Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Метод для культивирования эмбриональных Published: September 21, 2013 doi: 10.3791/50649
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

Summary

Мы описываем здесь пересмотренный протокол для крупномасштабного культуры эмбриональных С. Элеганс клетки. Эмбриональные С. Элеганс клетки, культивируемые в лабораторных, используя этот метод, по-видимому, дифференцировать и резюмировать экспрессию генов в определенном порядке клеток. Методы, которые требуют прямого доступа к клеткам или изоляцию специфические типы клеток из других тканей можно применять на С. Элеганс культивируемых клеток.

Abstract

С. Элеганс является мощным модель системы, в которой генетические и молекулярные методы легко применимы. До недавнего времени не менее, методы, которые требуют прямой доступ к клеткам и выделения специфических типов клеток, не могли быть применены в C. Элеганс. Это ограничение было связано с тем, что ткани заключены внутри герметичной кутикулы, которое не легко переваривается обработкой ферментами и / или моющих средств. Основываясь на ранней пионерской работе по Laird Блум, Кристенсен и его коллеги 1 разработали надежный метод для культивирования C. Элеганс эмбриональные клетки в больших масштабах. Яйца изолированы от беременных взрослых путем обработки отбеливающей / NaOH и затем обрабатывали хитиназы, чтобы удалить скорлупы. Эмбриональные клетки затем диссоциирует с помощью ручного пипетки и помещают на подложки, покрытые стеклом в сыворотке крови, обогащенной средах. В 24 часов в одиночных камерах начинают дифференцироваться путем изменения морфологии и, выражая определенную Marke клетокRS. C. Элеганс-клетки, культивируемые с помощью этого метода выживать в течение 2 недель в пробирке и были использованы для электрофизиологических, иммунохимическими и визуализации анализа, а также они были отсортированы и используется для микрочипов профилирования.

Introduction

Caenorhabditis Элеганс (C. Элеганс) является мощным модельным организмом для изучения молекулярных основ клеточной функции, дифференциации и поведения. В то время как его геном, метаболические и биосинтеза похожи на позвоночных », его генетических и молекулярных уступчивость гораздо больше 2. Среди его преимуществ являются его размер и простой анатомии, его быстрый цикл жизни (3 дней при 25 ° С), короткий срок службы (2 недели) и большое количество потомства (> 200). Благодаря своей гермафродитного природы и коротким жизненным циклом, молекулярные и генетические манипуляции просты в С. Элеганс, в том числе получения трансгенных животных 3,4 и применения генных методов бросовым таких как РНК-интерференция 5. С. Элеганс тело и яичной скорлупы прозрачны. Поэтому клетки могут быть легко визуализированы как в взрослых и эмбриона с помощью стандартного микроскопии. В последние 40 лет, С. Элеганс C. Исследование Элеганс в том числе большой коллекции мутантов, врезками и трансгенных, подробное описание анатомии и развития 6,7, в том числе полная реконструкция нервной системы 8, и полностью секвенированных генома, которая хорошо аннотированный и доступной для всего сообщества ( www.wormbase.com ).

Несмотря на многочисленные преимущества, некоторые экспериментальные подходы, создают большие сложности в С. Элеганс. К ним относятся те, которые требуют доступ к плазматической мембране клеток и тканей изоляции или типов клеток. Действительно C. Elegans ткани заключены внутри ее под давлением гидростатического скелета, которое не легко переваривается ферментативной обработкой или моющих средств. В конце 1990-х годов Мириам Гудман и Джанет Ричмонд впервые методы электрофизиологических записей С. Элеганснейроны и мышечные клетки в месте 9,10. Хотя эти методы дали нам важную информацию о нейронных и функции мышц в естественных условиях, они являются сложными и низкая пропускная. Альтернативные методы для изучения функции клеток в естественных условиях была разработана, в основном в частности, в естественных изображений кальция с использованием генетически закодированные датчики кальция, такие как GCamP и Cameleon 11-13. Эти методы не менее, не позволяют использование фармакологических средств, так как они применяются на интактных живых животных.

Первая попытка культивирования C. Элеганс клетки в пробирке в больших масштабах выступил Laird Блум в ходе подготовки своей диссертации 14. К сожалению, трудности, возникающие с плохой адгезии клеток к подложке, плохое дифференцировка клеток и выживание предотвратить создание этой ранней протокола как надежного метода культуры клеток. В 1995 году Эдгар и его коллеги опубликовали процедуруисследовать деление клеток и морфогенеза путем выделения и культуры одного C. Элеганс эмбрионов 15. Эмбриональные клетки, полученные путем гидролиза из яичной скорлупы с комбинацией ферментативной обработки и ручной диссоциации, продолжали размножаться, производя до ~ 500 клеток 15. Впоследствии Леунг и его коллеги культивировали небольшие количества бластомеров для изучения кишечной морфогенез. Они показали, что один в пробирке изолированные E бластомер производится поляризованные клетки кишечника, которые создали структуру, аналогичную просвет кишечника, взаимодействуя друг с другом через верхушечных слипчивых соединений 16. Бюхнер и его коллеги также сообщили подобный метод для культивирования C. Элеганс эмбриональные клетки в пробирке 17.

Основываясь на этой ранней работы, Кристенсен и его коллеги разработали надежную протокол для культивирования эмбриональных C. Элеганс клетки в пробирке 1. Онипоказали, что изолированные C. Элеганс клетки могут дифференцироваться в различные типы клеток и поддерживать функции, которыми они обладают в естественных условиях, в том числе экспрессию маркеров для соты. Некоторые методы, которые являются сложными в естественных условиях, могут быть применены на изолированных С. Элеганс эмбриональные клетки. К ним относятся электрофизиологические 1,18 19 изображений, и иммунохимических методов 20,21, а также изоляцию специфические типы клеток флуоресцентным-Активированный сортировки клеток (FACS) для строительства клеточных конкретных библиотек кДНК 22,23. Генные нокдаун методы, такие как РНК-интерференция (RNAi) может быть применен на культивируемой С. Элеганс клетки 1 и роман метаболический метод маркировки с помощью Азидо-сахар в качестве инструмента для открытия гликопротеина недавно был разработан для в пробирке культурного C. Элеганс клетки 24.

В заключение, метод культуры клеток расширяет массив Oе методы, которые могут быть применены к С. Элеганс модель в попытке расшифровать функции генов в контексте живой организм. Мы описываем здесь протокол для культивирования C. Элеганс эмбриональные клетки в пробирке, которая в значительной степени на основе протокола, впервые описанным Кристиансен и 1 коллегами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Звездочки (*) указывают новые или измененные меры по сравнению с Кристенсен и др.. 1

1. Настройка Материал

  1. Процедура культуры клеток требует большого количества яиц, изолированных от беременных взрослых. Расти C. Элеганс на 8P пластин агара высевают с na22 (доступно через C. Элеганс генной консорциума - CGC) бактерий, чтобы изолировать большое количество яиц. В этих плит количество пептона, используемой в 8 раз сумма, которая обычно используется для NGM пластин. Чем выше концентрация пептон более эффективно поддерживает рост na22 бактерий, которые в отличие от OP50-, растут в толстых слоях.

8P пластины рецепт:

Растворите 3 г NaCl, 20 г Бакто-пептона, 25 г агара в 1 л стерильной дистиллированной воды и автоклаве в течение 30 мин. Пусть Medium Cool при 55 ° С, а затем добавить стерильно фильтруют 1 мл холестерина (5 мг / мл в этаноле), 1 мл 1 MgCl 2, 1 мл MgSO 4 и 25 мл KP буфера (фондовой 500 мл: 5 г K 2 HPO 4, 30 г KH 2 PO 4, рН 6.00). Залейте жидкое агаровой среды на 10 см чашки Петри (25 мл / планшет).

  1. На следующий день распространилась всю поверхность каждого обогащенного пептонной агаром с 1 мл na22 Е. палочка культивировали в течение ночи в 2xYT СМИ (16 г триптон, экстракт 10 г дрожжей, 5 г NaCl в 1 л стерильной воды, рН 7,0) при 37 ° С Эти бактерии образуют обильный источник пищи, который сформирует толстый слой, поддерживающий рост больших количеств беременных взрослых. Оставьте семенами пластины ночи при комнатной температуре, чтобы позволить рост бактерий. Этот процесс может быть ускорен путем инкубации при 37 ° С в течение 4-5 часов.
  2. Трансфер голодали животных посеянных 8P пластин. Промыть животных покинуть голодал NGM пластины с использованием 5-6 мл буфера M9 или воды и добавляют 1-2 мл этой суспензии к каждому 8P пластины.
  3. Разрешить рост и размножение животных ЕНТIL планшеты заселен при слиянии на беременных взрослых.
  4. Изолировать яйца, необходимые для приготовления C. Элеганс эмбриональные клетки, от беременных взрослых, используя 5-6 мл лизирующего раствора.

Лизис решение рецепт

5 мл свежей Bleach, 1,25 мл 10 N NaOH и 18,5 мл стерильной H 2 O. Эта смесь должна быть подготовлена ​​свежий перед каждым использованием.

  1. Вымойте яйца, выделенные из беременных взрослых с использованием яиц буфер:

Яйцо буфер рецепт

118 мМ NaCl, 48 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 2 мМ MgCl 2, 25 мМ Hepes, рН 7,3, осмолярность 340 мОсм.

  1. Снимите яичную скорлупу, которая окружает яйца обработкой хитиназы. Хитиназа является ферментом, с высокой активностью в кислом рН 25. Растворить хитиназу (Sigma, каталожный номер. C6137) в яичном буфере с рН 6,5 до конечной концентрации 2 мг / мл. Храните хитиназы акциираствор при -20 ° С в 1 мл аликвоты в стерильные 15 мл конические пробирки. Аликвоты могут храниться при температуре -20 ° С до нескольких месяцев.
  2. Расти C. Элеганс культивируемые клетки на автоклавного покровные (диаметр 12 мм), покрытых с арахисовым лектина. Растворить арахисовое лектин в стерильной воде (0,5 мг / мл). Арахис решение лектин не следует фильтровать или в автоклаве. Кроме того, не нужно лечить с помощью УФ-света. Магазин 2 мл аликвоты при -20 ° С в течение до 6 месяцев.
  3. Полная среда клеточной культуры (500 мл) содержит 500 мл L-15 культуральную среду от Gibco, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (инактивированной нагреванием), 7,7 г сахарозы (45 мОсм), 5 мл 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (2%). Полную среду затем фильтруют с помощью фильтра с порами 0,20 мкм.

Обратите внимание, что буфер яйцо и культурная среда имеют осмолярность 340 и 345 мОсм соответственно. В самом деле, в отличие от клеток млекопитающих, C. Elegans клетки имеют относительно высокую осмолярность, который должен быть принят во подсчета при приготовлении растворов, которые придут в непосредственный контакт с плазматической мембраной клеток. Рецепты этих реагентов были скорректированы, чтобы достичь желаемого осмолярность, которое было измерено с помощью осмометр 1. Не стоит использовать осмометр если эти рецепты следуют точно и ухода используется в подготовке этих реагентов. Однако следует использовать Osmoter если другие решения должны быть подготовлены, чьи рецепты не сообщается здесь или в любой из публикаций, использующих C. Элеганс культивируемых клеток.

2. Яйцо Изоляция

  1. Рекомендуется, чтобы начать с по крайней мере четыре 8P пластин для сбора достаточного количества яиц на 12 лунок культивируемых клетках (в 24-луночных планшетах).
  2. Перед началом процедуры таять один тюбик арахисовое лектин маточного раствора. Поместите автоклавного покровные в нижней части лунки в 24-луночный планшет и добавляют 200 мкл лектина арахиса к покровные. Инкубировать в течение 1 часа или Until клетки готовы к покрытием. Полностью удалить арахисовое лектин и промывают лунки один раз 1 мл стерильной автоклавного воды. Полное удаление арахиса лектина от покровных имеет важное значение для предотвращения слипания клеток.
  3. Вымойте беременной взрослых от агара с использованием стерильного автоклавного воды. Сбор суспензии в два стерильных конической трубе 50 мл. Оставьте пробирки во льду в течение вплоть до 5 мин, чтобы позволить осаждение червей в нижней части трубок (*). Удалить воду с передачи пластиковой пипетки и заменить его свежим стерильным автоклавного воды. Гранул червей на настольной центрифугирования при 200g (~ 1200 оборотов в минуту) в течение 10 мин (*). Повторите этот последний шаг, по крайней мере 3.
  4. Передача червей в стерильный 15 мл коническую пробирку и гранул их при 200g (~ 1200 оборотов в минуту) в течение 10 мин (*). Не следует использовать более высокую скорость центрифугирования, чтобы избежать сбора бактерий в нижней части трубки, а также. Иногда после центрифугирования черви не полностью осаждали. Мтер друг вымыть и перед удалением супернатанта, поместить пробирки в течение 5 мин на льду. В охлажденной воды червей осадок на дне пробирки.
  5. Удалить воду и добавить 5-6 мл лизирующего раствора (см. Материал создан). Rock подвеску на медленном огне 5-10 минут, а затем приступить к мониторингу червя лизис под стереомикроскопа через каждые 2-3 мин. Каплю суспензии могут быть также размещены на покровное для облегчения контроля. Инкубационный период варьируется в зависимости от свежести отбеливателя; купить маленькие бутылки отбеливателя и открыть новую бутылку каждый месяц.
  6. При ~ 70-80% червей лизируют (10 мин от начала инкубации), остановить реакцию лизиса, добавив 9 мл яичного буфера рН 7,3 (см. Материал создан). Центрифугируют суспензию с 200 мкг (~ 1200 оборотов в минуту) в течение 10 мин. С этого момента есть горелку на, на скамейке, чтобы предотвратить повторное загрязнение яиц (*).
  7. Осторожно удалите супернатант, используя стерильный пластиковый пипетки передачи и мыть гранул 3-4х с яйцом буфера, пока раствор не станет прозрачным. Убедитесь в том, чтобы смешать гранулы хорошо в буфере яйца во время каждого мытья.
  8. Яйца отделены от туш животных с использованием 30% раствора сахарозы. Ресуспендируют гранул в 2 мл стерильной буфера яйцо и добавить 2 мл 60% раствора сахарозы (фондовый в стерильной буфера яиц). Хорошо перемешайте и центрифуги в течение 20 мин при 200g (~ 1200 оборотов в минуту) (*).
  9. Осторожно снимите трубки из центрифуги. Яйца с плавающей в верхней части раствора. Использование P1000 пипетки и стерильные наконечники, передать все яйца в свежих стерильные 15 мл коническую трубку.
  10. Добавьте 10 мл стерильного буфера яиц в пробирку и центрифугируют при 200 х г (~ 1200 оборотов в минуту) в течение 10 мин. Повторите промыть 3 раза. Убедитесь в том, что яйца полностью ресуспендировали в буфере яйца во время каждого мытья.

3. Эмбриональные клетки диссоциация

Провести следующие этапы процедуры в стерильных условиях с использованием ламинаре. В то время как животныеплатье на бактерии пластин, промываний и лечения с лизиса раствора, содержащего отбеливатель должны устранить большинство, если не все бактерии. Таким образом, используя ламинарный капот на данный момент процедуры предотвращает новую загрязнения яиц подвески.

  1. Ресуспендируют осаждали яйца в 1 мл 2 мг / мл хитиназы (складочном в яичном буфера рН 6,5 (*)) и передать их в новую стерильную 15 мл коническую трубку. Rock трубку в течение 10-30 мин при комнатной температуре. Точное время инкубации изменяется в зависимости от свежести фермента и температурой в помещении и, следовательно, должен быть определен для каждого препарата. Рекомендуется начать мониторинг яйца под перевернутой культивирования клеток микроскопом после 10 мин инкубации. Примечание: по нашему опыту, низкий рН увеличивает ферментативную активность хитиназы. По этой причине мы используем яйцо буфер при рН 6,5 распустить хитиназы (рецепт сообщалось выше, где рН доводят до 6,5 с помощью NaOH).
  2. При ~ 80% из яичной скорлупы перевариваютсялечение хитиназа (рис. 1 AB), осаждения яиц путем центрифугирования при 900 мкг в (~ 2500 оборотов в минуту) в течение 3 мин (*). Использование P1000 пипетки и стерильные наконечники, удалить тщательно супернатант и добавить 3 мл L-15 среды (*).
  3. Передача яйца в диаметре пластины диаметром 6 см и осторожно отделить клетки с использованием 10 мл стерильного шприца, снабженного 18 G иглу. Монитор степень диссоциации, помещая каплю суспензии в свежем пластиковой чашке Петри и просмотра под микроскопом. Не аспирации воздуха в шприц во время этой процедуры, чтобы не повредить клетки. Продолжить диссоциацию до ~ 80% клеток не диссоциируют.
  4. Суспензию фильтруют с помощью стерильного 5 мкм Millipore фильтр. Клеточные суспензии должен быть отфильтрован, чтобы удалить клеточные скопления, непереваренные яйца и выведенных личинок. Фильтр дополнительные 4-5 мл свежих L-15 СМИ через фильтр, чтобы восстановить все клетки. Не прилагайте чрезмерных усилий во время стадии фильтрации, чтобы избежать DAmaging фильтр и / или клеток.

4. Культивирования клеток

  1. Гранул диссоциированных клеток путем центрифугирования при 900 мкг (~ 2500 оборотов в минуту) в течение 3 мин (*). Использование P1000 пипетки и стерильные наконечники тщательно удалить все супернатант. Ресуспендируют клетки осаждали в полной L-15 среды и пластины 1 мл / лунку. Количество добавленного среды зависит от количества используемого 8P пластин, слиянии червей на пластинах, и типа экспериментов, которые будут выполнены на клетках. Плотность клеток может быть определена с помощью гемоцитометра. Для патч-зажим записи обшивки плотность ~ 230000 клеток / см 2 является оптимальным.
  2. Держите пластину 24 скважин в пластиковом Tupperware контейнер, содержащий влажные бумажные полотенца, чтобы избежать испарения питательной среды. Хранить контейнер в увлажненном инкубаторе при 20 ° С и атмосферном воздухе.
  3. Клетки, как правило, готовы к экспериментам в пределах 24 часов, когда морфологическая дифференцировка и экспрессион GFP маркеров являются полными. Клетки могут быть в культуре в течение до 2 недель, но они, как правило, самый здоровый до 7-9 дней после посева. Среда должна быть заменена раз в день, чтобы поддерживать здоровые клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C. Элеганс культивируемые клетки дифференцируются и экспресс клеток специфические маркеры

Кристенсен и его коллеги с помощью окрашивания трипановым синим показали, что> 99% эмбриональной С. Элеганс клетки выживают процедуру изоляции. На 9-й день и 22 после посева, 85% и 65%, соответственно все еще ​​живы 1. Изолированные эмбриональных С. Элеганс клетки должны придерживаться подложку, чтобы отличать. Клетки, которые не придерживаются образованию комков и не ясно, выжить ли они. Дифференцировка клеток начинается 2-3 ч после посева и продолжается в течение ~ 24 часов. В 24 часов, клетки принимают на конкретных морфологии. Таким образом, нейроны посылают процессы 1,18-20, мышечные клетки образуют пальцеобразные вытянутые структуры, подобные тем, которые видели в естественных условиях 1 и канала клеток образуют просвет 17. Морфологические особенности в пробирке удивительно похожи на те, в естественных условиях. Например, <EM> в пробирке культивированный ALM и PLM сенсорные нейроны (обозначенные выражения Pmec-4 :: GFP) разработать только два нервных процессов с одним больше, чем другие, как они это делают в естественных условиях 1,20 (рис. 2А). Это означает, что по крайней мере некоторые из молекулярных механизмов, которые ведут дифференциацию С. Elegans клетки клеточной автономно и, таким образом, могут быть обобщены в пробирке.

В 1990-х годах, Chalfie пионером в использовании зеленого флуоресцентного белка (GFP) в С. Элеганс маркировать типы клеток, в которых интерес ген экспрессируется 26. Работа, проделанная до сих пор на культурной C. Элеганс эмбриональные клетки поддерживает, что экспрессия GFP в специфические типы клеток могут быть обобщены в пробирке 1,18-20,27 (рис. 2А). Кроме того, отношение клеток, которые экспрессируют GFP в пробирке аналогично соотношению, найденного в естественных условиях. Например, UNC-4 гомеодоменовый репортерген экспрессируется в 13 моторных нейронов в зрелом эмбриона (13 из 550 клеток-2,3%) 28,29. Fox и коллеги, считали UNC-4 :: GFP клеток в культуре и обнаружили, что они 2% от общего числа клеток 23. Точно так же, UNC-119, белок необходим для G торговли белка 30, выражается в большей C. Элеганс нейроны и некоторые мышечные клетки (76% из клеток в L1 личинки 31). Кристенсен и его коллеги сообщили, что в культуре UNC-119 :: выражение GFP наблюдалась в 74-76% клеток, напоминающих нейроны и мышечные клетки 1. Наконец, MEC-4, механочувствительных Na + / Са 2 + каналов субъединицы необходимы для нежного прикосновения 32 выражается в 6 сенсорных нейронов у взрослых С. Элеганс. Из этих шести сенсорных нейронов, четыре (милостыню и PLMS) являются зародыше происходит. Таким образом 4 из 550 (0,7%) эмбриональные клетки должны выразить GFP под контролем MEC-4-промотора. В самом деле, нейроны в культурное, что выразить Pmec-4 :: GFP составляют ~ 0,5% от общего числа клеток 18,20.

Белковые маркеры и посттрансляционные модификации, которые соты можно наблюдать и в пробирке. Например, альфа тубулина ацетилируется только в сенсорных нейронов в С. Элеганс 33. Экстракорпоральное процессы сенсорных нейронов пятно с антителом, поднятые против ацетилированного-альфа-тубулина 20 (рис. 2В). Искусственный сенсорные нейроны также выразить токсическое мутантный канала MEC-4 (г), что приводит к гибели сенсорных нейронов в естественных условиях 34. Действительно, GFP выражения нейроны, полученные из MEC-4 (г); pmec-4 :: GFP штамм изначально присутствует в культуре, но затем вырождаются 20. Важно отметить, что прикоснуться нейроны, полученные из MEC-4 (г); pmec-4 :: GFP ведут себя в пробирке аналогично тому, как они ведут себя в естественных условиях. Например, они могут быть спасены от смерти обработкойmiloride и дантролен, что запчасти MEC-4 (г) сенсорные нейроны от дегенерации в естественных условиях 20,35. В заключение, не только С. Элеганс эмбриональные клетки морфологически напоминают клетки в живом организме, но они также выразить специфические маркеры клеток и присутствуют в той же пропорции они присутствуют в естественных условиях. Взятые вместе, поддерживать эти данные, что культивируют С. Элеганс клетки составляют общую хорошую систему для изучения биологических процессов как на клеточном и молекулярном уровнях.

Патч-зажим электрофизиологические анализ культурного C. Элеганс клетки

Техника патч-зажим, который был представлен Sakmann и Неер в семидесятых для изучения деятельности ионных каналов из клеток в изоляции или в тканях может быть применен к культурной C. Элеганс клетки 36. Кристенсен и его коллеги были первыми, кто учиться ионные каналы в культурной C. Элеганс ячеек с помощьюПатч-зажим 1. С тех пор, K +, анионные, катионные и неселективные каналов (фиг. 2 CE), а также переносчиков дофамина-зависимые каналы были описаны в культуре С. Элеганс 1,18,19,37. Эти исследования расширили наше понимание роли ионных проводимостей в функции С. Элеганс нейронов. Есть несколько модификаций, которые должны быть рассмотрены при использовании метода патч зажим для записи активность ионов канала от культурного C. Элеганс клетки. Эти изменения в основном отношение к целых записей клеток. Во-первых, С. Elegans клетки малы, например, нейроны имеют диаметр 1-2 мкм. Таким образом, стекло пипетки должны иметь небольшой наконечник (0,5 мкм). Небольшие наконечники увеличить входное сопротивление, в результате чего стимуляции и регистрации ошибок. Чтобы решить эту проблему, пипетки может быть построена, чтобы иметь маленький совет, но широкий конус. Гудман и Lockery разработали метод эмиloying пожара полировщик оснащенный воздушным насосом высокого давления для литья пипеток в этой форме 38. Во-вторых, из-за малого размера клеток, получая весь доступ клеток с помощью всасывания обычно приводит к повреждению клетки. Гораздо выше успех обычно достигается путем применения импульс высокого напряжения (электрический Подгонка) в участке мембраны под кончиком пипетки. Другие конфигурации технике патч зажим (клеток прилагается, наизнанку и за ее пределами выезда) просты для применения к С. Элеганс культивируемые клетки, с той лишь модификацией, что кончик пипетки должен быть небольшим, чтобы принимать во внимание небольшой размер С. Элеганс клетки. Перфорированная техника патч, как известно, более трудоемкий и требует много времени, чем другие методы патч зажим. Тем не менее, он был успешно применен на С. Элеганс клетки в месте 39, 40 и, таким образом, должны применяться в культуре, а также.

Визуализации кальцияметоды, применяемые к С. Элеганс культивируемые клетки

Функциональная роль напряжения закрытого Са 2 + каналов (VGCC) в нейронах и глии была исследована в культурной C. Элеганс клеток путем визуализации кальция 20, 21, 41. Применение визуализации кальция в культуре позволило использование растворов, содержащих высокие концентрации KCl, чтобы побудить клетки деполяризацию и блокаторов кальциевых каналов различить вклад различных типов каналов притока кальция. Например, вклад Na + / Ca 2 + проницаемой MEC-4 (г) канала к внутриклеточной концентрации кальция была определена с помощью визуализации кальция CAMELEON YC2.12 в присутствии и в отсутствие DEG / ENaC канал блокатор амилорид. Эти эксперименты показали, что амилорид-чувствительных приток кальция присутствует в сенсорных нейронах, выражающих MEC-4 (D), но не в сенсорных нейронах дикого типа. Использование ионофор на проницаемыми мембранукоснуться нейронов и для калибровки Cameleon (3а и В), Бьянки и его коллеги также установили, что средняя концентрация бесплатно кальция в сенсорном нейроне составляет 200 нМ 20 (рис. 3C и D). Точно так же, Frokjaer-Дженсен и его коллеги исследовали роль VGCCs EGL-19 и UNC-36 в регуляции деполяризации, вызванной приток кальция в С. Элеганс культивировали механосенсорных нейроны, выражающие Cameleon 21. Они обнаружили, что деполяризация сенсорных нейронов, индуцированные внеклеточным K + в диапазоне между 20 и 100 мм, в результате подъема внутриклеточного кальция, обнаруженные на YFP / CFP изменения соотношения между 17% и 70%. Кроме того, переходные кальция были снижены на EGL-19 и UNC-36 мутаций с потерей функции и не были обнаружены в отсутствие внеклеточного Ca 2 + предполагая, что VGCCs играть ключевую роль в возбудимости С. Элеганс прикоснуться нейроны 21.

Стаут и Parpura рассмотрели роль напряжения закрытого Ca 2 + каналов EGL-19, ОСО-1 и UNC-2 в CEPsh оболочки глии головной сенсилл в содействии притоку кальция 41. Динамика внутриклеточного кальция были проанализированы в CEPsh глиальных клеток, культивированных из трансгенных животных совместно выражающих красный флуоресцентный маркер mCherry и зеленый флуоресцентный цитозольную Са 2 + индикатор GcaMP2.0. В большинстве клеток глии CEPsh, деполяризацию мембраны, индуцированный высоких внеклеточных концентраций KCl индуцированное увеличение внутриклеточного Са 2 +, как сообщает роста флуоресценции GcaMP2.0. Кроме того, лечение с кальциевых каналов блокаторы Cd 2 + и NEMA (nemadipine-А) значительно снижается переходные кальция. Эти данные подтверждают, что напряжение зависимое повышение внутриклеточного кальция в CEPsh глиальных клеток зависит, по крайней мере частично, на напряжения закрытого кальциевых каналов. Авторы, дополнительно проанализированы внутриклеточные изменения кальция в L-типа EGL-19RF (снижение функции), Т-типа CCA-1 и N, P / Q, R-типа канала UNC-2 нокаутом животные и пришли к выводу, что все три типа Ca 2 + каналов внести существенный вклад в динамику внутриклеточного кальция в этих глиальных клеток . Таким образом, поскольку незрелые макроглии млекопитающих реагировать на деполяризации через VGCC-зависимых изменений в внутриклеточных + концентрациях Ca 2, авторы приходят к выводу, что C. Элеганс CEPsh глиальные клетки могут функционально напоминают млекопитающих макроглии, астроциты, олигодендроциты и клетки-предшественники олигодендроцитов.

Другие методы, применимые к культурной C. Элеганс эмбриональные клетки

Флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS) был успешно применен к С. Элеганс культивируемых клеток обогатить культур с определенными типами клеток и / или изолировать клетки для анализа микрочипов 23,4243. Основная модификация, которая должна была быть введенак способу культивирования клеток был тип используемого субстрата. Странные и его коллеги протестировали разные субстраты, включая коллагена IV, поли-L-лизин, фибронектин и ламинин и установлено, что поли-L-лизин является лучшим субстратом 37. Поли-L-лизин способствует дифференциации клеток так же, как арахисовое лектина, но в отличие от арахисового лектина позволяет отделение клеток от подложки без ущерба 36. Несколько различных типов С. Элеганс клетки были отсортированы по СУИМ, в том числе thermosensory, обонятельных, двигателя и механосенсорных нейронов и глии 23,42 - 45. Сотовый маркировка было достигнуто путем экспрессии GFP репортеров и в общем, сортировка эффективность высока с выделением до 90% GFP-меченых клеток 23.

Молчание генов РНК-интерференции (RNAi) может быть достигнуто в культуре. Кристенсен и его коллеги показали, что инкубация GFP-экспрессирующих культивируютC. Элеганс нейронов с дцРНК против GFP привело к значительному снижению уровня экспрессии GFP с максимальным эффектом через 4 дня после того двухцепочечной РНК в культуру 1. Точно так же, Ши и его коллеги использовали RNAi в культуре, чтобы продемонстрировать, что С. Элеганс SID-1 необходим для посреднических эффект дсРНК и это, скорее всего, необходимо в естественных условиях за посредничество системное распространение РНК-интерференции 46. В заключение, РНК-интерференции, который является одним из наиболее часто используемых и эффективных методов молчания генов в С. Элеганс могут быть применены в культуре. Этот метод может быть использован для глушителей генов, нокаут смертельна или мешает С. Элеганс нормальное развитие.

Рисунок 1
Рисунок 1. С. Элеганс эмбрионов до и после лечения хитиназы. (A) фотографии яиц перед воздействием циtinase. Стрелка указывает на прозрачных и неповрежденных яичной скорлупы, окружающих эмбрион. (В) Яйца, получавших хитиназы в течение 10 мин. В яичная скорлупа не были переваривается и не видны вокруг эмбрионов. Стрелки указывают на эмбрионах трехкратно, освобожденных из яичной скорлупы. Синяя коробка окружает группу ячеек, которые все еще прикреплены друг к другу.

Рисунок 2
Рисунок 2. Искусственный С. Элеганс прикоснуться нейронов. () Люминесцентная микрофотография культурного C. Элеганс прикоснуться нейроны, экспрессирующие GFP под ощупь промотор тес-4 (Р тес-4 :: GFP), масштаб шин 5 мкм. (В) Флуоресцентные микрофотографии сенсорным нейроном выражения P MEC-4 :: GFP (верхняя панель), который окрашивали моноклональным антителом против ацетилированного альфа-тубулина (Sigma), posttranslationaл модификация альфа тубулина, что происходит в сенсорных нейронах только 33. Взято из 20. (CE) Пример механочувствительных каналов, записанных в дикого типа культивируемых сенсорных нейронов в конфигурации ячейки подключением техники патч зажим. Канал имеет проводимость ~ 100 пс и он присутствует в сенсорных нейронах, выделенных из тес-4 нокаутом животных (MEC-4 (u253)), а. Эти данные позволяют предположить, этот канал не является каналом MEC 20. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3
Рисунок 3. Оценка свободной внутриклеточной концентрации кальция в культивируемых сенсорных нейронов, использующих Cameleon. (A) Псевдоцвет образы культивируемых сенсорных нейронов, выражающие Cameleon YC2.12 в 0 мм Ca 2 + (+ EGTA, слева) и в 10 мМ Ca 2 + (справа). Масштабы псевдоцветовую показано на рисунке справа. (В) представитель Cameleon флуоресцентные изменения, связанные с изменением внутриклеточной концентрации кальция в проницаемыми сенсорным нейроном. До записи, клетки инкубировали в течение 30 мин в растворе, содержащем кальциевый ионофор BR-23187 (10 мкМ) и определенную концентрацию свободного кальция (250 нМ в этом случае). Ротенон (10 мМ) и 2-дезокси-D-глюкозы (1,8 мм) были добавлены к раствору, чтобы блокировать активные насосы. Нейрон затем вливают раствор, содержащий 0 мм (+5 мМ EGTA) Ca 2 + и 10 мМ Са 2 +, чтобы определить минимальное и максимальные изменения соотношения флуоресценции. (С) Cameleon калибровочной кривой, показывая результаты, полученные от 4-7 клетки, флуоресценция изменения были оценены в 11 различных решений свободного кальция. Каждое изменение соотношение был нормализован до максимального изменения соотношения для отдельной клетки. (D) (B). Отдыхает отношение Cameleon в культивируемых сенсорных нейронов составила 22% ± 7 (п = 2, 18 ячеек) максимального изменения соотношения. На основе калибровочной кривой, показанной в (С) это соотношение соответствует концентрации свободного кальция из ~ 200 нм. Взято из 20. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

С. Элеганс является мощным модельным организмом для расшифровки генетических путей, участвующих в разработке, поведения и старения. Ее удобство происходит, главным образом от той легкости, с которой он может быть генетически манипулировать и от его короткого жизненного цикла. Несмотря на удобство, С. Элеганс имеет свои ограничения. C. Elegans клетки крошечные и заключены в герметичной кутикулы, что ограничивает применение методов, которые требуют прямого доступа к клеткам, таким как электрофизиологических и фармакологических методов, или выделение специфических типов клеток, таких как профиль генной экспрессии путем анализа микрочипов. С. Метод культуры клеток Элеганс был решением для многих из ограничений этого модельного организма.

В этой рукописи мы описываем обновленный метод выделения и культивирования эмбриональных C. Элеганс клетки в больших масштабах на основе ранних работ по Кристенсен и его коллеги 1. Мы ALSо докладе, опубликованном репрезентативные результаты, полученные с использованием различных методов, включая иммуноцитохимия, электрофизиологии и визуализации кальция, которые расширили наше понимание физиологических процессов и генетические требований базового функции клеток в С. Элеганс. Работа, проделанная до сих пор на культурной C. Элеганс клетки поддерживает, что они дифференцируются в пробирке, как в естественных условиях обобщал экспрессии специфических маркеров клеток 1,18-20,22,23,27,44. Хотя не все типы клеток, были охарактеризованы в культуре, это объем работы предполагает, что метод культуры клеток позволяет изучение С. Элеганс клетки в изоляции без ущерба их личность.

Протокол является простым и легко применимо в любой лаборатории. Вещи, которые необходимо иметь в виду, для успешного культивирования C. Elegans эмбриональные клетки являются следующие: 1) Животные должны быть синхронизированы так, что большинство из них Вильл быть беременной взрослых во время процедуры клеточной культуры. Запуск червя культуру от голода пластины является хорошим вариантом. 2) Бактерии используются для выращивания C. Элеганс должны быть устранены до червя лизиса, чтобы избежать загрязнения клеточной культуре. Рекомендуется, чтобы большие объемы стерильной воды используются для промывки и что животные центрифугируют при предложил (не при более высокой) скорости, чтобы избежать осаждения бактерий, а также. В самом деле, в то время как лечение с помощью лизирующего буфера, содержащего отбеливатель должен устранить бактерии, начиная с относительно бактерий свободные животных суспензии рекомендуется. 3) Животные следует относиться с отбеливателем / NaOH до ~ 80% из них не выпустили их яйца. Более короткие и более длинные периоды инкубации снижают эффективность извлечения яиц и яиц повредить соответственно. 4) Яичная скорлупа пищеварение хитиназой следует пристально следить. Руководство диссоциации следует начинать, когда ~ 80% из яичной скорлупы были переварены. Длиннее и короче incubatионные раз и привести к повреждению клеток, в связи с прямой ущерб плазматической мембраны ферментом и повреждения в результате длительной и более жесткой механической диссоциации в попытке изолировать клетки, соответственно. 5) фильтрация Cell через фильтр 5 мкм не должны быть вынуждены. Если фильтр засоряется, он должен быть изменен на свежую, чтобы избежать повреждения клеток.

Несмотря на то, что культивируемые эмбриональные клетки революцию в области во многих отношениях, они не являются ответом на каждый научный вопрос и до сих пор имеют ряд ограничений. Например, гены, выраженные в культуре, в основном эмбриональной с клетки выделяют из эмбрионов. Субклеточных отсеков не может правильно развиваться в культуре. Например, разработка и сопровождение ресничек определенных amphid сенсорных нейронов, таких как AWA и AWC зависят от взаимодействия с amphid глии, которая теряется в культуре 44. Клетки теряют свои природные соседей и не делают физиологически отнЕВАНТ клетка-клетки контакты. Например, не известно, клетки образуют ли плотные соединения, электрические или химические синапсы и если они это сделают, это вряд ли будет с их физиологическими партнерами. Кроме того, клетки высевают на одной подложке, арахисовое лектина. Внеклеточного матрикса в естественных условиях, вероятно, будет сложным и трудно воспроизвести смесь многих молекул, включая арахисовое лектина, ламинин, коллаген, и фибронектина. Кроме того, специализированная внеклеточный матрикс, может быть, необходимое для определенных типов клеточных функций. Например, механочувствительных канал выражается в корпуса сенсорных нейронов и формируется MEC-4 и MEC-10 субъединицы не может быть закрытого в культуре 18, но может быть легко закрытого в естественных условиях 47. Это скорее всего проистекает из того факта, что внеклеточный коллаген MEC-5 обычно получают соседних шва клетки в живом организме, отсутствует в культуре 48. MEC-5, вместе с белками внеклеточного матрикса MEC-1 (1999 аа долгобелок с доменом Kunitz-типа и двух областей EGF) и MEC-9 (а аа 834 длинного белка, который содержит несколько доменов Kunitz-типа, EGF повторы и домен глутаминовой кислоты богатых) необходимы для сенсорного ощущения и, как полагают, чтобы связать на внеклеточных доменов канала комплекса MEC и приложить напряжение на стробирования комплекса при механической стимуляции.

В заключение, С. Элеганс эмбриональные клетки можно культивировать в пробирке и они появятся дифференцировать обобщал экспрессии специфических генов клеток. Протокол для изоляции и культуре клеток является простым и может быть применено в любой лаборатории с минимальным опытом в методов культуры клеток. Принимая во внимание ограниченность этого метода, метод культуры клеток могут быть и доказала, что это мощная техника, когда прямые клетки доступ и / или изоляция специфические типы клеток необходимы. Протокол для выделения клеток из личинок был также недавно разработанный (пOT описано здесь) 49. Широкое интерес к разработке дополнительных методов делает C. Элеганс еще более мощная система для в конечном счете понимания связи между функцией генов и поведения, развития или старения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Bacto Peptone VWR International Inc. 90000-382
Difco Agar Granulated VWR International Inc. 90000-784
Bacto Tryptone VWR International Inc. 90000-284
Bacto Yeast Extract VWR International Inc. 90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid Invitrogen 11415-064
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16140-063
Penicillin-streptomycin Sigma P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus Sigma C6137-25UN
NA22 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center
Peanut Lectin Sigma L0881-10MG
Sucrose Sigma 57903-1KG
D-(+)Glucose Sigma 67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) Sigma E0396-25G
Hepes Sigma H3375-500G
Cholesterol
NaCl Sigma 57653-1KG
KCl Sigma P9333-500G
CaCl2 Sigma C1016-500G
MgCl2 Sigma M8266-100G
MgSO4 Sigma M2643-500 g
K2HPO4 Sigma P2222-500G
KH2PO4 Sigma P9791-500G
NaOH Sigma S8045-500G
KOH Sigma P1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips USA Scentific 1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped USA Scentific 1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector VWR International Inc. 89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond VWR International Inc. 53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile VWR International Inc. 14670-114
15 ml Conical Tube USA Scentific 1475-1611
50 ml Conical Tube USA Scentific 1500-1811
Sterile 18 gauge Needles Becton, Dickinson and Co. 305196
Sterile 10 ml Syringes Becton, Dickinson and Co. 305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size Corning 431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane VWR International Inc. 28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips VWR International Inc. 48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid Thomas scientific 6902A09
Dumont #5- Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Centrifuge 5702 Eppendorf 022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  6. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
  7. Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
  8. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
  9. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  10. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
  11. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
  12. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
  14. Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
  15. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
  16. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
  17. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
  18. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  19. Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
  20. Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
  21. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  22. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
  23. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
  24. Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
  25. Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
  26. Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
  27. Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
  28. Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
  29. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
  30. Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
  31. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  32. Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
  33. Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
  34. Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
  35. Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
  36. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  37. Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
  38. Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
  39. Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
  40. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
  41. Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
  42. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
  43. Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
  44. Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
  45. Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
  46. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
  47. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
  48. Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
  49. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).

Tags

Биология развития выпуск 79 Eukaryota биологических явлений сотовый физиологических явлений C. Элеганс культура клеток эмбриональные клетки
Метод для культивирования эмбриональных<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Клетки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sangaletti, R., Bianchi, L. A Method … More

Sangaletti, R., Bianchi, L. A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells. J. Vis. Exp. (79), e50649, doi:10.3791/50649 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter