Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En metode for dyrking Embryonic Published: September 21, 2013 doi: 10.3791/50649
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

Summary

Vi beskriver her en revidert protokoll for storskala kultur embryonale C. elegans celler. Embryonale C. elegans celler dyrket in vitro ved å bruke denne metoden, ser ut til å differensiere og rekapitulere ekspresjonen av gener i en celle spesifikk måte. Teknikker som krever direkte adgang til cellene og isolering av spesifikke celletyper fra andre vev kan påføres på C. elegans dyrkede celler.

Abstract

C. elegans er en kraftig modellsystem, i hvilket genetiske og molekylære teknikker er lett anvendelig. Inntil nylig har imidlertid teknikker som krever direkte tilgang til celler og isolering av spesifikke celletyper og kunne ikke bli anvendt i C. elegans. Denne begrensning skyldes det faktum at vev er innelukket i en trykksatt hårstråene som ikke er lett fordøyes ved behandling med enzymer og / eller vaskemidler. Basert på tidlig pioner arbeid av Laird Bloom, Christensen og kollegene en utviklet en robust metode for dyrking C. elegans embryonale celler i stor skala. Egg er isolert fra av gravid voksne ved behandling med blekemiddel / NaOH og deretter behandlet med chitinase å fjerne eggeskall. Embryonale celler blir deretter dissosiert ved manuell pipettering og platet ut på substrat-dekket glass i serum-anrikede mediet. Innen 24 timer av isolasjonscellene begynner å differensiere ved å endre morfologi og ved å uttrykke celle spesifikke markers. C. elegans cellene dyrkes ved hjelp av denne metode overleve i opptil 2 uker, in vitro, og har vært benyttet for elektrofysiologisk, immunokjemisk, og avbildningsanalyser, så vel som de er blitt sortert, og som brukes for mikromatrise profilering.

Introduction

Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en kraftig modellorganisme for å undersøke molekylære grunnlaget for cellulær funksjon, differensiering, og atferd. Mens sitt genom, metabolske og biosyntetiske banene er lik virveldyr ', dens genetiske og molekylære tractability er langt større to. Blant fordelene er dens størrelse og enkel anatomi, sin raske livssyklus (3 dager ved 25 ° C), kort levealder (2 uker) og stort antall avkom (> 200). På grunn av sin tvekjønnet natur og kort livssyklus, molekylære og genetiske manipulasjoner er grei i C. elegans, inkludert generering av transgene dyr 3,4 og anvendelsen av genet knock-down teknikker som RNA-interferens fem. C. elegans kropp og eggeskall er gjennomsiktig. Derfor celler kan lett visualiseres i både voksen og embryoet ved hjelp av standard mikroskopi. I de siste 40 årene, C. elegans C. elegans forskning, inkludert en stor samling av mutanter, knockouts og transgenics, en detaljert beskrivelse av anatomi og utvikling 6,7, inkludert fullstendig rekonstruksjon av nervesystemet 8, og en helt sekvensert genomet som er godt merket og tilgjengelig for hele samfunnet ( www.wormbase.com ).

Til tross for de mange fordelene, har noen eksperimentelle tilnærminger vært utfordrende i C. elegans. Disse omfatter de som krever tilgang til plasmamembranen av celler og isolering av vev eller celletyper. Faktisk C. elegans vev er begrenset innenfor den hydrostatiske trykk skjelett, som ikke er lett fordøyes av enzymatisk behandling eller vaskemidler. På slutten av 1990-tallet Miriam Goodman og Janet Richmond pioner metoder for elektrofysiologiske opptak av C. elegansnevroner og muskelceller i situ 9,10. Selv om disse metodene ga oss viktig innsikt i nevronale og muskel funksjon in vivo, er de utfordrende og lav gjennomstrømming. Alternative metoder for å studere cellefunksjon in vivo hadde blitt utviklet, mest spesielt in vivo avbildning ved hjelp av kalsium-genetisk kodede kalsium sensorer slik som GCamP og Came 11-13. Disse metodene imidlertid ikke tillate bruk av farmakologiske verktøy, fordi de anvendes på intakte levende dyr.

Det første forsøket på dyrking C. elegans celler in vitro i stor skala ble gjort av Laird Bloom under utarbeidelsen av sin doktoravhandling 14. Uheldigvis vanskelighetene med dårlig adhesjon av cellene til substratet, dårlig celle differensiering og overlevelse hindret etableringen av denne tidlige-protokollen som en robust metode cellekultur. I 1995 Edgar og kolleger publiserte en prosedyreå undersøke celledeling og morphogenesis ved isolering og kulturen av en enkelt C-. elegans embryoer 15. Embryonale celler fremstilt ved fordøyelse av eggeskall med en kombinasjon av enzymatisk behandling og manuell dissosiasjon, fortsatte å spre seg, produsere opp til ~ 500 celler 15. Deretter Leung og medarbeidere dyrket et lite antall blastomeres å studere tarm morphogenesis. De viste at en in vitro isolert E blastomere produsert polarisert tarmceller som skapte en struktur analogt til intestinal lumen ved å samhandle med hverandre gjennom apikale adherens veikryss 16. Buechner og kolleger rapporterte også en lignende metode for dyrking C. elegans embryonale celler in vitro 17.

Basert på dette tidlige arbeid, Christensen og kolleger utviklet en robust protokoll for dyrking embryonale C. elegans celler in vitro en. Deviste at isolert C. elegans cellene kan differensieres til ulike celletyper og vedlikeholde de funksjonene som de besitter in vivo, inkludert uttrykk for celle-spesifikke markører. Flere teknikker som er utfordrende in vivo, kan påføres på isolert C. elegans embryonale celler. Disse omfatter elektro 1,18 19, avbildning, og immunkjemiske teknikker 20,21, samt isolering av spesifikke celletyper fra Fluorescent-aktivert cellesortering (FACS) for konstruksjon av cellespesifikke cDNA-biblioteker 22,23. Gene knockdown teknikker som RNA interferens (RNAi) kan brukes på kultivert C. elegans celler en og en roman metabolsk merking metoden bruker Azido-sukker som et verktøy for glykoprotein oppdagelsen har nylig blitt utviklet for in vitro kultivert C. elegans celler 24.

Som konklusjon, ekspanderer cellekulturmetode matrisen of teknikker som kan brukes til C. elegans modell i et forsøk på å dechiffrere gen-funksjon i sammenheng med en levende organisme. Vi beskriver her protokollen for dyrking C. elegans embryonale celler in vitro, som i stor grad basert på protokollen først beskrevet av Christiansen og kolleger en.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Stjerne (*) indikerer nye eller modifiserte skritt i forhold til Christensen et al. 1

En. Materiale Setup

  1. Prosedyren cellekultur krever store mengder av egg av gravid isolert fra voksne. Grow C. elegans på 8P agarskålene seeded med NA22 (tilgjengelig gjennom C. elegans Genetisk Consortium - CGC) bakterier å isolere store mengder egg. I disse plater mengden av pepton som brukes er åtte ganger mengden som normalt brukes for NGM platene. Jo høyere pepton konsentrasjon opprett veksten av NA22 bakterier mer effektivt, som i motsetning til OP50-, vokser i tykke lag.

8P plater oppskrift:

Oppløs 3 g NaCl, 20 g Bacto-Peptone, 25 g agar i en L sterilt destillert vann og autoklav i 30 min. La mediet kjøling ved 55 ° C og deretter legge steril-filtrerte 1 ml av kolesterol (5 mg / ml i EtOH), 1 ml av en MgCl2, 1 ml MgSo4 og 25 ml av KP buffer (lager av 500 ml: 5 g K 2 HPO 4, 30 g KH 2 PO 4, pH 6,00). Hell flytende agar medium i 10 cm petriskåler (25 ml / plate).

  1. Neste dag spre hele overflaten av hver anriket pepton-agar-plate med 1 ml av NA22 E. coli dyrket over natten i 2 x YT-medium (16 g trypton, 10 g gjærekstrakt, 5 g NaCl i 1 l i sterilt vann, pH 7,0) ved 37 ° C. Disse bakteriene utgjør en rik matkilde som vil danne et tykt lag å støtte veksten av store mengder av gravid voksne. La seeded platene over natten ved romtemperatur for å tillate vekst av bakteriene. Fremgangsmåten kan akselereres ved inkubering ved 37 ° C i 4-5 timer.
  2. Overfør sultet dyr til seeded 8P plater. Vask dyr av en utsultet NGM plate ved hjelp av 5-6 ml av M9 buffer eller vann og tilsett 1-2 ml av denne suspensjonen til hver 8P plate.
  3. Tillate vekst og multiplikasjon av dyrene until platene er befolket ved samløpet av av gravid voksne.
  4. Isoler eggene som kreves for fremstilling av C. elegans embryonale celler, fra av gravid voksne ved hjelp av 5-6 ml lyseringsløsning.

Lysis løsning oppskrift

5 ml frisk blekemiddel, 1,25 ml 10 N NaOH og 18,5 ml sterilt H2O Denne blandingen må være forberedt frisk før hver bruk.

  1. Vask eggene isolert fra av gravid voksne ved hjelp av egg buffer:

Egg buffer oppskrift

118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolariteten 340 mOsm.

  1. Fjern eggeskall som omgir eggene ved behandling med chitinase. Kitinase er et enzym med høy aktivitet ved sur pH 25.. Oppløs chitinase (Sigma, katalognr. C6137) i egg-buffer pH 6,5 til en endelig konsentrasjon på 2 mg / ml. Oppbevar chitinase lagerløsning ved -20 ° C i 1 ml alikvoter i sterile 15 ml koniske rør. Aliquoter kan oppbevares ved -20 ° C opp til et par måneder.
  2. Grow C. elegans dyrkede celler på autoklaveres Dekk (12 mm diameter) dekket med peanut lektin. Oppløs peanut lektin i sterilt vann (0,5 mg / ml). Peanut lektin oppløsningen må ikke filtreres og autoklaveres. Den heller ikke trenger å bli behandlet med UV-lys. Oppbevares 2 ml mengder ved -20 ° C i opptil seks måneder.
  3. Hele cellekulturmedium (500 ml) inneholder 500 ml L-15 kulturmediet fra Gibco, 50 ml føtalt bovinserum (varme-inaktivert), 7,7 g sukrose (45 mOsm) og 5 ml 100 U / ml penicillin og av 100 mikrogram / ml Streptomycin (2%). Det komplette mediet blir deretter filtrert under anvendelse av et 0,20 um pore-filter.

Legg merke til at egget buffer, og kulturmediet har osmolaritet på 340 og 345 mOsm hhv. Faktisk, i motsetning til pattedyrceller, C. elegans celler har en relativt høy osmolaritetsom må tas i telle ved fremstilling av løsninger som vil komme i direkte kontakt med plasmamembranen til cellene. Oppskriftene av disse reagenser ble justert for å nå den ønskede osmolaritet, som ble målt ved hjelp av et osmometer 1.. Det er ikke nødvendig å bruke et osmometer dersom disse oppskrifter blir fulgt nøyaktig og forsiktig benyttes i fremstillingen av disse reagenser. Imidlertid bør man bruke en osmoter hvis andre løsninger må være forberedt, hvis oppskrifter er ikke rapportert her eller i noen av de publikasjoner som bruker C. elegans dyrkede celler.

2. Egg Isolation

  1. Det anbefales å starte med minst fire 8P plater å samle nok egg for 12 brønner av dyrkede celler (i 24-brønners plater).
  2. Før man starter med prosedyren tine en tube av peanut lektin stamløsning. Plasser autoklaveres Dekk på bunnen av brønnene i en 24-brønns plate og tilsett 200 ul av peanut lektin til Dekkglass. Inkuber i 1 time eller until cellene er klare til å bli belagt. Fjern helt peanut lektin og vaske brønnene en gang med 1 ml sterilt autoklavert vann. Fullstendig fjernelse av peanut lektin fra Dekkglass er avgjørende for å unngå celleklumpdannelse.
  3. Vask av gravid voksne utenfor agarplater ved hjelp av sterilt vann autoklaveres. Samle suspensjon i to sterile konisk 50 ml tube. La rørene på is i opp til 5 minutter for å tillate utfelling av ormene i bunnen av rørene (*). Fjern vannet med en overføring plastpipette og erstatte det med frisk sterilt autoklavert vann. Pellet ormer ved table-top sentrifugering ved 200 xg (~ 1200 rpm) for 10 min (*). Gjenta dette siste trinnet i det minste tre.
  4. Overfør ormer i en steril 15 ml konisk rør og pellet dem ved 200 xg (~ 1200 rpm) i 10 min (*). Bruk ikke høyere sentrifugehastighet for å unngå oppsamling av bakterier i bunnen av røret i tillegg. Noen ganger etter sentrifuger ormer ikke er helt pelletert. Aftér hver vask, og før fjerning av supernatanten, plasserer rørene i 5 min på is. I kjølevanns ormer fremskynde til bunnen av røret.
  5. Fjern vannet og tilsett 5-6 ml lysis løsning (se Materiale satt opp). Rock the suspensjon forsiktig i 5-10 min og deretter begynne å overvåke orm lyse under stereo hver 2-3 min. En dråpe av suspensjon kan også plasseres på et dekkglass for enklere inspeksjon. Inkubasjonstiden varierer avhengig av friskhet av blekemiddel, kjøpe små flasker med blekemiddel og åpne en ny flaske hver måned.
  6. Når ~ 70-80% av ormene lyseres (10 minutter fra begynnelsen av inkuberingen), stopp reaksjonen ved å tilsette lysis 9 ml av egg-buffer pH 7,3 (se Materialer oppstilling). Sentrifuger suspensjonen ved 200 xg (~ 1200 rpm) i 10 min. Fra dette punktet har en gassbrenner på, på benken for å hindre ny forurensning av eggene (*).
  7. Fjern forsiktig supernatanten ved hjelp av en steril plast overføringspipetten og vask pelleten 3-4x med egg buffer inntil oppløsningen er klar. Sørg for å blande pellets godt i egget buffer under hver vask.
  8. Egg er atskilt fra dyreskrotter ved hjelp av 30% sukrose-løsning. Resuspender pellet i 2 ml sterilt egg buffer og tilsett 2 ml 60% sakkarose-løsning (lager i sterilt egg buffer). Bland godt og sentrifuger i 20 min ved 200 xg (~ 1200 rpm) (*).
  9. Fjern forsiktig rørene fra sentrifugen. Eggene flyter på toppen av oppløsningen. Ved hjelp av en P1000 pipettor og sterile tips, overføre alle eggene i en fersk sterile 15 ml konisk tube.
  10. Tilsett 10 ml sterilt egg buffer til røret og sentrifuger ved 200 xg (~ 1200 rpm) i 10 min. Gjenta vask 3 x. Sørg for at eggene er helt resuspendert i egget buffer under hver vask.

Tre. Embryonale celler Dissosiasjon

Gjennomføre de neste trinnene i prosedyren under sterile forhold ved hjelp av en laminær hette. Mens dyrene erkappe på bakterier plater, de vasker og behandlingen med lysis løsning som inneholder blekemiddel skal eliminere de fleste om ikke alle bakterier. Således ved bruk av en laminær hette på dette punkt av fremgangsmåten forhindrer ny forurensning av egg suspensjon.

  1. Suspender pelleterte egg i en ml 2 mg / ml chitinase (lager i egg buffer pH 6,5 (*)) og overføre dem til en ny steril 15 ml konisk tube. Skjer røret i 10-30 minutter ved romtemperatur. Den nøyaktige inkubasjonstid endres i henhold til friskhet av enzymet, og temperaturen i rommet, og bør derfor bestemmes for hvert preparat. Det anbefales å starte overvåking av egg under en omvendt celle-kultur mikroskop etter 10 min av inkubasjon. Merk: I vår erfaring, øker lav pH chitinase enzymatisk aktivitet. Av denne grunn bruker vi egg-buffer ved pH 6,5 for å oppløse chitinase (oppskrift angitt ovenfor, hvor pH-verdien justeres til 6,5 ved hjelp av NaOH).
  2. Ved ~ 80% av eggeskall er fordøyd medchitinase behandling (figurene 1 AB), pellet eggene ved sentrifugering ved 900 x g (~ 2500 rpm) i 3 min (*). Ved hjelp av en P1000 pipettor og sterile tips, fjern forsiktig supernatanten og tilsett 3 ml av L-15 medium (*).
  3. Overfør eggene i en 6 cm i diameter plate og forsiktig dissosiere i cellene ved bruk av en 10 ml steril sprøyte utstyrt med en 18 G nål. Overvåke graden av dissosiasjon ved å plassere en dråpe av suspensjonen inn i et friskt plastpetriskål, og ved å se under mikroskop. Ikke aspirer luft inn i sprøyten i løpet av denne prosedyren for å unngå å skade cellene. Fortsett dissosiasjon til ~ 80% av cellene er dissosiert.
  4. Filtrer suspensjonen ved hjelp av en steril 5 um Millipore-filteret. Cellesuspensjoner må filtreres for å fjerne celleklumper, ufordøyd egg og klekket larver. Filter ytterligere 4-5 ml frisk L-15 mediet gjennom filteret for å gjenopprette alle cellene. Ikke bruk for mye kraft under filtreringen trinn for å unngå daMaging filteret og / eller cellene.

4. Dyrkning Cells

  1. Pellet de dissosierte cellene ved sentrifugering ved 900 x g (~ 2500 rpm) i 3 min (*). Ved hjelp av en P1000 pipettor og sterile tips fjerne all supernatanten forsiktig. Resuspender de pelleterte celler i fullstendig L-15 medium, og platen 1 ml / brønn. Mengden av medium tilsatt, avhenger av antallet av 8P plater anvendes, sammenløpet av ormene på platene, og den type eksperimenter som blir utført på cellene. Celletettheten kan bestemmes ved hjelp av et hemocytometer. For patch-clamp opptak plating tetthet av ~ 230.000 celler / cm 2 er optimal.
  2. Hold 24 brønner plate i en plast Tupperware container inneholder våt papirhåndklær for å unngå fordamping av kulturmedium. Oppbevar beholderen i en fuktet inkubator ved 20 ° C og omgivende luft.
  3. Cellene er vanligvis klar for eksperimentene innen 24 timer når den morfologiske differensiering og uttrykkeion av GFP markører er fullført. Celler kan holdes i kultur for opp til to uker, men de er som regel mest sunne opptil 7-9 dager etter plating. Mediet må skiftes en gang om dagen for å opprettholde sunne celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C. elegans dyrkede celler differensiere og ekspress celle spesifikke markører

Christensen og kolleger ved hjelp av trypan blå farging viste at> 99% av embryonale C. elegans celler overleve isolering prosedyre. På dag 9 og 22 etter plating, 85% og 65%, henholdsvis er fortsatt i live ett. Isolert embryonale C. elegans celler må forholde seg til et substrat for å differensiere. Celler som ikke klarer å overholde danner klumper og det er ikke klart om de overlever. Differensiering av cellene begynner 2-3 timer etter plating og fortsetter til ~ 24 timer. Innen 24 timer, celler tar på spesifikke kroppsformene. Dermed nevroner sender ut prosesser 1,18-20, muskelceller danne finger-lignende langstrakte strukturer som ligner på de som blir sett in vivo en og kanal cellene danner en lumen 17. De morfologiske egenskaper in vitro er bemerkelsesverdig lik de i vivo. For eksempel, <em> in vitro dyrkede ALM og PLM berørings nevroner (identifisert ved uttrykk for Pmec-4 :: GFP) utvikle bare to nevronale prosesser med ett lengre enn andre, som de gjør i vivo 1,20 (Figur 2A). Dette tyder på at i det minste noen av de molekylære mekanismer som driver differensiering av C. elegans cellene er celle-autonome og kan således rekapitulert in vitro.

På 1990-tallet, Chalfie pioner i bruk av grønt fluorescerende protein (GFP) i C. elegans å merke celletyper der et gen av interesse er uttrykt 26. Arbeidet som er gjort så langt på kultivert C. elegans embryonale celler støtter at uttrykket av GFP i bestemte celletyper kan recapitulated in vitro 1,18-20,27 (Figur 2A). Videre har forholdet mellom celler som uttrykker GFP in vitro er det samme forhold som finnes in vivo. For eksempel, unc-4 homeodomen reportergen blir uttrykt i 13 motoriske nerveceller i moden embryo (13 av 550 celler-2.3%) 28,29. Fox og medarbeidere, regnet unc-4 :: GFP-celler i kultur, og funnet at de er 2% av det totale antall celler 23. Tilsvarende UNC-119, et protein som kreves for G-protein-handel 30, er uttrykt i de fleste C. elegans nevroner og enkelte muskel-celler (76% av cellene i den L1 larven 31). Christensen og medarbeidere rapporterte at i kultur unc-119 :: GFP ekspresjon ble observert i 74-76% av cellene som likner nerveceller og muskelceller 1. Til slutt, MEC-4, en mechanosensitive Na + / Ca 2 + kanaler subenheten nødvendig for svak touch 32 er uttrykt i seks berørings nevroner i voksen C. elegans. Av disse seks berørings nevroner, er fire (almisse og PLMS) embryonically avledet. Således 4 av 550 (0,7%) embryonale celler skal uttrykke GFP under kontroll av den mec-4-promotor. Faktisk, nevroner i kulturelte som uttrykker Pmec-4 :: GFP utgjør ~ 0,5% av det totale antall celler 18,20.

Proteinmarkører og posttranslational modifikasjoner som er celle-spesifikt kan også observert in vitro. For eksempel, er alfa tubulin acetylert bare i berørings nevroner i C. elegans 33. In vitro, prosesser av touch nevroner flekken med et antistoff reist mot acetylert-alfa-tubulin 20 (figur 2B). Dyrkede berørings nevroner også uttrykke toksisk mutant kanal MEC-4 (d), noe som fører til døden av touch nevroner i vivo 34. Faktisk, GFP uttrykke nevroner tilberedt av et mec-4 (d); pmec-4 :: GFP belastning er i utgangspunktet til stede i kultur, men da utarte 20. Viktigere, berører nevroner forberedt fra mec-4 (d); pmec-4 :: GFP oppføre in vitro på samme måte hvordan de oppfører seg i vivo. For eksempel kan de bli reddet fra døden ved behandling med enmiloride og dantrolen, som reservedeler mec-4 (d) berørings nevroner fra degenerasjon in vivo 20,35. For å konkludere, ikke bare C. elegans embryonale celler ligner morfologisk celler in vivo, men de kan også uttrykke cellespesifikke markører og er tilstede i samme forhold at de er tilstede in vivo. Samlet utgjør disse dataene støtter at kultivert C. elegans cellene utgjør en samlet godt system for å studere biologiske prosesser både på cellulært og molekylært nivå.

Patch-clamp elektrofysiologisk analyse av kultivert C. elegans celler

Den patch-clamp teknikk, som ble introdusert av Sakmann og Neher i sytten for studiet av ionekanaler aktivitet fra celler i isolasjon eller i vev kan anvendes på dyrkede C. elegans celler 36. Christensen og kollegene var de første til å studere ionekanaler i kultivert C. elegans celler ved hjelppatch-clamp en. Siden da, har K +, anioniske og kationiske, ikke-selektive kanaler (figur 2 CE), så vel som dopamin-transportører avhengige kanaler er beskrevet i dyrkede C. elegans 1,18,19,37. Disse studiene utvidet vår forståelse av rollen til ioniske ledningsevne i funksjon av C. elegans nevroner. Det er noen endringer som må vurderes når du bruker patch clamp teknikken til å spille inn ionekanal aktivitet fra kultivert C. elegans celler. Disse endringene er stort sett relevant for hele celle innspillinger. Først C. elegans cellene er små, for eksempel nerveceller har en diameter på 1-2 um. Således glass pipetter må ha en liten spiss (0,5 mikrometer). Små pipettespisser øke inngangsmotstand, som resulterer i stimulering og registrering av feil. For å avhjelpe dette problem, kan pipetter være konstruert til å ha en liten spiss, men et bredt kjegle. Goodman og Lockery utviklet en metode employing en brann poleringsmaskin utstyrt med en høytrykksluftpumpe for støping pipetter til denne formen 38. For det andre, på grunn av den lille størrelsen av cellene, å få tilgang til hele cellen ved å bruke suge resulterer vanligvis i skade på cellen. Mye høyere suksess oppnås vanligvis ved å anvende en høy spenning impuls (elektrisk søk) til oppdatering av membranen under spissen av pipetten. De andre konfigurasjoner av patch clamp teknikken (celle festet, innsiden ut og utsiden-out) er grei å bruke til C. elegans dyrkede celler, med den eneste modifikasjon at spissen av pipetten bør være liten for å ta hensyn til den lille størrelsen av C. elegans celler. Den perforerte patch teknikken er notorisk mer arbeidskrevende og tidskrevende enn andre patch clamp-teknikker. Det har imidlertid blitt brukt på C. elegans celler i situ 39, 40 og dermed bør være aktuelt i kultur også.

Kalsium bildebehandlingteknikker brukes på C. elegans dyrkede celler

Den funksjonelle rollen til spenningsstyrte Ca 2 + kanaler (VGCC) i nerveceller og gliaceller har blitt undersøkt i kultivert C. elegans celler ved kalsium-avbildning 20, 21, 41. Anvendelsen av kalsium avbildning i kultur har tillatt bruk av oppløsninger inneholdende høye konsentrasjoner av KCl til å indusere celle depolarisering og kalsiumkanalblokkere å skjelne bidraget av forskjellige typer kanaler til kalsiuminnstrømningen. For eksempel ble bidraget av Na + / Ca2 +-gjennomtrengelig MEC-4 (d) kanalen til den intracellulære kalsiumkonsentrasjon bestemt ved kalsium-avbildning ved hjelp Came YC2.12 i nærvær og fravær av DEG / ENaC kanalblokk amilorid. Disse eksperimentene viste at en amilorid-sensitive kalsium tilstrømningen er til stede i berørings nevroner uttrykker MEC-4 (d), men ikke i vill type berørings nevroner. Bruke ionophore å permeabilize membranenberøre nevroner og å kalibrere Cameleon (Tall 3A og B), Bianchi og kolleger har også fastslått at den gjennomsnittlige frie kalsiumkonsentrasjonen i kontakt nevron er 200 nM 20 (Tall 3C og D). Tilsvarende Frokjaer-Jensen og kolleger undersøkte rollen som VGCCs EGL-19 og UNC-36 i å regulere depolarisering-indusert kalsium tilstrømningen i C. elegans dyrket mechanosensory nevroner uttrykker Cameleon 21. De fant at depolarisering av berøringsnerveceller indusert ved ekstracellulær K + i et område mellom 20 mM og 100 mM, resulterte i økning av intracellulær kalsium åpenbart av YFP / CFP utvekslingsforhold mellom 17% og 70%. Videre ble kalsium transienter redusert med EGL-19 og unc-36 tap-funksjon mutasjoner og ble ikke oppdaget i fravær av ekstracellulært Ca 2 + som tyder på at VGCCs spille en nøkkelrolle i eksitabilitet av C. elegans berøre nevroner 21.

Stout og Parpura undersøkt hvilken rolle spenningsstyrte Ca 2 + kanaler EGL-19, CCA-en og UNC-2 i CEPsh slire gliaceller av cephalic sensilla i å bidra til kalsium tilstrømningen 41. Intracellulære kalsium dynamikk ble analysert i CEPsh gliaceller dyrkede fra transgene dyr co-uttrykker den røde fluoriserende fargestoff mCherry og den grønne fluorescerende cytosoliske Ca 2 + indikator GcaMP2.0. I de fleste av de CEPsh gliaceller, membran depolarisasjonsinduserte av høye ekstracellulære konsentrasjoner av KCl induserte økningen av intracellulær Ca2 + som rapportert av økningen i GcaMP2.0 fluorescens. Videre behandling med kalsiumkanaler blokkere Cd 2 + og NEMA (nemadipine-A) gir en vesentlig redusert kalsium-transienter. Disse dataene støtter som spenningsavhengig økning i intracellulært kalsium i CEPsh gliaceller, avhenger i det minste delvis på spenningsstyrte kalsiumkanaler. Forfatterne, analysert intracellulære kalsium endringer i L-type-EGL en ytterligere9RF (reduksjon av funksjon), T-type CCA-1 og N, P / Q, R-type kanal unc-2 knockout dyr og konkluderte med at alle tre typer av Ca 2 +-kanaler bidrar betydelig til den intracellulære kalsium dynamikken i disse gliaceller . Derfor, siden umodne pattedyr macroglia reagere til depolarisering via VGCC-avhengige endringer i intracellulær Ca 2 + konsentrasjon, forfatterne konkluderer med at C. elegans CEPsh gliaceller kan funksjonelt ligne pattedyr macroglia, astrocytter, oligodendrocytes og oligodendrocyte forløper celler.

Andre teknikker som gjelder for kultivert C. elegans embryonale celler

Fluorescens-Aktivert Cell Sorting (FACS) har blitt brukt til C. elegans dyrkede celler for å berike kulturer med spesifikke celletyper, og / eller for å isolere celler for mikromatriseanalyse 23,4243. Den store modifikasjon som måtte bli innførttil cellekultur-metoden var typen av substrat som brukes. Stange og kolleger testet forskjellige substrater inkludert kollagen IV, poly-L-lysin, fibronektin og laminin og etablert som poly-L-lysin er den beste substrat 37.. Poly-L-lysin fremmer celledifferensiering like godt som peanut lektin, men i motsetning til peanut lektin tillater løsgjøring av celler fra substratet uten å skade 36. Flere forskjellige typer C. elegans celler har blitt sortert etter FACS, inkludert thermosensory, olfactory, motor og mechanosensory nevroner, og gliaceller 23,42 - 45 år. Cell merking er blitt oppnådd ved ekspresjon av GFP reportere og samlet, er høy med isolering av inntil 90% av GFP-merkede celler 23 sorteringseffektivitet.

Genet stanse av RNA interferens (RNAi) kan oppnås i kultur også. Christensen og kolleger viste at inkubasjon av GFP-uttrykke kultivertC. elegans neuroner med dsRNA mot GFP resulterte i signifikant redusert nivå av GFP-ekspresjon med en maksimal effekt 4 dager etter tilsetning av dobbelt-trådet RNA i kulturen 1.. Tilsvarende Shih og kolleger brukte RNAi i kultur for å demonstrere at C. elegans SID-en er nødvendig for å mediere effekt av dsRNA, og det er sannsynligvis nødvendig for in vivo for å mediere systemisk spredning av RNAi 46.. Som konklusjon, RNAi som er en av de mest brukte og effektive metoder for genet stanse i C. elegans kan brukes i kultur. Denne metoden kan brukes for støydempere gener hvis knockout er dødelig eller forstyrrer C. elegans normal utvikling.

Figur 1
Figur 1. C. elegans embryoer før og etter chitinase behandling. (A) Fotografi av egg før eksponering for chitinase. Pilen peker på de gjennomsiktige og intakte eggeskall rundt et embryo. (B) Egg behandlet med chitinase for 10 min. De eggeskall har blitt fordøyd og er ikke lenger synlige rundt embryoene. Pilene peker på tre-fold embryoer løslatt fra eggeskallet. Den blå boksen omgir en gruppe av celler som fremdeles er festet til hverandre.

Fig. 2
Figur 2. Kultivert C. elegans berøre nevroner. (A) Fluorescent micrograph av kultivert C. elegans berøre nevroner uttrykker GFP under berørings promoter mec-4 (P mec-4 :: GFP), skala bar 5 mikrometer. (B) Fluorescent mikrografer av en touch nevron uttrykker P mec-4 :: GFP (øvre panel), som ble farget med et monoklonalt antistoff mot acetylert alfa tubulin (Sigma), en posttranslational modifikasjon av alfa tubulin som oppstår i kontakt nevroner bare 33. Tilpasset fra 20.. (CE) Eksempel på mechanosensitive kanaler spilt inn i villtype dyrkede berørings nevroner i celle-festet konfigurasjon av plasteret clamp teknikken. Kanalen har en ledningsevne på ~ 100 HK, og det er til stede i berørings nevroner isolert fra mec-4 knockout dyr (mec-4 (u253)) i tillegg. Disse dataene antyder denne kanalen er ikke MEC kanal 20. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Estimering av gratis intracellulær kalsiumkonsentrasjon i dyrkede berørings nevroner bruker Cameleon. (A) Pseudo bilder av dyrkede berørings nevroner uttrykker Cameleon YC2.12 i 0 mM Ca 2 + (+ EGTA, venstre) og i 10 mM Ca 2 + (høyre). Den Pseudo skala er vist til høyre. (B) Representant Cameleon fluorescerende endringer knyttet til endringer i intracellulær kalsiumkonsentrasjon i en permeabilized berørings nevron. Før opptaket ble cellene inkubert i 30 min i en oppløsning inneholdende kalsium ionophore A23187-Br (10 mM) og en definert konsentrasjon av frie kalsium (250 nM i dette tilfellet). Rotenon (10 mM) og 2-deoksy-D-glukose (1,8 mm) ble også tilsatt til oppløsningen for å blokkere aktive pumper. Den neuron ble deretter perfusert med en oppløsning inneholdende 0 mM (5 mM EGTA) Ca 2 + og 10 mM Ca 2 + for å finne minimum og maksimal fluorescens-forhold endres. (C) Camekalibreringskurve som viser resultatene oppnådd 4-7 celler som fluorescens endringer ble evaluert i 11 forskjellige frie kalsium løsninger. Hvert utvekslingsforhold ble normalisert til den maksimale endringsforholdet for den enkelte celle. (D) (B). Det hviler Cameleon forholdet i dyrkede berørings nevroner var 22% ± 7 (n = 2, 18 celler) av maksimal ratio endring. Ut fra kalibreringskurven vist i (C) er dette forholdet tilsvarer en fri kalsiumkonsentrasjon på ~ 200 nM. Tilpasset fra 20. Klikk her for å se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans er en kraftig modellorganisme for å tyde den genetiske stier involvert i utvikling, atferd og aldring. Dens bekvemmelighet stammer primært fra den enkle som det kan være genetisk manipulert og fra sin korte livssyklus. Til tross for sin bekvemmelighet, C. elegans har sine begrensninger. C. elegans celler er små og innelukket i en trykksatt hårstråene som begrenser anvendelsen av metoder som krever direkte adgang til cellene, så som elektrofysiologiske og farmakologiske teknikker, eller isolering av spesifikke celletyper, slik som gen-ekspresjon profil ved mikromatriseanalyse. The C. elegans cellekultur-metoden har vært en løsning på mange av begrensningene i denne modellorganisme.

I dette manuskriptet beskriver vi en oppdatert metode for å isolere og dyrking embryonale C. elegans celler i stor skala basert på tidlig arbeid av Christensen og kollegene en. Vi also rapport publisert representative resultater oppnådd ved hjelp av en rekke forskjellige teknikker inkludert immunocytokjemi, elektrofysiologi og kalsium avbildning som har avansert vår forståelse av de fysiologiske prosesser og genetiske krav liggende celle-funksjonen i C. elegans. Arbeidet som er gjort så langt på kultivert C. elegans celler støtter at de skiller in vitro som de gjør in vivo rekapitulere uttrykk for celle spesifikke markører 1,18-20,22,23,27,44. Selv om ikke alle celletyper er blitt karakterisert i kultur, er dette legeme arbeid antyder at cellekulturmetode tillater studiet av C. elegans celler i isolasjon uten å svekke deres identitet.

Protokollen er enkel og lett anvendbar i ethvert laboratorium. Ting som må holdes i bakhodet for vellykket dyrking C. elegans embryonale celler er følgende: 1) Dyr må synkroniseres slik at de fleste av dem will bli drektige voksne på tidspunktet for inngrepet cellekultur. Starte ormen kultur fra en utsultet plate er et godt alternativ. 2) De bakterier som brukes til å vokse C. elegans må elimineres før orm lyse for å unngå forurensning av cellekulturen. Det anbefales at store volumer av sterilt vann er brukt til vaskinger, og at dyrene blir sentrifugert ved foreslått (ikke høyere) hastighet for å unngå utfelling av bakteriene i tillegg. Faktisk, mens behandling med lyseringsbuffer inneholdende blekemiddel skal eliminere bakterier, som starter fra en relativt bakteriefri dyr suspensjon anbefales. 3) Dyr skal behandles med blekemiddel / NaOH til ~ 80% av dem har gitt ut eggene sine. Kortere eller lengre inkubasjonstider redusere effektiviteten av egg utvinning og skade eggene hhv. 4) Eggeskall fordøyelsen ved chitinase bør overvåkes nøye. Manuell dissosiasjon bør startes ved ~ 80% av eggeskall er blitt spaltet. Lengre og kortere incubation ganger både resultere i celleskade, på grunn av direkte skade på plasmamembranen av enzymet og skade forårsaket av langvarig og grovere manuell dissosiasjon i forsøk på å isolere cellene, henholdsvis. 5) Cell filtrering gjennom fem mikrometer filter bør ikke bli tvunget. Hvis filteret blir tilstoppet, må den skiftes ut med et nytt for å unngå celleskader.

Til tross for at dyrkede embryonale celler har revolusjonert feltet på mange måter, de er ikke svaret for alle vitenskapelig spørsmål og fortsatt ha begrensninger. For eksempel er genene som uttrykkes i kultur er for det meste embryonale ettersom celler er isolert fra embryo. Subcellulære avdelinger kan ikke utvikle riktig i kultur. For eksempel, for utvikling og opprettholdelse av cilia av visse amphid sensoriske nevroner som AWA, og AWC er avhengig av interaksjonen med amphid gliaceller, som går tapt i kultur 44.. Cellene mister sine naturlige naboer og gjør ikke fysiologisk relvante celle-til-celle kontakter. For eksempel er det ikke kjent hvorvidt cellene danner trange veikryss, elektriske eller kjemiske synapser, og hvis de gjør, disse er ikke sannsynlig å være sammen med sine fysiologiske partnere. Videre blir cellene sådd ut på et enkelt substrat, peanøtt lectin. Den ekstracellulære matriks in vivo er sannsynlig å være en kompleks og vanskelig å reprodusere blanding av mange molekyler inkludert peanut lektin, laminin, kollagen og fibronektin. Videre spesialisert ekstracellulære matrise kanskje nødvendig for visse typer cellefunksjoner. For eksempel mechanosensitive kanal uttrykt i kroppsberørings nevroner og dannet av MEC-4 og MEC-10 underenheter kan ikke bli avgrenset i kultur 18, men kan lett gated in vivo 47.. Dette stammer sannsynligvis fra det faktum at ekstracellulære kollagen MEC-5 normalt blir produsert av nabostikkceller in vivo, er fraværende i kultur 48.. MEC-5, sammen med ekstracellulære matrix proteiner MEC-en (en 1999 aa langprotein med en Kunitz-type-domenet og to EGF-domener), og MEC-9 (en 834 aa lang protein som inneholder flere Kunitz-type domener, EGF gjentar og et glutaminsyre-rikt domene) er nødvendig for berøring følelse og er antatt å binde til de ekstracellulære domener av MEC-kanal kompleks og å utøve gating spenning på komplekset under mekanisk stimulering.

For å konkludere, C. elegans embryonale celler kan bli dyrket in vitro, og de ​​ser ut til å differensiere rekapitulere ekspresjonen av cellespesifikke gener. Protokollen for isolering og kulturen av cellene er enkel og kan anvendes i ethvert laboratorium med minimal erfaring i cellekulturteknikker. Med tanke på de begrensninger av denne teknikken, kan cellekultur metoden være og har vist seg å være en mektig teknikk når direkte celler tilgang til og / eller isolering av bestemte celletyper er nødvendig. En protokoll for å isolere celler fra larver er også nylig utviklet (not beskrevet her) 49. Utbredt interesse i å utvikle komplementære metoder gjør C. elegans en enda kraftigere system for til slutt å forstå sammenhengen mellom gen-funksjon og atferd, utvikling eller aldring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Bacto Peptone VWR International Inc. 90000-382
Difco Agar Granulated VWR International Inc. 90000-784
Bacto Tryptone VWR International Inc. 90000-284
Bacto Yeast Extract VWR International Inc. 90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid Invitrogen 11415-064
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16140-063
Penicillin-streptomycin Sigma P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus Sigma C6137-25UN
NA22 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center
Peanut Lectin Sigma L0881-10MG
Sucrose Sigma 57903-1KG
D-(+)Glucose Sigma 67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) Sigma E0396-25G
Hepes Sigma H3375-500G
Cholesterol
NaCl Sigma 57653-1KG
KCl Sigma P9333-500G
CaCl2 Sigma C1016-500G
MgCl2 Sigma M8266-100G
MgSO4 Sigma M2643-500 g
K2HPO4 Sigma P2222-500G
KH2PO4 Sigma P9791-500G
NaOH Sigma S8045-500G
KOH Sigma P1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips USA Scentific 1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped USA Scentific 1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector VWR International Inc. 89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond VWR International Inc. 53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile VWR International Inc. 14670-114
15 ml Conical Tube USA Scentific 1475-1611
50 ml Conical Tube USA Scentific 1500-1811
Sterile 18 gauge Needles Becton, Dickinson and Co. 305196
Sterile 10 ml Syringes Becton, Dickinson and Co. 305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size Corning 431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane VWR International Inc. 28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips VWR International Inc. 48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid Thomas scientific 6902A09
Dumont #5- Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Centrifuge 5702 Eppendorf 022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  6. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
  7. Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
  8. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
  9. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  10. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
  11. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
  12. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
  14. Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
  15. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
  16. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
  17. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
  18. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  19. Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
  20. Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
  21. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  22. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
  23. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
  24. Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
  25. Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
  26. Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
  27. Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
  28. Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
  29. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
  30. Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
  31. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  32. Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
  33. Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
  34. Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
  35. Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
  36. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  37. Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
  38. Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
  39. Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
  40. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
  41. Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
  42. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
  43. Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
  44. Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
  45. Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
  46. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
  47. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
  48. Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
  49. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).

Tags

Utviklingsbiologi Eukaryota biologiske fenomener Cell Fysiologisk fenomener C. elegans cellekultur embryonale celler
En metode for dyrking Embryonic<em&gt; C. elegans</em&gt; Celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sangaletti, R., Bianchi, L. A Method … More

Sangaletti, R., Bianchi, L. A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells. J. Vis. Exp. (79), e50649, doi:10.3791/50649 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter