Summary
Vi beskriver här ett reviderat protokoll för storskalig odling av embryonala C. elegans-celler. Embryonala C. elegans-celler odlade in vitro med användning av denna metod verkar att differentiera och rekapitulera uttrycket av gener i ett cellspecifikt sätt. Tekniker som kräver direkt tillgång till cellerna eller isolering av specifika celltyper från andra vävnader kan tillämpas på C. elegans odlade celler.
Abstract
C. elegans är en kraftfull modellsystem, i vilka genetiska och molekylära metoder är lätta att tillämpa. Fram till helt nyligen men tekniker som kräver direkt tillgång till celler och isolering av specifika celltyper, kunde inte tillämpas i C. elegans. Denna begränsning beror på det faktum att vävnaderna är begränsade till en trycksatt nagelband som inte är lättsmält genom behandling med enzymer och / eller detergenter. Baserat på tidiga pionjärarbete från Laird Bloom, Christensen och kollegor 1 utvecklat en robust metod för odling av C. elegans embryonala celler i stor skala. Ägg är isolerade från gravida vuxna genom behandling med blekmedel / NaOH och därefter behandlas med chitinas att ta bort äggskal. Embryonala celler sedan dissocieras genom manuell pipettering och ströks ut på substrattäckta glas i serumberikat medium. Inom 24 timmar av isoleringsceller börjar differentiera genom att ändra morfologi och genom att uttrycka cellspecifika Markers. C. elegans celler odlade med hjälp av denna metod överleva i upp 2 veckor in vitro och har använts för elektrofysiologiska, immun och bildhantering analyser samt de har sorterats och används för microarray profilering.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en kraftfull modellorganism för att undersöka de molekylära grunderna för cellulär funktion, differentiering, och beteende. Medan dess genom, metabola och biosyntetiska vägar liknar ryggradsdjur ", dess genetiska och molekylär spårbarhet är mycket större 2. Bland dess fördelar är dess storlek och enkel anatomi, dess snabba livscykel (3 dagar vid 25 ° C), kort livslängd (2 veckor) och ett stort antal avkommor (> 200). På grund av sin hermafroditiska natur och kort livscykel, molekylära och genetiska manipulationer är enkla i C. elegans, även produktion av transgena djur 3,4 och tillämpningen av gen knock-down tekniker såsom RNA-interferens 5. C. elegans kropp och äggskal är transparenta. Därför celler kan enkelt visualiseras i både vuxna och embryot med standard mikroskopi. Under de senaste 40 åren, i C. elegans C. elegans forskning inklusive en stor samling av mutanter, knockouts och transgena, en detaljerad beskrivning av anatomi och utveckling 6,7, inklusive fullständig återuppbyggnad av nervsystemet 8, samt ett helt sekvens genomet som är väl kommenterad och tillgänglig för hela samhället ( www.wormbase.com ).
Trots de många fördelar, har en del experimentella metoder varit utmanande i C. elegans. Dessa inkluderar de som kräver tillgång till plasmamembranet i cellerna och isolering av vävnader eller celltyper. Indeed C. elegans vävnader är begränsade till sin tryckhydrostatiskt skelett, som inte är lättsmält genom enzymatisk behandling eller rengöringsmedel. I slutet av 1990-talet Miriam Goodman och Janet Richmond pionjärer metoder för elektrofysiologiska inspelningar av C. elegansnervceller och muskelceller i situ 9,10. Även om dessa metoder gav oss viktiga insikter i neuronal-och muskelfunktion in vivo, de är utmanande och låg genomströmning. Alternativa metoder för att studera cellfunktionen in vivo hade utvecklats, mestadels särskilt in vivo kalcium avbildning med genetiskt kodade kalcium sensorer såsom GCamP och came 11-13. Dessa metoder dock inte tillåta användning av farmakologiska verktyg, eftersom de tillämpas på intakta levande djur.
Det första försöket vid odling C. elegans celler in vitro i stor skala gjordes av Laird Bloom under utarbetandet av sin doktorsavhandling 14. Tyvärr, svårigheter med dålig vidhäftning av cellerna till underlaget, dålig celldifferentiering och överlevnad hindrade etableringen av denna tidiga protokoll som en robust cellodlingsmetod. 1995 Edgar och kollegor publicerade ett förfarandeatt undersöka celldelning och morfogenes av isolering och odling av en enda C. elegans embryon 15. Embryoceller erhållna genom digerering av äggskal med en kombination av enzymatisk behandling och manuell dissociation fortsatte att föröka sig och att producera upp till ca 500 celler 15. Därefter Leung och medarbetare odlade ett litet antal blastomerer att studera tarm morfogenes. De visade att en in vitro isolerade E blastomere producerade polarisetarmceller som skapade en struktur analog med tarmlumen genom att interagera med varandra genom apikala adherensgränssnitten junctions 16. Buechner och kollegor rapporterade också en liknande metod för odling C. elegans embryoceller in vitro 17.
Baserat på detta tidiga arbete, Christensen och kollegor utvecklat en robust protokoll för odling av embryonala C. elegans-celler in vitro 1. Devisade att isolerade C. elegans celler kan differentiera till olika celltyper och upprätthålla de funktioner som de besitter in vivo, inklusive uttrycket av cellspecifika markörer. Flera tekniker som utmanar in vivo, kan tillämpas på enstaka C. elegans embryonala celler. Dessa inkluderar elektro 1,18 19, bildbehandling, och immunkemiska metoder 20,21, samt isolering av specifika celltyper genom Lysrör-Aktivt cellsortering (FACS) för byggande av cellspecifika cDNA-bibliotek 22,23. Gen knockdown tekniker såsom RNA-interferens (RNAi) kan appliceras på odlade C. elegans-celler 1 och en ny metabolisk märkningsmetod med användning av azido-socker som ett verktyg för glykoprotein upptäckt har nyligen utvecklats för att in vitro odlad C. elegans-celler 24.
Sammanfattningsvis expanderar cellodlingsmetod arrayen of tekniker som kan tillämpas på C. elegans modell i ett försök att dechiffrera geners funktion i samband med en levande organism. Vi beskriver här protokollet för odling av C. elegans embryonala celler in vitro, som till stor del bygger på protokoll som först beskrevs av Christiansen och kollegor 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Asterisk (*) anger nya eller ändrade åtgärder jämfört med Christensen et al. 1
1. Material Setup
- Cellodlingsförfarandet kräver stora mängder ägg isolerade från gravida vuxna. Grow C. elegans på 8P agarplattor ympats med NA22 (tillgänglig via C. elegans Genetic Consortium - CGC) bakterier för att isolera stora mängder ägg. I dessa plattor mängden pepton användas är 8 gånger den mängd som normalt används för NGM plattor. Den högre peptonkoncentrationen upprätt tillväxten av NA22 bakterier mer effektivt, vilket i motsats till OP50-, växer i tjocka lager.
8P plattor recept:
Lös 3 g NaCl, 20 g Bacto-pepton, 25 g agar i en L sterilt destillerat vatten och autoklav under 30 min. Låt mediet kyler vid 55 ° C och tillsätt sedan sterilfiltrerad 1 ml kolesterol (5 mg / ml i EtOH), 1 ml av en MgCl2, 1 ml MgSO 4 och 25 ml av KP-buffert (lager på 500 ml: 5 g K 2 HPO 4, 30 g KH 2 PO 4, pH 6,00). Häll flytande agarmedium i 10 cm petriskålar (25 ml / platta).
- Nästa dag spred hela ytan på varje berikat pepton agarplatta med 1 ml NA22 E. coli odlades över natten i 2 x YT-medium (16 g trypton, 10 g jästextrakt, 5 g NaCl i 1 liter sterilt vatten, pH 7,0) vid 37 ° C. Dessa bakterier utgör en riklig näringskälla som bildar ett tjockt lager stödja tillväxten av stora mängder gravida vuxna. Lämna ympade plattorna över natten vid rumstemperatur för att tillåta tillväxt av bakterierna. Processen kan accelereras genom inkubation vid 37 ° C under 4-5 timmar.
- Överför utsvultna djur till heat 8P plattor. Tvätta djur utanför en starved NGM plattan med 5-6 ml M9-buffert eller vatten och tillsätt 1-2 ml av denna suspension till varje 8P platta.
- Tillåt tillväxt och förökning av djuren until plattorna befolkas vid sammanflödet av gravida vuxna.
- Isolera äggen som krävs för framställning av C. elegans embryonala celler, från gravida vuxna med hjälp av 5-6 ml lyseringslösning.
Lys lösning recept
5 ml Fresh Bleach, 1,25 ml 10 N NaOH och 18,5 ml av steril H 2 O. Denna blandning måste beredas på nytt före varje användning.
- Tvätta äggen isolerade från gravida vuxna som använder ägg buffert:
Egg buffert recept
118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolalitet 340 mOsm.
- Ta bort äggskal som omger äggen genom behandling med chitinas. Kitinas är ett enzym med högst aktivitet vid surt pH 25. Lös kitinas (Sigma, katalog nr. C6137) i ägg-buffert pH 6,5 vid en slutkoncentration av 2 mg / ml. Förvara kitinaset lagerlösning vid -20 ° C i 1 ml alikvoter i sterila 15 ml koniska rör. Prover kan förvaras vid -20 ° C upp till några månader.
- Grow C. elegans odlade celler på autoklaverade täckglas (12 mm diameter) täckta med jordnöts lektin. Lös jordnöts lektin i sterilt vatten (0,5 mg / ml). Peanut lektin lösning bör inte filtreras eller autoklaveras. Det spelar också behöver inte behandlas med UV-ljus. Butiks 2 ml alikvoter vid -20 ° C i upp till 6 månader.
- Komplett cellodlingsmedium (500 ml) innehåller 500 ml L-15 kulturmedium från Gibco, 50 ml fetalt bovint serum (värmeinaktiverat), 7,7 g sackaros (45 mOsm), 5 ml av 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin (2%). Det fullständiga mediet filtreras därefter med användning av ett 0,20 ^ m porstorlek filter.
Observera att ägget bufferten och odlingsmediet har osmolaritet på 340 och 345 mOsm respektive. I själva verket, i motsats till däggdjursceller, C. elegans-celler har en relativt hög osmolaritetsom måste tas med i räkningen när de förbereder lösningar som kommer i direkt kontakt med plasmamembranet av cellerna. Recepten för dessa reagens justerades för att nå den önskade osmolariteten, som mättes med användning av en osmometer 1. Det är inte nödvändigt att använda en osmometer om dessa recept följs exakt och omsorg används vid framställning av dessa reagenser. Man bör dock använda en osmoter om andra lösningar måste vara beredda, vars recept redovisas inte här eller i någon av de publikationer som använder C. elegans odlade celler.
2. Egg Isolering
- Det rekommenderas att börja med åtminstone fyra 8P plattor för att samla in tillräckligt med ägg för 12 brunnar i odlade celler (i 24-hålsplattor).
- Innan du börjar med det förfarande tina en tub av jordnöts lektin stamlösning. Placera autoklaveras täckglas i botten av brunnarna i en 24-brunnsplatta och tillsätt 200 | il av jordnöt lektin till täckglasen. Inkubera i 1 timme eller until cellerna är redo att pläteras. Avlägsna helt jordnöts lektin och tvätta brunnarna en gång med 1 ml sterilt autoklaverat vatten. Fullständigt avlägsnande av jordnöts lektin från täckglasen är väsentligt för att undvika cellklumpning.
- Tvätta gravida vuxna utanför agarplattor använder sterilt autoklaveras vatten. Samla suspensionen i två sterila koniska 50 ml tub. Lägg rören på is under upp till 5 min för att medge utfällning av maskarna vid botten av rören (*). Avlägsna vattnet med en överföring av plast pipett och ersätta det med färskt sterilt autoklaveras vatten. Pelle maskar efter bordscentrifugering vid 200 x g (~ 1200 rpm) under 10 min (*). Upprepa detta sista steg åtminstone tre.
- Överför maskar i en steril 15 ml koniska rör och pelletera dem vid 200 x g (~ 1200 rpm) under 10 min (*). Använd inte högre centrifugeringsvarvtal för att undvika uppsamling av bakterierna vid botten av röret samt. Ibland efter centrifuge maskarna inte är helt pelleterat. After varje tvätt och före borttagning supernatanten, placera rören i 5 minuter på is. I kylt vatten maskar utfällas till botten av röret.
- Ta bort vattnet och tillsätt 5-6 ml lyseringslösning (se Material inrättat). Rock suspensionen försiktigt i 5-10 minuter och sedan börja övervaka mask lys i stereomikroskop varje 2-3 min. En droppe av suspension kan också placeras på ett täckglas för enklare kontroll. Inkubationstiden varierar beroende på färskhet blekmedel, köpa små flaskor blekmedel och öppna en ny flaska varje månad.
- När ~ 70-80% av maskar lyseras (10 min från början av inkubation), stoppa lys reaktionen genom tillsats av 9 ml ägg buffert pH 7,3 (se Material inrättat). Centrifugera suspensionen vid 200 x g (~ 1200 rpm) under 10 min. Från och med nu har en bunsenbrännare på, på bänken för att förhindra återkontaminering av äggen (*).
- Ta försiktigt bort supernatanten med en steril plast överföringspipett och tvätta pelleten 3-4x med ägg buffert tills lösningen är klar. Se till att blanda pellets väl i ägget bufferten vid varje tvätt.
- Ägg är åtskilda från djurkroppar med hjälp av 30% sackaroslösning. Återsuspendera pelleten i 2 ml sterilt ägg buffert och tillsätt 2 ml av 60% sackaroslösning (lager i sterilt ägg buffert). Blanda väl och centrifugera i 20 min vid 200 x g (~ 1200 rpm) (*).
- Ta försiktigt bort rören från centrifugen. Äggen flyter på toppen av lösningen. Med hjälp av en P1000 pipett och sterila spetsar, överföra alla ägg i en färsk sterila 15 ml koniska rör.
- Tillsätt 10 ml sterilt ägg buffert till röret och centrifugera vid 200 x g (~ 1200 rpm) under 10 min. Upprepa tvätta 3 x. Se till att äggen är helt suspenderade i ägget bufferten vid varje tvätt.
3. Embryonala celler Dissociation
Genomför nästa steg i proceduren under sterila förhållanden med hjälp av ett laminärt flöde huva. Medan djurenklänning på bakterieplattorna, tvättar och behandlingen med lys-lösning innehållande blekmedel bör eliminera de flesta om inte alla bakterier. Således hjälp av en laminär huva i detta skede av förfarandet hindrar nya föroreningar av ägget fjädring.
- Resuspendera pelleterat ägg i 1 ml 2 mg / ml chitinas (lager i ägg buffert pH 6,5 (*)) och för över dem till en ny steril 15 ml koniska rör. Vagga röret i 10-30 min vid rumstemperatur. Den exakta inkubationstiden förändras beroende på färskhet av enzymet och temperaturen i rummet och bör därför bestämmas för varje preparat. Det rekommenderas att börja övervaka äggen i en omvänd cell-kultur mikroskop efter 10 min av inkubation. Notera: i vår erfarenhet, ökar lågt pH för kitinas enzymatisk aktivitet. Av denna anledning använder vi ägg-buffert vid pH 6,5 för att upplösa kitinas (recept rapporterade ovan, där pH justeras till 6,5 med användning av NaOH).
- När ~ 80% av äggskalen uppslutes medkitinas-behandling (fig. 1 AB), pelletera äggen genom centrifugering vid 900 x g (~ 2500 rpm) i 3 min (*). Med hjälp av en P1000 pipett och sterila tips, ta bort försiktigt supernatanten och tillsätt 3 ml L-15-medium (*).
- Överför äggen i en tallrik diameter 6 cm och försiktigt dissociera cellerna med hjälp av en 10 ml steril spruta med en 18 G nål. Övervaka graden av dissociation genom att placera en droppe av suspensionen in i en färsk plastpetriskål och genom att titta i mikroskopet. Inte aspirera luft i sprutan under den här proceduren för att undvika skada celler. Fortsätt dissociationen tills ~ 80% av cellerna dissocieras.
- Filtrera suspensionen med hjälp av en steril 5 | im Millipore-filter. Cellsuspensioner måste filtreras för att avlägsna cellklumpar, osmälta ägg och kläckta larver. Filter ytterligare 4-5 ml färsk L-15 media genom filtret för att återvinna alla celler. Använd inte för mycket kraft under filtreringssteg för att undvika damaging filtret och / eller cellerna.
4. Odling av celler
- Pelletera dissocierade celler genom centrifugering vid 900 x g (~ 2500 rpm) i 3 min (*). Med hjälp av en P1000 pipett och sterila tips försiktigt bort alla supernatanten. Resuspendera pelleterade cellerna i fullständigt L-15-medium och plattan 1 ml / brunn. Den mängd av mediet tillsättas beror på antalet 8P plattor används, sammanflödet av maskar på plattorna, och den typ av experiment som kommer att utföras på cellerna. Celldensiteten kan bestämmas med användning av en hemocytometer. För patch-clamp inspelningar bordläggningen densitet ~ 230.000 celler / cm 2 är optimal.
- Håll 24 brunnars platta i en plast Tupperware behållare innehållande våta pappershanddukar för att undvika avdunstning av odlingsmedium. Förvara behållaren i en fuktad inkubator vid 20 ° C och omgivningsluft.
- Cellerna är oftast redo för experimenten inom 24 timmar när den morfologiska differentiering och expression av GFP markörer är fullbordad. Celler kan hållas i odling under upp till 2 veckor, men de är oftast mest hälso upp till 7-9 dagar efter plätering. Mediet behöver bytas ut en gång per dag för att bibehålla friska celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. elegans odlade celler differentierar och uttrycker cell specifika markörer
Christensen och kollegor med trypanblått färgning visade att> 99% av embryonala C. elegans celler överlever isoleringsförfarandet. Vid dag 9 och 22 efter plätering, 85% och 65%, respektive fortfarande lever 1. Isolerad embryonal C. elegans cellerna måste hålla sig till ett substrat för att skilja. Celler som inte följer bildar klumpar och det är oklart om de överlever. Differentiering av cellerna börjar 2-3 h efter plätering och fortsätter under ~ 24 timmar. Inom 24 timmar, cellerna tar på specifika morfologier. Sålunda neuroner skicka ut processer 1,18-20, muskelceller bilda fingerliknande långsträckta strukturer liknande de som ses in vivo 1 och kanalceller bildar en lumen 17. De morfologiska egenskaper in vitro är anmärkningsvärt lika de som in vivo. Exempelvis <em> in vitro odlade ALM och PLM-touch-neuroner (identifieras genom uttryck av Pmec-4 :: GFP) utvecklas endast två neuronala processer med en längre tid än andra, som de gör i vivo 1,20 (Figur 2A). Detta tyder på att vissa av de molekylära mekanismer som driver differentiering av C. åtminstone elegans-celler är cellautonoma och kan således rekapituleras in vitro.
På 1990-talet, Chalfie börjat använda sig av grönt fluorescerande protein (GFP) i C. elegans att märka celltyper i vilka en gen av intresse uttrycks 26. Arbete som hittills på odlade C. elegans embryoceller stöder att uttryck av GFP i specifika celltyper kan rekapituleras in vitro 1,18-20,27 (Figur 2A). Dessutom förhållandet av celler som uttrycker GFP i vitro liknar förhållandet påträffats in vivo. Exempelvis unc-4 homeodomän reportergenen uttrycks i 13 motoriska nervceller i mogna embryo (13 av 550 celler-2,3%) 28,29. Fox och kollegor, räknade UNC-4 :: GFP-celler i kultur och funnit att de är 2% av det totala antalet celler 23. Likaså UNC-119, ett protein som erfordras för G-protein trafficking 30, uttrycks i de flesta C. elegans neuroner och vissa muskel-celler (76% av cellerna i den L1 larv 31). Christensen och medarbetare rapporterade att i kultur unc-119 :: GFP-uttryck observerades i 74 till 76% av cellerna som liknar nervceller och muskelceller 1. Slutligen MEC-4, en mechanosensitive Na + / Ca2 +-kanal-subenheten krävs för lätt beröring 32 uttryckt i sex berörings neuroner i vuxen C. elegans. Av dessa sex berörings nervceller, är fyra (ALMS och PLMS) embryonically härstammar. Sålunda 4 av 550 (0,7%) embryonala celler bör uttrycka GFP under kontroll av den mec-4-promotor. Faktum nervceller i culture att uttrycka Pmec-4 :: GFP utgör ~ 0,5% av det totala antalet celler 18,20.
Proteinmarkörer och posttranslationella modifieringar som är cellspecifika kan också observerats in vitro. Till exempel är alfa-tubulin acetylerad endast i beröring nervceller i C. elegans 33. In vitro processer av berörings neuroner färgas med en antikropp framtagen mot acetylerat-alfa-tubulin-20 (figur 2B). Odlade berörings neuroner uttrycker också den toxiska mutanten kanal MEC-4 (d), som orsakar död av avkänningspunkten neuroner in vivo 34. Faktum GFP uttrycka nervceller som framställts av en mec-4 (d), pmec-4 :: GFP stammen är från början närvarande i kulturen, men sedan urartar 20. Viktigt Rör neuroner framställda av mec-4 (d), pmec-4 :: GFP beter in vitro liknande sätt hur de beter sig in vivo. Till exempel, de kan räddas från död genom behandling med enmiloride och dantrolen, som skonar mec-4 (d) berörings nervceller från degeneration in vivo 20,35. Avslutningsvis, inte bara C. elegans embryoceller liknar morfologiskt celler in vivo, men de också uttrycka cellspecifika markörer och är närvarande i samma förhållande som de förekommer in vivo. Sammantaget stöder dessa data att odlade C. elegans celler utgör ett övergripande bra system för att studera biologiska processer, både på cellulär och molekylär nivå.
Patch-clamp elektrofysiologisk analys av odlade C. elegans-celler
Den patch-clamp teknik, som introducerades av Sakmann och Neher på sjuttiotalet för att studera jonkanaler aktivitet från celler i isolering eller i vävnader kan tillämpas på odlade C. elegans-celler 36. Christensen och kollegor var de första att studera jonkanaler i odlade C. elegans-celler med användningpatch-clamp 1. Sedan dess har K +, anjoniska och katjoniska icke-selektiva kanaler (figurer 2 CE), samt dopaminupptag beroende kanaler beskrivits i odlade C. elegans 1,18,19,37. Dessa studier avancerade vår förståelse av rollen av joniska konduktanser i funktionen av C. elegans neuroner. Det finns några ändringar som måste beaktas vid användning av patch clamp teknik för att spela in jonkanalaktivitet från odlade C. elegans-celler. Dessa ändringar är oftast relevanta för hela cellinspelningar. Först C. elegans-celler är små, t.ex. neuroner ha en diameter av 1-2 | im. Sålunda glaspipetter måste ha en liten spets (0,5 mikrometer). Små pipettspetsar ökar ingångsmotståndet, vilket resulterar i stimulering och inspelning fel. För att lindra detta problem, kan pipetter konstrueras för att ha ett litet tips men ett brett kon. Goodman och Lockery utvecklat en metod employing brand poler utrustad med en högtrycksluftpump för formning av pipetter av denna form 38. För det andra, på grund av den begränsade storleken på cellerna, få hela cell åtkomst med hjälp av sug oftast resulterar i skador på cellen. Mycket högre framgång uppnås vanligen genom att applicera en högspänningsimpuls (elektrisk zapping) till plåstret av membran under spetsen på pipetten. De andra konfigurationer av patch-clamp-tekniken (cell bifogas, inifrån och ut och utifrån-ut) är enkel att tillämpa på C. elegans odlade celler, med den enda ändringen att pipettspetsen bör vara liten för att ta hänsyn till den ringa storleken på C. elegans-celler. Den perforerade patch-tekniken är som bekant mer arbetskrävande och tidskrävande än andra patch clamp teknik. Det har emellertid med framgång tillämpats på C. elegans celler på plats 39, 40 och därmed bör tillämpas i kulturen också.
Kalcium avbildningmetoder tillämpas på C. elegans odlade celler
Den funktionella rollen för spänningskänsliga Ca2 +-kanaler (VGCC) i nervceller och glia har undersökts i odlade C. elegans-celler genom kalcium avbildning 20, 21, 41. Tillämpningen av kalcium avbildning i kultur har tillåtit användning av lösningar som innehåller höga koncentrationer av KCl att inducera cell depolarisation och kalciumantagonister att urskilja bidraget av olika typer av kanaler till kalciuminflödet. Till exempel var det bidrag av Na + / Ca2 +-permeabelt MEC-4 (d) kanalen till den intracellulära kalciumkoncentrationen bestämdes genom kalcium avbildning med came YC2.12 i närvaro och frånvaro av DEG / ENaC antagonisten amilorid. Dessa experiment visade att en amilorid känsliga kalciuminflödet finns i beröring nervceller som uttrycker MEC-4 (d) men inte i vildtyp beröring nervceller. Använda jonofor att permeabilisera membranet iRör neuroner och för att kalibrera came (fig. 3A och B), Bianchi och kollegor bestämdes även att den genomsnittliga fria kalciumkoncentrationen i kontakt neuron är 200 nM 20 (figurerna 3C och D). Likaså Frokjaer-Jensen och kollegor undersökt vilken roll VGCCs EGL-19 och UNC-36 i regleringen depolarisation-inducerad kalciuminflödet i C. elegans odlade mechanosensory nervceller som uttrycker came 21. De fann att depolarisation av berörings neuroner inducerade av extracellulära K ^ i ett intervall mellan 20 mM och 100 mM, resulterade i ökning av intracellulärt kalcium avslöjas av YFP / GFP utväxlingsändring mellan 17% och 70%. Dessutom var kalcium transienter minskat med EGL-19 och UNC-36 förlustfunktions mutationer och inte registreras i frånvaro av extracellulärt Ca2 + tyder på att VGCCs spela en nyckelroll i retbarhet av C. elegans röra nervceller 21.
Stout och Parpura sökte rollen av spänningskänsliga Ca2 +-kanaler EGL-19, CCA-1 och UNC-2 i CEPsh slida glia av cefaliska sensilla bidra till kalciuminflöde 41. Intracellulärt kalcium dynamik analyserades i CEPsh gliaceller odlade från transgena djur som samuttrycker den röda fluorescerande markör mCherry och grönfluorescerande cytosoliskt Ca 2 + indikator GcaMP2.0. I majoriteten av de CEPsh gliaceller, membrandepolarisering induceras av höga extracellulära koncentrationer av KCl-inducerad ökning av intracellulär Ca 2 + som rapporterats av stigande GcaMP2.0 fluorescens. Vidare behandling med kalcium kanaler blockerare Cd 2 + och NEMA (nemadipine-A) minskade signifikant kalcium transienter. Dessa data stöder att spänningsberoende ökning i intracellulärt kalcium i CEPsh gliaceller beror åtminstone delvis på spänningsstyrda kalciumkanaler. Författarna, analyseras ytterligare intracellulära kalciumförändringar L-typ EGL-19RF (minskning av funktion), T-typ CCA-1 och N, P / Q, R-typ kanal unc-2 knockout djur och kom fram till att alla tre typerna av Ca2 +-kanaler bidrar avsevärt till intracellulära kalcium dynamiken i dessa gliaceller . Således, eftersom omogna däggdjurs macroglia svarar på depolarisation via VGCC beroende förändringar i intracellulära Ca2 +-koncentrationer, författarna menar att C. elegans CEPsh gliaceller kan funktionellt likna däggdjurs macroglia, astrocyter, oligodendrocyter och oligodendrocyt prekursorceller.
Andra tekniker som gäller för odlad C. elegans embryonala celler
Fluorescens-Aktivt cellsortering (FACS) har med framgång tillämpats på C. elegans odlade celler för att berika kulturerna med specifika celltyper och / eller för att isolera celler för microarray analys 23,4243. Den stora förändring som behövs för att införastill cellodlingsmetoden var den typ av substrat som används. Främmande och kollegor testade olika substrat inklusive kollagen IV, poly-L-lysin, fibronektin och laminin och etablerat att poly-L-lysin är den bästa substratet 37. Poly-L-lysin främjar celldifferentiering lika bra som jordnöts lektin, men i motsats till jordnötter lektin gör att cellerna lossnar från underlaget utan att skada 36. Flera olika typer av C. elegans celler har sorterats genom FACS, inklusive thermosensory, lukt-, motor-och mechanosensory nervceller och glia 23,42 - 45. Cell märkning har åstadkommits genom uttryck av GFP reportrar och totalt sett är hög med isolering av upp till 90% av GFP-märkta celler 23 sorteringseffektiviteten.
Geners uttryck genom RNA-interferens (RNAi) kan uppnås i kulturen också. Christensen och kollegor visade att inkubation av GFP-uttryckande odladeC. elegans nervceller med dsRNA mot GFP ledde till signifikant minskad nivå av GFP uttryck med en maximal effekt 4 dagar efter tillsats av dubbelsträngat RNA till kulturen 1. Likaså Shih och kollegor använde RNAi i kultur för att visa att C. elegans SID-1 är nödvändig för att mediera effekten av dsRNA och det är sannolikt behövs in vivo för att förmedla system diffusion av RNAi 46. Sammanfattningsvis, RNAi, som är en av de mest använda och effektiva metoder för geners uttryck i C. elegans kan appliceras i kultur. Denna metod skulle kunna användas för att tysta gener vars knockout är letal eller stör C. elegans normal utveckling.
Figur 1. C. elegans embryon före och efter kitinas behandling. (A) Fotografi av ägg före exponering för chitinase. Pilen pekar på de transparenta och intakta äggskal kring ett embryo. (B) Ägg som behandlats med chitinas i 10 min. De äggskal har smält och inte längre syns runt embryona. Pilarna pekar på tre-faldiga embryon frigörs från äggskal. Den blå rutan omger en grupp av celler som fortfarande är knutna till varandra.
Figur 2. Odlade C. elegans Rör nervceller. (A) Fluorescerande mikroskop av odlade C. elegans Rör nervceller som uttrycker GFP under beröring promotor mec-4 (P mec-4 :: GFP), skal 5 ìm. (B) Fluorescerande mikrofotografier av en touch neuron som uttrycker P mec-4 :: GFP (övre panelen), som färgades med en monoklonal antikropp mot acetylerade alfa tubulin (Sigma), ett posttranslational modifiering av alfa tubulin som sker i beröring nervceller bara 33. Anpassad från 20. (CE) Exempel på mechanosensitive kanaler som spelats in i vildtyp odlade berörings nervceller i konfigurationscell fäst i patch clamp teknik. Kanalen har en ledningsförmåga av ca 100 pS, och det finns i touch-neuroner som isolerats från mec-4 knockout-djur (mec-4 (u253)) också. Dessa data tyder på denna kanal är inte MEC-kanalen 20. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Uppskattning av den fria intracellulära kalciumkoncentrationen i odlade berörings nervceller med hjälp came. (A) pseudo bilder av odlade berörings nervceller som uttrycker came YC2.12 i 0 mM Ca2 + (+ EGTA, vänster) och i 10 mM Ca2 + (höger). Den pseudoskalan visas till höger. (B) Representant cameleon fluorescerande förändringar i samband med förändringar i intracellulära kalciumkoncentrationen i en permeabiliserad beröring neuron. Före inspelning, inkuberades cellerna i 30 min i en lösning innehållande kalciumjonofor Br-A23187 (10 | iM) och en definierad koncentration av fritt kalcium (250 nM i detta fall). Rotenone (10 mM) och 2-deoxi-D-glukos (1,8 mm) tillsattes också till lösningen för att blockera aktiva pumpar. Neuronen därefter perfusion med en lösning innehållande 0 mM (5 mM EGTA) Ca 2 + och 10 mM Ca 2 + för att bestämma den minsta och maximala fluorescensförhållande ändras. (C) Cameleon kalibreringskurva som visar de resultat som erhölls 4-7 celler vars fluorescens förändringar utvärderades i 11 olika fria kalciumlösningar. Varje utväxlingsändring normaliserades till den maximala utväxlingsändring för den enskilda cellen. (D) (B). Den vilar cameförhållandet hos odlade berörings neuroner var 22% ± 7 (n = 2, 18-celler) av maximalutväxlingsändring. På grundval av den kalibreringskurva som visas i (C), detta förhållande motsvarar en fri kalciumkoncentration på ~ 200 nM. Anpassad från 20. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans är en kraftfull modell organism för att dechiffrera den genetiska vägar som är involverade i utveckling, beteende och åldrande. Dess bekvämlighet härrör främst från den lätthet med vilken den kan vara genetiskt manipulerade och från sin korta livscykel. Trots sin bekvämlighet, C. elegans har sina begränsningar. C. elegans celler är liten och innesluten i en trycksatt nagelband som begränsar tillämpningen av metoder som kräver direkt tillgång till cellerna, t.ex. elektrofysiologiska och farmakologiska metoder, eller isolering av specifika celltyper, t.ex. gen-uttrycksprofilen av microarray analys. The C. elegans cellodlingsmetod har varit en lösning på många av de begränsningar av denna modell organism.
I detta manuskript beskriver vi en uppdaterad metod för isolering och odling av embryonala C. elegans celler i stor skala som bygger på tidiga arbete av Christensen och kollegor 1. Vi also rapportera publicerade representativa resultat som erhållits med hjälp av olika tekniker inklusive immuncytokemi, elektrofysiologi och kalcium avbildning som har avancerat vår förståelse av de fysiologiska processer och genetiska krav underliggande cellfunktionen i C. elegans. Arbete som hittills på odlade C. elegans celler stödjer att de differentierar in vitro som de gör in vivo rekapitulera uttrycket av cellspecifika markörer 1,18-20,22,23,27,44. Även om inte alla celltyper har karakteriserats i odling, föreslår denna kropp av arbete som cellodlings metod tillåter studiet av C. elegans celler i isolering utan att kompromissa deras identitet.
Protokollet är enkla och lätta att tillämpa på alla laboratorier. Saker som måste hållas i minnet för att framgångsrikt odla C. elegans embryonala celler är följande: 1) Djur måste synkroniseras så att de flesta av dem till vara gravida vuxna vid tiden för cellodlingsförfarandet. Starta masken kultur från en utsvulten plattan är ett bra alternativ. 2) De bakterier som används för att odla C. elegans måste undanröjas innan masken lys för att undvika kontaminering av cellkulturen. Det rekommenderas att stora volymer av sterilt vatten används för tvättningar och att djur centrifugerades vid den föreslagna (inte högre) hastighet för att undvika utfällning av bakterierna också. Indeed, medan behandling med lysbuffert innehållande blekmedel bör eliminera bakterier, från en relativt bakteriefria djur suspension rekommenderas. 3) Djur ska behandlas med blekmedel / NaOH tills ~ 80% av dem har släppt sina ägg. Kortare och längre inkubationstider minska effektiviteten i ägg återhämtning och skada äggen respektive. 4) Äggskal matsmältningen genom chitinas bör övervakas noga. Manuell dissociation bör inledas när ~ 80% av äggskal har smält. Längre och kortare incubatjon gånger både resultera i cellskada, på grund av den direkta skadan av plasmamembranet med hjälp av enzymet och skada som orsakas av långvarig och hårdare manuell dissociation i försöket att isolera celler, respektive. 5) Cell filtrering genom 5 pm filter bör inte tvingas. Om filtret blir igensatt, bör den ändras med en ny man för att undvika cellskador.
Trots att odlade embryonala celler har revolutionerat området på många sätt, de är inte svaret för varje vetenskaplig fråga och fortfarande har begränsningar. Exempelvis kan de gener som uttrycks i kulturen är mestadels embryonal eftersom cellerna är isolerade från embryon. Subcellulära avdelningar kan inte utvecklas på rätt sätt i kulturen. Till exempel, utveckling och underhåll av flimmerhåren i vissa amphid sensoriska neuroner såsom AWA och AWC beror på samverkan med amphid glia, som förloras i kultur 44. Celler förlorar sina naturliga grannar och gör inte fysiologiskt relvanta cell-till-cell-kontakter. Exempelvis är det inte känt om celler bildar tight junctions, elektriska eller kemiska synapser och om de gör, det är inte troligt att vara med sina fysiologiska partners. Vidare är cellerna ströks ut på ett enda substrat, jordnöts lektin. Den extracellulära matrisen in vivo kommer troligen att vara en komplex och svår att reproducera blandning av många molekyler inkluderande jordnöts lektin, laminin, kollagen och fibronektin. Dessutom specialiserad extracellulär matrix kanske behövs för vissa typer av cellfunktioner. Exempelvis mechanosensitive kanal uttrycks i kroppsberörings neuroner och som bildas av MEC-4 och MEC-10 subenheterna kan inte gated i kultur 18, men kan lätt gated in vivo 47. Detta härrör sannolikt från det faktum att extracellulär kollagen MEC-5 som normalt produceras av angränsande skarvceller in vivo, är frånvarande i kultur 48. MEC-5, tillsammans med extracellulära matrixproteiner MEC-1 (en 1999 aa långprotein med en Kunitz-typ domän och två EGF-domäner) och MEC-9 (en 834 aa lång protein som innehåller flera Kunitz-typ domäner, EGF-upprepningar och en glutaminsyra-rik domän) behövs för beröring känsla och är tänkt att binda till den extracellulära domäner av MEC-kanalen komplexa och att utöva slussning spänning på komplexet under mekanisk stimulering.
Avslutningsvis, C. elegans embryonala celler kan odlas in vitro och de förefaller att skilja rekapitulera uttrycket av cellspecifika gener. Protokollet för isolering och odling av cellerna är enkel och kan tillämpas i alla laboratorier med minimal erfarenhet av cellodlingstekniker. Med tanke på de begränsningar av denna teknik, kan cellodlingsmetoden vara och har visat sig vara en kraftfull teknik när direkta celler åt och / eller isolering av specifika celltyper behövs. Ett protokoll för att isolera celler från larver har också nyligen utvecklat (not beskrivs här) 49. Utbredd intresse av att utveckla kompletterande metoder gör C. elegans ett ännu mer kraftfullt system för att i slutändan förstå sambandet mellan geners funktion och beteende, utveckling och åldrande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator | |||
References
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
- Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
- Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
- Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
- Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
- Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
- Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
- Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
- Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
- Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
- Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
- Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
- Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
- Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
- Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
- Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
- Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
- Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
- Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
- Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
- Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
- Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
- Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
- Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
- Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
- O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
- Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).
