Summary
Biz embriyonik C. büyük ölçekli kültür için burada bir revize protokol açıklar hücreleri elegans. Embriyonik C. elegans Bu yöntemi kullanarak, in vitro olarak kültürlenmiş hücreler, bir hücre özel bir şekilde genlerin ekspresyonunu ayırt ve özetlemek için görünür. Doğrudan hücrelere erişimi ya da diğer dokulardan özel hücre tiplerinin izolasyonu gerektiren C teknikleri uygulanabilir kültür hücreleri elegans.
Abstract
C. elegans genetik ve moleküler teknikler kolay uygulanabilir olduğu güçlü bir model sistem vardır. Yakın zamana kadar olsa da, hücreler ve özel hücre tiplerinin izolasyonu doğrudan erişim gerektiren teknikleri, C de uygulanamadı elegans. Bu sınırlama, dokuların kolayca enzimler ve / veya deterjan ile muamele ile sindirilmeyen bir basınçlı kütikül içinde sınırlı olmasından kaynaklanıyordu. Laird Bloom, Christensen ve 1 C kültürleme için sağlam bir yöntem geliştirdi meslektaşları tarafından erken öncü çalışmalara dayanarak Büyük ölçekli embriyonik hücreleri elegans. Yumurta ağartıcı / NaOH ile işlenerek gebe yetişkin izole edilmiş ve daha sonra da yumurta kabuğu kaldırmak için çitinaz ile tedavi edilir. Embriyonik hücreler daha sonra el ile pipetleme ayrılmış ve serum zenginleştirilmiş ortam içinde alt-tabaka kaplı cam üzerine kaplanmıştır. Izolasyon hücrelerin 24 saat içinde morfolojisi değiştirerek ve hücre spesifik marke ifade ederek ayırt başlarrs. C. elegans, bu yöntem kullanılarak kültür hücreleri, in vitro olarak 2 hafta kadar hayatta kalma ve elektrofizyolojik, immünokimyasal için kullanılmıştır ve bu kriteri ve mikroarray kullanılmaktadır gibi görüntüleme de analiz eder.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) hücresel fonksiyonun, farklılaşma ve davranış moleküler temellerini araştıran güçlü bir model organizmadır. Genom, metabolik ve biyosentetik yollar omurgalılar 'benzer olmakla birlikte, genetik ve moleküler tractability 2 çok daha fazladır. Avantajları arasında, onun büyüklüğü ve basit anatomi, onun hızlı yaşam döngüsü (25 ° C'de 3 gün), kısa ömürlü (2 hafta) ve yavrular çok sayıda (> 200) vardır. Nedeniyle hermaphroditic doğası ve kısa yaşam döngüsü, moleküler ve genetik manipülasyonlar C. basittir transgenik hayvanlarda 3,4 ve bu RNA girişim 5 gibi gen knock-down tekniklerin uygulanması da dahil olacak elegans. C. elegans vücut ve yumurta kabuğu şeffaf. Bu nedenle hücreleri kolayca yetişkin ve standart mikroskopi kullanılarak embriyo hem de görülebilir. Son 40 yıl içinde, C. elegans C için çok değerli bir kaynak yarattı mutantlar, tırnakları ve transgeniklerinin geniş bir koleksiyon, sinir sistemi 8 tam yeniden yapılanma dahil anatomi ve geliştirme 6,7 ayrıntılı bir açıklama, ve de açıklamalı ve bütün topluma mevcuttur tamamen sıralı genom (dahil elegans araştırma www.wormbase.com ).
Sayısız avantajlara rağmen, bazı deneysel yaklaşımlar C. zorlu olmuştur elegans. Bu dokular ya da hücre tiplerinin hücre ve tecrit plazma zarına erişim gerektiren olanları içerir. Gerçekten C. elegans dokular kolayca enzimatik muamele ya da deterjanların tarafından sindirilir değil onun basınçlı hidrostatik iskelet, içinde hapsedilir. 1990'ların sonunda Miriam Goodman ve Janet Richmond C elektrofizyolojik kayıtlar için yöntemler öncülük elegansin situ 9,10 nöronlar ve kas hücreleri. Bu yöntemler bize nöronal ve in vivo kas fonksiyonu önemli bilgiler verirken, onlar zor ve düşük verim vardır. In vivo olarak, hücre fonksiyonlarını incelemek için alternatif yöntemler çoğunlukla, özellikle bu tür GCamP ve cameleon 11-13 genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörler kullanılarak kalsiyum vivo görüntüleme, geliştirilmiştir. Onlar bozulmadan yaşayan hayvanlar üzerinde uygulanır çünkü bu olsa yöntemleri, farmakolojik araçların kullanımına izin vermez.
Kültür C'de ilk girişimi Büyük ölçekli in vitro hücre elegans doktora tezi 14 hazırlanmasında Laird Bloom tarafından yapıldı. Ne yazık ki, zorluklar substrata hücrelerin zayıf yapışması ile karşılaşılan, zayıf hücre farklılaşması ve hayatta kalma güçlü bir hücre kültür yöntemi olarak bu erken protokol kurulmasını engelledi. 1995 yılında Edgar ve arkadaşları bir prosedür yayınladıTek bir C izolasyonu ve kültürü ile hücre bölünmesini ve morfogenetiğine araştırmak. elegans 15 embriyolar. Tedavisi ve enzimatik ayrışma manuel bir kombinasyonu ile yumurta kabuğu sindirilmesi ile elde edilen embriyonik hücreler, ~ 500 hücre 15 kadar üreten, çoğalmaya devam etti. Daha sonra, Leung ve arkadaşları bağırsak morfogenetiğine çalışma blastomerlerin küçük bir sayıda kültüre. Bunlar, bir in vitro izole edilmiş E blastomere apikal adherens birleşme 16 üzerinden birbirleri ile etkileşerek intestinal lümene benzer bir yapı oluşturulur polarize bağırsak hücreleri tarafından üretilebilir olduğunu gösterdi. Buechner ve arkadaşları, kültürleme C için benzer bir yöntem rapor etmiştir. 17, in vitro olarak embriyonik hücreleri elegans.
Bu erken çalışmalara dayanarak, Christensen ve arkadaşları embriyonik C kültürleme için sağlam bir protokol geliştirmiştir. elegans vitro 1 hücreler. Onlarbu izole edilmiş C göstermiştir. elegans hücreler, çeşitli hücre tipleri farklılaşmak ve hücreye özel markörlerin ekspresyonu dahil olmak üzere, in vivo olarak sahip olduğu özellikleri muhafaza edebilir. In vivo olarak zor olan çeşitli teknikler, izole edilmiş C uygulanabilir embriyonik hücreleri elegans. Bu elektrofizyolojik 1,18 19, görüntü işleme ve immünokimyasal teknikleri 20,21, hem de hücreye özgü cDNA kütüphanelerinin 22,23 inşası için (FACS) floresan aktive hücre spesifik hücre tipleri izolasyonunu içerir. Bu tür RNA girişim (RNAi) olarak Gene demonte teknikleri kültürlenmiş C uygulanabilir elegans hücreler 1 ve glikoprotein keşfi için bir araç olarak Azido-şeker kullanarak yeni bir metabolik etiketleme yöntemi, son zamanlarda in vitro kültürlenmiştir C için geliştirilmiştir elegans hücreleri, 24.
Sonuç olarak, hücre kültürü yöntemi dizi o genişletirC. uygulanabilir f teknikleri Bir canlı organizmanın bağlamında gen fonksiyonunu çözmek için bir çaba elegans modeli. Biz C kültürleme için buraya protokolü açıklamak büyük ölçüde birinci Christiansen ve arkadaşları 1 tarafından tarif edilen protokole göre in vitro olduğu, embriyonik hücreler elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Christensen ve diğerleri ile karşılaştırıldığında, Yıldız (*), yeni ya da değiştirilmiş adımlarını gösterir. 1
1.. Malzeme Kur
- Hücre kültürü prosedür gebe yetişkin izole edilmiş yumurtaların büyük miktarda gerektirir. C'yi büyüyecek yumurtaların büyük miktarda izole etmek için bakteriler - elegans 8P agar plakaları üzerinde NA22 (CGC C. elegans Genetik Consortium kullanılabilir) ile ekildi. Bu plakalar kullanılmıştır pepton miktarı normal olarak NGM plakalar için kullanılan 8 kez miktardır. Daha yüksek pepton konsantrasyonu OP50-, kalın tabakalar halinde büyümeye ki aksine, daha verimli NA22 bakterilerin gelişimini devam ettirir.
8P plakaları tarifi:
3 g NaCl, 20 g Bacto-pepton, 30 dakika süre ile, steril damıtılmış su ve otoklav içinde 1 L 25 g agar çözülür. 55 ° C'de orta serin ve daha sonra 1 ml 1 MgCl2 kolesterol steril olarak filtreden geçirilmiş, 1 ml EtOH (5 mg / ml), ekleme, MgSO 4 ile 1 ml KP tamponu (500 ml stok: 5 g 2 K HPO 4, 30 g KH 2 PO 4, pH 6.00) 25 ml. 10 cm Petri kutularına (25 ml / plaka) sıvı agar ortam dökün.
- Ertesi gün NA22 E: 1 ml her bir zenginleştirilmiş pepton agar levhasının tüm yüzeyi yayılmış 2XYT ortamı (16 g tripton, 10 g maya ekstresi, steril su, pH 7.0, 1 L NaCl 5 g) 37 ° C sıcaklıkta gece boyunca kültürlendi coli Bu bakteriler gravid yetişkinlerin büyük miktarlarda büyümeyi destekleyen kalın bir tabaka oluşturacak bol bir besin kaynağı oluşturmaktadır. Bakterilerin büyümesine izin vermek üzere gece boyunca oda sıcaklığında tohumlanmış plakaları bırakın. Bu süreç, 4-5 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek hızlandırılabilir.
- Numaralı seribaşı 8P plakalarına hasret hayvanları aktarın. 5-6 M9 tampon veya ml su kullanılarak bir hasret NGM plaka hayvanları yıkayın ve her 8P plaka bu süspansiyonun 1-2 ml ekleyin.
- Hayvanların büyüme ve çarpma unt izinil plakaları gebe yetişkinler tarafından izdiham doldurulur.
- C. hazırlanması için gerekli olan yumurta izole lizis çözeltisi 5-6 ml kullanarak gebe yetişkinlerden embriyonik hücreler, elegans.
Lysis çözelti tarifi
Taze Bleach 5 mi, 10 N NaOH ve 1.25 ml steril H2O 18.5 mi Bu karışım, her kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır.
- Yumurta tampon kullanarak gebe yetişkinlerden izole yumurta yıkayın:
Yumurta tampon tarifi
118 mM NaCl, 48 mM KCI, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7.3, 340 mOsm ozmolarite.
- Çitinaz ile muamele edilerek yumurta çevreleyen yumurtaların çıkarın. Kitinaz asidik pH 25 ile en yüksek aktiviteye sahip bir enzimdir. 2 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda yumurta tamponu pH 6.5 içinde kitin (Sigma, katalog no. C6137) içinde çözülür. Şitinaz stok saklamaksteril 15 ml konik tüplerde 1 ml alikotlar içinde -20 ° C'de çözelti. Bu süspansiyonun tam bölenleri bir kaç ay için -20 ° C de muhafaza edilebilir.
- C'yi büyüyecek fıstık lektinle kaplı otoklavlanmıştır lamelleri (12 mm çap) üzerinde elegans kültür hücreleri. Steril su (0.5 mg / ml) içinde fıstık lektin çözülür. Fıstık lektin çözelti filtre otoklave olmamalıdır. Ayrıca, UV ışığı ile muamele edilmesi gerekmez. 6 aya kadar -20 ° C'de saklayın 2 ml lik bir kısmı.
- Tam hücre kültür ortamı (500 mi) Gibco, 50 ml cenin sığır serumu (ısı ile deaktive edilmiş), 7.7 g sükroz (45 mOsm), 100 U / ml penisilin ve 100 ug, 5 ml / 500 ml L-15 kültür ortam içeren ml Streptomisin (% 2). Tam ortam daha sonra bir 0.20 mikron gözenek filtresi kullanılarak filtre edilir.
Yumurta tampon ve kültür ortamı, sırasıyla 340 ve 345 mOsm osmolaritesini sahip olduğunu unutmayın. Gerçekten de, memeli hücrelerinin aksine, C. elegans hücrelerin nispeten yüksek ozmotik basıncı vardırbu hücrelerin plazma membran ile doğrudan temas edecek çözümler hazırlanırken saymak içine alınması gerekir. Bu reaktiflerin tarifleri bir osmometre 1 kullanılarak ölçülmüştür istenen ozmolarite ulaşmak için ayarlanmıştır. Bu tarifleri tam olarak takip edilmektedir ve bakım Bu reaktif maddelerin hazırlanmasında kullanıldığında bir osmometre kullanmak gerekli değildir. Diğer çözümler, yemek tarifleri burada rapor edilmez veya C'yi kullanmak yayınların herhangi hazırlanmış olması, gerekiyorsa Ancak, tek bir osmoter kullanmalısınız kültür hücreleri elegans.
2. Yumurta İzolasyon
- Bu (24 oyuklu plakalar içerisinde) kültürlenmiş hücrelerin 12 kuyu için yeterli yumurta toplamak için en az dört 8P plakaları ile başlamak için tavsiye edilir.
- Prosedüre başlamadan önce fıstık lektin stok solüsyonu bir tüpü eritin. Bir 24-çukurlu plaka içindeki kuyuların altındaki otoklav lamelleri yerleştirin ve lamelleri fıstık lektin 200 ul ekle. 1 saat ya da u inkübentil hücreler kaplama hazırdır. Tamamen fıstık lektin çıkarın ve steril otoklavlanmış 1 ml su ile bir kez kuyu yıkayın. Lamelleri fıstık lektininin tam çıkarılması hücre topaklanma kaçınmak için gereklidir.
- Steril otoklava su kullanarak agar plakaları kapalı gebe yetişkin yıkayın. İki steril konik 50 ml tüp içine süspansiyon toplayın. Tüplerin (*) altındaki solucanlar çökelmesine izin verecek şekilde 5 dakika boyunca buz üzerinde tüpler bırakın. Bir transfer plastik bir pipet ile su çıkarmak ve taze steril otoklavlanmıştır su ile değiştirin. 200 xg 10 dakika boyunca (~ 1.200 rpm) (*) masa üstü santrifüj ile solucanlar Pelet. En az 3, bu son adımı tekrarlayın.
- Bir steril 15 ml konik bir tüp içine transfer solucanlar ve 200 x g'de 10 dakika boyunca (~ 1,200 rpm) (*) onları pelet. Hem tüpün altındaki bakteri toplama önlemek için daha yüksek bir hız santrifüj kullanmayın. Bazen santrifüj işlemi sonrasında tamamen solucanlar topak değildir. After Her bir yıkama ve temizleme önce yüzer madde, buz üzerinde 5 dakika boyunca tüpleri. Soğutulmuş su solucanlar tüpün dibine çökme olmamıştır.
- Su çıkarmak ve parçalama çözüm 5-6 ml ekleyin (Malzeme kurmak bakınız). 5-10 dakika boyunca yavaşça süspansiyon kaya ve daha sonra her 2-3 dk stereomicroscope altında solucan lisizine izleme başlar. Süspansiyonun bir damla daha kolay kontrolü için bir lamel üzerine yerleştirilebilir. Kuluçka süresi ağartıcının tazelik bağlı olarak değişir; ağartıcının küçük şişe satın almak ve her ay yeni bir şişe açın.
- ~% 70-80 oranında solucan (İnkübasyonun başından itibaren 10 dakika) lize ne olursa olsun (Malzeme ayarlamak için bkz) yumurta tamponu, pH 7.3 içinde 9 ml eklenerek parçalama reaksiyonu durdurun. 10 dakika boyunca 200 x g'de (1200 rpm ~) de süspansiyonu santrifüj. Yumurta (*) yeniden kirlenmesini önlemek için bankta bir Bunsen beki var Bu noktadan itibaren.
- Dikkatlice steril plastik transfer pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve pelet 3-4 yıkayınçözüm açıktır x yumurta tamponu ile kadar. Her bir yıkama sırasında yumurta tamponunda pelet iyice karıştırın emin olun.
- Yumurta% 30 sukroz çözeltisi kullanılarak Hayvan karkaslarının ayrılır. Steril yumurta tampon, 2 ml pelet yeniden süspanse edin ve 2 ml% 60 sukroz çözeltisi (steril yumurta tamponunda stoku) ekleyin. İyice karıştırın ve 200 x g (~ 1200 rpm) (*) 20 dakika boyunca santrifüj.
- Dikkatlice santrifüj tüpleri çıkarın. Yumurtalar çözeltisinin üstünde yüzen. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak, yeni bir steril 15 ml konik tüp içine tüm yumurta transferi.
- 10 dakika boyunca 200 x g (~ 1200 rpm) ve santrifüj tüpüne steril yumurta tampon 10 ml ilave edilir. Yıkandıkları 3 x tekrarlayın. Yumurtalar Tamamen her yıkama sırasında yumurta tampon içinde tekrar süspanse edilir emin olun.
3. Embriyonik hücreler Ayrılma
Laminer akış kapağı steril şartlar altında Prosedürün sonraki adımlar Davranış. Hayvanlar datüm bakteri değilse en ortadan kaldırmak gerekir bakteri plakalarının, yıkama ve ağartma maddesi içeren lizis çözeltisi ile muamele elbise. Bu durumda, prosedür, bu noktada, bir laminar bir başlık kullanılarak yumurta süspansiyonu yeni bir kirlenmesini önler.
- 2 mg / ml kitinaz (yumurta tamponu pH 6.5 (*) stok), 1 ml topak haline yumurta yeniden süspanse edin ve yeni bir steril 15 ml konik tüp aktarın. Oda sıcaklığında 10-30 dakika boyunca tüp sallayın. Kesin inkübasyon süresi, enzimin ve oda sıcaklığının tazelik göre değişen ve bu nedenle her hazırlanması için belirlenmelidir. Bu inkübasyon 10 dakika sonra, ters çevrilmiş bir hücre kültürü mikroskop altında yumurta izlemeye başlamak için tavsiye edilir. Not: bizim deneyim, düşük pH şitinaz enzimatik aktivitesini arttırır. Bu nedenle, biz kitinaz (pH NaOH ile 6.5 'e ayarlanır yukarıda belirtilen tarifi) eritmek için pH 6.5' de yumurta tampon kullanın.
- ~ Yumurtalarında% 80'i tarafından sindirilir zamankitinaz tedavisi (Şekil 1 AB), 900 x g'de 3 dakika boyunca (~ 2,500 rpm) (*) santrifüjleme ile yumurta pelet. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak, dikkatlice süpernatant kaldırmak ve L-15 orta 3 ml (*) ekleyin.
- 6 cm çaplı plaka içine yumurta aktarın ve yavaşça bir 18 G iğne ile donatılmış bir 10 ml'lik steril bir şırınga kullanılarak hücreleri ayırmak. Yeni bir plastik Petri kabı içine bir süspansiyon damla yerleştirerek ve mikroskop altında görüntüleyerek ayrışma derecesini izlemek. Zarar hücreleri önlemek için bu işlem sırasında enjektör içine hava aspire etmeyin. Hücrelerin% 80 ayrışmış olan ~ kadar ayrışma devam edin.
- Steril 5 um Millipore filtresi kullanılarak süspansiyon filtre. Hücre süspansiyonları, hücre kümeleri, sindirilmemiş yumurta ve larvalarına yumurtadan çıkarmak için filtre edilmelidir. Tüm hücreleri kurtarmak için filtre boyunca taze L-15 ortamı ilave 4-5 ml filtre. Dekar önlemek için filtrasyon aşaması sırasında aşırı güç kullanmayınfiltresi ve / veya hücreleri maging.
4. Hücre Kültürleme
- 3 dakika boyunca (*) için 900 x g (~ 2,500 rpm) santrifüjleme ile ayrışmış hücreleri Pelet. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak dikkatlice süpernatant kaldırmak. Tüm L-15, orta ve plakanın 1 ml / oyuk olarak pelet hücreleri yeniden süspanse edin. Ilave ortamın miktarı, kullanılan 8P plakaların sayısı, plakalar üzerinde solucanların birleştiği ve hücreler üzerinde yapılacak deneyler türüne bağlıdır. Hücre yoğunluğu bir hemositometre kullanılarak belirlenebilir. ~ 230.000 hücre / cm 2 optimal yoğunluk kaplama yama-kelepçe kayıtları için.
- Kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için ıslak kağıt havlu içeren plastik bir kap içinde Tupperware 24 kuyu plakası tutun. 20 ° C ve çevre havası ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde kabı saklayın.
- Hücreler genellikle 24 saat içinde deneyler için hazır olduğunda morfolojik ayrım ve ekspresGFP belirteçlerin iyon tamamlandı. Hücreler kadar 2 hafta boyunca kültür içinde tutulur, fakat bunlar genellikle kaplama sonrası 7-9 gün kadar en sağlıklı. Ortam, sağlıklı hücreleri korumak için günde bir değiştirilmesi gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. kültür hücreleri spesifik belirteçler farklılaştırmak ve ekspres hücre elegans
Christensen ve tripan mavi lekelemesi kullanılarak arkadaşları göstermiştir ki, embriyonik C>% 99 elegans hücreler izolasyon prosedürü hayatta. 9 gün sonra kaplama ve 22, sırasıyla% 85 ve% 65, hala 1. hayatta. İzole embriyonik C. elegans hücreleri ayırt etmek için bir alt-tabaka için uygun olmalıdır. Form kümeleri uymadığı ve onlar hayatta olup olmadığı açık değildir Hücreler. Hücrelerin farklılaşması kaplama sonrası 2-3 saat başlar ve ~ 24 saat boyunca devam eder. 24 saat içinde, hücreler belirli morfolojiler almak. Böylece nöronlar işlemleri 1,18-20 göndermek, kas hücreleri bir lümen 17 oluşturacak vivo 1 ve kanal hücrelerinde görülen benzeyen parmak gibi uzunlamasına yapılar oluşturur. In vitro morfolojik özellikleri, in vivo olanlara oldukça benzer. Örneğin, <em> in vitro (Pmec-4 :: GFP ifade tarafından tespit) kültürlü ALM ve PLM dokunmatik nöronlar in vivo 1,20 (Şekil 2A) olduğu gibi, biri diğerinden daha uzun olan sadece iki nöronal süreçleri geliştirir. Bu durum, C. farklılaşmasını sürücü moleküler mekanizmaların en azından bir kısmını elegans hücreleri hücre-bağımsız olan ve bu nedenle in vitro değinmeyecek edilebilir.
1990 yılında, Chalfie C. Yeşil Floresan Protein (GFP) kullanımına öncülük ilgi çekici bir gen 26, ifade edildiği hücre tipleri etiket elegans. Kültürlü C. hakkında şu ana kadar yapılan çalışmalar elegans embriyonik hücreler, spesifik hücre tiplerinde GFP ekspresyonu in vitro 1,18-20,27 (Şekil 2A) değinmeyecek olabilir destekler. Ayrıca in vitro olarak GFP eksprese eden hücrelerin oranının in vivo bulunan oranına benzerdir. Örneğin, unc-4 Homeodomain muhabiriOlgun embriyo geni (13 550 hücre-% 2.3) 28,29 13 motor nöronların olarak ifade edilir. Fox ve arkadaşları, kültür unc-4 :: GFP hücreler sayılır ve hücre 23 toplam sayısının% 2 olduğu bulundu. Benzer şekilde, UNC-119, G-protein ticareti 30 için gerekli olan bir proteini, C olarak ifade edilir. nöronlar ve kas hücreleri, bazı (L1 larvalarının 31 hücrelerinin% 76) elegans. Christensen ve arkadaşları kültür unc-119 :: GFP ifade nöronlar ve kas hücreleri 1 benzeyen hücrelerin% 74-76 gözlenmiştir bildirmiştir. Son olarak, MEC-4, yumuşak bir dokunuş 32 için gerekli olan bir mechanosensitive Na + / Ca2 + kanalı alt-birim yetişkin C. 6 dokunmatik nöron olarak ifade edilir elegans. Bu altı dokunmatik nöronların, dört (sadaka ve PLMS'yi) embryonically türetilmiştir. Bundan dolayı, 4 (% 0.7) 550 embriyonik hücreler mec-4 promoterin kontrolü altında GFP ifade etmelidir. Gerçekten de, Kültür nöronlarPmec-4 :: GFP ifade e hücrelerin 18,20 toplam sayısının ~% 0.5 oluşturmaktadır.
Protein belirteçler ve hücreye özgü post-translasyonel modifikasyonlar, aynı zamanda, in vitro olarak gözlenebilir. Örneğin, alfa tübülin sadece C dokunmatik nöronlarda asetilatlanır 33. elegans. In vitro, dokunmatik nöronların işlemleri asetile-alfa-tubulin 20 (Şekil 2B) karşı ortaya çıkan bir antikor ile leke. Kültürlü nöronlar dokunmatik in vivo 34 dokunmatik nöron ölümüne neden olan toksik mutant kanal MEC-4 (d), ifade eder. Gerçekten de, bir GFP mec-4 (d) 'den hazırlandı nöronlar eksprese etmek; pmec-4 :: GFP streyn ilk kültüründe mevcut olan ancak daha sonra 20 dejenere. Önemlisi, mec-4 (d) hazırlanan nöronlar dokunun; pmec-4 :: GFP benzer onlar in vivo nasıl davrandığını in vitro davranırlar. Örneğin bunlar ile muamele ile ölümden kurtarılabilecek birvivo 20,35 dejenerasyon (d) dokunmatik nöronlar mec-4 yedek miloride ve dantrolene. Sonuç olarak, sadece C. elegans embriyonik hücreler, in vivo koşullarında hücreler morfolojik olarak benzer, fakat aynı zamanda hücre spesifik markörleri ifade ve in vivo mevcut olan aynı oranda bulunurlar. Birlikte alındığında, bu veriler destekleyen kültürlendi C. elegans hücreleri hücresel ve moleküler düzeyde hem biyolojik süreçleri incelemek için genel olarak iyi bir sistem oluştururlar.
Kültür C Patch-clamp elektrofizyolojik analizi elegans hücreler
Tek başına ya da dokularda hücrelerin iyon kanallarının aktivite çalışmaları için de yetmişli Sakmann ve Neher ile tanıtıldı patch-clamp tekniği, kültürlü C uygulanabilir elegans hücreleri 36. Christensen ve arkadaşları kültürlü C'de iyon kanallarını incelemek için ilk idi kullanarak elegans hücrelerpatch-kelepçe 1. O zamandan beri, K +, anyonik, katyonik ve non-selektif kanal (Şekil 2 CE), hem de dopamin taşıyıcıları bağımlı kanalları kültürlenmiş C 'de tarif edilmiştir elegans 1,18,19,37. Bu çalışmalar, C işlevinde iyonik iletkenlikleri rolünün anlaşılmasını elegans nöronlar. Kültürlü C. iyon kanal aktivitesini kaydetmek için yama kelepçe tekniği kullanırken dikkat edilmesi gereken bir kaç değişiklik var hücreleri elegans. Bu değişiklikler, bütün hücre kayıtları çoğunlukla uygundur. İlk olarak, C. elegans hücreleri, örneğin nöronlar 1-2 um arasında bir çapa sahiptir küçüktür. Böylece, cam pipetler küçük bir ipucu (0.5 mikron) olması gerekir. Küçük pipet uçları Uyan ve kayıt hataları ile sonuçlanan, giriş direnci artırır. Bu sorunu hafifletmek için, pipetler küçük bir ipucu ama geniş bir koni için inşa edilebilir. Goodman ve Lockery bir yöntem geliştirdi empBu şekil 38 kalıplama pipetler için bir yüksek basınçlı hava pompası ile donatılmış bir yangın parlatıcı loying. İkinci olarak, hücrelerin en küçük boyutu, emme kullanılarak bütün hücre erişimini genellikle hücreye zarar ile sonuçlanır. Çok daha yüksek bir başarı genellikle pipet ucu altında zarın yama için yüksek gerilim darbesi (elektrik ZAP) kullanılarak elde edilir. Yama kelepçe tekniğin diğer konfigürasyonları (ekli hücre, out-iç ve dış-out) C'ye uygulamak için basit pipet ucu dikkate C küçük boyutu almak için küçük olmalıdır tek değişiklik ile, kültür hücreleri elegans hücreleri elegans. Delikli yama tekniği bildiği diğer yama kelepçe teknikleri nazaran daha zahmetli ve zaman alıcıdır. Bununla birlikte, başarı C üzerinde uygulanmıştır Bu şekilde elegans yerinde 39, 40 hücreleri ve aynı zamanda kültür uygulanabilir olmalıdır.
Kalsiyum görüntülemeteknikler C. uygulanan elegans kültürlenmiş hücreler
Nöron ve glial hücrelerdeki voltaj kapılı Ca 2 + kanalları (VGCC) işlevsel rolü kültüre C araştırılmıştır elegans kalsiyum görüntüleme 20, 21, 41 ile hücreler. Kültür içinde kalsiyum görüntüleme uygulaması hücre depolarizasyonu indüklemek için KCI yüksek konsantrasyonlarını ihtiva eden solüsyonların ve kalsiyum kanal blokerlerinin kullanımı kalsiyum akışı için kanallar farklı katkı ayırt izin verdi. Örneğin, Na + / Ca, hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ile 2 + geçirgen MEC-4 (d) bir kanal katkısı ° / ENaC kanal blokeri amilorid varlığında ve yokluğunda cameleon YC2.12 kullanılarak kalsiyum görüntüleme ile belirlenmiştir. Bu deneyler, bir Amilorid duyarlı kalsiyum girişini MEC-4 (d), ancak, yabani tip dokunmatik nöronlarda ifade dokunmatik nöronlar içinde mevcut olduğunu gösterdi. Membranın permeabilize iyonofor kullanmanöronlar dokunma ve Cameleon (Şekil 3A ve B) kalibre etmek, Bianchi ve arkadaşları da dokunmatik nöron ortalama serbest kalsiyum konsantrasyonu 200 nM 20 (Şekil 3C ve D) olduğunu belirledi. Benzer şekilde, Frøkjær-Jensen ve arkadaşları C'de depolarizasyon kaynaklı kalsiyum girişini düzenleyen VGCCs EGL-19 ve UNC-36 rolünü araştırdık elegans Cameleon 21 ifade mechanosensory nöronlar kültüre. Bunlar, 20 mM ve 100 mM arasında bir aralıkta hücre dışı K + ile indüklenen dokunma nöronların depolarizasyon,% 17 ve% 70 arasında YFP / CFP oranı değişikliği ortaya hücre içi kalsiyum artışa neden olduğu bulunmuştur. Ayrıca, kalsiyum geçici EGL-19 ve unc-36 zarar fonksiyonlu mutasyonlar azaltılmıştır ve VGCCs C uyarılabilirliği önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir + hücre dışı Ca2 yokluğunda saptanmamış elegans nöronlar 21 dokunun.
Stout ve Parpura voltaj kapılı Ca 2 + kanal EGL-19, CCA-1 ve kalsiyum akışı 41 katkıda sefalik Sensilla arasında CEPsh kılıf Gliadaki UNC-2 rolünü inceledik. Hücre içi kalsiyum dinamiklerinin kırmızı flüoresan işaretleyici mCherry ve yeşil floresan sitosolik Ca2 + göstergesi GcaMP2.0 eş-ifade eden transjenik hayvanlardan elde edilen kültürlenmiş CEPsh glial hücrelerinde analiz edilmiştir. GcaMP2.0 floresanstaki artış bildirilmiştir CEPsh glial hücrelerin çoğunda, zar depolarizasyon, hücre içi Ca KCl neden olduğu artışın 2 +, yüksek hücre dışı konsantrasyonları ile indüklenen. Ayrıca, kalsiyum kanal blokerleri Cd 2 + ve Nema (nemadipine-A) ile tedavisi, geçici kalsiyum azalır. Bu veriler CEPsh glial hücrelerinde hücre içi kalsiyum voltaj bağımlı bir yükselme destek voltaj geçitli kalsiyum kanalları üzerinde, en azından kısmen bağlıdır. Yazarlar, ayrıca L tipi egl-1 hücre içi kalsiyum değişiklikleri analiz9RF (fonksiyon azalması), T-tip CCA-1 ve N, P / Q, R tipi kanal unc-2 nakavt hayvan ve Ca2 + kanallarının her üç türleri bu glial hücreleri içinde hücre içi kalsiyum dinamiklerinin önemli ölçüde katkıda sonucuna . Olgunlaşmamış memeli macroglia hücre içi Ca2 + konsantrasyonlarında VGCC bağımlı değişiklikler ile depolarizasyon yanıt gözönüne alınarak, yazarlar varıldı C. elegans CEPsh glial hücreler işlevsel memeli macroglia, astrositleri, oligodendrositleri ve oligodendrocyte öncü hücreleri benzeyebilir.
Kültür C için geçerli olan diğer teknikler elegans embriyonik hücreler
Floresan aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) başarılı bir şekilde C uygulanmıştır özel hücre tipleri ile ve / veya mikro-dizi analizi için 23,4243 hücreleri izole etmek için kültürlerin ettirecek kültür hücreleri elegans. Tanıtılan gereken en büyük değişiklikHücre kültürü için kullanılan yönteme substratın türü oldu. Strange ve arkadaşları, kolajen IV, poli-L-lisin, laminin ve fibronektin dahil olmak üzere farklı test alt tabakaları ve poli-L-lisin en alt-tabaka 37 kurulan. Poli-L-lisin gibi iyi fıstık lektin gibi hücre farklılaşmasını teşvik ama fıstık lektin aykırı zarar vermeden 36 substrattan hücrelerin ayrılmasına olanak tanır. C arasında birkaç farklı türde 45 - elegans hücreleri thermosensory, koku alma, motor ve mechanosensory nöronlar ve glia 23,42 dahil, FACS göre sınıflandırılmaktadır edilmiştir. Hücre etiketleme GFP habercilerin ifadesi ile başarılmıştır ve genel olarak, ayırma verimliliği GFP-etiketli hücreleri 23% 90 kadar bir izolasyon ile yüksektir.
RNA girişim (RNAi) ile gen susturma hem de kültür içinde elde edilebilir. Christensen ve arkadaşları gösterdi GFP-ifade eden kültürlenmiş inkübasyonuC. 4 gün kültüre 1 çift-şeritli RNA ilave edilmesinden sonra, bir maksimal etki ile GFP ekspresyonunun önemli ölçüde azaltılmış bir düzeyde sonuçlanan GFP dsRNA ile karşı nöronları elegans. Benzer şekilde, Shih ve arkadaşları göstermek için kültür içinde RNAi kullanılan C. elegans SID-1 dsRNA etkisini aracılık için gerekli olan ve büyük olasılıkla RNAi 46 sistemik yayılmasını aracılık için in vivo olarak gereklidir. Sonuç olarak, C. gen susturma için en çok kullanılan ve etkin yöntemlerden biridir RNAi elegans kültür içinde uygulanabilir. Bu yöntem, nakavt öldürücü ya da C ile müdahale susturulması genleri için kullanılabilir normal gelişimini elegans.
Şekil 1. C. elegans embriyolar önce ve kitinaz tedavi sonrası. Önce ki maruziyete yumurta (A) Fotoğraftinase. Ok, bir embriyoyu çevreleyen şeffaf ve sağlam kabuğu. (B) Yumurta 10 dakika kitinazla tedavi için puan. Yumurta kabuğu sindirilmiş ve embriyoların etrafında görünür artık olmuştur. Oklar kabuğu salınan üç kat embriyo işaret. Mavi kutu halen birbirine bağlı olan bir grup hücre çevreler.
Şekil 2. Kültürlü C. elegans nöronlar dokunun. Kültür C (A) floresan mikrografı elegans dokunuşla spesifik promotör mec-4 (P mec-4 :: GFP), ölçek çubuğu 5 mikron altında GFP ifade nöronlar dokunun. (B) dokunmatik bir nöronun Floresan mikrografları P mec-4 :: GFP (üst panel) ifade, asetil alfa tübülin (Sigma) karşı bir monoklonal antikor ile boyanmış, bir posttranslationasadece 33 dokunmatik nöronlarda meydana alfa tübülin l modifikasyonu. Yama kelepçe tekniğiyle hücre-bağlı bir yapılandırmada yabani tip kültürlenmiş nöronlar dokunmatik kaydedilen mechanosensitive kanallar 20 uyarlanmıştır. (CE) Örnek. Kanal ~ 100 pS iletkenlik vardır ve mec-4 nakavt hayvanlar (MEC-4-(u253)) ve aynı zamanda izole bir dokunuş nöronlarda bulunur. Bu veriler, bu kanalı MEC kanal 20 değil düşündürmektedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Cameleon kullanılarak kültürlü nöronlar dokunmatik serbest hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun tahmin edilmesi. 0 mM Ca 2 + (içinde cameleon YC2.12 sentezleyen kültürlenmiş dokunmatik nöronların (A) Pseudocolor görsel+ EGTA, sol) ve 10 mM Ca 2 + (sağ). Pseudocolor ölçek sağda gösterilir. Bir permeabilize dokunmatik nöron hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri ile ilişkili (B) Temsilcisi cameleon floresan değişir. Önce kayıt için, hücreler, kalsiyum iyonofor Br-A23187 (10 uM) ve serbest kalsiyum (bu durumda 250 nM) belirli bir konsantrasyonunu ihtiva eden bir çözelti içinde 30 dakika için kuluçkalanmıştır. Rotenone (10 mM) ve 2-deoksi-D-glikoz (1.8 mm), aynı zamanda, aktif pompalar bloke etmek üzere çözeltiye ilave edildi. Nöron daha sonra minimum ve maksimum fluoresan oranı değişikliklerini saptamak için 0 mM (5 mM EGTA) Ca2 + ve 10 mM Ca2 + içeren bir çözelti ile perfüze edildi. 4-7 elde edilen sonuçları gösteren (C) Cameleon kalibrasyon eğrisi Floresan değişiklikleri olan hücre 11 farklı bir serbest kalsiyum Çözeltilerin değerlendirildi. Her oran değiştirme bireysel hücre için maksimum oran değişikliği için normalize edildi. (D) (B) 'de tarif edildiği gibi en az ve en fazla cameleon oran değişirse, o zaman tespit edildi. Kültür dokunmatik nöronlarda dinlenme cameleon oranı% 22 ± 7 (n = 2, 18 hücreleri) maksimum oranı değişebilir. (C) 'de gösterilen kalibrasyon eğrisine göre, bu oran ~ 200 nM serbest bir kalsiyum konsantrasyonuna karşılık gelir. 20 den uyarlanmıştır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans gelişim, davranış ve yaşlanma ile ilgili genetik yollar deşifre için güçlü bir model organizmadır. Onun rahatlığı öncelikle genetik manipüle edilebilme kolaylığından ve kısa yaşam döngüsü kaynaklanıyor. Onun kolaylık rağmen, C. elegans sınırlamaları vardır. C elegans hücreler son derece küçük ve bu mikro-dizi analizi ile gen ekspresyon profili olarak, doğrudan bu tür elektrofizyolojik ve farmakolojik teknikleri gibi hücrelere erişim, veya özel hücre tiplerinin izolasyonu gerektirir yöntemlerin uygulanmasını kısıtlar basınçlı kütikül içinde sınırlı bulunmaktadır. C. elegans hücre kültürü yöntemi, bu model organizma sınırlamaları çok bir çözüm olmuştur.
Bu yazıda; embriyonik C izole ve kültürleme için güncelleştirilmiş bir yöntemi tarif elegans büyük ölçekte hücreler Christensen tarafından erken çalışmaya dayalı ve arkadaşları 1. Biz also C. fizyolojik süreçler ve genetik gereksinimleri yatan hücre fonksiyonu anlayışımızı gelişmiş immünsitokimya, elektrofizyoloji ve kalsiyum görüntüleme dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılarak elde yayınlanan temsilcisi sonuçlarını rapor elegans. Kültürlü C. hakkında şu ana kadar yapılan çalışmalar elegans hücreleri hücre özel işaretleri 1,18-20,22,23,27,44 ifadesini yansıtan in vivo yaptıkları gibi in vitro ayırt desteklemektedir. Tüm hücre tipleri kültüründe karakterize edilmiş olmakla beraber, bu iş vücut hücre kültür yöntemi sağlar: göstermektedir C olan çalışma kimliklerini ödün vermeden izolasyon elegans hücreler.
Protokol, herhangi bir laboratuvar basit ve kolay uygulanabilir. Başarıyla C kültürü için akılda tutulması gereken şeyler elegans embriyonik hücreler, aşağıdaki gibidir: 1) Hayvanlar senkronize edilmesi gerekir bunların çoğunluğu wil böylecel, hücre kültür prosedürü esnasında yetişkin gebe edilebilir. Bir hasret plakadan solucan kültürü başlayarak iyi bir seçenektir. 2) bakteri büyümesi için kullanılan C'ye elegans hücre kültürünün kirlenmesini önlemek için önce solucan lizise yok edilmesi gerekir. Bu, steril su içinde büyük miktarda yıkama için kullanılması önerilir ve hayvanların yanı sıra bakteri çökelmesini önlemek için bir hızda (yüksek olmayan at) önerilen santrifüjlenir olmasıdır. Gerçekten de, ağartıcı ihtiva eden liziz tamponu ile tedavi nispeten bakteri içermeyen hayvan süspansiyon başlayarak bakterileri ortadan kaldırmak gerekir ise tavsiye edilir. Bunların% 80'i kendi yumurtalarını yayımlandı ~ kadar 3) Hayvanlar ağartıcı / NaOH ile tedavi edilmelidir. Daha kısa ve daha uzun inkubasyon süreleri yumurta geri kazanım verimliliğini azaltmak ve sırasıyla yumurta zarar verebilir. 4) çitinaz tarafından Eggshell sindirim yakından izlenmelidir. ~ Yumurtalarında% 80 sindirilmiş edildiğinde manuel ayrışma geçilmelidir. Daha uzun ve daha kısa incubatnedeniyle sırasıyla hücreleri izole etmek amacıyla uzun süreli ve daha sert el ile ayrışma neden enzim ve hasar, plazma zarının doğrudan zarar hücre hasarına, iyon kez sonuç her iki. 5) 5 um bir filtreden süzme Cell zorunda olmamalıdır. Filtresinin tıkalı alırsa, hücre hasarı önlemek için taze bir biri ile değiştirilmelidir.
Kültürlü embriyonik hücreler birçok yönden alanında devrim olmasına rağmen, onlar her bilimsel soru için cevap değildir ve hala sınırlamaları vardır. Örneğin, kültür olarak ifade edilen genler, hücreler, embriyolardan izole çünkü çoğunlukla embriyonik bulunmaktadır. Subselüler bölmeleri kültürde doğru geliştirmek olmayabilir. Örneğin, bu tür AWA'nın ve AWC gibi bazı amphid duyusal nöronların kirpikler geliştirilmesi ve bakım kültürü 44 kaybolur amphid glia ile etkileşimine bağlıdır. Hücreler kendi doğal komşuları kaybeder ve fizyolojik rel yapmayınEvant hücre-hücre temas. Örneğin, hücrelerin elektrik sıkı kavşaklar, veya kimyasal sinaps oluşturmak olup olmadığı bilinmemektedir ve eğer, bu onların fizyolojik ortakları ile olması muhtemel değildir. Ayrıca, hücreler, tek bir alt-tabaka, yer fıstığı lektin üzerinde plakalanır. In vivo hücre dışı matris fıstık lektin, laminin, kolajen, ve fibronektin dahil olmak üzere birçok moleküllerin karmaşık ve yeniden zor karışımı olması muhtemeldir. Üstelik, belki hücre fonksiyonları belirli türleri için gerekli hücre dışı matriks uzmanlaşmıştır. Örneğin, kanal mechanosensitive gövde dokunmatik nöronlarda ifade MEC-4 tarafından oluşturulan ve MEC-10 alt-birimleri kültür 18 kapılı edilemez, fakat kolayca in vivo 47 kapılı edilebilir. Bu büyük olasılıkla hücre dışı kollajen MEC-5 normal olarak in vivo olarak dikiş komşu hücreler tarafından üretilen, kültür 48'de mevcut olmasından kaynaklanmaktadır. MEC-5 birlikte, hücre dışı matris proteinleri MEC-1 ile (uzun bir 1999 aabir Kunitz-tipi alanı ve iki EGF alanları) ve çok sayıda Kunitz tipi etki, EGF tekrarlar ve bir glutamik asit açısından zengin domeni ihtiva MEC-9 (bir 834 aa uzunluğunda protein) ile protein dokunma hissi için gerekli olan ve bağlamak için düşünülen MEC kanal kompleksinin hücre dışı etki ve mekanik uyarılması sırasında karmaşık yolluk gerilim uygulamak için.
Sonuç olarak, C. elegans embriyonik hücreler, in vitro kültür edilebilir ve bunlar, hücre spesifik genlerin ekspresyonunu yansıtan ayırt görünmektedir. Hücrelerin izolasyonu ve kültürü için protokol basittir ve hücre kültürü teknikleri az deneyime sahip bir laboratuvarda uygulanabilir. Bu akılda teknik sınırlamaları taşıyan, hücre kültür yöntemi olabilir ve doğrudan hücre ulaşmak ve / veya belirli bir hücre tiplerinin izolasyonu gerekli olduğunda, güçlü bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. Larva hücreleri izole etmek için bir protokol de son zamanlarda geliştirilmiştir (n edilmişot) Burada 49 nitelendirdi. Tamamlayıcı yöntemler geliştirilmesinde yaygın ilgi C yapıyor sonuçta gen fonksiyonu ve davranışı, gelişim veya yaşlanma arasındaki bağlantıyı anlamak için daha güçlü bir sistem elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator | |||
References
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
- Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
- Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
- Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
- Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
- Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
- Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
- Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
- Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
- Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
- Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
- Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
- Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
- Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
- Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
- Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
- Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
- Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
- Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
- Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
- Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
- Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
- Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
- Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
- Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
- O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
- Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).
