Summary
Se describe aquí un protocolo revisado para el cultivo a gran escala de embriones C. elegans células. Embryonic C. elegans células cultivadas in vitro utilizando este método, parecen diferenciarse y recapitular la expresión de genes de una manera específica de la célula. Las técnicas que requieren el acceso directo a las células o el aislamiento de tipos de células específicas de los otros tejidos se pueden aplicar sobre C. elegans células cultivadas.
Abstract
C. elegans es un modelo de sistema de gran alcance, en la que las técnicas genéticas y moleculares son de fácil aplicación. Hasta hace poco, sin embargo, las técnicas que requieren acceso directo a las células y el aislamiento de determinados tipos de células, podrían no aplicarse en C. elegans. Esta limitación se debe al hecho de que los tejidos están confinados dentro de una cutícula presurizado que no es fácilmente digerido por el tratamiento con enzimas y / o detergentes. Basado en el trabajo de los pioneros por Laird Bloom, Christensen y sus colegas han desarrollado la 1 un método robusto para el cultivo de C. Elegans células embrionarias en gran escala. Los huevos están aisladas de adultos grávidas por tratamiento con lejía / NaOH y posteriormente tratados con quitinasa para eliminar las cáscaras de huevo. Las células embrionarias se disocia mediante pipeteo manual y sembraron en sustrato de vidrio cubierto en medio de suero enriquecido. Dentro de las 24 horas de las celdas de aislamiento comenzar a diferenciar cambiando la morfología y expresando marke células específicasrs. C. elegans células cultivadas con este método sobrevivir hasta 2 semanas in vitro y se han utilizado para electrofisiológico, inmunoquímica, y proyección de imagen analiza todo lo bien que se han clasificado y utilizado para los microarrays de perfiles.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un organismo modelo de gran alcance para la investigación de las bases moleculares de la función celular, la diferenciación y el comportamiento. Mientras que su genoma, metabólicos y las vías biosintéticas son similares a los vertebrados, su maleabilidad genética y molecular son mucho mayores 2. Entre sus ventajas son su tamaño y simple anatomía, su rápido ciclo de vida (3 días a 25 ° C), de corta duración de la vida (2 semanas) y gran número de crías (> 200). Debido a su naturaleza hermafrodita y corto ciclo de vida, las manipulaciones genéticas y moleculares son sencillos en C. elegans, incluyendo la generación de animales transgénicos 3,4 y la aplicación de técnicas de saldo de genes tales como ARN de interferencia 5. C. cuerpo elegans y la cáscara de huevo son transparentes. Por lo tanto las células se pueden visualizar fácilmente tanto en el adulto y el embrión utilizando microscopía estándar. En los últimos 40 años, el C. elegans C. investigación elegans incluyendo una gran colección de mutantes, knockouts y transgénicos, una descripción detallada de la anatomía y desarrollo 6,7, incluida la reconstrucción completa del sistema nervioso 8, y un genoma secuenciado completamente, que es bien anotado y disponible para toda la comunidad ( www.wormbase.com ).
A pesar de las numerosas ventajas, algunos enfoques experimentales han sido difíciles en C. elegans. Estos incluyen los que requieren la accesibilidad a la membrana plasmática de las células y el aislamiento de los tejidos o tipos de células. De hecho C. tejidos elegans están confinados dentro de su esqueleto hidrostático a presión, que no es fácilmente digerido por tratamiento enzimático o detergentes. A finales de la década de 1990 Miriam Goodman y Janet Richmond pioneros métodos de registros electrofisiológicos de C. elegansneuronas y células musculares in situ 9,10. Si bien estos métodos nos dio pistas importantes sobre neuronal y la función muscular in vivo, que son desafiantes y bajo rendimiento. Los métodos alternativos para el estudio de la función de células in vivo se han desarrollado, sobre todo en especial en vivo de imágenes de calcio por medio de sensores de calcio genéticamente codificados como GCamP y cameleon 11-13. Estos métodos, sin embargo, no permiten el uso de herramientas farmacológicas porque se aplican en animales vivos intactos.
El primer intento de cultivar C. elegans células in vitro en gran escala fue realizada por Laird Bloom durante la preparación de su tesis doctoral 14. Desafortunadamente, las dificultades encontradas con una pobre adhesión de las células al sustrato, pobre diferenciación celular y la supervivencia prevenir el establecimiento de este protocolo ya en un método de cultivo celular robusto. En 1995 Edgar y sus colegas publicaron un procedimientopara investigar la división celular y la morfogénesis por aislamiento y cultivo de una sola C. elegans embriones 15. Las células embrionarias obtenidos por la digestión de las cáscaras de huevo con una combinación de tratamiento enzimático y la disociación manual, continuaron proliferando, produciendo hasta ~ 500 células 15. Posteriormente, Leung y colaboradores cultivaron un pequeño número de blastómeras estudiar la morfogénesis intestinal. Ellos mostraron que uno in vitro aislados E blastómeros produjo células intestinales polarizadas que crearon una estructura análoga a la luz intestinal al interactuar entre sí a través de las salidas 16 adherentes apicales. Buechner y colegas también informaron un método similar para el cultivo C. elegans células embrionarias in vitro 17.
Sobre la base de este trabajo inicial, Christensen y sus colegas desarrollaron un protocolo robusto para el cultivo embrionario C. elegans células in vitro 1. Ellosmostró que el aislado C. elegans células pueden diferenciarse en diversos tipos de células y mantener las características que poseen in vivo, incluyendo la expresión de marcadores específicos de célula. Varias técnicas que son un reto in vivo, se pueden aplicar en aislado C. elegans células embrionarias. Estos incluyen electrofisiológico 1,18 19, de formación de imágenes, y técnicas inmunoquímicas 20,21, así como el aislamiento de tipos de células específicas por-fluorescente clasificación de células activadas (FACS) para la construcción de bibliotecas de ADNc de células específicas de 22,23. Técnicas de genes desmontables tales como interferencia de ARN (RNAi) se pueden aplicar sobre culta C. elegans células 1 y un método novedoso marcaje metabólico usando Azido-azúcar como una herramienta para el descubrimiento de glicoproteína se ha desarrollado recientemente para cultivadas in vitro C. elegans células 24.
En conclusión, el método de cultivo celular se expande la matriz Of técnicas que se pueden aplicar a la C. modelo elegans en un esfuerzo para descifrar la función de genes en el contexto de un organismo vivo. Se describe aquí el protocolo para el cultivo de C. Elegans células embrionarias in vitro, que se basa en gran parte en el protocolo descrito por primera vez por Christiansen y sus colegas 1.
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Protocol
Los asteriscos (*) indican los pasos nuevos o modificados en comparación con Christensen et al. 1
1. Configuración del material
- El procedimiento de cultivo celular requiere grandes cantidades de huevos aislados de los adultos grávidas. Crecer C. elegans en 8P placas de agar sembrado con NA22 (disponible a través de la C. elegans Consorcio Genético - CGC) bacterias para aislar grandes cantidades de huevos. En estas placas de la cantidad de peptona utilizado es 8 veces la cantidad que se utiliza normalmente para las placas de NGM. La concentración de peptona superior sostiene el crecimiento de bacterias NA22 de manera más eficiente, que contrariamente a OP50-, crecer en capas gruesas.
8P placas de recetas:
Disolver 3 g de NaCl, 20 g de Bacto-peptona, 25 g de agar en 1 L de agua destilada estéril y se autoclave durante 30 min. Deje enfriar el medio a 55 ° C y luego añadir-filtrados estériles de 1 ml de colesterol (5 mg / ml en EtOH), 1 ml de 1 MgCl 2, 1 ml de MgSO4 y 25 ml de tampón KP (un balance de 500 ml: 5 g de K 2 HPO 4, 30 g de KH 2 PO 4, pH 6,00). Verter medio de agar líquido en 10 cm de placas de Petri (25 ml / placa).
- El día siguiente se extendió toda la superficie de cada placa de agar de peptona enriquecida con 1 ml de E. NA22 coli cultivadas durante la noche en medios 2xYT (16 g de triptona, extracto de 10 g de levadura, 5 g de NaCl en 1 l de agua estéril, pH 7,0) a 37 ° C. Estas bacterias constituyen una fuente de alimento abundante que formará una capa gruesa apoyar el crecimiento de las grandes cantidades de adultos grávidas. Deja placas sembradas durante la noche a temperatura ambiente para permitir el crecimiento de las bacterias. El proceso puede ser acelerado por incubación a 37 ° C durante 4-5 horas.
- Traslado animales murieron de sembradas 8P placas. Lavar los animales fuera de una placa de NGM hambre usando 5-6 ml de tampón M9 o agua y añadir 1-2 ml de esta suspensión a cada placa 8P.
- Permitir el crecimiento y la multiplicación de los animales UNTil las placas se llenan en la confluencia de los adultos grávidas.
- Aislar los huevos necesarios para la preparación de C. Elegans células embrionarias, de adultos grávidas utilizando 5-6 ml de solución de lisis.
Receta de solución de lisis
5 ml de lejía fresca, 1,25 ml de NaOH 10 N y 18,5 ml de H2O estéril Esta mezcla debe prepararse antes de cada uso.
- Lavar los huevos aislados de los adultos grávidas usando tampón de huevo:
Receta búfer Huevo
NaCl 118 mM, 48 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl 2, 25 mM de Hepes, pH 7,3, osmolaridad 340 mOsm.
- Retire la cáscara de huevo que rodea los huevos por el tratamiento con quitinasa. La quitinasa es una enzima con actividad más alta a pH ácido 25. Disolver quitinasa (Sigma, n º de catálogo. C6137) en tampón de huevo de pH 6,5 a una concentración final de 2 mg / ml. Almacene las acciones quitinasasolución a -20 ° C en alícuotas de 1 ml en tubos de 15 ml cónicos estériles. Las alícuotas se pueden almacenar a -20 ° C hasta unos pocos meses.
- Crecer C. células cultivadas sobre cubreobjetos elegans en autoclave (12 mm de diámetro) cubierto con lectina de cacahuete. Disolver lectina de cacahuete en agua estéril (0,5 mg / ml). Solución de lectina de cacahuete no debe ser filtrada o en autoclave. También no tiene que ser tratada con luz UV. Tienda 2 ml alícuotas a -20 ° C durante un máximo de 6 meses.
- Medio de cultivo celular completo (500 ml) contiene 500 ml de L-15 medio de cultivo de Gibco, 50 ml de suero bovino fetal (inactivado por calor), 7,7 g de sacarosa (45 mOsm), 5 ml de 100 U / ml de penicilina y de 100 g / ml de estreptomicina (2%). El medio completo se filtra a continuación, utilizando un filtro de poro 0,20 micras.
Tenga en cuenta que la memoria intermedia de huevo y el medio de cultivo tienen osmolaridad de 340 mOsm y 345, respectivamente. En efecto, contrariamente a las células de mamíferos, C. células elegans tienen una relativamente alta osmolaridadque necesita ser tenido en cuenta al preparar soluciones que estarán en contacto directo con la membrana plasmática de las células. Las recetas de estos reactivos se ajustaron para alcanzar la osmolaridad deseada, que se midió utilizando un osmómetro 1. No es necesario utilizar un osmómetro si estas recetas se siguen con exactitud y cuidado se utiliza en la preparación de estos reactivos. Sin embargo, se debe utilizar un Osmoter si otras soluciones tienen que estar preparados, cuyas recetas no son reportados aquí o en cualquiera de las publicaciones que utilizan C. elegans células cultivadas.
2. Aislamiento Huevo
- Se recomienda comenzar con al menos cuatro 8P placas para recoger los huevos suficientes para 12 pocillos de células cultivadas (en placas de 24 pocillos).
- Antes de comenzar con el procedimiento de descongelar un tubo de solución de cacahuete lectina de valores. Coloque cubreobjetos tratados en autoclave en la parte inferior de los pocillos en una placa de 24 pocillos y añadir 200 l de lectina de cacahuete a los cubreobjetos. Incubar durante 1 hora o uasta las células están listas para ser chapada. Retire completamente la lectina de cacahuete y lavar los pocillos una vez con 1 ml de agua estéril tratada en autoclave. La eliminación completa de la lectina de cacahuete de los cubreobjetos es esencial para evitar la formación de grumos de células.
- Lave los adultos grávidas de las placas de agar con agua tratada en autoclave estéril. Recoger la suspensión en dos cónica tubo de 50 ml estéril. Dejar los tubos en hielo durante hasta 5 minutos para permitir la precipitación de los gusanos en la parte inferior de los tubos (*). Retire el agua con una pipeta de plástico de transferencia y reemplazarla con agua esterilizada en autoclave fresco. Pellet gusanos sobremesa centrifugación a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 min (*). Repita este último paso al menos 3.
- Transferencia de gusanos en un tubo cónico de 15 ml estéril y sedimentar ellos a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 min (*). No utilice una mayor velocidad de centrifugación para evitar la recogida de las bacterias en la parte inferior del tubo también. A veces, después centrifugaciones los gusanos no están completamente sedimentan. After de cada lavado y antes de la eliminación del sobrenadante, coloque los tubos durante 5 minutos en hielo. En refrigerada gusanos de agua precipitan a la parte inferior del tubo.
- Retire el agua y añadir 5-6 ml de solución de lisis (ver material creado). Rock the suspensión suavemente durante 5-10 minutos y luego comenzar a supervisar lisis gusano bajo el microscopio estereoscópico, cada 2-3 min. Una gota de la suspensión puede ser también colocado en un cubreobjetos para la inspección fácil. El tiempo de incubación varía en función de la frescura de la lejía, comprar pequeñas botellas de lejía y abrir una botella nueva cada mes.
- Cuando ~ 70-80% de los gusanos se lisan (10 min desde el comienzo de la incubación), detener la reacción de lisis mediante la adición de 9 ml de tampón de huevo de pH 7,3 (ver Material SET UP). Centrifugar la suspensión a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 min. A partir de ahora tendrá un mechero Bunsen en adelante, en el banco para evitar una nueva contaminación de los huevos (*).
- Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia de plástico estéril y lavar el pellet 3-4x con tampón de huevo hasta que la solución es clara. Asegúrese de mezclar bien el sedimento en el tampón de huevos durante cada lavado.
- Los huevos se separan de los cadáveres de animales utilizando solución de sacarosa al 30%. Resuspender el sedimento en 2 ml de tampón de huevo estéril y añadir solución de sacarosa al 2 ml de 60% (en tampón de stock huevo estéril). Mezclar bien y centrifugar durante 20 min a 200 xg (~ 1200 rpm) (*).
- Retire con cuidado los tubos de la centrífuga. Los huevos están flotando en la parte superior de la solución. Usando una pipeta P1000 y puntas de pipetas estériles, transferir todos los huevos en un tubo cónico frescas 15 ml estériles.
- Añadir 10 ml de tampón de huevo estéril para el tubo y centrifugar a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 min. Repita el lavado 3 x. Asegúrese de que los huevos estén totalmente resuspendidas en el tampón de huevos durante cada lavado.
3. Células embrionarias de disociación
Llevar a cabo los siguientes pasos del procedimiento en condiciones estériles utilizando una campana de flujo laminar. Mientras que los animales sonel vestido en placas de bacterias, los lavados y el tratamiento con la solución de lisis que contiene blanqueador debería eliminar la mayoría si no todas las bacterias. Por lo tanto el uso de una campana laminar en este punto del procedimiento evita nueva contaminación de la suspensión de huevos.
- Resuspender huevos sedimentadas en 1 ml de 2 mg / ml quitinasa (existencias en tampón de huevo pH 6,5 (*)) y transferirlos a un nuevo tubo cónico de 15 ml estéril. Roca el tubo de 10-30 minutos a temperatura ambiente. La hora exacta de incubación varía de acuerdo con la frescura de la enzima y la temperatura de la habitación y por lo tanto debe determinarse para cada preparación. Se recomienda iniciar la supervisión de los huevos en un microscopio invertido de cultivo celular después de 10 minutos de incubación. Nota: en nuestra experiencia, el bajo pH aumenta la actividad enzimática quitinasa. Por esta razón se utiliza tampón de huevo a pH 6,5 para disolver quitinasa (receta se informó anteriormente, donde el pH se ajusta a 6,5 usando NaOH).
- Cuando ~ 80% de las cáscaras de huevo son digeridos por latratamiento quitinasa (Figuras 1 AB), que sedimenten los huevos por centrifugación a 900 xg (~ 2500 rpm) durante 3 min (*). Usando una pipeta P1000 y puntas esterilizadas, retire con cuidado el sobrenadante y añadir 3 ml de medio L-15 (*).
- La transferencia de los huevos en un plato de 6 cm de diámetro y disociar suavemente las células utilizando una jeringa estéril de 10 ml equipado con una aguja de calibre 18. Monitorear el grado de disociación mediante la colocación de una gota de suspensión en un placa Petri de plástico fresco y por ver bajo el microscopio. No aspirar aire en la jeringa durante este procedimiento para evitar dañar las células. Continuar la disociación hasta ~ 80% de las células se disocian.
- Filtrar la suspensión utilizando un filtro de 5 micras Millipore estéril. Las suspensiones celulares deben ser filtrados con el fin de eliminar los agregados celulares, los huevos no digeridas y larvas eclosionadas. Filtrar 4-5 ml adicionales de frescas L-15 medios de comunicación a través del filtro para recuperar todas las células. No use fuerza excesiva durante la etapa de filtración para evitar damaging el filtro y / o las células.
4. El cultivo de células
- Sedimenten las células disociadas por centrifugación a 900 xg (~ 2500 rpm) durante 3 min (*). Usando una pipeta P1000 y puntas esterilizadas retire con cuidado todo el sobrenadante. Resuspender las células sedimentadas en completa medio L-15 y la placa 1 ml / pocillo. La cantidad del medio añadido depende del número de placas 8P utilizado, la confluencia de los gusanos en las placas, y el tipo de experimentos que se pueden realizar en las células. La densidad celular se puede determinar usando un hemocitómetro. Para patch-clamp grabaciones enchapado densidad de ~ 230.000 células / cm 2 es óptima.
- Guarde la placa de 24 pozos en un recipiente Tupperware plástico con toallas de papel mojadas para evitar la evaporación del medio de cultivo. Almacenar el recipiente en un incubador humidificado a 20 ° C y el aire ambiente.
- Las células suelen estar listos para los experimentos dentro de las 24 horas cuando la diferenciación morfológica y expresoion de los marcadores GFP están completos. Las células se pueden mantener en cultivo durante un máximo de 2 semanas, pero por lo general son más sanos hasta 7-9 días después de la siembra. El medio tiene que ser reemplazado una vez al día para mantener las células sanas.
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Representative Results
C. elegans y células cultivadas se diferencian de células expresan marcadores específicos
Christensen y sus colegas utilizando tinción con azul tripán demostraron que> 99% de los embriones C. elegans células sobreviven el procedimiento de aislamiento. En días 9 y 22 después de la siembra, 85% y 65%, respectivamente, siguen vivos 1. Aislado embrionario C. células elegans deben adherirse a un sustrato con el fin de diferenciar. Las células que no se adhieren forman grumos y no está claro si sobreviven. La diferenciación de las células comienza 2-3 horas después de la siembra y se prolonga durante ~ 24 h. Dentro de 24 horas, las células adoptan morfologías específicas. Por lo tanto, las neuronas envían procesos 1,18-20, células musculares forman estructuras alargadas en forma de dedo similares a las que se ven in vivo 1 y las células del canal formar un lumen 17. Las características morfológicas in vitro son notablemente similares a los que están en vivo. Por ejemplo, <em> in vitro neuronas táctiles ALM y PLM cultivadas (identificados por la expresión de PMEC-4 :: GFP) se desarrollan dos procesos neuronales con una más larga que la otra, como lo hacen en vivo de 1,20 (Figura 2A). Esto sugiere que al menos algunos de los mecanismos moleculares que conducen a la diferenciación de C. células elegans son autónomo de la célula y por lo tanto se pueden recapitulan in vitro.
En la década de 1990, Chalfie fue pionera en el uso de la proteína verde fluorescente (GFP) en C. elegans para etiquetar tipos de células en el que un gen de interés se expresa 26. El trabajo realizado hasta el momento sobre culta C. elegans células embrionarias apoya que la expresión de GFP en tipos específicos de células puede ser recapitulado in vitro 1,18-20,27 (Figura 2A). Además la proporción de células que expresan GFP in vitro es similar a la relación encontrado in vivo. Por ejemplo, el reportero homeodominio unc-4gen se expresa en 13 neuronas motoras en embrión maduro (13 de 550 células-2.3%) 28,29. Fox y sus colegas, contados :: GFP células unc-4 en la cultura y encontró que son el 2% del número total de células 23. Del mismo modo, la UNC-119, una proteína requerida para G tráfico de proteínas 30, se expresa en la mayoría de C. elegans neuronas y algunas células musculares (76% de las células en la larva L1 31). Christensen y sus colegas informaron de que en la cultura se observó UNC-119 :: GFP expresión en 74-76% de las células se asemejan a las neuronas y las células musculares 1. Por último, MEC-4, un mechanosensitive Na + / Ca2 + canal subunidad necesario para toque suave 32 se expresa en 6 neuronas táctiles en el adulto C. elegans. De estos seis neuronas táctiles, cuatro (ALM y PLM) se derivan embrionaria. Así 4 de 550 (0,7%) las células embrionarias deben expresar GFP bajo el control del promotor MEC-4. De hecho, las neuronas en culturalmentee que expresan PMEC-4 :: GFP constituye ~ 0,5% del número total de células 18,20.
Marcadores de proteínas y modificaciones posteriores a la traducción que son específicos de células pueden ser también observados in vitro. Por ejemplo, alfa tubulina se acetila solamente en neuronas táctiles en C. elegans 33. in vitro, los procesos de las neuronas se tiñen táctiles con un anticuerpo generado contra acetilado-alfa-tubulina 20 (Figura 2B). Neuronas táctiles cultivadas también expresan el mutante tóxico canal MEC-4 (d), que causa la muerte de las neuronas táctiles in vivo 34. De hecho, las neuronas que expresan GFP preparados a partir de un MEC-4 (d); PMEC-4 :: GFP cepa son inicialmente presente en la cultura pero luego degenere 20. Es importante destacar que tocar las neuronas preparadas a partir de mec-4 (d); PMEC-4 :: GFP in vitro comporta de manera similar a cómo se comportan in vivo. Por ejemplo, pueden ser rescatados de la muerte por tratamiento con unmiloride y dantroleno, que no perdona mec-4 (d), las neuronas del tacto de la degeneración in vivo 20,35. Para concluir, no sólo C. elegans células embrionarias morfológicamente parecen a las células in vivo, sino que también expresan marcadores específicos de células y están presentes en la misma proporción que están presentes in vivo. Tomados en conjunto, estos datos apoyan que cultivaron C. elegans células constituyen un buen sistema general para estudiar los procesos biológicos, tanto a nivel celular y molecular.
Patch-clamp análisis electrofisiológico de culta C. elegans células
La técnica de patch-clamp, que fue presentado por Sakmann y Neher en los años setenta para el estudio de la actividad de los canales iónicos de las células en el aislamiento o en los tejidos se puede aplicar a cultivó C. elegans células 36. Christensen y sus colegas fueron los primeros en estudiar los canales iónicos en cultivó C. células elegans utilizandopatch-clamp 1. Desde entonces, K +, aniónico, y los canales catiónicos no selectivos (Figuras 2 CE), así como de dopamina canales transportadores dependientes se han descrito en cultivos de C. elegans 1,18,19,37. Estos estudios avanzaron nuestra comprensión de la función de las conductancias iónicas en la función de C. elegans neuronas. Hay algunas modificaciones que deben tenerse en cuenta cuando se utiliza la técnica de patch clamp para registrar la actividad de los canales iónicos de la culta C. elegans células. Estas modificaciones son en su mayoría relevante para grabaciones de células enteras. En primer lugar, C. células elegans son pequeñas, por ejemplo, las neuronas tienen un diámetro de 1-2 micras. Por lo tanto, pipetas de vidrio necesitan tener una pequeña propina (0,5 m). Puntas de pipeta pequeños aumentan la resistencia de entrada, lo que resulta en errores de estimulación y registro. Para aliviar este problema, pipetas pueden construirse para que tenga una pequeña punta pero una amplia cono. Goodman y Lockery desarrollaron un método employing un pulidor de incendio equipada con una bomba de aire de alta presión para pipetas de moldeo a esta forma 38. En segundo lugar, debido al pequeño tamaño de las células, el acceso de células enteras utilizando la succión usualmente resulta en daños a la célula. Mucho mayor éxito se logra generalmente mediante la aplicación de un impulso de alta tensión (zapping eléctrica) para el parche de membrana bajo la punta de la pipeta. Las otras configuraciones de la técnica de patch clamp (células vinculada, de adentro hacia afuera y de afuera hacia fuera) son fáciles de aplicar a la C. elegans células cultivadas, con la única modificación de que la punta de la pipeta debe ser pequeña para tener en cuenta el pequeño tamaño de C. elegans células. La técnica de patch perforada es notoriamente más laborioso y lento que otras técnicas de patch clamp. Sin embargo, se ha aplicado con éxito en C. elegans células in situ 39, 40 y por lo tanto deben ser aplicables en la cultura también.
El calcio de imágenestécnicas aplicadas a C. células cultivadas elegans
El papel funcional de 2 + voltaje canales de Ca (VGCC) en las neuronas y la glía se ha investigado en cultivos de C. elegans células por imágenes de calcio 20, 21, 41. La aplicación de imágenes de calcio en la cultura ha permitido el uso de soluciones que contienen altas concentraciones de KCl para inducir la despolarización de células y de los bloqueadores de los canales de calcio para discernir la contribución de los diferentes tipos de canales a la entrada de calcio. Por ejemplo, la contribución de Na + / Ca2 + permeable al canal de MEC-4 (d) a la concentración de calcio intracelular se determinó mediante el uso de imágenes de calcio YC2.12 cameleon en presencia y ausencia de la DEG / ENaC bloqueador de canal de amilorida. Estos experimentos demostraron que una afluencia de calcio sensible a amilorida está presente en las neuronas que expresan táctiles MEC-4 (d), pero no en las neuronas del tacto de tipo salvaje. Uso de ionóforo para permeabilizar la membrana detocar las neuronas y para calibrar cameleon (Figuras 3A y B), Bianchi y sus colegas también determinaron que la concentración media de calcio libre en contacto neurona es 200 Nm 20 (Figuras 3C y D). Del mismo modo, Frokjaer-Jensen y sus colegas investigaron la función de VGCCs EGL-19 y UNC-36 en la regulación de la entrada de calcio inducida por despolarización en C. elegans neuronas cultivadas mechanosensory expresan cameleon 21. Ellos encontraron que la despolarización de las neuronas táctiles inducidos por K + extracelular en un rango entre 20 mM y 100 mM, originó un aumento de calcio intracelular revelado por YFP / PPC cambio de relación entre 17% y 70%. Por otra parte, los transitorios de calcio se redujeron en EGL-19 y UNC-36 mutaciones de pérdida de función y no se detectaron en la ausencia de Ca2 + extracelular lo que sugiere que VGCCs juegan un papel clave en la excitabilidad de C. elegans tocar las neuronas 21.
Stout y Parpura examinaron el papel de la Ca 2 + canales activados por voltaje EGL-19, CCA-1 y UNC-2 en CEPsh vaina glia del sensilla cefálica en la contribución a la entrada de calcio 41. La dinámica del calcio intracelular se analizaron en las células gliales CEPsh cultivadas de animales transgénicos que expresan el co-mCherry marcador fluorescente de color rojo y el verde fluorescente citosólica de Ca 2 + GcaMP2.0 indicador. En la mayoría de las células gliales CEPsh, despolarización de la membrana inducida por altas concentraciones extracelulares de aumento de KCl inducida intracelular de Ca 2 + como se informa por el aumento en la fluorescencia GcaMP2.0. Por otra parte, el tratamiento con bloqueadores de canales de calcio Cd 2 + y NEMA (nemadipine-A) redujo significativamente los transitorios de calcio. Estos datos apoyan que el aumento dependiente de la tensión en el calcio intracelular en las células gliales CEPsh depende al menos en parte en los canales de calcio dependientes del voltaje. Los autores, analizan más cambios intracelulares de calcio de tipo L en EGL-19RF (reducción de la función), tipo T CCA-1 y N, P / Q, de tipo R de canal unc-2 knockout animales y llegaron a la conclusión de que los tres tipos de Ca 2 + canales contribuyen significativamente a la dinámica del calcio intracelular en estas células gliales . Así, desde macroglia mamíferos inmaduros responden a la despolarización a través de cambios VGCC-dependientes de Ca 2 + concentraciones intracelulares, los autores concluyen que la C. células gliales elegans CEPsh pueden parecerse funcionalmente macroglía mamíferos, astrocitos, oligodendrocitos y las células precursoras de oligodendrocitos.
Otras técnicas aplicables a cultivaron C. elegans células embrionarias
Fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) se ha aplicado con éxito a C. Elegans células cultivadas para enriquecer las culturas con determinados tipos de células y / o para aislar células para el análisis de microarrays 23,4243. La modificación importante que necesitaba ser introducidopara el método de cultivo celular era el tipo de sustrato utilizado. Colegas extraño y probaron diferentes sustratos incluyendo el colágeno IV, poli-L-lisina, fibronectina y laminina y establecieron que la poli-L-lisina es el mejor sustrato 37. Poli-L-lisina promueve la diferenciación de células tan bien como lectina de cacahuete, pero al contrario de lectina de cacahuete permite el desprendimiento de las células del sustrato sin daños 36. Varios tipos diferentes de C. células elegans han sido ordenados por FACS, incluyendo thermosensory, olfativas, motoras y neuronas mechanosensory y glia 23,42 - 45. Etiquetado de la célula se ha logrado mediante la expresión de GFP reporteros y, en general, la eficacia en la clasificación es alta con aislamiento de hasta el 90% de las células GFP-etiquetados 23.
El silenciamiento génico por ARN de interferencia (ARNi) se puede lograr en la cultura también. Christensen y sus colegas demostraron que la incubación de GFP-expresando cultaC. elegans neuronas con dsRNA frente a GFP como resultado una reducción significativamente el nivel de expresión de GFP con un efecto máximo 4 días después de la adición de ARN de doble cadena a la cultura 1. Del mismo modo, Shih y sus colegas utilizaron RNAi en cultivo para demostrar que el C. elegans SID-1 es necesaria para la mediación del efecto de dsRNA y es probable que se necesita in vivo para mediar la difusión sistémica de ARNi 46. En conclusión, el ARNi que es uno de los métodos más utilizados y eficaces para el silenciamiento de genes en C. elegans se pueden aplicar en la cultura. Este método podría ser utilizado para los genes de silenciamiento cuyos nocaut es letal o interfiere con C. elegans desarrollo normal.
Figura 1. C. elegans embriones antes y después del tratamiento quitinasa. (A) Fotografía de los huevos antes de la exposición a chitinase. La flecha señala la cáscara de los huevos transparentes e intactos que rodean un embrión. (B) Los huevos tratados con quitinasa durante 10 min. Las cáscaras de huevo han sido digerido y ya no son visibles alrededor de los embriones. Las flechas apuntan a los embriones de tres veces liberados de la cáscara del huevo. La caja azul rodea un grupo de células que aún están unidos el uno al otro.
Figura 2. Cultivadas C. elegans toque neuronas. (A) micrografía fluorescente de culta C. elegans tocar las neuronas que expresan GFP bajo el toque promotor específico mec-4 (P mec-4 :: GFP), la barra de escala 5 micras. (B) micrografías fluorescentes de una neurona toque expresar P mec-4 :: GFP (panel superior), que se tiñó con un anticuerpo monoclonal contra la alfa tubulina acetilada (Sigma), un posttranslational modificación de tubulina alfa que se produce en las neuronas táctiles sólo 33. Adaptado de 20. (CE) Ejemplo de canales mecanosensibles registrados en tipo salvaje neuronas táctiles cultivadas en la configuración de la celda-adjunto de la técnica de patch clamp. El canal tiene una conductancia de ~ 100 ps y que está presente en las neuronas táctiles aisladas de MEC-4 animales knockout (MEC-4 (U253)), así. Estos datos sugieren que este canal no es el canal MEC 20. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 3. La estimación de la concentración de calcio libre intracelular en las neuronas cultivadas táctiles utilizando cameleon. (A) Pseudocolor imágenes de neuronas táctiles cultivadas que expresan YC2.12 cameleon en 0 mM Ca 2 + (+ EGTA, izquierda) y en mM Ca 2 + 10 (derecha). La escala pseudocolor se muestra a la derecha. (B) cameleon Representante cambios fluorescentes asociadas con los cambios en la concentración intracelular de calcio en una neurona toque permeabilizada. Antes de la grabación, las células se incubaron durante 30 min en una solución que contiene el ionóforo de calcio A23187-Br (10 M) y una concentración definida de calcio libre (250 nM en este caso). Rotenona (10 mM) y 2-desoxi-D-glucosa (1,8 mM) también se añadieron a la solución para bloquear las bombas activas. A continuación, la neurona se perfundió con una solución que contiene 0 mM de (5 mM de EGTA) Ca 2 + y 10 mM de Ca 2 + para determinar los cambios de relación de fluorescencia máxima y mínima. (C) Cameleon curva de calibración que muestra los resultados obtenidos partir de la 4-7 células cuya fluorescencia cambios se evaluaron en 11 diferentes soluciones libres de calcio. Cada cambio de la relación se normalizó con el cambio de relación máxima de la celda individual. (D) (B). La relación cameleon descansando en las neuronas cultivadas de contacto fue de 22% ± 7 (n = 2, 18 células) de cambio de relación máxima. Sobre la base de la curva de calibración se muestra en (C) esta relación corresponde a una concentración de calcio libre de ~ 200 nM. Adaptado de 20. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
C. elegans es un organismo modelo de gran alcance para descifrar los mecanismos genéticos implicados en el desarrollo, la conducta y el envejecimiento. Su conveniencia se debe principalmente a la facilidad con la que puede ser manipulada genéticamente y de su ciclo de vida corto. A pesar de su conveniencia, C. elegans tiene sus limitaciones. C. células elegans son pequeñas y confinado dentro de una cutícula a presión que limita la aplicación de métodos que requieren el acceso directo a las células, tales como técnicas electrofisiológicas y farmacológicas, o el aislamiento de tipos de células específicas, tales como el perfil de expresión génica por análisis de microarrays. El C. elegans método de cultivo celular ha sido una solución a muchas de las limitaciones de este organismo modelo.
En este manuscrito se describe un método de actualización para el aislamiento y cultivo de embriones C. elegans células en gran escala basados en los primeros trabajos de Christensen y sus colegas 1. Nosotros also informe publicado resultados representativos obtenidos usando una variedad de técnicas que incluyen la inmunocitoquímica, la electrofisiología y de imágenes de calcio que han avanzado nuestra comprensión de los procesos fisiológicos y la función celular subyacente requisitos genéticos en C. elegans. El trabajo realizado hasta el momento sobre culta C. elegans células apoyos que se diferencian in vitro como in vivo que hacen una recapitulación de la expresión de marcadores específicos de células 1,18-20,22,23,27,44. Aunque no todos los tipos de células se han caracterizado en la cultura, este cuerpo de trabajo sugiere que el método de cultivo de células permite el estudio de C. células elegans en aislamiento, sin comprometer su identidad.
El protocolo es sencillo y de fácil aplicación en cualquier laboratorio. Las cosas que deben tenerse en cuenta para el cultivo con éxito C. células embrionarias elegans son los siguientes: 1) Los animales deben estar sincronizados para que la mayoría de ellos duraranL se grávido adultos en el momento del procedimiento de cultivo celular. Inicio de la lombricultura desde una placa de hambre es una buena opción. 2) Las bacterias utilizadas para el cultivo C. elegans deben ser eliminados antes de la lisis gusano para evitar la contaminación del cultivo celular. Se recomienda que grandes volúmenes de agua estéril se utilizan para los lavados y que los animales se centrifugan a la sugerido (no a mayor) Velocidad para evitar la precipitación de las bacterias, así. De hecho, mientras que el tratamiento con el tampón de lisis que contiene cloro debe eliminar las bacterias, a partir de una suspensión animales relativamente libre de bacterias se recomienda. 3) Los animales deben ser tratados con cloro / NaOH hasta ~ 80% de ellos han dado a conocer sus huevos. Tiempos de incubación más cortos y más largos reducen la eficiencia de la recuperación de huevo y dañan los huevos respectivamente. 4) la cáscara de huevo digestión quitinasa debe vigilarse estrechamente. Disociación Manual debe iniciarse cuando ~ 80% de las cáscaras de huevo se han digerido. Más largo y más corto incutiempos de iones tanto resultado en daño celular, debido a los daños directa de la membrana plasmática por la enzima y los daños causados por prolongado y más duro de disociación manual en el intento de aislar las células, respectivamente. 5) la filtración celular a través del filtro 5 micras no debe ser forzado. Si el filtro está obstruido, debe cambiarse por una nueva para evitar el daño celular.
A pesar del hecho de que las células embrionarias cultivadas han revolucionado el campo de muchas maneras, no son la respuesta para cada pregunta científica y todavía tienen limitaciones. Por ejemplo, los genes expresados en cultivo son en su mayoría embrionario ya que las células se aíslan a partir de embriones. Compartimentos subcelulares pueden no desarrollarse correctamente en cultivo. Por ejemplo, el desarrollo y el mantenimiento de los cilios de ciertas neuronas sensoriales amphid tales como AWA y AWC dependen de la interacción con la glía amphid, que se pierde en la cultura 44. Las células pierden sus vecinos naturales y no hacen fisiológicamente relEvant célula a célula de contactos. Por ejemplo, no se sabe si las células forman uniones estrechas, eléctricos o sinapsis químicas y si lo hacen, estos no son susceptibles de estar con sus parejas fisiológicas. Además, las células se extendieron en placas sobre un sustrato único, lectina de cacahuete. La matriz extracelular in vivo es probable que sea una mezcla compleja y difícil de reproducir de muchas moléculas, incluyendo lectina de cacahuete, laminina, colágeno, y fibronectina. Por otra parte, especializado matriz extracelular tal vez sea necesario para ciertos tipos de funciones celulares. Por ejemplo, el canal mechanosensitive expresa en neuronas tocar el cuerpo y formado por el MEC-4 y MEC-10 subunidades no puede ser cerrada en la cultura 18, pero puede ser cerrada fácilmente in vivo 47. Esto muy probablemente deriva del hecho de que el colágeno extracelular MEC-5 normalmente producida por las células de costura vecina in vivo, está ausente en la cultura 48. MEC-5, junto con las proteínas de la matriz extracelular MEC-1 (a aa 1999 largoproteína con un dominio de tipo Kunitz y dos dominios EGF) y el MEC-9 (una proteína de 834 aa de largo que contiene varios dominios de tipo Kunitz, repeticiones EGF y un dominio rico en ácido glutámico) son necesarios para la sensación táctil y se cree que se une a los dominios extracelulares del complejo de canal MEC y para ejercer gating tensión en el complejo durante la estimulación mecánica.
Para concluir, C. células embrionarias elegans pueden ser cultivadas in vitro y que aparecen para diferenciar la recapitulación de la expresión de genes específicos de células. El protocolo para el aislamiento y cultivo de las células es sencillo y se puede aplicar en cualquier laboratorio con un mínimo de experiencia en las técnicas de cultivo de células. Teniendo en cuenta las limitaciones de esta técnica, el método de cultivo de células puede ser y ha demostrado ser una técnica eficaz cuando las células directas acceder y / o se necesitan aislamiento de tipos celulares específicos. Un protocolo para el aislamiento de células a partir de larvas ha sido también desarrollado recientemente (Not describe aquí) 49. Gran interés en el desarrollo de métodos complementarios está haciendo C. elegans un sistema aún más poderosa para finalmente entender el vínculo entre la función de los genes y el comportamiento, el desarrollo o el envejecimiento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator | |||
References
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