다.
- 멸균 15 ML 원뿔 튜브로 웜을 전송하고 200 XG에 10 분 동안 (~ 1,200 RPM) (*)에 그들을 펠렛. 뿐만 아니라 튜브의 하단에있는 박테리아를 수집하지 않도록하기 위해 더 높은 원심 분리 속도를 사용하지 마십시오. 때로는 centrifugations 후 벌레가 완전히 펠렛되지 않습니다. AF터 각 세척 및 제거하기 전에 상층 액을 얼음에 5 분 동안 튜브를 놓습니다. 식힌 물 웜 튜브 바닥에 침전.
- 물을 제거하고 용해 액의 5 ~ 6 mL를 넣고 (재료가 설정 참조). 5 ~ 10 분 동안 부드럽게 정지 록하고 매 2-3 분 실체 현미경을 이용하여 웜 용해 모니터링을 시작합니다. 현탁액의 방울은 쉽게 검사 용 커버 슬립 상에 배치 될 수있다. 배양 시간은 표백제의 신선도에 따라 달라집니다, 표백제의 작은 병을 구입하고 매월 새로운 병을 엽니 다.
- ~ 웜 70 ~ 80 %의 (배양 시작부터 10 분)를 용해하는 경우, (재료가 설정 참조) 계란 버퍼 산도 7.3의 9 ML을 추가하여 용해 반응을 중지합니다. 10 분 동안 200 XG (~ 1,200 RPM)에서 현탁액을 원심 분리기. 계란 (*)의 재 오염을 방지하기 위해 벤치에 분젠 버너를 가지고이 시점에서.
- 조심스럽게 멸균 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 상층 액을 제거하고 펠렛 3-4 씻어용액을 명확 X 달걀 완충액까지. 각 세척하는 동안 알 버퍼에 펠릿 잘 혼합해야합니다.
- 계란 30 % 수크로오스 용액을 사용하여 동물 사체로부터 분리된다. 살균 계란 버퍼의 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁 2 ML 60 % 자당 용액 (살균 계란 버퍼의 주식을)를 추가합니다. 잘 섞어 200 XG (~ 1,200 RPM) (*)에서 20 분 동안 원심 분리.
- 조심스럽게 원심 분리기에서 튜브를 제거합니다. 계란은 솔루션의 상단에 떠있다. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용, 신선한 멸균 15의 ML 원뿔 튜브에 모든 달걀을 전송합니다.
- 10 분 200 XG (~ 1,200 RPM)에서 튜브와 원심 분리기에 살균 계란 버퍼 10 ML을 추가합니다. 세척 3 X를 반복합니다. 계란이 완전히 각 세척하는 동안 알 완충액되어 있는지 확인하십시오.
3. 배아 세포 해리
층류 후드를 사용하여 멸균 조건 하에서 과정의 다음 단계를 실시한다. 동물은 있지만모든 박테리아하지 않을 경우 대부분 제거해야 세균 플레이트, 세척 및 표백제가 포함 된 용해 용액으로 처리에 가운. 따라서 과정의이 시점에서 층류 후드를 사용하는 달걀 현탁액의 새로운 오염을 방지한다.
- 2 ㎎ / ㎖ 키티 나제 (계란 버퍼의 pH 6.5 (*) 재고) 1 ㎖에 계란 펠렛을 재현 탁하고 새로운 멸균 15 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. 실온에서 10-30 분 동안 튜브를 흔들어. 정확한 배양 시간은 효소와 실내 온도의 신선도에 따라 변화하고, 따라서 각각의 제조에 대해 결정되어야한다. 그것은 배양 10 분 후 반전 된 세포 배양 현미경으로 계란을 모니터링을 시작하는 것이 좋습니다. 참고 : 우리의 경험에서, 낮은 pH는 키티 나제 효소의 활동을 증가시킨다. 이러한 이유로 우리는 키티 나제 (pH를 수산화 나트륨을 사용하여 6.5로 조정 위에서보고 레시피를) 용해 pH가 6.5에 달걀 버퍼를 사용합니다.
- ~ 달걀 껍질의 80 %가 소화 될 때키티 나제 치료 (그림 1 AB)는 900 XG 3 분 (~ 2,500 RPM) (*)에서 원심 분리하여 계란 펠렛. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용하여 조심스럽게 뜨는을 제거하고 L-15 배지 3 ㎖ (*)를 추가합니다.
- 6cm 직경 플레이트에 달걀을 전송하고 부드럽게 18 G 바늘을 구비 한 10 ㎖ 멸균 주사기를 사용하여 세포를 해리. 신선한 플라스틱 페트리 접시에 현탁액 드롭을 배치하고 현미경으로 보면 해리도를 모니터한다. 손상 세포를 방지하기 위해이 절차를 수행하는 동안 주사기로 공기를 흡인하지 마십시오. 세포의 80 %가 분해됩니다 ~까지 해리를 계속합니다.
- 살균 5 μm의 밀리 포아 필터를 사용하여 현탁액을 필터링합니다. 세포 현탁액은 세포 덩어리, 소화되지 않은 계란과 부화 유충을 제거하기 위해 필터링해야합니다. 모든 세포를 복구하기 위해 필터를 통해 신선한 L-15 미디어의 추가 4 ~ 5 ㎖의 필터. DA을 방지하기 위해 여과 단계에서 과도한 힘을 사용하지 마십시오필터 및 / 또는 세포를 maging.
4. 세포를 배양
- 3 분 (*) 900 XG (~ 2,500 RPM)에서 원심 분리하여 해리 세포 펠렛. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용하여주의 깊게 뜨는을 제거합니다. 전체 L-15 중간 플레이트 1 ML / 잘 펠렛 세포를 Resuspend. 첨가 매체의 사용량은 8P 플레이트의 개수, 접시에 웜의 합류 및 셀에 대해 수행 될 실험의 유형에 따라 달라진다. 세포 밀도는 혈구 계를 사용하여 측정 할 수있다. ~ 230,000 셀 / ㎠가 최적의 밀도를 도금 패치 클램프 녹음하십시오.
- 배양액의 증발을 방지하기 위해 젖은 종이 타월을 함유 플라스틱 섬유 복합 재질 용기에서 24 웰 플레이트를 유지한다. 20 ° C와 주위 공기에 가습 인큐베이터에서 컨테이너를 저장합니다.
- 세포는 보통 24 시간 이내에 실험을위한 준비가되었을 때 형태 학적 분화와 표현GFP 마커의 이온이 완료됩니다. 세포는 최대 2 주 동안 문화 유지 될 수 있지만, 도금 후 보통 7-9일까지 대부분의 건강. 매체는 건강한 세포를 유지하기 위해 하루에 한 번 교체해야.
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Representative Results
C. 배양 세포가 특정 마커를 차별화하고 표현 세포 엘레
크리스텐슨과 트리 판 블루 염색법을 사용하여 동료는 것을 보여 주었다 배아 C.의> 99 % 엘레 세포는 분리 절차를 생존. 9 일 도금 후 22에서 각각 85 %와 65 %는 여전히 1 살아있다. 고립 된 배아 C. 엘레 세포 분화하기 위하여 기판에 부착한다. 양식 대단히 짧은 시간을 준수하는 데 실패하고 그들이 살아 있는지 명확하지 않다 세포. 세포의 분화 도금 후 2 ~ 3 시간을 시작 ~ 24 시간 동안 계속된다. 24 시간 내, 세포는 특정 형태학에 걸릴. 따라서, 신경이 과정 1,18-20을 보내, 근육 세포는 루멘 (17)을 형성 생체 내 1, 운하 세포에서 볼 수있는 것과 비슷한 손가락 같은 긴 구조를 형성한다. 체외의 형태 학적 특징은 생체 내에서 사람과 상당히 유사합니다. 예를 들어, <EM> 체외 (PMEC-4 :: GFP의 발현에 의해 식별) 배양 ALM 및 PLM 터치 신경 세포는 생체 1,20 (그림 2A)에서처럼, 하나가 다른 것보다 더 이상으로 두 신경 프로세스를 개발. 이 제안하는 C.의 차별화를 구동하는 분자 메커니즘의 적어도 일부 엘레 세포는 세포 자율적 따라서 체외에서 효과적으로 요약 할 수있다.
1990 년대에, 샬피는 C.에있는 녹색 형광 단백질 (GFP)의 사용을 개척 관심의 유전자가 26를 표현하는 세포 유형의 레이블을하는 엘레. 배양 된 C.에서 지금까지 수행 한 작업 엘레 배아 세포는 특정 세포 유형에서 GFP의 발현이 체외 1,18-20,27 (그림 2A)에 효과적으로 요약 할 수있다 지원한다. 또한 시험관 내에서 GFP를 발현하는 세포의 비율은 생체 내에서 발견되는 비율과 유사하다. 예를 들어, UNC-4의 homeodomain 기자유전자는 성숙한 배아 (13 550의 세포 - 2.3 %) (28, 29)에서 13 운동 뉴런으로 표현된다. 여우와 동료, 문화 UNC-4 :: GFP 세포를 계산하고 셀 (23)의 총 수의 2 %입니다 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, UNC-119, G 단백질 인신 매매 (30)에 필요한 단백질은 대부분 C로 표시됩니다. 뉴런과 일부 근육 세포 (L1 유충 (31)에있는 세포의 76 %) 엘레. 크리스텐슨과 동료 문화 UNC-119 :: GFP 발현이 신경 세포와 근육 세포 1을 닮은 세포의 74-76%에서 관찰 된 것을보고했다. 마지막으로, MEC-4, 부드러운 터치 32에 필요한 mechanosensitive 나 + / CA 2 + 채널의 서브 유닛은 성인 C. 6 터치 신경 세포로 표현된다 엘레. 이 여섯 터치 신경의, 4 개 (ALMS 및 PLMS는) embryonically 파생됩니다. 따라서 4 (0.7 %) 550의 배아 세포는 MEC-4 프로모터의 조절 하에서 GFP를 표현한다. 사실,의 cultur의 뉴런PMEC-4 :: GFP를 표현 전자는 셀 (18, 20)의 총 수의 ~ 0.5 %를 구성한다.
단백질 마커 및 세포 - 특정 번역 후 변형은 시험 관내에서 관찰 될 수있다. 예를 들어, 알파 튜 불린은 C.에있는 터치 신경에서 아세틸 엘레 33. 체외 터치 뉴런의 프로세스는 아세틸-α-튜 블린 (20) (그림 2B)에 대해 제기 항체와 얼룩. 배양 터치 신경 세포는 생체 내 34에 터치 신경 세포의 죽음을 유발하는 독성 돌연변이 채널 MEC-4 (D)를 표현한다. 실제로, GFP MEC-4 (D)에서 제조 된 뉴런을 표현, PMEC-4 :: GFP의 변형은 초기 문화에 존재하지만 20 퇴화. 중요한 것은, MEC-4 (D)에서 제조 된 뉴런을 터치, PMEC-4 :: GFP 유사가 생체 내에서 어떻게 행동하는지에 체외 작동합니다. 예를 들면, 그들은 함께 처리하여 죽음으로부터 구출 할 수있다생체 20,35의 변성에서 (D) 터치 신경 MEC-4 여분 miloride 및 트롤 렌. 결론적으로,뿐만 아니라 C. 엘레 배아 세포는 형태 학적으로 생체 내에서 세포와 유사하지만, 그들은 또한 세포 특정 마커를 표현하고 생체에 존재하는 동일한 비율로 존재한다. 종합적으로, 이들 데이터는 지원하는 배양 C. 엘레 세포는 세포 및 분자 수준 모두에서 생물학적 과정을 연구하기위한 전반적인 시스템을 구성한다.
배양 된 C.의 패치 클램프 전기 생리학 분석 엘레 세포
격리 또는 조직에있는 세포에서 이온 채널의 활성의 연구에 대한 70 년대 Sakmann 및 Neher에 의해 도입 된 패치 클램프 기술은 배양 된 C.에 적용 할 수 있습니다 엘레 세포 36. 크리스텐슨과 동료 배양 C.에있는 이온 채널을 연구하는 첫번째이었다 사용 엘레 세포패치 클램프 1. 그 이후, K +, 음이온 성, 양이온 성 및 비 선택적 채널 (도 2 CE)뿐만 아니라, 도파민 수송 종속 채널 배양 C.에서 설명되었다 엘레 1,18,19,37. 이러한 연구는 C의 기능에 이온 컨덕턴스의 역할에 대한 우리의 이해를 전진 신경 엘레 간스. 배양 C.에서 이온 채널 활성을 기록하는 패치 클램프 기술을 사용할 때 고려되어야 할 몇 가지 변형이있다 세포 엘레 간스. 이러한 수정은 전체 세포 녹음에 주로 관련되어 있습니다. 첫째, C. 엘레 세포는, 예를 들면 신경 세포는 1-2 μM의 직경이 작고. 따라서, 유리 피펫은 작은 팁 (0.5 μm의)가 필요합니다. 작은 피펫 팁 자극 및 기록 오류의 결과로, 입력 저항을 증가시킨다. 이 문제를 완화하기 위해, 피펫은 작은 팁이지만 넓은 원뿔을 갖도록 구성 될 수있다. 굿맨과 Lockery는 방법 EMP를 개발이 모양 (38)에 성형 피펫 고압 에어 펌프를 구비 한 불 광택제를 loying. 둘째로 인해 세포의 작은 크기로 흡입하여 전체 셀 액세스를 얻는 것은 일반적으로 셀에 손상을 초래한다. 훨씬 높은 성공은 보통 피펫 팁하에 멤브레인의 패치에 고전압 임펄스 (전기 잼핑)을인가함으로써 달성된다. 패치 클램프 기술의 다른 구성 (첨부 전지는 아웃 내외 아웃) C.에 적용 할 간단합니다 피펫의 끝이 계정에 C.의 작은 크기를 취할 작아야 만 수정으로, 배양 된 세포 엘레 간스 세포 엘레 간스. 천공 패치 기술은 악명 다른 패치 클램프 기술보다 소비 더 힘들고 시간입니다. 그러나, 성공적 C.에 적용된 따라서 elegans의 현장 39, 40에있는 세포뿐만 아니라 문화에 적용 할 수 있어야합니다.
칼슘 이미징기술은 C.에 적용 엘레 배양 세포
뉴런과 신경교의 전압 문 칼슘 2 + 채널 (VGCC)의 기능적인 역할은 배양 된 C. 조사되었다 엘레 칼슘 이미징 20, 21, 41에 의해 세포. 문화 칼슘 이미징 애플리케이션은 세포 탈분극을 유도하는 KCl을 고농도 함유 용액과 칼슘 채널 차단제의 사용이 칼슘 유입 채널의 다른 유형의 기여를 식별 할 수있다. 예를 들어, 나 + / CA 세포 내 칼슘 농도에 2 + 투과성 MEC-4 (d) 채널의 기여는 DEG / ENAC 채널 차단제의 아밀로 라이드의 유무에 카멜레온의 YC2.12를 사용하여 칼슘 이미징에 의해 결정되었다. 그 실험은 아밀로 라이드에 민감한 칼슘 유입 MEC-4 (D)하지만 야생형 터치 뉴런을 표현하는 터치 신경 세포에 존재하는 것을 보여 주었다. 멤브레인을 투과하는 이온 운반체를 사용뉴런을 터치 카멜레온 (그림 3A와 B) 보정, 비앙키와 동료는 또한 터치 신경 세포의 평균 무료 칼슘 농도가 200 ~ 20 ㎚ (그림 3C와 D) 것으로 판단. 마찬가지로, Frokjaer - 젠슨과 동료 C.에 탈분극에 의한 칼슘 유입을 조절하는 VGCCs EGL-19 및 UNC-36의 역할을 조사 엘레 카멜레온 21 표현 mechanosensory 뉴런을 배양. 그들은 20 ㎜, 100 ㎜의 범위에서 세포 외 K +에 의해 유도 된 터치 뉴런의 탈분극은 17 %와 70 % 사이의 YFP / CFP 비율 변화에 의해 밝혀 세포 내 칼슘의 증가의 결과 것으로 나타났습니다. 또한 칼슘은 과도 EGL-19-36 및 UNC 손실 함수 돌연변이에 의해 감소되었고 VGCCs는 C.의 흥분성에 중요한 역할을한다는 것을 제안 + 세포 외 칼슘의 부재 검출되지 않았다 엘레 신경 (21)를 터치합니다.
스타우트와 Parpura는 전압 문 칼슘 2 + 채널 EGL-19, CCA-1과 칼슘 유입 (41)에 기여 두부 sensilla의 CEPsh 칼집의 glia에서 UNC-2의 역할을 살펴 보았다. 세포 내 칼슘 역학은 적색 형광 마커 mCherry 및 녹색 형광 세포 내 칼슘 2 + 표시 GcaMP2.0 공동 발현하는 형질 전환 동물에서 배양 CEPsh glial 세포에서 분석 하였다. GcaMP2.0 형광의 증가에 의해보고 CEPsh glial 세포의 대부분에서, 막 탈분극은 세포 내 칼슘의 KCl을 유도 증가 2 +의 높은 세포 농도에 의해 유도. 또한, 칼슘 채널 차단제 2 CD + 및 NEMA (nemadipine-A) 치료는 크게 칼슘 과도 전압을 감소시켰다. 이러한 데이터는 CEPsh 신경교 세포에서의 세포 내 칼슘에 전압 의존성 상승을 지원하는 전압 게이트 된 칼슘 채널에 적어도 부분적으로 의존한다. 저자는, 상기 L-형 EGL-1의 세포 내 칼슘의 변화를 분석9rf (기능의 감소), T 형 CCA-1 및 N, P / Q, R-타입 채널 UNC-2 녹아웃 동물과 칼슘 2 + 채널의 세 가지 유형이 glial 세포에서 세포 내 칼슘 역학에 크게 기여 결론 . 미숙 한 포유 동물 macroglia는 세포 내 칼슘 이온 농도의 VGCC에 의존하는 변화를 통해 탈분극에 반응하기 때문에 따라서, 저자는 결론을 내린다 그 C. 엘레 CEPsh glial 세포가 기능적으로 포유 동물 macroglia, 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포 전구 세포를 유사 할 수 있습니다.
배양 된 C.에 적용 할 다른 기술 엘레 배아 세포
형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 성공적으로 C.에 적용되었습니다 특정 세포 유형 및 / 또는 마이크로 어레이 분석 23,4243을 위해 세포를 분리하는 문화를 풍부하게 배양 된 세포 엘레 간스. 도입 될 필요가있는 주요 변형세포 배양 방법에 사용되는 기판의 종류였다. 이상과 동료 콜라겐 IV, 폴리-L-라이신, 피브로넥틴 및 라미닌을 포함한 다양한 기판을 테스트하고 폴리-L-라이신이 최고의 기판 (37) 설립. 폴리-L-라이신은 물론 땅콩 렉틴 등의 세포 분화를 촉진하지만, 땅콩 렉틴에 반대 손상 36 않고 기판에서 세포의 분리를 할 수 있습니다. C.의 여러 가지 유형 45 - 엘레 세포 thermosensory, 후각, 모터와 mechanosensory 뉴런과 신경교 23,42 포함, FACS으로 분류되었다. 셀 라벨은 GFP 기자의 표현에 의해 수행되었으며, 전반적으로 정렬 효율성은 GFP - 라벨 세포 (23)의 90 %까지의 절연이 높다.
RNA 간섭 (RNAi의)에 의한 유전자 침묵뿐만 아니라 문화에 달성 될 수있다. 크리스텐슨과 동료 보여 주었다 GFP - 표현 양식의 배양C. 4 일 문화 1 이중 가닥 RNA의 첨가 후 최대 효과가있는 GFP 발현을 현저하게 감소 수준의 결과 GFP에 대한 dsRNA를 가진 뉴런 엘레 간스. 마찬가지로, 시즈와 동료 설명하는 문화의 RNAi를 사용하는 C. 엘레 SID-1은 dsRNA에의 효과를 매개하는 데 필요한이며 그것은 가능성의 RNAi (46)의 전신 확산을 매개 위해 생체 내에서 필요하다. 결론적으로, C의 유전자 침묵을 위해 가장 많이 사용되는 효과적인 방법 중 하나입니다 RNAi의 엘레 문화에 적용 할 수 있습니다. 이 메서드는 녹아웃 치명적인 또는 C를 방해 침묵 유전자에 사용될 수 있습니다 정상적인 발달 엘레 간스.
그림 1. C. 엘레 배아 전에 키티 나제 치료 후. 이전 치에 노출 계란의 (A) 사진tinase. 화살표 배아를 둘러싼 투명하고 그대로 껍질. (B) 계란 10 분 동안 키티 나제로 치료 점. 달걀 껍질은 소화하지 않고 배아 주위에 보이는 더 이상되었습니다. 화살표는 달걀 껍질에서 출시 3 배의 배아를 가리 킵니다. 블루 박스는 여전히 서로 부착 된 세포 집단을 둘러싼 다.
그림 2. 배양 된 C. 엘레 뉴런을 터치합니다. 배양 된 C.의 (A) 형광 현미경 엘레 터치 특이 적 프로모터 MEC-4 (P MEC-4 :: GFP), 스케일 바 5 μm의에서 GFP를 발현하는 신경 세포를 터치합니다. (B) 터치 신경 세포의 형광 현미경은 P MEC-4 :: GFP (상단 패널) 표현, 아세틸 알파 튜 불린 (시그마)에 대한 단일 클론 항체로 염색 한, posttranslationa만 33 터치 신경 세포에서 발생하는 알파 튜 불린 L의 수정. 패치 클램프 기술의 셀에 연결된 구성의 야생형 배양 터치 뉴런에 기록 mechanosensitive 채널 20에서 적응. (CE) 예. 채널 ~ 100 PS의 전도성을 가지고 있으며, 그것은 MEC-4 녹아웃 동물 (MEC-4 (u253))뿐만 아니라 분리 터치 신경 세포에 존재한다. 이러한 데이터는이 채널이 MEC 채널 20 아닙니다 좋습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 카멜레온을 사용하여 배양 터치 뉴런 자유 세포 내 칼슘 농도의 추정. 0 밀리미터 칼슘 2 + (에 카멜레온의 YC2.12을 표현 배양 터치 뉴런의 (A) 사색 이미지+ EGTA, 왼쪽)와 10 mM의 캘리포니아에있는 + (오른쪽). 사색 규모가 오른쪽에 표시됩니다. permeabilized 터치 신경 세포에서 세포 내 칼슘 농도의 변화와 관련된 (B) 대표 카멜레온 형광 변화. 이전 녹음, 세포 칼슘 이온 운반체 A23187 브롬 (10 μM) 및 자유 칼슘 (이 경우 250 nm 정도)의 규정 농도를 함유하는 용액에서 30 분 동안 배양 하였다. 로테 논 (10 ㎜) 및 2 - 데 옥시-D-글루코스 (1.8)도 펌프 활성을 차단하는 용액에 첨가 하였다. 신경 세포는 다음의 최소 및 최대 형광 비율의 변화를 결정하기 위하여 0 MM (+5 mM의 EGTA) 칼슘 2 + 10 ㎜ 칼슘 2 +를 함유하는 용액으로 관류시켰다. 4-7 얻어진 결과를 나타내는 (C) 카멜레온 검량선 누구의 형광 변화 세포는 11 개의 무료 칼슘 솔루션을 평가 하였다. 각각의 비율 변화가 개별 셀에 대한 최대 비율의 변경을 정상화시켰다. (D) (B)에 설명 된대로 최소 및 최대 카멜레온 비율 변경 후 설립되었다. 배양 터치 뉴런의 휴식 카멜레온의 비율은 22 %였다 ± 7 (N = 2, 18 셀) 최대 비율 변화. (C)에 나타낸 검량선에 따라이 비율은 ~ 200 ㎚의 자유 칼슘 농도에 대응한다. 20에서 적응. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
C. elegans의 개발, 행동과 노화에 관련된 유전자 경로를 해독하기위한 강력한 모델 생물이다. 그것의 편익은 주로이 유전자 조작 할 수있는 용이성에서와 짧은 수명주기에서 유래한다. 의 편의에도 불구하고, C. 엘레는 한계가있다. C.를 엘레 세포는 작은 그러한 마이크로 어레이 분석에 의해 유전자 발현 프로파일과 직접적인 같은 전기 생리학 및 약리학 기술 등 셀에 대한 액세스, 또는 특정 세포 유형의 분리를 요구하는 방법의 적용을 제한하는 가압 표피 내에 갇혀있다. C. elegans의 세포 배양 방법은 본 모델 생물의 많은 한계에 대한 해결책이다.
이 논문에서 우리는 배아 C.를 분리 및 배양에 대한 업데이트 방법을 설명 엘레 대규모의 세포는 크리에 의해 초기 작품을 기반으로 동료 1. 우리 ALSO C.의 생리 학적 과정과 유전 적 요구 사항을 기본 세포의 기능에 대한 우리의 이해를 전진하고, 면역 세포 화학, 전기 생리학, 칼슘 이미지 등을 포함한 다양한 기술을 사용하여 얻은 출판 대표적인 결과를보고 엘레. 배양 된 C.에서 지금까지 수행 한 작업 엘레 세포가 세포 특정 마커 1,18-20,22,23,27,44의 표현을 recapitulating 생체 내에서와 마찬가지로 그들은 체외에서 분화 것을 지원합니다. 모든 세포 유형이 배양에있어서되었지만,이 작업 바디는 세포 배양 방법은 허용 제안 C. 연구 자신의 정체성을 손상시키지 않고 분리해서 엘레 세포.
이 프로토콜은 모든 실험실에서 간단하고 쉽게 적용 할 수 있습니다. 성공적으로 C. 배양을 위해 염두에 두어야 할 것들 엘레 배아 세포는 다음과 같다 : 1) 동물 동기화해야합니다 그들 중 대부분은 줘야 있도록L은 세포 배양 수속시 인원수를 임신하는 될. 굶주린 판에서 웜 문화를 시작하는 것은 좋은 방법입니다. 2) 박테리아는 C.에게 성장하는 데 사용 엘레는 세포 배양 물에 오염을 방지하기 위해 종래 웜에 용해 제거 될 필요가있다. 그것은 멸균 다량의 물이 세척에 사용하는 것이 좋습니다 및 동물뿐만 아니라 박테리아의 침전을 방지하기 위해 속도 (안 이상에서) 제안에서 원심 분리되는 것입니다. 사실, 표백제가 포함 된 용해 버퍼 치료가 상대적으로 세균없는 동물 정지에서 시작, 세균을 제거해야하는 동안 권장합니다. 그 중 80 %가 자신의 알을 발표했다 ~ 할 때까지 3) 동물 표백제 / NaOH로 처리해야한다. 짧고 긴 배양 시간은 달걀 회수의 효율을 감소시키고 각각의 알을 손상한다. 4) 키티 나제에 의해 달걀 껍질 소화 면밀히 모니터링해야한다. ~ 달걀 껍질의 80 %가 소화 된 경우 수동 해리가 시작되어야한다. 길고 짧은 incubat인해 각각 세포를 분리하기위한 시도에서 연장하고 가혹한 설명서 해리 기인 효소와 손상에 의한 세포막의 직접적인 손상에 세포 손상에서 이온 배 결과 둘. 5) 5 μm의 필터를 통해 세포 여과 강제 할 수 없습니다. 필터가 막히면 경우, 세포의 손상을 방지하기 위해 신선한 하나로 변경한다.
배양 된 배아 세포는 여러 가지 방법으로 필드를 혁명을 가지고 있다는 사실에도 불구하고, 그들은 모든 과학적 질문에 대한 대답하지 여전히 제한이 있습니다. 예를 들면, 배양에서 발현 유전자는 세포가 배아로부터 분리되므로 주로 배아이다. 세포 내 구획은 문화에서 제대로 개발하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, AWA 및 AWC와 같은 특정 amphid 감각 신경 세포의 섬모의 개발 및 유지 보수 문화 (44)에 손실 amphid 아교와의 상호 작용에 따라 달라집니다. 세포는 그들의 자연 이웃을 잃고 생리 학적으로 확인해하지 않는다evant 세포 간 접촉. 예를 들면, 세포가 전기 꽉 접합 또는 화학 물질이 시냅스를 형성 여부를 알 수없는 그들이 할 경우, 이들은 자신의 생리적 인 파트너와 함께 할 가능성이 없습니다. 또한, 세포를 단일 기판, 땅콩 렉틴에 도금된다. 생체 내 세포 외 기질은 땅콩 렉틴, 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴 및 등 많은 분자 복합체 및 재현하기 어려운 혼합 될 가능성이있다. 또한, 아마도 세포 기능의 특정 유형에 필요한 세포 외 기질을 전문. 예를 들어, mechanosensitive 채널 보디 터치 뉴런에서 발현 및 MEC -4 의해 형성 MEC-10 서브 유닛은 배양 18 게이팅 할 수 없지만 쉽게 생체 내에서 게이트 (47) 할 수있다. 이 가능성이 가장 높은 세포 콜라겐 MEC-5 일반적으로 생체 내에서 심 인접 셀에 의해 생산이, 문화 48 결석 사실에서 유래한다. MEC-5, 함께 세포 외 기질 단백질 MEC-1 (긴 1999 년 AAKunitz 형 도메인과 두 EGF 도메인) 여러 Kunitz 형 도메인, EGF 반복하고 글루타민산이 풍부한 도메인을 포함 MEC-9 (834 AA 긴 단백질)와 단백질은 터치 감각에 필요한 및 바인딩 것으로 생각된다 MEC 채널 복합체의 세포 외 도메인에 대한 기계적 자극하는 동안 복잡한에 긴장을 게이팅 발휘합니다.
결론적으로, C. elegans의 배아 세포가 시험 관내에서 배양 할 수 있으며, 그들은 세포 특정 유전자의 발현을 recapitulating 차별화 보인다. 세포의 분리 및 배양 프로토콜은 간단하다 및 세포 배양 기술에 최소한의 경험이 어떤 실험실에서 적용 할 수 있습니다. 마음에이 기술의 한계를 베어링, 세포 배양 방법은있을 수 있고 직접적인 세포에 접근 및 / 또는 특정 종류의 세포 분리가 필요할 때 강력한 기술로 입증되었다. 애벌레에서 세포를 분리하기위한 프로토콜은 또한 최근에 개발 (N되었습니다OT는) 여기에 49을 설명했다. 보완적인 방법을 개발에 대폭적인 관심은 C를하고있다 궁극적으로 유전자 기능 및 동작, 개발이나 노화 사이의 연결을 이해하는데 더욱 강력한 시스템 엘레 간스.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator | |||
References
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